CN101574340A - 杜鹃素及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杜鹃素及其盐的新用途，具体为其在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明通过体外细胞实验表明对多种肿瘤细胞的增殖具有明显抑制作用，能不可逆的抑制多组织来源的恶性肿瘤细胞，而对人正常细胞影响较小，在高浓度剂量时对正常肝细胞有一定促增殖作用；通过对小鼠移植性肿瘤体内实验，表明杜鹃素对小鼠移植性肿瘤具有一定程度的治疗作用：常规腹腔给药，抑制率可达30％以上，总之杜鹃素具有良好的抗肿瘤活性，同时具有低毒，副作用小等特点，且可工业化合成，价格低廉，可与普通药用载体或赋形剂组合用于制备抗肿瘤临床用药，从而为临床治疗肿瘤提供新的方法和手段，为临床用药开辟新的方向。此外，杜鹃素的盐类物质同样具有抗肿瘤活性。

Description

杜鹃素及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于天然化合物新用途领域，具体为杜鹃素及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

抗肿瘤药物的研究属于药物研究领域的研究热点，现阶段的研究主要集中于烷化剂类、金属类、天然来源活性成份及其衍生物类等，前两种研究较为成熟，临床运用较广，但药物副作用较大，对人体正常细胞同样有抑制作用；后者现在研究较多，但作用大多较弱，运用到临床的较少。天然来源活性成份及其衍生物用于抗肿瘤的药物主要有喜树碱、紫杉醇等，喜树碱对胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤均有一定疗效，但副作用明显，紫杉醇是近年来运用较多的植物提取类抗肿瘤药物，具有疗效好，副作用小等优点，但价格昂贵，难以大量运用。

杜鹃素又名法尔杜鹃素，英文名为：Farrerol，其结构式如下：

属二氢黄酮类物质，天然存在于杜鹃花科植物兴安杜鹃(Rhododendron dauricum L.)的叶等植物，本品已报道的体外实验表明：能抑制小鼠气管-肺组织呼吸，主要作用于吡啶核苷酸的酶体系。同时本品为满山红(兴安杜鹃叶)治疗气管炎的有效成分，祛痰效果较好，止咳次之，平喘效果较差，有抗炎症作用，其药理作用为能促进兔气管粘液--纤毛运动，即有促进呼吸道机械清除异物的功能，能使正常及熏SO₂小鼠及小鼠呼吸道排出的总蛋白量减少，在临床上有其积极意义，因为老年气管炎患者持续大量吐痰，常常是造成低蛋白症和慢性消耗的原因。另外，本品能对皮肤烫伤性炎症渗出有一定抑制作用，表现为皮片水肿程度减轻，染料渗出减少，其作用强度随剂量增加而递减。总之，杜鹃素早期主要用于慢性支气管炎及抗菌作用，目前临床应用仍主要局限于祛痰作用。杜鹃素的研究已经有几十年的历史，国内对杜鹃素的研究较为充分，目前，国内外对于杜鹃素的活性研究及临床应用仍停留在用于呼吸系统疾病的治疗，然而，随着祛痰平喘新药的不断涌现，其临床运用也逐渐减少。

目前国内外对黄酮类物质的活性研究较多，发现多种对抑制肿瘤细胞增生及促进肿瘤细胞凋亡的天然产物。而作为微黄酮类——二氢黄酮类物质，对其抗肿瘤活性研究的报道较少，这与其在天然植物中含量较少，不易获得有关。到目前为止，对于杜鹃素的抗肿瘤活性药理作用国内外尚无相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杜鹃素及其盐的新用途，具体是其在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了更好地理解本发明的新用途的实质内容，以下将用杜鹃素的药理实验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的天然产物单一成分——杜鹃素，将其配制成不同浓度的溶液，通过体外细胞实验(利用MTT分析法，将杜鹃素溶液与肿瘤细胞共培养，加入MTT做试剂，反应4小时，除去培养液，加入二甲基亚砜，然后在490nm处检测吸光度，判断药物活性)，表明对多种肿瘤细胞的增殖具有明显抑制作用，能不可逆的抑制多组织来源的恶性肿瘤细胞，而对人正常细胞影响较小，在高浓度剂量时对正常肝细胞有一定促增殖作用；此外，通过对小鼠移植性肿瘤体内实验(通过腹腔注射给药检测对小鼠移植性肿瘤是否存在抑制作用)，表明杜鹃素对小鼠移植性肿瘤具有一定程度的治疗作用：常规腹腔给药，抑制率可达30％以上。

