CN101583725A - 连接扩增 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于基于连接的指数式核糖核酸扩增，以及随后的使用核酸聚合反应的检测的方法和试剂，所述反应利用包括3个或更多磷酸的末端磷酸标记的核苷酸作为核酸聚合酶的底物。

Description

连接扩增
与相关申请的交叉参照
本申请是以下申请的部分继续申请：于2003年2月5日提交的美国专利申请号10/358,818，所述美国专利申请号10/358,818是于2002年4月1日提交的美国专利申请号10/113,030的部分继续申请，所述美国专利申请号10/113,030要求于2001年8月29日提交的美国临时申请号60/315,798的优先权，所有上述专利申请名称为“Terminal-phosphate-labeled Nucleotides and Methods of Use”；以及于2004年12月23日提交的美国专利申请号60/638,937；所述美国专利申请号60/638,937要求于2005年5月27日提交的美国临时申请号60/685,661的优先权；以及名称为“Ligation-based RNA Amplification”，于2005年12月22日提交的国际专利申请号PCT/US2005/046800。
发明背景
具有特异性和灵敏性的用于扩增和检测特定分析物例如核酸的各种方法是已知的。此种方法一般需要在检测步骤前发生的扩增步骤。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)和逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，分别用于扩增脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。并且，用于核酸的检测方法一般包括可检测标记，例如与酶或抗体偶联的荧光标记或放射性标记的使用。
许多核糖核酸(RNA)扩增方法包括多步骤反应，例如RNA转换成互补DNA(cDNA)作为步骤之一，并且需要多种酶和中间体纯化步骤。
此外，扩增和检测方法需要标记的原材料与标记的产物的分离，其使用例如电泳或亲和分离技术。
因此，提供克服已知技术的某些局限性、用于指数式RNA扩增和后续检测的方法将是有利的。
发明领域
总的来说，本发明涉及用于基于连接的指数式核糖核酸扩增以及随后的使用核酸聚合反应的检测的方法，所述反应利用包括3个或更多磷酸的末端磷酸标记的核苷酸作为核酸聚合酶的底物。还公开了用于特定靶的检测和鉴定的方法的用途。
发明简述
在某些实施方案中，本发明提供了用于扩增和检测靶RNA序列的方法。该方法包括下述步骤：扩增靶RNA序列以产生扩增的RNA序列，在至少一个末端磷酸标记的核苷酸的存在下，使扩增的RNA序列与核酸聚合酶反应以产生标记的多磷酸，以及检测标记的多磷酸。在某些实施方案中，标记的多磷酸进一步与磷酸反应，以产生可检测种类。在某些实施方案中，各个步骤在单个反应容器中同时进行。
在某些实施方案中，本发明提供了用于检测样品中靶RNA序列的存在的方法，其包括步骤(a)扩增靶RNA序列以产生扩增的RNA序列，(b)在多磷酸链中包含3个或更多磷酸基的至少一个末端磷酸标记的核苷酸的存在下，对扩增的RNA序列进行核酸聚合酶反应，所述反应导致标记的多磷酸的产生，和(c)检测标记的多磷酸。对于扩增，靶RNA首先与核酸序列进行杂交，所述核酸序列包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域。杂交后，使核酸序列的双链区域的5′末端与靶RNA序列的3′末端连接，以形成连接的序列。连接的序列随后用RNA聚合酶进行转录，以形成扩增的反义、互补RNA序列。在某些实施方案中，对扩增的反义互补RNA序列进行第二轮扩增，以提供扩增的有义RNA序列。
在某些实施方案中，本发明进一步通过了用于同时扩增和检测样品中的靶RNA序列的试剂盒。该试剂盒包括至少一个核酸序列，所述核酸序列包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶核糖核酸序列杂交的单链3′末端区域；连接酶；基本上抗磷酸酶的核苷酸；DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶、逆转录酶或其组合中的至少一种；一个或多个末端磷酸标记的核苷酸和磷酸酶。核酸序列的5’凹端是磷酸化的，并且末端3′末端用聚合酶延伸阻断剂进行封端。在基本上抗磷酸酶的辅因子的存在下，试剂盒中的连接酶能够使靶RNA序列与核酸序列连接。末端磷酸标记的核苷酸具有下式：
B-S-Y-(P)n-P-L
其中P＝磷酸(PO3)及其衍生物，n是2或更大；Y是氧或硫原子；B是含氮杂环碱基；S是无环部分、碳环部分或糖部分；L是包含适合于在天然或修饰核苷酸的末端磷酸处形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键(phosphoramidate)的羟基、巯基或氨基的酶可激活标记；P-L是磷酸化的标记，其优选在磷酸被去除时成为可独立检测的。
附图简述
当参考附图阅读下文详述时，本发明的这些和其他特征、方面和优点将更变得更好理解。
图1是通过最初连接和后续转录反应的指数式RNA扩增的图示。
图2是使用末端磷酸标记的核苷酸检测扩增的RNA序列的图示。
图3是通过最初连接和后续转录反应的同时RNA扩增，随后在单个反应容器中使用末端磷酸标记的核苷酸进行检测的图示。
图4是15％7M尿素TBE凝胶的荧光图像(fluoroimage)，显示3种不同的连接酶(大肠杆菌(E.coli)连接酶、T4DNA连接酶和T4RNA连接酶)可以使双链DNA与RNA连接。
图5是15％7M尿素TBE凝胶的荧光图像，显示基于连接的mRNA扩增。
图6是显示在磷酸酶的存在下，在模板指导的过程中通过γ-磷酸标记的ddGTP的聚合酶利用获得的荧光的曲线图。
图7是显示在磷酸酶的存在下，在模板指导的过程中通过γ-磷酸标记的ddATP的聚合酶利用获得的荧光的曲线图。
发明详述
为了更清晰和简明地描述和指出本发明的主题，提供在下文说明书和所附权利要求中使用的特定术语的下述定义。
除非上下文另有明确说明，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。如本文在说明书和权利要求中自始至终所使用的，近似语言可以应用于修饰任何定量表示，其可以获准改变，而不导致它所涉及的基本功能的变化。因此，由术语例如“约”修饰的值并不限于所指定的精确值。
如本文所使用的，术语“扩增”指靶核酸序列的多个拷贝的产生，或与靶核酸序列互补的多个核酸序列拷贝的产生。
如本文所使用的，术语“扩增的RNA序列”指通过使用本文提供的方法扩增靶RNA序列产生的序列。就靶RNA序列而言，扩增的RNA序列可以是同义的(在第二轮和后续偶数轮扩增中产生的+ve链)或反义的(即在第一轮和后续奇数轮扩增中产生的-ve链)。
如本文所使用的，术语“封端”和“封端的”指合适的化学部分与分子中的功能或反应基团的连接，所述功能或反应基团当连接时，掩蔽、减少或阻止官能性或反应性。例如，核苷酸的末端磷酸基可以用化学部分进行封端，以便阻止经由磷酸酶进行的去磷酸化。可以用于封端的合适的化学部分包括但不限于，可检测部分(例如染料)或烷基(例如甲基或乙基)。
如本文所使用的，术语“依赖DNA的RNA聚合酶”指任何以下RNA聚合酶：其识别双链DNA启动子序列用于起始其聚合酶活性。RNA聚合酶的例子包括但不限于T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶和T3RNA聚合酶。
如本文所使用的，术语“电化学标记”是电化学活性部分，例如氧化还原部分。合适的电化学标记包括具有可与核苷酸的固有氧化还原电位容易地区分开的氧化还原电位的那些(例如，鸟嘌呤可以在约0.75V下进行电化学氧化，腺嘌呤在约1.05V下进行电化学氧化)。电化学标记的例子包括但不限于，1，4-苯醌(-0.54V)、二茂铁(+0.307)、四氰基醌二甲烷(+0.127，-0.291)、N，N，N′，N′-四甲基-对苯二胺(+0.21)和四硫富瓦烯(+0.30)。
