CN101560526B - 一种从液体木糖醇里制备l-阿拉伯糖醇的方法 - Google Patents

Abstract

一种生物技术领域的从液体木糖醇里制备L-阿拉伯糖醇的方法，包括如下步骤：取原料，加入氮源和无机盐，得到发酵培养基，灭菌，得到无菌发酵培养基；将芽孢杆菌CGMCC No.3041接种到含一级种子培养基中，培养，形成一级种子液；将一级种子液加入到含二级种子培养基中，培养，形成二级种子液；将二级种子液加入到含无菌发酵培养基的发酵罐中，发酵，当L-阿拉伯糖醇的相对纯度＞65％时停止发酵；发酵结束后去除芽孢杆菌，取发酵上清液，脱色，利用离子交换树脂进行脱盐、浓缩，得到发酵液；结晶，离心，洗涤干燥，得到L-阿拉伯糖醇晶体。本发明的方法无污染，生产成本极低，适合工业规模化从液体木糖醇或者含有L-阿拉伯糖醇的原料中分离提取L-阿拉伯糖醇。

Description

一种从液体木糖醇里制备L-阿拉伯糖醇的方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的制备方法，具体涉及一种从液体木糖醇里制备L-阿拉伯糖醇的方法。

技术背景

L-阿拉伯糖醇为一种稀有糖醇，分子量为152，与木糖醇、核糖醇、D-阿拉伯糖醇一起属于戊糖醇(Pentitol)。越来越多的研究表明稀有糖或者稀有糖醇在医药、膳食以及保健领域中发挥重要的作用，其中已经有不少稀有糖或者稀有糖醇被开发利用，比如D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、塔格糖、D-阿洛酮糖、卫矛醇、木糖醇、赤藓糖醇、核糖醇。稀有糖醇由于其具有与蔗糖相近的甜度，再加上其低热量或零热量以及人体消化道吸收缓慢或不能吸收，使得其成为一种越来越受欢迎的甜味剂替代品，在能量控制的饮食中发挥重要的作用，即在人们的膳食结构调整中的作用越来越明显。绝大多数口腔细菌不能代谢稀有糖醇，因而食用稀有糖醇不会引起龋齿，因此目前绝大多数口香糖均添加了一定量的稀有糖醇，比如木糖醇。L-阿拉伯糖醇与木糖醇为同分异构体，研究表明(J.Appl.Glycosci.，Vol48，No.2，P131～133，2001，应用糖科学杂志，第48卷，第二期，131～133页，2001年)，L-阿拉伯糖醇具有与木糖醇相似的生理功效，能够显著地减少机体的脂肪组织，防止脂肪在机体消化道沉积，其功效类似于可溶性膳食纤维。

目前L-阿拉伯糖醇的制备是采用L-阿拉伯糖为原料，在高温高压下催化加氢而成。由于目前L-阿拉伯糖仍为一种非常昂贵的试剂，制成的L-阿拉伯糖醇就更加昂贵，极大的限制了其在食品医药领域的使用。因此发明一种廉价的L-阿拉伯糖醇的制备方法对推广其使用非常关键。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从液体木糖醇里制备L-阿拉伯糖醇的方法。本发明通过芽孢杆菌来消耗液体木糖醇或者含有L-阿拉伯糖醇的原料中的除了L-阿拉伯糖醇以外的其它糖或者糖醇，提高L-阿拉伯糖醇在原料中的相对纯度，达到L-阿拉伯糖醇结晶的纯度要求，进而可对L-阿拉伯糖醇进行结晶；本发明的方法无污染，生产成本极低，适合工业规模化制备L-阿拉伯糖醇。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明包括如下步骤：

