CN101560243A - 一种分离、纯化相思子毒素的方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分离、纯化云南相思子毒素的方法，包括：将相思子粗毒素上酸化的Sepharose4B亲和层析柱，先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后用半乳糖进行梯度洗脱，收集半乳糖梯度洗脱液；浓缩后加样于DEAE－SepharoseFF凝胶面上，洗脱杂蛋白，梯度洗脱，收集梯度洗脱液，浓缩、脱盐，即得。本发明方法利用两次层析就可以得到相思子的两种毒素蛋白纯品，不仅简化了纯化步骤，而且再纯度，产率上均有显著提高，为大规模的纯化奠定了基础。体外抗肿瘤活性试验和动物移植性肿瘤抑制作用试验结果表明，本发明所分离的相思子毒素对Bel7402等10余种肿瘤细胞均有很强的抑制作用，能有效的抑制动物移植性肿瘤的增殖活性。

Description

一种分离、纯化相思子毒素的方法及其产品

技术领域

本发明涉及一种植物活性成分的分离、纯化方法，尤其涉及一种从云南豆科植物相思子(Abrus precatorius)种子中分离、纯化毒素(abrin)的方法，属于植物化学领域。

背景技术

相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子(Abrus precatorius)种子中的一种毒蛋白，与蓖麻毒素(ricin)同为II型核糖体失活蛋白(RIP)家族成员，是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一，相思子毒素类似于蓖麻毒素，是一种植物蛋白毒素，具有极强的细胞毒性作用，特别是对某些恶性肿瘤细胞的毒性更强，这使它成为用于杀伤肿瘤细胞的候选毒素之一。

相思子毒素是一种分子质量约为63ku～67ku的糖蛋白，分子由A、B两条多肽链通过1个二硫键连接而成。完整毒素在SDS-PAGE分析时呈一条蛋白带，经二巯基乙醇处理后，A、B两条链分离开，其中A链呈酸性，分子质量约为30ku，与蓖麻毒素A链存在102个相同的氨基酸残基；B链呈中性，分子质量约35ku。有关试验表明，相思子毒素两条链经二巯基乙醇还原分离开后，其活性并不丧失。

迄今为止，从相思子种子中分离和纯化毒素和凝集素的方法有多种。大多经过离子交换，凝胶过滤，亲和层析等多步层析，才能得到纯品，方法较为繁琐，费用，成本相对较高。例如，国外从70年代开始进行相思子毒素的分离纯化，首先经DE-52阴离子交换层析，然后经凝胶过滤，Sepharose4B亲和层析，操作过程较为烦琐，流程较长，费用和成本也相对较高，制约了对相思子的开发和利用，所以寻找一种步骤简捷、制备成本低的相思子毒素的分离和纯化方法，对于相思子的开发和利用具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种分离、纯化相思子毒素的方法，该方法步骤简捷、生产成本相对较低。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种分离、纯化相思子毒素的方法，包括：

(1)将云南相思子粗毒素上酸化的Sepharose4B亲和层析柱，先用初始平衡缓冲洗脱掉杂蛋白，然后用半乳糖梯度洗脱液进行梯度洗脱，收集半乳糖梯度洗脱液的前面两个在280nm处有吸收的峰；

(2)将步骤(1)所收集的洗脱液浓缩后加样于DEAE-SepharoseFF凝胶面上，先用洗脱平衡液洗脱掉杂蛋白；然后用含0-0.5mol/L NaCL的10mmol/LTris-HCL进行梯度洗脱，分别收集在280nm处有吸收的前两个较大的峰，分别浓缩后进行脱盐处理，即得P₁、P₂。

为了达到更好的分离或纯化效果，步骤(1)中所述的酸化的Sepharose4B亲和层析柱按照以下方法制备得到：将凝胶Sepharose4B酸化处理，经洗涤、脱气、平衡后装层析柱；其中，所述的酸化处理优选用盐酸处理凝胶Sepharose4B5-6小时。

步骤(1)中所述的初始平衡缓冲液优选是10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4；所述的半乳糖梯度洗脱液优选为含0-0.5mol/L半乳糖的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4；步骤(2)中所述的洗脱平衡液优选为10mmol/L的Tris-HCL，pH为7.0；

步骤(2)中所述的脱盐处理优选为用脱盐柱进行脱盐处理，更优选的，以SephadexG-25(30×2.0cm)为脱盐柱，将浓缩液上脱盐柱后用水洗脱，流速为0.8ml/min，280nm检测，收集第一主峰。

本发明中所述的相思子优选为云南相思子(Abrus precatorius L.)，其分布于云南南部较热地区以及广东、广西、福建和台湾等地，1200米以下山坡、灌丛、路边等地。云南相思子粗毒素可从市场购买得到，也可按照常规的方法从云南相思子种子中制备得到。