如本文所使用的，术语“标记的多磷酸”指磷酰基转移的无机副产物，所述磷酰基转移起因于末端磷酸标记的核苷酸的核酸聚合酶处理。标记的多磷酸可以包含标记，所述标记在与磷酸酶反应后可以产生可检测种类。经由磷酸酶的磷酰基转移的多磷酸产物的切割，导致在其上连接的标记的可检测变化。
如本文所使用的，术语“连接酶”指催化核酸的相邻碱基之间的切口连接的酶。例如，连接酶可以是能够在5′磷酸基和3′羟基之间形成分子内或分子间共价键的酶。合适的连接酶可以包括但不限于T4DNA连接酶、T4RNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
如本文所使用的，术语“质量标记”指适合于质谱法的分子量部分，由于质量的差异，其可与其他组分容易地区分开。质量标记可以在整个谱的范围内变动，并且质量的差异可以低至单个原子质量单位。
如本文所使用的，术语“核酸聚合酶”指其关键功能与核酸聚合物例如RNA和DNA相关的酶。例如，核酸聚合酶可以催化从存在的DNA或RNA模板产生新DNA或RNA。
如本文所使用的，术语“核酸聚合酶反应”一般指涉及使用核酸聚合酶(例如DNA聚合酶或RNA聚合酶)来合成核酸(例如DNA或RNA)的反应。RNA和DNA聚合酶经由从三磷酸核苷(NTP)、三磷酸脱氧核苷(dNTP)或三磷酸双脱氧核苷(dNTP)到增长中的寡核苷酸链的3′羟基的一磷酸核苷的转移而合成寡核苷酸。驱动这种反应的力是酸酐键的裂解和无机焦磷酸的伴随形成。核酸的合成涉及仅在核苷酸的α-和β-磷酰基处的直接变化，使得在末端磷酸位置处具有修饰的多磷酸链中具有3个或更多磷酸基的核苷酸能够作为核酸聚合酶反应的底物。
如本文所使用的，术语“核苷”指在1′位置或等价位置处具有与糖或糖取代物例如碳环或无环部分连接的嘌呤、脱氮嘌呤、嘧啶或修饰碱基的化合物，并且包括2′-脱氧和2′-羟基、和2′，3′-双脱氧形式以及其他取代。
如本文所使用的，术语“核苷酸”指天然和修饰的磷酸核苷。酯化反应位点可以对应于与核苷的戊糖的C-5位置连接的羟基。核苷酸可以在结构上进行修饰，以便使得它们与磷酸酶基本上无反应。结构修饰可以包括用化学基团给核苷酸封端，所述化学基团阻止磷酸酶使核苷酸去磷酸化。封端可以通过使烷基(例如甲基或乙基)与核苷酸的末端磷酸连接而达到。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸”包括但不限于核苷酸或其衍生物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷等的线性寡聚物。说明书自始至终，当寡核苷酸由字母的序列代表时，核苷酸从左到右是5′→3′的顺序，其中A指腺苷，C指胞嘧啶，G指鸟苷，T指胸苷。
如本文所使用的，术语“磷酸酶”指切割磷酸单酯、磷酸硫酯、氨基磷酸酯、多磷酸和核苷酸以释放无机磷酸的任何酶。在本发明的背景中，这种酶不切割末端标记的磷酸核苷(即末端磷酸标记的核苷酸与磷酸酶基本上无反应)。本文提供的磷酸酶定义特别包括但不限于，碱性磷酸酶和酸性磷酸酶(例如细菌碱性磷酸酶、小牛肠磷酸酶、北极(artic)虾碱性磷酸酶)。
如本文所使用的，术语“磷酸酶延伸阻断剂”指这样的化学部分：当与寡核苷酸的3′末端连接时，其阻止经由核酸聚合反应的增长中的核酸链从3′末端的进一步延伸。聚合酶延伸阻断剂可以是修饰核苷酸(例如双脱氧核糖核苷酸)。在寡核苷酸的3′末端处的修饰核苷酸能够阻断逆转录酶从3′末端的延伸反应。
如本文所使用的，术语“引发酶”指参与DNA复制的RNA聚合酶。在复制过程中，引发酶合成起始RNA引物，且起始经由DNA聚合酶的DNA合成。在细菌中，引发酶与DNA解旋酶结合，形成复杂的引发体。引发酶随后由DNA解旋酶激活，并且合成长约11个核苷酸的短RNA引物，可以通过DNA聚合酶向其添加新核苷酸。
如本文所使用的，术语“引物”指与预定核酸序列特异性退火的线性寡核苷酸。引物设计为具有这样的序列，所述序列是与其退火的靶核酸的区域的反向互补序列。引物长度的上限和下限都凭经验进行确定。引物长度的下限是稳定杂交，因为极短引物(长度小于12个核苷酸)在杂交条件下不形成热力学稳定的双链体。上限通过除预定查询靶外的区域中的双链体形成的可能性进行确定。合适的引物长度为约12-100个核苷酸，优选约15-30个核苷酸，和最优选约17-25个核苷酸的长度。
如本文所使用的，术语“靶核酸序列”指这样的核酸序列：其序列同一性、或核苷的排序或定位通过本发明的一种或多种方法进行测定。靶核酸序列可以是天然或合成来源的核糖核酸(RNA)。靶RNA序列可以是但不限于，信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA、线粒体RNA、核内小RNA(snRNA)、小干扰RNA(siRNA)、或异源核RNA(hnRNA)。
如本文所使用的，术语“末端磷酸标记的核苷酸”指在核苷酸的末端磷酸处包括结构修饰的核苷酸。结构修饰可以是标记(例如化学发光、荧光、电化学或生色团部分，拉曼活性标记或质量标记)的连接，并且此种修饰不消除核苷酸在聚合酶反应中起作用的能力。采用的标记可以是但不限于酶可活化的标记。末端磷酸标记的核苷酸可以包括多磷酸链中的3个或更多磷酸基，并且当这些末端磷酸标记的核苷酸用于核酸聚合酶反应中时，反应导致标记的多磷酸的产生。
如本文所使用的，术语“转录”指一种过程，通过该过程，DNA或RNA序列经由RNA聚合酶进行酶促拷贝以产生互补RNA。转录以5′→3方向进行(即，以3′→5′方向读模板，并且以5′→3方向产生新的互补片段)。如果RNA模板与双链DNA启动子序列连接用于起始其聚合活性，那么依赖DNA的RNA聚合酶可以用于转录RNA模板。在双链DNA区域上通过RNA聚合酶起始转录后，转录跨RNA-DNA连接处并且通过RNA区域而进行，不伴随可观察到的速度或持续合成能力的丧失。转录中的模板RNA可以是单链RNA、双链RNA或DNA:RNA异源双链体。
实施方案
在某些实施方案中，本发明提供了用于扩增和检测靶RNA序列的方法。该方法包括下述步骤：扩增靶RNA序列以产生扩增的RNA序列，在至少一个末端磷酸标记的核苷酸的存在下，使扩增的RNA序列与核酸聚合酶反应以产生标记的多磷酸，以及检测标记的多磷酸。
怀疑或已知包含预期靶核酸的样品可以得自各种来源。样品可以是但不限于生物样品、食物或农业样品或环境样品。样品还可以来源于自生物受试者。生物受试者可以是原核或真核来源且包括病毒。此种样品可以是但不限于，来自/衍生自生物组织或体液或渗出物的那些(例如血液、血浆、血清或尿、乳、脑脊液、胸水、淋巴、泪液、痰、唾液、粪便、肺穿刺物、咽喉或生殖道拭子等)、完整细胞、细胞级份或培养物。在某些情况下，可能必须或希望处理样品，以释放和/或提取靶核酸序列用于杂交。当靶核酸以双链形式存在时，可能还必须或希望变性且使得成为可杂交的单链形式。样品中的靶核酸可以分散在溶液中或可以固定在固体支持物上(例如印迹、阵列或微量滴定孔或板)。
靶RNA序列的检测可以用于例如检测致病生物、法医用途、医学诊断用途或用于临床用途。本发明包括一般涉及可应用于分析、诊断或预后应用的方法的实施方案。
在某些实施方案中，靶RNA序列可以是杂聚或同聚序列。用于检测的靶RNA序列可以包括天然或合成RNA和/或天然或合成的寡核糖核苷酸。它可以是但不限于核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA、线粒体RNA、核内小RNA(snRNA)或小干扰RNA(siRNA)、和异源RNA(hnRNA)。在某些实施方案中，扩增不包括合成中间体c-DNA的步骤。
在某些实施方案中，与靶RNA序列比较，扩增的RNA序列同义(扩增的有义RNA序列)。在可替代实施方案中，就靶RNA序列而言，扩增的RNA序列反义(扩增的反义、互补RNA序列)。
在某些实施方案中，扩增的核酸序列与核酸聚合酶的反应是核酸聚合反应。在某些实施方案中，扩增靶RNA序列、执行核酸聚合酶反应和检测标记的多磷酸的步骤在单个反应容器中进行。在某些实施方案中，前述步骤以均质测定形式进行。在某些实施方案中，前述步骤顺次进行。在某些实施方案中，同时进行前述步骤中的两个或更多步骤。在某些实施方案中，所有前述步骤使用单一、均质的反应混合物同时进行。在某些实施方案中，所有前述步骤使用单一、均质的反应混合物顺次进行。
标记的多磷酸的存在、不存在和/或浓度可以与靶核糖核酸的存在、不存在和/或定量相关。因此，在某些实施方案中，该方法可以进一步包括向聚合酶反应中添加一种或多种另外的检测试剂(例如标记的探针或标记的抗体)的步骤。