步骤一，取液体木糖醇或者含有L-阿拉伯糖醇的原料，加入氮源和无机盐，得到发酵培养基，灭菌，得到无菌发酵培养基；

步骤二，将芽孢杆菌CGMCC No.3041接种到含一级种子培养基中，培养，形成一级种子液；

步骤三，将一级种子液加入到含二级种子培养基中，培养，形成二级种子液；

步骤四，将二级种子液加入到含无菌发酵培养基的发酵罐中，发酵，当L-阿拉伯糖醇的相对纯度＞65％时停止发酵；

步骤五，发酵结束后去除芽孢杆菌，取发酵上清液，脱色，利用离子交换树脂进行脱盐、浓缩，得到发酵液；

步骤六，在发酵液中加入无水乙醇，再加入L-阿拉伯糖醇晶种，结晶，悬液离心，洗涤晶体，干燥，得到L-阿拉伯糖醇晶体。

步骤一中，所述液体木糖醇或者含有L-阿拉伯糖醇的原料中L-阿拉伯糖醇的质量分数为10％～80％。

步骤一中，所述氮源选自酵母膏、酵母粉、酵母抽提物、玉米浆、大豆饼粉、棉籽粉、硫酸铵或尿素中的至少一种；氮源的添加量为发酵培养基质量的0.2％～3％。

步骤一中，所述无机盐选自无水硫酸镁、七水硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或磷酸二氢钠中的至少一种；无机盐的添加量为发酵培养基质量的0.05％～0.3％。

步骤二中，一级种子培养基的成分为：1L培养基由以下组分组成，液体木糖醇10克，酵母粉10克，蛋白胨2克，蒸馏水1000克。

步骤三中，二级种子培养基的成分为：1L培养基由以下组分组成，液体木糖醇20克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨2克/升，蒸馏水1000克。

步骤四中，二级种子液的接种量为无菌发酵培养基体积的5～20％。

步骤四中，所述发酵为，发酵温度为30～40℃，发酵时间为24～80小时，发酵搅拌电机转速100～600rpm。

步骤五中，添加L-阿拉伯糖醇晶种的质量为发酵液质量的5～10％，4～30℃下结晶。

本发明所涉及的芽孢杆菌基本生物学特性如下：

1、细胞形态特征：对数生长时期，该菌株在640倍光学显微镜下的形态为杆状，对数生长期大小为10～40μm*3～5μm，生长后期细胞变为卵圆形，80％以上的细胞里面可见明显折光度强的芽孢，芽孢近端。对数生长期细胞分裂生殖，可见2～3个细胞纵向连接在一起；

2、菌落特征：该菌株在固体LB培养基上在37℃培养48小时后形成白色菌落，表面有明显的折纹，边缘不规则，表面干燥；

3、生理生化特性：能利用D-葡萄糖，D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、木糖醇、D-山梨醇、D-甘露醇、D-半乳糖醇，不能利用D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇，最适培养温度为35～40℃，最适生长pH值为5.0～7.5；

4、稳定性特征：该菌稳定性极强，在65℃处理24小时仍能保持80％以上活性。

本发明所涉及的芽孢杆菌能高效利用液体木糖醇或者含L-阿拉伯糖醇的液体中除L-阿拉伯糖醇以外的其它糖或者糖醇，能将这些糖或者糖醇彻底代谢，不会将这些糖或者糖醇转化为其它的糖或者糖醇，大大提高了发酵液中L-阿拉伯糖醇的相对纯度，使后续纯化变得相对简单。

本发明所涉及的芽孢杆菌保藏信息如下：菌株分类命名：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2009年4月27日，保藏号：CGMCC 3041。

附图说明

图1为液体木糖醇的HPLC图谱；

图2为液体木糖醇经CGMCC NO.3041发酵60小时后发酵液的HPLC图谱；

图3为液体木糖醇经CGMCC NO.3041发酵60小时后从发酵液中纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC图谱；

图4为含L-阿拉伯糖醇的液体的HPLC图谱；

图5为含L-阿拉伯糖醇的液体经CGMCC NO.3041菌株发酵60小时后发酵液的HPLC图谱；

图6为含L-阿拉伯糖醇的液体经CGMCC NO.3041菌株发酵60小时后从发酵液中纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC图谱。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明涉及的芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.3041由芽孢杆菌菌种库中经过筛选分离并经过驯化而得到，过程如下：

