CN101570733B - 耐酸性霉菌的培养分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物培养分离技术，具体为一种耐酸性霉菌的培养分离方法。解决现有技术中存在的微生物琼脂培养基在低PH值下不易凝固、不易划线、不易涂布而导致不利于嗜酸霉菌的单菌种的分离的问题。方法的主要特点是使用渗透了活性碳的滤纸代替凝胶作为支撑物质，从而避免了现有方法的不可控性，使目的微生物易于成单菌落分离，操作方便，适于生长环境pH值较低的真菌类微生物的分离。

Description

耐酸性霉菌的培养分离方法

技术领域

本发明涉及一种微生物培养分离技术，具体为一种耐酸性霉菌的培养分离方法。

背景技术

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。在现行的教课书中，如《微生物学实验》(高等教育出版社1980.11.42)中记载了微生物分离纯化的原理和方法：采用平板分离法，，一般包括两个方面：一是选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该特定微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。二是将混合的微生物稀释后在固体培养基生长形成若干个单个菌落，每个菌落可以认为是一个菌体细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落再培养而达到分离纯化的目的。该方法操作简便，用于微生物的分离与纯化。

中国科学院微生物研究所编写的《常见与常用真菌》(科学出版社.1973.8.270)中记载的方法有划线法和稀释法，使用的平板均为琼脂平板，其划线法为：将固体培养基熔化，冷却至45℃，注入无菌培养皿中，稍微摇转，静置，使成平板备用。取分离物少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使微生物悬浮于水中。将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸一环上述悬浮液，在平板上划线。划线完毕，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养一定时间，挑取单菌落。稀释法操作过程为：取无菌水若干管，每管含有无菌水，用笔分别标记顺序号。然后取样品，投入第1号管内，振摇，使悬浮均匀。再从1号管中吸取定量悬浮液注入2号管，并将2号管摇动，使悬浮液均匀，根据需要稀释的倍数同样类推。然后将稀释后的含菌液注入二个无菌培养皿中，再加入熔化后冷至45℃的培养基，在桌面上摇转，静置，使凝成平板，然后倒置于恒温培养箱中培养一定时间，挑取单菌落。

专利申请号为94103474.7公开了一种微生物分离培养方法，要点是将含目的微生物的自然物质，置于适量容积的灭菌容器中，用无菌水或培养液浸提出适量含菌液，置于特定频率特定电场强度的条件下培养分离，用不同的电场条件，即可得到相应的目的微生物。本发明分离培养微生物迅速准确，变异极小，保持了野生型的特性。专利申请号为200680008409.1公开了一种用于分离微生物的方法和装置特点是在所述培养基的提取物中加入给定数量的磁性或可磁化粒子，孵育所述粒子和所述培养基一段足够长时间以使所述微生物生长并附着到所述粒子的表面，从所述培养基中分离所述粒子，在与所述微生物生长相容的一种载体上铺开所述粒子，在一种载体上孵育所述粒子一段足够长时间是对应于所分离的微生物的菌落生长。

以上所有的方法都离不开培养基，常规微生物固体分离培养基都选用琼脂作为凝固剂。琼脂具有很强的凝固性，且无臭、无味，吸水性和持水性高，具有特殊的凝固点和熔点，所含成分很难被微生物分解利用，不含抑制性成分，非常适合用于微生物培养基的制备。但溶液的PH值对其凝固性有影响。培养基处于酸性条件下时，灭菌温度、灭菌时间与凝固性呈负相关，琼脂量、PH值与凝固性呈正相关。所以常规分离培养基PH控制在3.5以上，而一些耐酸菌如红曲霉生长最适PH为3-5，能耐PH2.5的酸性环境。在这样的酸性条件下，琼脂则不会凝固。例如贾秀玲在《山西食品工业》(1998(4)：10-11)发表的文章——PH值对琼脂凝固性能的影响初探一文中，通过实验论述了2％的琼脂在不同PH值下灭菌后的凝固性，指出PH值低于4时，琼脂失去凝固能力。所以在分离耐酸菌类过程中，只有得到有一定硬度的固体培养基，才有利于物质的扩散和微生物对物质的吸收，有利于划线，涂布和影印等技术的操作。

发明内容

本发明为了解决现有技术中存在的微生物琼脂培养基在低PH值下不易凝固、不易划线、不易涂布而导致不利于嗜酸霉菌的单菌种的分离的问题提供了一种耐酸性霉菌的培养分离方法。

本发明是由以下技术方案实现的，一种耐酸性霉菌的培养分离方法，包括以下步骤：

1、先将被分离物稀释，

2、工具处理：将粉末活性炭过80目标准筛，然后铺在滤纸上，再压住活性炭往复涂擦，使活性炭颗粒渗透到滤纸纤维中，并使滤纸由白色变为均匀的黑色，涂好后，将滤纸上多余的活性炭弹掉，并裁剪成符合培养皿规格的圆形，使其能放在培养皿中。滤纸可叠放多层，以利吸收更多液体培养基。将这种培养皿高温杀菌，杀菌条件按常规方法。涂布用玻璃棒的处理方法：将涂布用玻棒与培养基接触的一端用脱脂棉缠绕，并固定，常规方式灭菌。划线用接种环的处理方法：将接种环一端用脱脂棉缠绕，常规方式灭菌。