在某些实施方案中，标记的多磷酸的检测通过检测标记的多磷酸的存在、不存在和/或浓度来进行。在某些实施方案中，标记的多磷酸进一步与磷酸酶反应以产生可检测种类。标记的多磷酸的检测可以通过下述来进行：使标记的多磷酸与磷酸酶反应以产生可检测种类，以及检测所形成的可检测种类。可检测种类可以通过比色、荧光、化学发光、质量变化、拉曼信号、电化学信号或其组合来检测。
在某些实施方案中，核酸聚合酶反应在DNA或RNA聚合酶中的至少一种聚合酶的存在下进行。合适的聚合酶包括但不限于，依赖DNA的RNA聚合酶、引发酶、端粒酶、末端脱氧核苷酰转移酶或依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)。核酸聚合酶可以是DNA聚合酶，例如DNA聚合酶I、II或III；DNA聚合酶α、β、γ；末端脱氧核苷酰转移酶；或端粒酶。可替代地，所采用的核酸聚合酶是依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)。合适的逆转录酶包括但不限于，具有逆转录酶活性的HIV RT、MMLV RT或DNA聚合酶。
在某些实施方案中，核酸聚合酶反应包括至少一个末端磷酸标记的核苷酸，其在多磷酸链中包含3个或更多磷酸基，产生标记的多磷酸作为副产物。在某些实施方案中，核酸聚合酶反应步骤可以进一步包括磷酸酶，其使标记的多磷酸副产物转换成可检测种类。在某些实施方案中，核酸聚合反应包括扩增的RNA序列与引物、核苷酸、逆转录酶和至少一个末端磷酸标记的核苷酸一起温育。在某些实施方案中，除了至少一个末端磷酸标记的核苷酸外，核酸聚合酶反应包括与磷酸酶基本上无反应的至少一个核苷酸。
在核酸聚合酶反应中用作底物的核苷酸可以包括但不限于，多磷酸核苷，例如多磷酸脱氧核糖核苷、多磷酸核糖核苷、多磷酸双脱氧核苷、多磷酸碳环核苷和多磷酸无环核苷及其类似物。在某些实施方案中，核苷酸可以用封闭基团进行封端，所述封闭基团阻止磷酸酶使核苷酸去磷酸化。在某些实施方案中，封端通过使烷基与核苷酸的末端磷酸连接来达到。在某些实施方案中，用于封端的烷基是甲基或乙基。
末端磷酸标记的核苷酸意指在一磷酸核苷掺入增长中的核苷酸链内后伴随释放的标记的多磷酸是可检测种类或能够产生可检测种类。
在某些实施方案中，在末端磷酸标记的核苷酸中的末端磷酸位置处连接的标记可以包括但不限于，化学发光标记、荧光标记、荧光团标记、生色团标记、质量标记、拉曼标记、电化学标记或其组合。在某些实施方案中，标记可以通过颜色、荧光发射、化学发光、质量变化、拉曼光谱、电化学信号或其组合的存在、不存在或变化而检测。
在某些实施方案中，末端磷酸标记的核苷酸在多磷酸链中包含3个或更多磷酸。合适的例子包括具有与末端磷酸连接的电化学、比色、化学发光或荧光标记、质量标记或拉曼标记的多磷酸核苷，例如多磷酸脱氧核糖核苷、多磷酸双脱氧核苷、多磷酸碳环核苷或多磷酸无环核苷及其类似物。在某些实施方案中，标记的多磷酸进一步与磷酸酶反应以产生可检测种类。在此种实施方案中，标记的多磷酸中的可检测种类以这样的方式合适地掩蔽，即，使得除非用磷酸酶处理否则它无法检测。然而，在将一磷酸核苷酸掺入增长中的寡核苷酸链内和反应的后续磷酸酶处理后，可检测种类是暴露的并且变得可检测。例如，如果在1，3-二氯-9，9-二甲基-吖啶-2-酮(DDAO)的三环结构的侧面上的羟基与核苷酸的末端磷酸位置连接，那么DDAO在659nm处不发出荧光。
在核酸聚合酶反应过程中，一旦一磷酸核苷掺入增长中的核酸内，副产物多磷酸DDAO(其在659nm处不发出荧光)就是磷酸酶的底物。一旦去磷酸化以形成DDAO，染料部分就变得在659nm处发出荧光且因此可检测。当去磷酸化时，DDAP-磷酸显示荧光发射的大偏移和荧光强度的大增加(DDAP-磷酸在约570nm处是弱荧光的。当去磷酸化时，荧光发射偏移至约659nm，并且荧光强度增加约20倍。)在某些实施方案中，多磷酸产物的特定分析可以在聚合酶反应溶液中进行，消除使反应产物与原材料分开的需要。这允许使用常规仪器例如分光光度计检测且任选定量在聚合酶反应过程中形成的核酸。
在某些实施方案中，磷酰基转移的标记的多磷酸副产物可以无需使用磷酸酶处理而进行检测。例如，天然或修饰核苷碱基，特别是鸟嘌呤，可以引起荧光的猝灭。因此，在末端磷酸标记的核苷酸中，当标记是荧光团时，标记可以通过碱基进行部分猝灭。在一磷酸核苷掺入后，由于其增强的荧光，可以检测标记的多磷酸副产物。可替代地，可以在检测前例如通过色谱分离法物理上分离标记的多磷酸产物。
在某些实施方案中，末端磷酸标记的核苷酸可以由下式表示：
B-S-Y-(P)n-P-L
其中P＝磷酸(PO3)及其衍生物，n是2或更大；Y是氧或硫原子；B是含氮杂环碱基；S是无环部分、碳环部分或糖部分；L是包含适合于在天然或修饰核苷酸的末端磷酸处形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基的酶可激活标记；P-L是磷酸化的标记，其优选在磷酸被去除时成为可独立检测的。
末端磷酸标记的核苷酸中的糖部分可以包括但不限于核糖基、2′-脱氧核糖基、3′-脱氧核糖基、2′，3′-双脱氧核糖基、2′，3′-双脱氢双脱氧核糖基、2′-或3′-烷氧基核糖基、2′-或3′-氨基核糖基、2′-或3′-氟核糖基、2′-或3′-巯基核糖基、2′-或3′-烷基硫代核糖基、无环、碳环和其他经修饰的糖。
末端磷酸标记的核苷酸中的碱基可以包括但不限于尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮次黄嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤及其类似物。
使用本文提供的方法，靶RNA可以通过基于连接的RNA扩增方法进行扩增，所述扩增方法省略了中间体c-DNA合成步骤。在某些实施方案中，靶RNA扩增通过首先使靶RNA与核酸序列杂交来进行，所述核酸序列包含包括RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域。杂交后，使核酸序列的双链区域的5′末端与靶RNA序列的3′末端连接，以形成连接的序列。连接的序列随后可以用RNA聚合酶进行转录，以形成扩增的反义、互补RNA序列。在某些实施方案中，对扩增的反义互补RNA序列进行第二轮扩增，以提供扩增的有义RNA序列。
在某些实施方案中，扩增靶RNA序列以产生扩增的RNA序列的步骤，包括以下步骤：(i)提供除聚腺苷酸外的靶RNA序列；(ii)提供一个或多个核酸序列，所述核酸序列包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域；(iii)使核酸序列的单链3′末端区域与靶RNA序列杂交；(iv)使核酸序列的双链区域的5′末端与靶RNA序列的3′末端连接，以形成连接的序列；(v)用RNA聚合酶转录连接的序列，以形成扩增的反义、互补RNA序列。在某些实施方案中，扩增靶RNA序列进一步包含使用扩增的反义互补RNA作为靶RNA序列执行前述步骤(i)-(iv)，以产生扩增的有义RNA序列。
在某些实施方案中，前述步骤中的两个或更多个步骤在单个反应容器中进行。可替代地，所有前述步骤可以在单个反应容器中进行。在某些实施方案中，各个步骤分步进行。在某些实施方案中，所使用的RNA聚合酶是依赖DNA的RNA聚合酶。在某些实施方案中，依赖DNA的RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
在转录反应中使用的脱氧核糖核苷酸可以在结构上进行修饰，从而使得它们与磷酸酶基本上无反应，这可以通过用某些封闭基给核苷酸封端来达到，所述封闭基阻止磷酸酶使核苷酸脱去磷酸。在某些实施方案中，封端可以通过使烷基(例如甲基或乙基)与核苷酸的末端磷酸连接来达到。
在某些实施方案中，包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域的核酸序列是合成核酸序列。在某些实施方案中，核酸序列是脱氧核糖核酸(DNA)或寡脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，核酸序列的双链区域的长度是至少约14个核苷酸对。在某些实施方案中，能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域的长度是至少3个核苷酸。在某些实施方案中，双链DNA寡核苷酸在双链区域内包含RNA聚合酶的启动子，双链区域后是形成3′突出端的单链DNA序列的区段。