筛选方法为：将待鉴定的细菌接种到LB固体平板上活化，然后逐一接种含1％木糖醇的M9、1％L-阿拉伯糖醇的M9、1％山梨醇的M9、1％卫矛醇的M9液体培养基中，得到一株除了不能在含1％L-阿拉伯糖醇的M9上生长但能在其它三种M9液体培养基上旺盛生长的细菌，实验室保存名为BM314，经鉴定该菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的一种；

驯化方法为：为了提高BM314耐受高浓度糖醇的性能，使之能在含高浓度液体木糖醇或者含有L-阿拉伯糖醇的液体的发酵培养基中良好的生长，消耗除L-阿拉伯糖醇以外的其它糖或者糖醇，将BM314接种在将液体木糖醇稀释五倍并含有一定氮源的液体培养基中，在37℃培养60小时，并在同样条件下连续培养50次，获得能在液体木糖醇稀释五倍的培养基中旺盛生长的菌株，该菌株命名为BM314-2。与BM314相比，BM314-2在液体木糖醇稀释五倍的培养基中在37℃中培养30小时即能达到对数生长期，而BM314需要经过60小时才能达到对数生长期，说明BM314-2已经适应了高浓度的糖醇环境，而且BM314-2菌株消耗除L-阿拉伯糖醇以外的糖或者糖醇的能力比BM314要迅速，该菌株在中国微生物菌种保藏管理中心的保存号为CGMCC NO.3041。

实施例1

取500ml液体木糖醇，含有木糖醇30～50％，木糖2～10％，L-阿拉伯糖1～5％，山梨醇5～15％，L-阿拉伯糖醇10～30％以及2％以下的其它杂糖醇(均按干物质的质量百分比计)。该液体木糖醇的HPLC分析如图1所示，其中保留时间为17.482min的峰为L-阿拉伯糖醇的峰，24.515min为木糖醇的峰，28.448min为山梨醇的峰，15min前的峰为各种未加氢的残糖的峰。经积分计算，L-阿拉伯糖醇在液体木糖醇的含量为31.6％，木糖醇的含量为42.3％，山梨醇的含量为9.0％，其它残留糖含量为17.1％。

加入质量百分比为1.5％的酵母粉、质量百分比为0.01％的无水硫酸镁和质量百分比为0.1％的磷酸二氢钾，用去离子水稀释到1.8L，充分溶解，转入3L的发酵罐(稀释四倍)，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌15分钟。

将保存在试管斜面上的芽孢杆菌CGMCC No.3041接种到含5ml一级种子培养基的50ml的试管中，在37℃下进行培养，按照200rpm的搅拌速度，培养6～12小时得到一级种子液；

将一级种子液5ml全部加入到含50ml二级种子培养基的500ml摇瓶中(共四瓶)，在37℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养6-12小时得到二级种子液；

再将此四瓶二级种子液按照10％的体积(即200ml)比全部接种到发酵罐中进行发酵，发酵罐中含有1.8升发酵培养基。在37℃、pH6.5、400rpm条件下发酵60小时，发酵结束后分析L-阿拉伯糖醇的纯度，结果如图2所示，其中保留时间为18.215min的为L-阿拉伯糖醇的峰，26.648min为木糖醇的峰，4min的峰为醋酸的峰(该峰在发酵前不存在)，10～15min之间的峰为未消耗完的残糖的峰。经积分计算，L-阿拉伯糖醇的含量由发酵前的31.6％提高到61.4％，醋酸的含量为8.7％，木糖醇的含量由发酵前的42.3％减少到8.4％。