总之杜鹃素具有良好的抗肿瘤活性，同时具有低毒，副作用小等特点，且可工业化合成，价格低廉，可与普通药用载体或赋形剂组合用于制备抗肿瘤临床用药，从而为临床治疗肿瘤提供新的方法和手段，为临床用药开辟新的方向。此外，杜鹃素的盐类物质同样具有抗肿瘤活性，其碱性阳离子可以是K⁺、Na⁺、Li⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺可供药用的离子及二乙胺、胆碱等，也可与与普通药用载体或赋形剂组合用于制备通过不可逆地杀伤肿瘤细胞所起作用的抗肿瘤药物。

具体实施方式

实施例1：杜鹃素注射液具有抗肿瘤活性

1、实验方法：

1.1体外细胞活性实验

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50％的N，N-二甲基甲酰胺和20％的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT法实验步骤：

1、接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液(此细胞可以分别是下列实验中涉及的SGC-7901胃癌细胞，HepG-2肝癌细胞，正常人体肝细胞)以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul；

2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)；

3、将杜鹃素用乙醇溶解，稀释至规定浓度，用微量移液枪移入96孔板中；96孔板中按照标准实验方法设置空白对照组，不同给药浓度组；

4、呈色：培养1～3天后，每孔加MTT溶液20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解；

5、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2小鼠体内抑瘤实验

1.2.1H₂₂荷瘤小鼠造模方法

无菌抽取腹腔接种H₂₂瘤株7～10天后小鼠腹水，用生理盐水(3∶1)稀释，置无菌容器内混匀，腹水呈乳白色半透明时，取0.1ml于玻璃片上，并取0.2％台酚蓝，加至台酚兰浓度约0.02％，涂片，光镜下计数，活细胞数应多于95％。取肿瘤细胞悬液，无菌条件下接种于体重18～22克昆明种小鼠右腋皮下，每只0.2ml。所有被接种小鼠均腹腔注射青霉素2000IU/只，然后随机分组。

1.2.2小鼠H₂₂肉瘤的实验治疗

将杜鹃素配成不同浓度的注射液，每鼠腹腔注射1ml；阴性对照注射生理盐水，连续7天给药，阳性组对照药采用环磷酰胺，最后一次给药后24小时，颈椎脱臼处死小鼠，称体重，剥去瘤块，称瘤重。

2、实验结果计算及统计分析：

3、结果：

3.1杜鹃素对多种肿瘤细胞具有抑瘤活性，对人体正常细胞影响较小。杜鹃素对SGC-7901人胃癌细胞、HepG-2肝癌细胞均有较强的抑制作用，并随剂量增加和作用时间延长，抑制率升高，具体实验结果见表1、表2。对人体正常细胞如：正常肝细胞无抑制作用，高浓度时反有一定增殖作用，具体实验结果见表3。

表1  杜鹃素不同浓度及时间对SGC一7901细胞抑制率的影响(％；x±s)

注：相同浓度、不同作用时间各组间比较：aP＜0.01；相同作用时间、不同浓度各组间比较：bP＜0.01。

表2  杜鹃素不同浓度对人体HepG-2肝癌细胞抑制率的影响(％；x±s)

注：不同浓度各组间比较：P＜0.01

表3  杜鹃素不同浓度对正常肝细胞抑制率的影响(％；x±s)

注：不同浓度各组间比较：P＜0.01

3.2杜鹃素注射液对小鼠移植性肿瘤具有抑制作用

杜鹃素对小鼠H₂₂肉瘤有明显抑制作用，在剂量为50mg/kg时，抑瘤率可达30％。用药组小鼠和对照组小鼠体重没有明显差异，未见小鼠外观、活动状态等方面的异常，具体实验结果见表4。

表4  杜鹃素对昆明小鼠H₂₂肉瘤的体内抗肿瘤作用

＊腹腔注射，连续7天给药

4、结论：

在体外细胞实验中，杜鹃素溶液能抑制人胃癌细胞SGC-7901、HepG-2肝癌细胞的生长，且随用药时间的增长，抑制率增加；对人体正常细胞如正常肝细胞无抑制作用，在高浓度时有一定增殖作用，呈现一定的选择性；昆明种小鼠，腹腔注射杜鹃素注射液(50mg/kg)，连续7天给药，在给药期间动物体重增加，且无其它明显不良反应，说明杜鹃素毒性较小，同时具有抑瘤活性，抑瘤率可达30％，统计学差异显著。随给药剂量的增大，抑瘤作用有增加的趋势。

总之，从以上实施例可以看出，本发明对已知天然产物-杜鹃素及其盐发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

Claims (1)

1、一种杜鹃素及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用。