DNA寡核苷酸可以进一步包含转录起始位点。在某些实施方案中，包含3′突出端的双链DNA寡核苷酸包含胸苷残基串。在某些实施方案中，包含胸苷残基串的单链3′突出端区域与靶信使RNA(mRNA)聚腺苷酸尾的3′末端杂交。在某些实施方案中，能够与靶RNA序列杂交的核酸序列的单链3′末端区域包含位于3′末端处的修饰核苷酸。在某些实施方案中，修饰核苷酸能够阻断逆转录酶从3′末端的延伸反应。在某些实施方案中，修饰核苷酸是双脱氧核糖核苷酸。
核酸序列中的启动子序列可以包含由细菌RNA聚合酶(例如，大肠杆菌RNA聚合酶)识别的序列。在某些实施方案中，核酸序列中的启动子序列包含由来自噬菌体的RNA聚合酶识别的序列。来自噬菌体的RNA聚合酶的例子可以包括但不限于，T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。在某些实施方案中，核酸序列中的启动子序列包含噬菌体T7RNA聚合酶的启动子。
在某些实施方案中，通过酶促方法进行核酸序列的双链区域的5′末端与靶RNA序列的3′末端的连接，以形成连接的序列。在某些实施方案中，连接使用DNA连接酶来进行。合适的DNA连接酶可以包括但不限于，来自细菌或噬菌体的连接酶。在某些实施方案中，使用T4DNA连接酶来进行连接。在某些实施方案中，通过使用DNA连接酶来进行连接，所述DNA连接酶利用基本上抗磷酸酶的辅因子。此种连接酶的合适例子包括但不限于，依赖NAD+的DNA连接酶(ligA)。合适的依赖NAD+的DNA连接酶可以包括但不限于，来自大肠杆菌或分支杆菌属(Mycobacterium)的连接酶。在某些实施方案中，所使用的DNA连接酶是大肠杆菌连接酶。
在某些实施方案中，本发明的方法在等温条件下来进行，其中温度条件在扩增的每个循环期间保持基本上恒定。反应的合适温度是15-50℃。在某些实施方案中，本发明的方法在等温条件下进行，其中所选择的温度是25-40℃。
在某些实施方案中，本发明提供了用于在单个反应容器中指数式扩增和检测样品中的靶核糖核酸序列的方法。该方法包括步骤：a)扩增靶RNA序列以产生扩增的RNA序列，b)在引物和多磷酸链中包含3个或更多磷酸基的至少一个末端磷酸标记的核苷酸的存在下，对扩增的RNA序列进行核酸聚合酶反应，所述反应导致标记的多磷酸的产生；c)允许标记的多磷酸与磷酸酶反应以产生可检测种类；和d)检测可检测种类。在某些实施方案中，前述步骤同时进行。
RNA的扩增涉及基于启动子的扩增而不涉及c-DNA中间体。扩增包括步骤(i.)提供除聚腺苷酸外的靶RNA序列；(ii)提供一个或多个核酸序列，所述核酸序列包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域；(iii.)使核酸序列的单链3′末端区域与靶RNA序列杂交；(iv.)使核酸序列的双链区域的5′末端与靶RNA序列的3′末端连接，以形成连接的序列；(v.)用RNA聚合酶转录连接的序列，以形成扩增的反义、互补RNA序列。在某些实施方案中，使用扩增的反义互补RNA作为靶RNA序列重复步骤(i)-(iv)，以形成扩增的有义RNA序列。在某些实施方案中，能够与靶RNA序列杂交的核酸序列的单链3′末端区域包含位于3′末端处的修饰核苷酸。修饰核苷酸基本上阻止使用靶RNA序列作为模板经由逆转录酶从3′末端的延伸反应。在某些实施方案中，修饰核苷酸是双脱氧核糖核苷酸。
在某些实施方案中，核酸序列的双链区域的5′末端与靶RNA序列的3′末端的连接反应包含不依赖ATP的DNA连接酶。合适的不依赖ATP的DNA连接酶可以是但不限于，依赖烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD+)的DNA连接酶(lig A)，例如大肠杆菌连接酶或分支杆菌属连接酶。在某些实施方案中，所连接的序列的转录使用与磷酸酶基本上无反应的修饰核糖核苷酸(rNTPs)来进行。在一个实施方案中，修饰包括末端磷酸修饰，例如使末端磷酸基团烷基化。合适的烷基化基团包括但不限于甲基或乙基。
在某些实施方案中，核酸聚合酶反应包括扩增的RNA序列与逆转录酶和基本上抗磷酸酶的修饰脱氧核糖核苷酸(dNTPs)的温育。在一个实施方案中，脱氧核糖核苷酸的修饰包括末端磷酸修饰，例如末端磷酸基的烷基化。
本文还提供了包含实践本发明方法所需的试剂的试剂盒，其允许在单个反应容器中同时指数式扩增和检测样品中的靶RNA序列。在某些实施方案中，试剂盒包含：(a)至少一个核酸序列，其包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶核糖核酸序列杂交的单链3′末端区域，其中5’凹端是磷酸化的，并且末端3′末端用聚合酶延伸阻断剂进行封端；(b)在基本上抗磷酸酶的辅因子的存在下，能够使靶核糖核酸序列与核酸序列连接的连接酶；(c)基本上抗磷酸酶的核苷酸；(d)DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶、逆转录酶或其组合中的至少一种；和(e)至少一个或多个根据下式的末端磷酸标记的核苷酸：
B-S-Y-(P)n-P-L
其中P＝磷酸(PO3)及其衍生物，n是2或更大；Y是氧或硫原子；B是含氮杂环碱基；S是无环部分、碳环部分或糖部分；L是包含适合于在天然或修饰核苷酸的末端磷酸处形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基的酶可激活标记；P-L是磷酸化的标记，其优选在磷酸被去除时成为可独立检测的；和(f)磷酸酶。
在某些实施方案中，试剂盒中的核酸序列包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域的核酸序列是合成核酸序列。在某些实施方案中，试剂盒包含DNA寡核苷酸作为核酸序列。在某些实施方案中，核酸序列的双链区域长度为至少约14个核苷酸对，并且能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域长度为至少3个核苷酸。在某些实施方案中，试剂盒包含含有依赖DNA的RNA聚合酶的启动子序列的核酸序列。依赖DNA的RNA聚合酶的合适例子可以是但不限于T7RNA聚合酶、T4RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。
在某些实施方案中，试剂盒包含双脱氧核糖核苷酸作为聚合酶延伸阻断剂。在某些实施方案中，试剂盒包含具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为其辅因子的连接酶。依赖NAD+的连接酶的合适例子可以包括但不限于ligA、大肠杆菌连接酶和分支杆菌属连接酶。在某些实施方案中，试剂盒包含封端的核苷酸，其中封端阻止磷酸酶使核苷酸去磷酸化。在某些实施方案中，封端通过使烷基与核苷酸的末端磷酸连接来达到。在某些实施方案中，用于封端的烷基是甲基或乙基。
在某些实施方案中，试剂盒包含末端磷酸标记的脱氧核糖核苷酸。末端磷酸标记的核苷酸可以在多磷酸链中包含3个或更多磷酸。合适的例子包括但不限于，具有与末端磷酸连接的电化学标记、质量标记、比色染料或化学发光、或荧光标记的多磷酸核苷，例如多磷酸脱氧核糖核苷、多磷酸双脱氧核苷、多磷酸碳环核苷或多磷酸无环核苷及其类似物。
实施例
尽管本发明的某些特征已在本文中进行举例说明和描述，但本领域技术人员可以进行许多修饰和变化。因此，应当理解所附权利要求预期涵盖如包括在本发明的真正精神内的所有此种修饰和变化。呈现的实施例提供仅用于举例说明性目的，并且不应解释为限制如由所附权利要求限定的本发明的范围。下文和说明书其他地方给出的所有参考文献在此通过引用纳入包本文。
材料
水：在这些实施例中使用的所有水，包括用于制备电泳缓冲液的水，已用焦碳酸二乙酯(DEPC)进行处理，并且进行高压灭菌以去除任何污染RNA核酸酶。在连接或转录反应的制备中使用的水是DEPC处理的并且得自Ambion。
PT7IVS5(Qiagen Operon)寡核苷酸SEQ ID NO：1
5′-d[GTAATACGACTCACTATAGGGAG(T)24]-3′.