由此可见，经过发酵后，L-阿拉伯糖醇的含量增加一倍。离心分离菌体，将澄清发酵上清浓缩五倍(浓缩后为400ml)，加入粉末活性炭8克，80℃脱色60分钟，转速为150转/分，滤布过滤除去活性炭，重复脱色3次。无色的发酵液再进行离子交换处理：依次通过D001型阳离子交换柱，D201型阴离子交换柱以及D001型阳离子交换柱，滤液通过交换柱的流速为每分钟100毫升。检测流出液的电导率，当流出液的电导率低于20μs/cm时停止离子交换。将脱盐后的发酵液通过旋转蒸发浓缩到折光率为60％以上，加入3倍体积的无水乙醇，然后，轻轻搅拌，4℃放置24小时充分结晶，离心，沉淀再用少量无水乙醇洗涤二次，然后干燥，得到白色粉末L-阿拉伯糖醇。

经HPLC分析，结果如图3所示，其中保留时间为17.257min的峰为L-阿拉伯糖醇的峰，24.457min为木糖醇的峰，12.590min与12.890min为未消耗的残留糖的峰。经积分计算，L-阿拉伯糖醇的纯度经过纯化后由61.4％提高到95.1％。木糖醇由纯化前的8.4％下降到2.5％。可知，从液体木糖醇发酵液中分离纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC的纯度可以达到95％。

实施例2

量取500ml液体木糖醇，加入质量百分比为0.5％的酵母粉、1.0％大豆饼粉、0.5％玉米浆、质量百分比为0.01％的无水硫酸镁和质量百分比为0.1％的磷酸二氢钾，用去离子水稀释到1.8L，充分溶解，转入3L的发酵罐(稀释4倍)，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌15分钟。以下步骤同实施例1，从发酵液中分离纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC纯度为95％。

实施例3

量取250ml液体木糖醇，加入质量百分比为1.5％的酵母粉、质量百分比为0.01％的无水硫酸镁和质量百分比为0.1％的磷酸二氢钾，用去离子水稀释到1.8L，充分溶解，转入3L的发酵罐(稀释8倍)，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌15分钟。将种子液200ml接入含有1.8L发酵培养基的3L发酵罐中，发酵36小时。其余分离纯化步骤同实施例1，从发酵液中分离纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC纯度为95％。

实施例4

量取125ml液体木糖醇，加入质量百分比为1.0％的酵母粉、0.2％蛋白胨、质量百分比为0.01％的无水硫酸镁和质量百分比为0.1％的磷酸二氢钾，用去离子水稀释到1.9L，充分溶解，转入3L的发酵罐(稀释16倍)，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌15分钟。将种子液100ml接入含有1.9L发酵培养基的3L发酵罐中，发酵24小时，发酵条件同实施例1。其余分离纯化步骤同实施例1，从发酵液中分离纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC纯度为95％。

实施例5

量取500ml含有L-阿拉伯糖醇的原料，其折光率为65％。该液体的HPLC分析如图4所示，其中18.165min为L-阿拉伯糖醇的峰，25.998min为木糖醇的峰，15min之前的峰为未消耗的残糖的峰。经积分计算，L-阿拉伯糖醇的含量为22.5％，木糖醇的含量为44.5％，其余物质的含量为33.0％。加入质量百分比为0.5％的酵母粉、1.0％蛋白胨、质量百分比为0.01％的无水硫酸镁和质量百分比为0.1％的磷酸二氢钾，用去离子水稀释到1.8L，充分溶解，转入3L的发酵罐(稀释4倍)，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌15分钟。种子液培养同实施例1。将200ml种子液接种到含1.8L发酵培养基的3L发酵罐中，在40℃下进行培养，pH7.0、按照350rpm的搅拌速度，培养60小时，发酵结束后分析L-阿拉伯糖醇的纯度，结果如图5所示，其中18.098min为L-阿拉伯糖醇的峰，26.332min为木糖醇的峰，15min之前的峰为未消耗的残糖的峰或发酵后产生的代谢产物的峰。经积分计算，L-阿拉伯糖醇的含量由发酵前的22.5％提高到60.0％，木糖醇的含量由发酵前的44.5％减少为12.2％，其余物质的含量由33.0减少为27.8％。分离纯化步骤同实施例1。经HPLC分析，结果如图6所示，其中17.232min为L-阿拉伯糖醇的峰，24.332min为木糖醇的峰，经纯化后L-阿拉伯糖醇的含量达到95.0％。可知，从含L-阿拉伯糖醇的液体中分离纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC的纯度可以达到95％。