3、在无菌条件下，用无菌移液管将灭菌后的低PH值液体培养基加入到上述培养皿中使培养基渗透到滤纸内，加好培养基后，用上述处理后的玻璃棒或接种环蘸取稀释后的欲分离物在滤纸上涂布或划线。

4、涂布(划线)完成，按欲分离的菌种不同，选定培养温度，在培养箱中正置培养，然后倒置培养，培养过程中保持培养环境的湿度达60-80％，培养5-7天后，即有单菌落出现，按常规方法挑取单菌落，即完成微生物的分离过程。

与现有技术相比本方法的特点在于：

1、液体培养基中不以琼脂直接为培养基凝固物，而是以用活性炭处理后的滤纸为载体，克服了在低PH值下，琼脂固体培养基不易凝固、强度低、不易涂布、不易划线的缺点。

2、现有方法在涂布或划线后直接倒置培养，本发明分正置和倒置两个过程，以保证培养基不会流动。

3、现有方法不要求培养过程的湿度控制，本发明则要求有，其目的是防止培养过程液体培养基水分散失过快，在菌落未出现时滤纸已经干燥的现象。

4、使用的滤纸经过活性炭处理后呈黑色，菌落生长出后容易观察。

总之，本发明所述方法在整个操作过程中避免了现有技术中存在的培养基使用凝胶的不可控性，使目的微生物易于成单菌落分离，操作方便，适于生长环境PH值较低的真菌类微生物的分离。

具体实施方式

实施例1，一种耐酸性霉菌的培养分离方法，包括以下步骤：具体为从糖化发酵剂大曲中分离耐酸性菌种(分离物为大曲)，

所需材料：分离物，培养皿，滤纸，液体培养基，涂布用玻璃棒，粉末活性炭，灭菌锅，无菌操作设施或设备，培养设备。

1、首先用稀释法被分离物稀释，取无菌水4-5管，每管含9ml无菌水，用笔分别标记1、2、3、4、5号，取样品1克，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。用1毫升无菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1毫升悬浮液注入2号管，并将2号管摇动，使悬浮液均匀，同样类推至5号管。

2、工具处理：将适量的已过80目标准筛的粉末活性炭铺在滤纸(圆形定性滤纸，直径12.5厘米)上，用干毛巾压在活性炭上往复涂擦，使滤纸由白色变为均匀的黑色。涂好后，将滤纸上多余的活性炭弹掉，并裁剪成直径9厘米的圆形，放在9厘米的培养皿中。滤纸叠放3层，高温杀菌，杀菌条件为121℃，30分钟。将涂布用玻棒与培养基接触的一端用脱脂棉缠绕，用棉线固定，121℃，30灭菌分钟。

将接种环一端用脱脂棉缠绕，用棉线固定，121℃，30灭菌分钟。

3、在无菌条件下，用无菌移液管将灭菌后的PH值为3的液体培养基加入到上述培养皿中，使滤纸与培养皿靠液体的张力贴在一起，液体培养基加入量为1.0毫升。加好培养基后，用上述处理后的玻璃棒或接种环蘸取稀释后的欲分离物在滤纸上涂布或划线。

4、涂布(划线)完成，选定培养温度为30℃，在培养箱中正置培养2天，然后倒置培养，培养过程中保持培养环境的湿度为60-80％。培养5天后，即有单菌落出现。

Claims (1)

1.一种耐酸性霉菌的培养分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、先将欲分离物稀释，

(2)、工具处理：将粉末活性炭过80目标准筛，然后铺在滤纸上，再压住活性炭往复涂擦，使活性炭颗粒渗透到滤纸纤维中，并使滤纸由白色变为均匀的黑色，涂好后，将滤纸上多余的活性炭弹掉，并裁剪成符合培养皿规格的圆形，使其能放在培养皿中，滤纸叠放多层，以利吸收更多液体培养基，将这种培养皿高温杀菌，杀菌条件按常规方法；涂布用玻璃棒的处理方法：将涂布用玻璃棒与培养基接触的一端用脱脂棉缠绕，并固定，常规方式灭菌；划线用接种环的处理方法：将接种环一端用脱脂棉缠绕，常规方式灭菌，

(3)、在无菌条件下，用无菌移液管将灭菌后的低pH值液体培养基加入到上述培养皿中使培养基渗透到滤纸内，加好培养基后，用上述处理后的玻璃棒或接种环蘸取稀释后的欲分离物在滤纸上涂布或划线，

(4)、涂布或划线完成，按欲分离的菌种不同，选定培养温度，在培养箱中正置培养，然后倒置培养，培养过程中保持培养环境的湿度达60-80％，培养5-7天后，即有单菌落出现，按常规方法挑取单菌落，即完成微生物的分离过程。