脱氧核糖寡核苷酸(寡核苷酸(oligo))由3部分组成。
1.T7RNA聚合酶的启动子序列以粗体指出(Lopez，等人1997)
2.具有5个碱基的间插序列(IVS)，或与聚(dT)序列起始的转录起始位点互补的序列以斜体指出。
3.具有24个碱基的聚(dT)序列(T24)，或用于“捕获”mRNA 3′聚(rA)尾的序列是加下划线的。
cPT7IVS5(Qiagen Operon)
寡核苷酸SEQ ID NO：2
5′-磷酸-d[AAAACTCCCTATAGTGAGTCGTATTAC]-3′
该寡核苷酸由4部分组成，并且是用于RNA合成的模板。
1.5′磷酸基参与和mRNA的3′羟基的共价键形成。
2.以斜体排成一列的4个dA残基促进mRNA的3′聚(rA)尾的杂交。
3.由RNA聚合酶转录的第一个碱基由加下划线的C指出。合成将朝向cPT7IVS5寡核苷酸的5′末端进行，进入连接的mRNA序列内。
4.与启动子序列互补的序列以粗体指出
PT7IVSI5(Qiagen Operon)
寡核苷酸SEQ ID NO：5
5′-d[AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG(T)24]-3′
该寡核苷酸由3部分组成。
1.T7RNA聚合酶的启动子序列以粗体指出。
2.具有15个碱基的IVS，或与聚(dT)序列起始的转录起始位点互补的序列是斜体的。
3.具有24个碱基的聚(dT)序列(T24)，或用于“捕获”mRNA 3′聚(rA)尾的序列是加下划线的。
cPT7IVSI5(Qiagen Operon)
寡核苷酸SEQ ID NO：4
5′-磷酸-d[AAAACCGTTGTGGTCTCCTATAGTGAGTCGTATTAATTT]-3′
该寡核苷酸由4部分组成，并且是用于RNA合成的模板。
1.5′磷酸基参与和mRNA的3′羟基的共价键形成。
2.以斜体排成一列的4个dA残基促进mRNA的3′聚(rA)尾的互补结合。
3.由RNA聚合酶转录的第一个碱基由加下划线的C指出。合成将朝向cPT7IVS5寡核苷酸的5′末端通过IVS进行，进入连接的mRNA序列内。
4.与启动子序列互补的序列以粗体指出。
RNA35(Dharmacon)
寡核苷酸SEQ ID NO：5
5′-r[UGUUG(U)3o]-3′
设计为测试连接和转录反应的合成RNA。这种分子的3′-羟基通过连接酶的作用变得与cPT7寡核苷酸(IVS5或IVS 15)的5′-磷酸基连接。
RNA65(Dharmacon)
寡核苷酸SEQ ID NO：6
5′-r[UACAACGUCGUGACUGGGAAAAC(A)42]-3′
设计为测试连接和转录反应的合成RNA。这种分子的3′-羟基通过连接酶的作用变得与cPT7寡核苷酸(IVS5或IVS15)的5′-磷酸基连接。
PT3w/T24(Qiagen Operon)
寡核苷酸SEQ ID NO：7
5′-d[AAATAATTAACCCTCACTAAAGGGAGACCACAACGG(T)24]-3′
该寡核苷酸由3部分组成。
1.T3RNA聚合酶的启动子序列以粗体指出(Ling M-L，等人1989)
2.具有15个碱基的IVS，或与聚(dT)序列起始的转录起始位点互补的序列是斜体的。
3.具有24个碱基的聚(dT)序列(T24)，或用于“捕获”mRNA 3′聚(rA)尾的序列是加下划线的。
cPT3(Qiagen Operon)
寡核苷酸SEQ ID NO：8
5′-磷酸-d[AAAACCGTTGTGGTCTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTATTT]-3′
该寡核苷酸由4部分组成，并且是用于RNA合成的模板。
1.5′磷酸基参与和mRNA的3′羟基的共价键形成。
2.以斜体排成一列的4个dA残基促进mRNA的3′聚(rA)尾的互补结合。
3.由RNA聚合酶转录的第一个碱基由加下划线的C指出。合成将朝向cPT7IVS5寡核苷酸的5′末端通过IVS进行，进入连接的mRNA序列内。
4.与启动子序列互补的序列以粗体指出。
寡核苷酸SEQ ID NO：9
ATCCG
该寡核苷酸是用于DNA合成的引物，并且是人工序列
寡核苷酸SEQ ID NO：10
TAGGCCGCTG
该寡核苷酸是用于DNA合成的模板，并且是人工序列
寡核苷酸SEQ ID NO：11
TAGGCTGCTG
该寡核苷酸是用于DNA合成的模板，并且是人工序列
实施例1：双链DNA与合成RNA的连接：
除大肠杆菌DNA连接酶(New England Biolabs；10单位/μL)外的所有连接反应组分如表1中所示进行混合。使反应于60℃加热5分钟，并且允许冷却至室温。将大肠杆菌DNA连接酶加入合适的管中，并且使反应于30℃温育2小时。每个反应通过添加1μL无RNA酶的0.5MEDTA(US Biochemicals，Inc.)得到终止。
表1.实施例1的连接反应制剂。
  组分↓/ID →  1  2  3   4  5  6   7
  水(Ambion)  16μL  15μL  16μL   15μL  14μL  13μL   15μL
  10X大肠杆菌连接酶缓冲液  2μL  2μL  2μL   2μL  2μL  2μL   2μL
  SUPERase In(Ambion 20单位/μL)  1μL  1μL  1μL   1μL  1μL  1μL   1μL
  PT7IVS15(15pmol/μL)  1μL  1μL   1μL
  CpT7IVS15(15pmol/μL)  1μL   1μL   1μL
  RNA35(16pmol/μL)  3μL  3μL
  大肠杆菌连接酶  1μL   1μL  1μL
  总体积  20μL  20μL  20μL   20μL  20μL  20μL   20μL
  组分↓/ID →   8  9   10   11  12
  水(Ambion)   14μL  12μL   11μL   15μL  14μL
  10X大肠杆菌连接酶缓冲液   2μL  2μL   2μL
  SUPERase In(Ambion 20单位/μL)   1μL  1μL   1μL   1μL  1μL
  PT7IVS15(15pmol/μL)   1μL  1μL   1μL   1μL  1μL
  CpT7IVS15(15pmol/μL)   1μL  1μL   1μL
  RNA35(16pmol/μL)  3μL   3μL   3μL  3μL
  大肠杆菌连接酶   1μL   1μL  1μL
  总体积   20μL  20μL   20μL   20μL  20μL
使每个反应的5微升样品与5μL凝胶加样缓冲液II(Ambion)混合，并且于95℃热变性2分钟。将完整量的每种样品加样到15％丙烯酰胺、7M尿素TBE凝胶(Invitrogen)的分开孔内，并且根据制造商的建议在室温下实施电泳。将样品分别以从左到右的数字顺序进行加样，其中散布DNA分子量标记。当溴酚蓝(BPB)加样染料在凝胶底部时，停止电泳。每种凝胶通过浸入在水中1∶200稀释的SYBR Gold Dye(MolecularProbes)中10分钟而进行染色。染色后凝胶用蒸馏水进行冲洗，并且通过在TyphoonTM 8600 Variable Mode Imager(Typhoon；GE HealthcareBio-Sciences)中扫描而显现DNA条带。
DNA分子量标记是100个碱基对的序列梯(0.5μg)、同型寡聚pd(A)40-60(1.25×10-3A260单位)和寡核苷酸大小区分标记(8-32个碱基；0.75μL；全部来自GE Healthcare Bio-sciences)的混合物。
凝胶使用绿色(532)激光和荧光素526SP发射滤波器进行扫描。结果显示连接反应的3种分开的核酸组分不形成自身连接产物：结果还显示完全反应中合适大小(75个碱基)的条带将是cPT7IVSI5和RNA35连接(DNA:RNA杂交物)的预期产物。
实施例2：3种不同的连接酶将使双链DNA与RNA连接。
除连接酶外的所有连接反应组分如表2中所示进行混合。使反应于60℃加热5分钟，并且允许冷却至室温。将不同的连接酶加入合适的管中，并且使反应于30℃温育2小时。每个反应通过添加1μL无RNA酶的0.5M EDTA(US Biochemicals，Inc.)得到终止。
表2.实施例2的连接反应制剂。10x连接缓冲液补充有酶。
  组分↓/ID→  1   2   3   4   5   6   7   8
  水  10μL   9μL   12μL   11μL   12μL   11μL   13μL   12μL
  10X大肠杆菌连接酶缓冲液  2μL   2μL
  10X T4DNA连接酶缓冲液   2μL   2μL
  10X T4RNA连接酶缓冲液   2μL   2μL   2μL   2μL
  SUPERase In(Ambion 20单位/μL)  1μL   1μL   1μL   1μL   1μL   1μL   1μL