作为参考，可按照以下方法制备得到相思子粗毒素：将相思子种子捣碎后，去掉种皮，种仁用5％的稀乙酸4℃浸泡过夜，次日用研钵磨碎，冷冻离心，取上清加入35％(NH₄)₂SO₄，低温静置，冷冻离心，取上清，加入95％的饱和(NH₄)₂SO₄，低温静置，冷冻离心，得到沉淀物，将沉淀物溶于少量水，然后用5mmol/L的PBS(pH＝7.4)透析3天，离心，取上清，得相思子Abrin粗毒素；

本发明方法采用酸化的Sepharose4B亲和层析柱可显著提高分离效果。相思子毒素具有乳糖结合专一性，而Sepharose4B是一种含有半乳糖功能基的多糖载体，用HCL处理使Sepharose4B发生部分酸水解，增加半乳糖残基数，可以提高基质的亲和容量。

另外，本发明采用半乳糖梯度洗脱毒蛋白，同时去除凝集素，简化了分离步骤。在植物种子中，毒素与凝集素是共存的，其分子相差一倍左右，一般使用凝胶过滤分离开，而本发明方法使用半乳糖梯度洗脱，在洗脱毒蛋白的同时，将凝集素除去，省略了凝胶过滤层析，简化了纯化步骤。

再者，本发明采用DEAE-SepharoseFF为离子交换介质可获得相思子两种毒蛋白成分。传统的纤维毒介质DE-52，由于流速太慢，柱床高度会随缓冲液浓度及pH值改变，难以纯化样品，而且纤维素不能承受0.1mol/NaOH的在位清洗，重生效果差，寿命短。鉴此，本发明采用化学稳定性高，流速快的高度偶联琼脂糖DEAE-SepharoseFF为介质。DEAE-SepharoseFF是在琼脂糖凝胶基础上改进的新产品，它是琼脂糖珠体经充分交联后得到的一类具有高通透能力的半刚性层析材料，引进功能基DEAE后具有阴离子交换能力，DEAE-SepharoseFF保留了天然多糖化合物的极好的亲水性及大网架结构，与生物活性大分子有很好的相容性，实验证明，其分离效果很好

总之，本发明方法利用两次层析就可以得到相思子的两种毒素蛋白纯品，不仅简化了纯化步骤，而且在纯度，产率上均有显著提高，为大规模的纯化奠定了基础。

由本发明方法所分离的相思子毒素由P₁和P₂两种相思子毒素组成，其中P₁分子量为64000，等电点为6.9，含糖量为9.4％；P₂的分子量在62000-63000之间，等电点为6.0-6.2，含糖量为3.3％。

体外抗肿瘤活性试验结果表明，本发明所分离的相思子毒素对Bel7402等10余种肿瘤细胞均有很强的抑制作用。观察本发明所分离的相思子毒素对动物移植性肿瘤抑制作用的试验结果表明，能有效的抑制动物移植性肿瘤的增殖活性。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种治疗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效剂量的本发明所分离的相思子毒素和药学上可接受的载体或辅料组成。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有10％-99％重量的相思子毒素，优选为含有10-50％重量的相思子毒素。

将本发明所分离得到的相思子毒素加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形剂或载体后，以常规的药物制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、滴丸等；其中，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等；所述的药学上可接受的载体可以是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种，优选为甘露醇或乳糖。

附图说明

图1Abrin和AAG从Sepharose4B的洗脱图。

图2Abrin和AAG从酸处理的Sepharose4B的洗脱图。

图3凝集素从Sepharose4B的洗脱图。

图4凝集素从酸处理的Sepharose4B的洗脱图。

图5经酸化Sepharose4B得到的两种毒素混合物再经过DEAE-SepharoseFF离子交换层析结果。

图6本发明纯化的毒素经SDS-PAGE电泳结果。

图7蛋白质分子量标准曲线。

图8本发明所分离的P₂的HPCE结果。

图9通过HPCE确定的P₂的分子量结果。

图10标准蛋白各自的相对迁移率与其分子量的对数线性关系图。

图11本发明所分离的P₁的MALDI-TOF-MS分析结果。

图12为等电聚胶电泳pH-cm图谱(横坐标为从阴极到阳极的距离，纵坐标为pH值)。

图13本发明所分离的P₂的毛细管等电聚胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

1云南相思子(Abrus precatorius L.)种子：购自中国科学院昆明植物研究所。

2凝胶：Sepharose4B(购自Pharmacia公司)，SephadexG-25(购自Pharmacia公司)，DEAE-SepharoseFF(购自四川成都晨光化工研究院)。

3层析系统：HD-8858型紫外检测仪(上海精科实业有限公司)，FBS-100型自动部分收集器(上海青浦沪西生化仪器厂)，TH-1000型梯度混合议(上海沪西分析仪器厂)，3057型记录仪(四川仪表四厂)，DW-II型层析冷柜(浙江嵊县中爱恒温设备厂)。