实施例6

量取250ml含有L-阿拉伯糖醇的原料，加入质量百分比为0.5％的酵母粉、0.5％蛋白胨、0.5％硫酸铵、质量百分比为0.01％的无水硫酸镁和质量百分比为0.1％的磷酸二氢钾，用去离子水稀释到1.8L，充分溶解，转入3L的发酵罐(稀释8倍)，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌15分钟。种子液培养同实施例1。将200ml种子液接种到含1.8L发酵培养基的3L发酵罐中，在37℃下进行培养，pH7.0、按照350rpm的搅拌速度，培养48小时。发酵结束后分离纯化步骤同实施例1。经HPLC分析，从含L-阿拉伯糖醇的液体中分离纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC的纯度可以达到95％。

实施例7

量取125ml含有L-阿拉伯糖醇的原料，加入质量百分比为0.25％的酵母粉、0.25％蛋白胨、0.25％硫酸铵、质量百分比为0.01％的无水硫酸镁和质量百分比为0.1％的磷酸二氢钾，用去离子水稀释到1.9L，充分溶解，转入3L的发酵罐(稀释16倍)，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌15分钟。种子液培养同实施例1。将100ml种子液接种到含1.9L发酵培养基的3L发酵罐中，在30℃下进行培养，pH6.0、按照400rpm的搅拌速度，培养60小时。发酵结束后分离纯化步骤同实施例1。经HPLC分析，从含L-阿拉伯糖醇的液体中分离纯化的L-阿拉伯糖醇的HPLC的纯度可以达到95％。

Claims (1)

1.一种从液体木糖醇里制备L-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，取液体木糖醇或者含有L-阿拉伯糖醇的原料，加入氮源和无机盐，得到发酵培养基，灭菌，得到无菌发酵培养基；

所述液体木糖醇或者含有L阿拉伯糖醇的原料中L-阿拉伯糖醇的质量分数为10％～80％；

所述氮源选自酵母膏、酵母粉、酵母抽提物、玉米浆、大豆饼粉、棉籽粉、硫酸铵或尿素中的至少一种；氮源的添加量为发酵培养基质量的0.2％～3％；

所述无机盐选自无水硫酸镁、七水硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或磷酸二氢钠中的至少一种；无机盐的添加量为发酵培养基质量的0.05％～0.3％；

步骤二，将芽孢杆菌CGMCC No.3041接种到一级种子培养基中，培养，形成一级种子液；

所述的一级种子培养基的成分为：1L培养基由以下组分组成，液体木糖醇10克，酵母粉10克，蛋白胨2克，蒸馏水1000克；

步骤三，将一级种子液加入到二级种子培养基中，培养，形成二级种子液；

所述的二级种子培养基的成分为：1L培养基由以下组分组成，液体木糖醇20克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨2克/升，蒸馏水1000克；

步骤四，将二级种子液加入到含无菌发酵培养基的发酵罐中，发酵，当L-阿拉伯糖醇的相对纯度＞65％时停止发酵；

所述的二级种子液的接种量为无菌发酵培养基体积的5～20％；

所述的发酵为，发酵温度为30～40℃，发酵时间为24～80小时，发酵搅拌电机转速100～600rpm；

步骤五，发酵结束后去除芽孢杆菌，取发酵上清液，脱色，利用离子交换树脂进行脱盐、浓缩，得到发酵液；

所述的添加L-阿拉伯糖醇晶种的质量为发酵液质量的5～10％，4～30℃下结晶；

步骤六，在发酵液中加入无水乙醇，再加入L-阿拉伯糖醇晶种，结晶，悬液离心，洗涤晶体，干燥，得到L-阿拉伯糖醇晶体。

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