  5mM NAD  2μL   2μL
  PT7IVS15(15pmol/μL)  1μL   1μL   1μL   1μL   1μL   1μL
  CpT7IVS15(15pmol/μL)  1μL   1μL   1μL   1μL   1μL   1μL   1μL   1μL
  RNA35(16pmol/μL)  3μL   3μL   3μL   3μL   3μL   3μL   3μL   3μL
  大肠杆菌连接酶(NEBL 400单位/μL)   1μL
  T4DNA连接酶(NEBL 400 Units/μL)   1μL
  T4RNA连接酶(NEBL 10单位/μL)   1μL   1μL
  总体积  20μL   20μL   20μL   20μL   20μL   20μL   20μL   20μL
使每个反应的5微升样品与5μL凝胶加样缓冲液II(Ambion)混合，并且于95℃热变性2分钟。将完整量的每种样品加样到15％丙烯酰胺、7M尿素TBE凝胶(Invitrogen)的分开孔内，并且根据制造商的建议在室温下实施电泳。将样品分别以从左到右的数字顺序进行加样，其中散布DNA分子量标记。当BPB加样染料在凝胶底部时，停止电泳。凝胶通过浸入在水中1∶200稀释的SYBR Gold Dye(Molecular Probes)中10分钟而进行染色。染色后凝胶在蒸馏水中进行冲洗，并且通过在Typhoon(GE Healthcare Bio-sciences)中扫描而显现DNA条带。图4是凝胶的荧光图像。凝胶使用与实施例1中相同的参数进行扫描。
泳道3中可见的DNA分子量标记是100个碱基对的序列梯(0.5μg)、同型寡聚pd(A)40-60(1.25×10-3A260单位)和寡核苷酸分筛标记(8-32个碱基；0.75μL；全部来自GE Healthcare Bio-sciences)的混合物。泳道1和2包含大肠杆菌连接酶DNA连接酶(分别为反应1和2)。泳道4和5包含T4DNA连接酶反应(分别为反应3和4)。泳道6-9包含T4RNA连接酶反应(分别为反应5、6、7和8)。在泳道2、5和7中可见连接产物，表明所有3种连接酶发挥作用，以使DNA 5′-磷酸基与RNA 3′-羟基连接。在泳道9中看不见连接产物(反应8)，推测是因为缺乏PT7IVSI5寡核苷酸，这种连接反应将花费很多时间以积聚产物。
实施例3：连接的RNA可以被转录。
除大肠杆菌DNA连接酶外的所有连接反应组分如表3中所示进行混合。使反应于60℃加热5分钟，并且允许冷却至室温。将大肠杆菌DNA连接酶加入合适的管中，并且使反应于16℃温育2小时。每个反应通过添加1μL无RNA酶的0.5M EDTA(US Biochemicals，Inc.)得到终止。
表3.实施例3的连接反应制剂。
  组分↓/ID→   1   2   3   4
  水(Ambion)   12μL   12μL   12μL   11μL
  10X大肠杆菌连接酶缓冲液   2μL   2μL   2μL   2μL
  SUPERase In(Ambion 20单位/μL)   1μL   1μL   1μL   1μL
  PT7IVS5(15pmol/μL)   1μL   1μL
  CpT7IVS5(5pmol/μL)   1μL   1μL
  PT7IVS15(15pmol/μL)   1μL   1μL
  CpT7IVS15(5pmol/μL)   1μL   1μL
  RNA35(5pmol/μL)   3μL   3μL   3μL   3μL
  大肠杆菌连接酶   1μL   1μL
  总体积   20μL   20μL   20μL   20μL
使每个反应的5微升样品与5μL凝胶加样缓冲液II(Ambion)混合，并且于95℃热变性2分钟。将完整量的每种样品加样到15％丙烯酰胺、7M尿素TBE凝胶(Invitrogen)的分开孔内，并且根据制造商的建议在室温下实施电泳。将样品连同RNA分子量标记(来自Ambion的DecadeTM Markers)分别以从左到右的数字顺序进行加样。当BPB加样染料在凝胶底部时，停止电泳。凝胶通过浸入在水中1∶200稀释的SYBRGold Dye(Molecular Probes)中10分钟而进行染色。染色后凝胶在蒸馏水中进行冲洗，并且通过在Typhoon(GE Healthcare Bio-sciences)中扫描而显现DNA条带。
凝胶使用与实施例1中相同的参数进行扫描。预期的连接产物分别从反应2和4(表3)中可见。
如表4中概述的，使用反应2和4的等分试样以及MEGAscriptTM T7试剂盒(Ambion)来完成扩增。将所有组分混合在一起，并且于37℃温育1小时。
表4.实施例3的扩增反应。
  组分↓/ID →   1   2   3   4
  水(Ambion)   2.6μL   0.6μL   2.6μL   0.6μL
  10X反应缓冲液   2μL   2μL   2μL   2μL
  SUPERase In(Ambion 20单位/μL)   1μL   1μL   1μL   1μL
  实施例3反应2   4μL   4μL
  实施例3反应4   4μL   4μL
  20mM MgCl2   4μL   4μL   4μL   4μL
  10mM NTP混合物   6.4μL   6.4μL   6.4μL   6.4μL
  T7酶混合物   2μL   2μL
  总体积   20μL   20μL   20μL   20μL
温育后，扩增反应2和4各自分成相同的等分试样。每个反应的一个等分试样具有添加的0.5μL 0.5M EDTA，并且贮存在冰上直至凝胶分析。其余等分试样于70℃加热5分钟，以灭活SUPERase In。每个加热的等分试样具有添加的1μL RNA酶A(44单位；US Biochemical，Inc.)，并且于37℃温育10分钟。RNA酶消化各自通过添加0.5μL 0.5M EDTA得到终止。使每个反应的5微升样品与5μL凝胶加样缓冲液II(Ambion)混合，并且于95℃热变性2分钟。将完整量的每种样品加样到15％丙烯酰胺、7M尿素TBE凝胶(Invitrogen)的分开孔内，并且根据制造商的建议在室温下实施电泳。当BPB加样染料距离凝胶底部约2cm时，停止电泳。凝胶通过浸入在水中1∶200稀释的SYBR Gold Dye(MolecularProbes)中10分钟进行染色。染色后凝胶在蒸馏水中进行冲洗，并且通过在Typhoon(GE Healthcare Bio-sciences)中扫描而显现DNA条带。凝胶使用与实施例1中相同的参数进行扫描。
一般而言，分别来自反应2和4的转录反应产物是T7RNA聚合酶(RNAP)反应的典型转录反应产物。观察到预期的9个核苷酸(nt)的失控转录物位于BPB染料上。这种短的失控转录物起因于从连接反应遗留下来的未连接的PT7IVS5和cPT7IVS5寡核苷酸。已知T7RNAP在失控反应中执行1个核苷酸的非模板添加(Arnaud-Barbe，等人1998)，并且这仅在9nt产物上可见。此外，还已知RNAP与双链DNA启动子结合后，经历流产转录循环(Lopez，等人1997)，直至已合成足够长的新生转录物，用于聚合酶清除启动子。在反应2中在9nt产物下观察到流产转录产物。令人惊讶的是，这种反应不包含预期大小范围为44nt的失控转录物。相反在凝胶中观察到更高的RNA污染，暗示产物大小的杂分散群体(非特异性产物)。RNA污染在用RNA酶A处理后消失，但DNA条带保留。这种污染是T7RNAP的另一种特性(Macdonald，等人，1993)，并且起因于在聚合过程中酶沿着同聚模板向前和向后滑动。
在包含PT7IVSI5和cPT7IVSI5寡核苷酸的转录中观察到相同类型的反应产物。观察到来自连接反应的未连接寡核苷酸的遗留的预期的19nt失控转录物以及更小的流产转录物。然而，核苷酸(nt)的非模板添加是模糊的，这看起来是由于当聚合酶进入DNA:RNA杂交物的RNA部分时，聚合酶的停顿(stuttering)。此外，未观察到预期的75nt转录物大小，而是观察到了RNA污染，其用RNA酶A处理后消失。RNA污染在某些反应中密度增高，暗示更长的IVS允许RNAP更有效地进入DNA:RNA杂交物的RNA部分。
实施例4：双链DNA与mRNA的连接和扩增。
所有组分如表5中所示进行混合，并且于30℃温育15分钟。在这个实施例中不包括退火步骤。除cPT7IVSI5与RNA35的连接外，骨骼肌聚腺苷酸RNA(smRNA；Russian Cardiology Research and DevelopmentCenter)也用作这种系统的连接靶。每个反应通过添加1μL无RNA酶的0.5M EDTA(US Biochemicals，Inc.)得到终止。
表5.实施例4的连接反应制剂。10x连接缓冲液和T4DNA连接酶已证明是无RNA酶的，并且由Takara提供。
  组分↓/ID →   1   2   3   4   5
  水(Ambion)   3.9μL   6.6μL   2.9μL   3.9μL   2.9μL
  10X连接缓冲液   2μL   2μL   2μL   2μL   2μL
  SUPERase In   1μL   1μL   1μL   1μL   1μL
  PT7IVS15(15pmol/μL)   1μL   1μL   1μL   1μL
  cPT7IVS15(5pmol/μL)   2.7μL   2.7μL   2.7μL   2.7μL
  SmRNA(1μg/μL)   1μL   1μL   1μL
  RNA35(16pmol/μL)   1μL   1μL
  50％PEG 8000   8.4μL   8.4μL   8.4μL   8.4μL   8.4μL
  T4DNA连接酶(350单位/μL)   1μL   1μL   1μL
  总体积   20μL   20μL   20μL   20μL
使每个反应的5微升样品与5μL凝胶加样缓冲液II(Ambion)混合，并且于95℃热变性2分钟。将完整量的每种样品加样到15％丙烯酰胺、7M尿素TBE凝胶(Invitrogen)的分开孔内，并且根据制造商的建议在室温下实施电泳。当BPB加样染料距离凝胶底部约2cm时，停止电泳。凝胶通过浸入在水中1∶200稀释的SYBR Gold Dye(Molecular Probes)中10分钟而进行染色。染色后凝胶在蒸馏水中进行冲洗，并且通过在Typhoon(GE Healthcare Bio-sciences)中扫描而显现DNA条带。凝胶使用与实施例1中相同的参数进行扫描。寡核苷酸与RNA35的预期连接产物在反应5中可见。
如表6中概述的，使用反应1和3的等分试样以及MEGAscriptTMT7试剂盒(Ambion)来完成扩增。将所有组分混合在一起，并且于37℃温育1小时。
表6.实施例4的反应。
  组分
  75mM ATP   2.8μL
  75mM CTP   2.8μL
  75mM GTP   2.8μL
  75mM UTP   2.8μL
  总体积   11.2μL
反应设置
  组分↓/ID →   1   2
  NTP混合物   11.2μL   11.2μL
  水   15.8μL   15.8μL
  10x转录缓冲液   4μL   4μL
  SUPERase In   1μL   1μL
  连接#1   4μL
  连接#3   4μL
  T7酶混合物   4μL   4μL
  总体积   40μL   40μL
反应通过添加1μL 0.5M EDTA各自得到终止。使每个反应的5微升样品与5μL凝胶加样缓冲液II(Ambion)混合，并且于95℃热变性2分钟。将完整量的每种样品加样到15％丙烯酰胺、7M尿素TBE凝胶(Invitrogen)的分开孔内，并且根据制造商的建议在室温下实施电泳。当BPB加样染料距离凝胶底部约2cm时，停止电泳。凝胶通过浸入在水中1∶200稀释的SYBR Gold Dye(Molecular Probes)中10分钟而进行染色。染色后凝胶在蒸馏水中进行冲洗，并且通过在Typhoon(GEHealthcare Bio-sciences)中扫描而显现DNA条带。凝胶使用与实施例1中相同的参数进行扫描。图5是凝胶的荧光图像。
图5中的泳道1和3显示失控和流产转录物以及单碱基非模板核苷酸添加，如同实施例3中观察到的。当与泳道1(反应1，表6)比较时，在泳道3(反应2，表6)中的凝胶顶部处的RNA污染，连同失控转录物的强度的相对减少，暗示这种系统(反应2，表6)退火、连接双链DNA RNAP启动子与mRNA以及由DNA:mRNA杂交物转录互补RNA的能力。
实施例5：使用γ磷酸标记的双脱氧核苷酸ddGTP的聚合酶掺入来检测核酸序列
使用γ-(4-三氟甲基香豆素基)ddGTP(ddGTP-CF3-香豆素)，反应在室温(23℃)下进行组装。反应包含具有单个寡核苷酸引物(由SEQID NO：9所示)的引物模板组合，所述引物与2个的不同寡核苷酸模板之一退火，所述模板具有dC或dT作为邻接引物的3′末端的下一个模板核苷酸，所述2个不同的寡核苷酸模板分别对应于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。
关于本实施例中的模板1(SEQ ID NO：10)现在参考图6，DNA聚合酶将预期用标记的ddGTP来延伸引物。类似地，对于图6中的模板2(SEQ ID NO：11)，DNA聚合酶将预期用ddATP而不是用标记的ddGTP来延伸引物。
反应条件：使包含25mM Tris，pH8.0、5％甘油、5mM MgCl2、0.5mM β-巯基乙醇、0.01％tween-20、0.25单位虾碱性磷酸酶、100nM与模板退火的引物(如所指示的，下一个模板核苷酸是dCMP或dTMP)和2μM ddGTP-CF3-香豆素的70μl反应在以时间驱动模式操作的LS-55发光分光光度计(Perkin Elmer)中，在石英荧光超微比色皿(ultra-microcuvet)中进行组装。激发和发射波长分别为390nm和500nm。缝宽对于激发缝为5nm，对于发射缝为15nm。反应通过添加0.35μl(11单位)克隆的DNA聚合酶I和0.25mM MnCl2来起始，所述DNA聚合酶I进行遗传改造以消除3′-5′核酸外切酶活性、5′-3′核酸外切酶活性和对双脱氧核苷酸的区分。
如图6中所示，对于包含γ标记的ddGTP的反应，仅用引物：模板1检测出染料发射，其中模板中的下一个核苷酸是dC。通过虾碱性磷酸酶的磷酰基转移的焦磷酸产物的切割导致CF3-香豆素标记的可检测变化，这使得能够检测核酸。用引物：模板2未获得可检测的染料发射。
实施例6：使用γ磷酸标记的双脱氧核苷酸ddATP的聚合酶掺入来检测核酸序列
使用双脱氧核苷酸，即γ-(3-香豆素基)ddATP(ddATP-CN-香豆素)，反应在室温(23℃)下进行组装。反应包含具有单个寡核苷酸引物(SEQID NO：9)的引物：模板组合，所述引物与2个不同的寡核苷酸模板之一退火，所述模板具有dC或dT作为邻接引物的3′末端的模板核苷酸，所述2个不同的寡核苷酸模板分别对应于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。
关于本实施例中的模板2(SEQ ID NO：11)现在参考图7，DNA聚合酶将预期用标记的ddATP来延伸引物。类似地，对于图7中的模板1(SEQ ID NO：10)，DNA聚合酶将预期用ddGTP而不是用标记的ddATP来延伸引物。
反应条件：使包含25mM Tris，pH8.0、5％甘油、5mM MgCl2、0.5mM β-巯基乙醇、0.01％tween-20、0.25单位虾碱性磷酸酶、100nM与模板退火的引物和2μM ddGTP-CF3-香豆素的70μl反应在以时间驱动模式操作的LS-55发光分光光度计(Perkin Elmer)中，在石英荧光超微比色皿(ultra-microcuvet)中进行组装。激发和发射波长分别为410nm和450nm。缝宽对于激发缝为5nm，对于发射缝为15nm。反应通过添加0.35μl(11单位)克隆的DNA聚合酶I和0.25mM MnCl2来起始，所述DNA聚合酶I进行遗传改造以消除3′-5′核酸外切酶活性、5′-3′核酸外切酶活性和对双脱氧核苷酸的区分。
如图7中所示，对于包含γ标记的ddATP的反应，仅对于引物：模板2检测出染料发射，其中模板中的下一个核苷酸是dT。通过虾碱性磷酸酶的磷酰基转移的焦磷酸产物的切割导致CN-香豆素标记的可检测变化，这使得能够检测核酸。用引物：模板1未获得可检测的染料发射。
实施例7：使用末端磷酸标记的核苷酸在单个反应容器中同时扩增和检测RNA
反应条件：将下述组分混合在一起并且在板读数仪中于37℃温育。缓冲液(50mM Tris：HCl，pH＝8.0、7mM MgCl2、1mM DDT、0.01％tween-20)、20ng靶RNA、30pmoles启动子/引物构建体(具有磷酸化的5′凹端和3′双脱氧延伸阻断剂)、100微摩尔NAD、1单位大肠杆菌DNA连接酶、200微摩尔封端的核糖核苷酸(例如rN4P-甲基)、20单位T7RNA聚合酶、20pmoles目的RNA的特异性引物、20单位MMLV逆转录酶、200微摩尔末端磷酸标记的核苷酸(例如dN4P-DDAO)和0.1单位细菌碱性磷酸酶。
来自磷酸酶的信号的发展可以使用肉眼或自动化装置进行观察，所述自动化装置例如具有646nm的激发波长和659nm的发射波长的板读数仪。
等同方案
本发明可以以其他具体形式体现，而不背离其精神或基本特征。前述实施方案因此在所有方面被视为举例说明性的，而不是本文描述的本发明的限制。本发明的范围因此由所附权利要求而不是前述说明书指出，并且在权利要求等同的意义和范围内的所有变化因此预期包含在其中。
序列表
<110>GENERAL ELECTRIC COMPANY
     NELSON，John R.
     DUTHIE，Robert Scott
<120>连接扩增
<130>PG07005
<150>US 11/620,804
<151>2007-01-08
<160>11
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>1
gtaatacgac tcactatagg gagt                          24
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>2
aaaactccct atagtgagtc gtattac                       27
<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>3
aaattaatac gactcactat agggagacca caacggt            37
<210>4
<211>39
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>4
aaaaccgttg tggtctccta tagtgagtcg tattaattt               39
<210>5
<211>7
<212>RNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>5
ruguugu                                                  7
<210>6
<211>24
<212>RNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>6
uacaacgucg ugacugggaa aaca                               24
<210>7
<211>37
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>7
aaataattaa ccctcactaa agggagacca caacggt                 37
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>8
aaaaccgttg tggtctccct ttagtgaggg ttaattattt              40
<210>9
<211>5
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>9
atccg                                       5
<210>10
<211>10
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>10
taggccgctg                                  10
<210>11
<211>10
<212>DNA
<213>扩增序列
<220>
<223>合成引物
<400>11
taggctgctg                                  10

Claims (33)

1.用于产生标记的、扩增的RNA序列的方法，其包括：
(a)扩增靶RNA序列以产生扩增的RNA序列；和
(b)在至少一个末端磷酸标记的核苷酸的存在下，使扩增的RNA序列与核酸聚合酶反应，以产生标记的多磷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述扩增的RNA序列是所述靶RNA序列的反义cRNA。
3.权利要求1的方法，其中所述扩增的RNA序列与所述靶RNA序列同义。
4.通过扩增靶RNA序列以产生扩增的RNA序列，从而检测样品中靶RNA序列的存在的方法，其包括步骤：
(a)提供除聚腺苷酸外的靶RNA序列；
(b)提供一个或多个核酸序列，所述核酸序列包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶RNA序列杂交的单链3′末端区域；
(c)使所述核酸序列的单链3′末端区域与所述靶RNA序列杂交；
(d)使所述核酸序列的双链区域的5′末端与所述靶RNA序列的3′末端连接，以形成连接的序列；
(e)用RNA聚合酶转录所述连接的序列，以形成扩增的反义、互补RNA序列；和
(f)任选使用所述扩增的反义互补RNA作为靶RNA序列执行步骤(a)-(e)，以形成扩增的有义RNA序列。
5.权利要求4的方法，其进一步包括下述步骤：在多磷酸链中具有3个或更多磷酸基的至少一个末端磷酸标记的核苷酸的存在下，使所述扩增的RNA序列与聚合酶反应，以产生标记的多磷酸。
6.权利要求1或5的方法，其进一步包括检测所述标记的多磷酸的步骤(c)。
7.权利要求6的方法，其中所述扩增步骤和检测步骤在单个反应容器中进行。
8.权利要求6的方法，其中所述步骤基本上同时发生。
9.权利要求1或4的方法，其中所述靶RNA序列是杂聚的。
10.权利要求1或5的方法，其中所述反应步骤包括使所述扩增的RNA序列与逆转录酶、核苷酸和引物一起温育。
11.权利要求10的方法，其中所述引物与所述扩增的RNA序列的内部序列互补。
12.权利要求10的方法，其中所述引物包含约10-约40个核苷酸。
13.权利要求10的方法，其中所述核苷酸进行结构修饰，以与磷酸酶基本上无反应。
14.权利要求6的方法，其中所述标记的多磷酸与磷酸酶反应以产生可检测种类，并且检测所形成的可检测种类。
15.权利要求14的方法，其中所述可检测种类以与所述靶RNA序列的量基本上成比例的量产生。
16.权利要求6的方法，其进一步包括对所述靶RNA序列进行定量的步骤。
17.权利要求1的方法，其中所述靶RNA序列的扩增包括：
提供除聚腺苷酸外的靶RNA序列；
提供一个或多个核酸序列，所述核酸序列包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与所述靶RNA序列杂交的单链3′末端区域；
使所述核酸序列的单链3′末端区域与所述靶RNA序列杂交；
使所述核酸序列的双链区域的5′末端与所述靶RNA序列的3′末端连接，以形成连接的序列；和
用RNA聚合酶转录所述连接的序列，以形成扩增的反义、互补RNA序列。
18.权利要求15的扩增方法，其进一步包括：
(a)提供所述扩增的反义、互补RNA序列；
(b)提供一个或多个核酸序列，所述核酸序列包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与所述反义、互补RNA序列杂交的单链3′末端区域；
(c)使所述核酸序列的单链3′末端区域与所述反义、互补RNA序列杂交；
(d)使所述核酸序列的双链区域的5′末端与所述反义、互补RNA序列酸的3′末端连接，以形成第二种连接的序列；和
(e)用RNA聚合酶转录所述第二种连接的序列，以形成与所述靶核酸序列同义的扩增的RNA序列。
19.权利要求4或17的方法，其中所述核酸序列包含DNA。
20.权利要求4或17的方法，其中所述核酸序列的5′凹端是磷酸化的，并且所述末端单链3′末端用双脱氧延伸阻断剂进行封闭。
21.权利要求19的方法，其中所述核酸序列的单链3′末端区域长度是至少3个核苷酸。
22.权利要求19的方法，其中所述核酸序列的双链区域长度是至少14个核苷酸对。
23.权利要求4或17的方法，其中所述连接步骤是酶促进行的。
24.权利要求4或17的方法，其中所述RNA聚合酶是依赖DNA的RNA聚合酶。
25.权利要求24的方法，其中所述依赖DNA的RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
26.权利要求23的方法，其中所述酶是DNA连接酶。
27.权利要求26的方法，其中所述DNA连接酶是依赖NAD+的连接酶。
28.权利要求26的方法，其中所述DNA连接酶是大肠杆菌连接酶。
29.权利要求26的方法，其中所述DNA连接酶是T4 DNA连接酶。
30.权利要求4的方法，其进一步包括基于所述检测来鉴定表征所述靶RNA序列。
31.用于同时扩增和检测样品中的靶RNA序列的试剂盒，其包含：
至少一个核酸序列，其包含含有RNA聚合酶的启动子序列的双链区域，以及能够与靶核糖核酸序列杂交的单链3′末端区域，其中5’凹端是磷酸化的，并且末端单链3′末端用聚合酶延伸阻断剂进行封端；
在基本上抗磷酸酶的辅因子的存在下，能够使所述靶RNA序列与所述核酸序列连接的连接酶
基本上抗磷酸酶的核苷酸；
RNA聚合酶、核酸外切酶、逆转录酶或其组合中的至少一种；
一个或多个根据下式的末端磷酸标记的核苷酸：
B-S-Y-(P)n-P-L
其中P＝磷酸(PO3)及其衍生物，n是2或更大；Y是氧或硫原子；B是含氮杂环碱基；S是无环部分、碳环部分或糖部分；L是包含适合于在天然或修饰核苷酸的末端磷酸处形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基的酶可激活标记；P-L是磷酸化的标记，其优选在所述磷酸被去除时成为可独立检测的；和
磷酸酶。
32.权利要求31的试剂盒，其中所述聚合酶延伸阻断剂是双脱氧核苷酸。
33.权利要求31的试剂盒，其中所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸和/或其类似物。
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