4层析柱  20×1.6cm，20×2.6cm，30×2.0cm等规格(购自上海锦华实验仪器厂)。

5离心机  日立55-P7型超速冷冻离心机(日立公司)。

6分光光度计  日立340型UV-VIS分光光度计(日立公司)。

7冷冻干燥机  LGJ型(军事医学科学院实验仪器厂)。

8试剂  Nacl、(NH₄)₂SO₄、NA₂HPO₄、NaH₂PO₄、Gal、HAC(均为分析纯，北京化工厂出品)，BSA(Serve公司出品)。

实施例1

一、实验方法

1、相思子Abrin粗毒素的制备

云南相思子(Abrus precatorius L.)种子100g捣碎后，去掉种皮，种仁用5％的稀乙酸4℃浸泡过夜，次日用研钵磨碎，1000g冷冻离心20min，得到的上清中加入35％(NH₄)₂SO₄，4℃静置2h，1000g冷冻离心10min，去除沉淀，留取上清，加入95％的饱和(NH₄)₂SO₄，4℃静置2小时，1000g冷冻离心20min，得到沉淀物，将沉淀物溶于少量水，然后用5mmol/L的PBS(pH＝7.4)透析3天，3000g离心去除变性蛋白，上清为相思子Abrin粗提取液，冷冻干燥保存；

2、酸化Sepharose4B的制备

取适量Sepharose4B，用HCL处理5-6小时，用水洗涤，缓冲液平衡后备用；

3Sepharose4B及酸化Sepharose4B柱层析

将酸化的Sepharose4B凝胶经常规清洗后脱气，装柱(20×1.6cm)平衡，将粗毒素溶于初始平衡缓冲液(0.005mol/L PBS，pH＝7.4)中，用吸管将其加到凝胶面上，以0.3ml/min的速度进入凝胶，先用初始平衡缓冲液(0.005mol/L PBS，pH＝7.4)洗脱杂蛋白，洗脱流速为0.7ml/min，然后用含0-0.5mol/L Gal的PBS梯度洗脱，收集半乳糖梯度洗脱液的前面两个在280nm处有吸收的峰；

4DEAE-SepharoseFF柱层析

将所收集的半乳糖梯度洗脱液的前面两个在280nm处有吸收的峰用DEAE-SepharoseFF初始平衡缓冲液(0.01mol/L Tris-HCL，pH＝7.0)透析，浓缩后，加样于DEAE-SepharoseFF柱层析(2.6×20cm)凝胶面上，以0.3ml/min的速度进入凝胶，先用初始平衡缓冲液(0.005mol/L PBS，pH＝7.4)洗脱杂蛋白，然后用含0-0.5mol/L NaCL的10mmol/L Tris-HCL进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液(洗脱流速优选为0.8ml/min)，分别收集在280nm处有吸收的前两个较大的峰，即分别得到P₁、P₂，将P₁、P₂经浓缩后进行脱盐处理(脱盐柱为SephadexG-25(30×2.0cm)，用水洗脱，流速为0.8ml/min.280nm检测)，冷冻干燥，样品保存于-20℃。

5蛋白含量测定  采用Lowry法。

二、实验结果

1采用酸化的Sepharose4B亲和层析提高分离效果

HCL处理Sepharose4B不同时间对亲和容量的影响，见表1.

表1  HCL处理Sepharose4B不同时间对亲和容量的影响

由表1可知，HCL处理Sepharose4B的时间不同，在亲和容量上是由差异的，未处理的凝胶吸附蛋白量为3.28mg/2ml凝胶，随着处理时间的延长，吸附蛋白量增加，处理5-6小时达到最大，吸附蛋白量最高达到3.86mg/2ml凝胶，比未处理凝胶高17.7％.但如果继续延长处理时间，吸附蛋白量又下降，所以本发明选择亲和容量达到最大的条件，用HCL处理5-6小时，作为实验分离介质。

(2)为了确定亲和容量的提高是否为特异性增加，做了对比实验，在同样条件下用Sepharose4B和酸处理的Sepharose4B进行分离，蛋白含量比较见表2，分离图谱见图1和图2。

表2  从Sepharose4B和酸化的Sepharose4B洗脱的蛋白含量的比较

由表2可见，酸化Sepharose4B滞留280mg毒蛋白，而Sepharose4B滞留200mg毒蛋白.可见，酸化Sepharose4B亲和容量可提高特异性蛋白(Abrin)的增加，而不增加凝集素或杂蛋白的增加。

从图1和图2还可以看出，采用酸化的Sepharose4B可以滞留两种毒性成分，而Sepharose4B只滞留一种毒性成分，由此结果分析，酸化Sepharose4B亲和容量的提高是因为多滞留了一种毒性成分P₁，另外，采用酸化Sepharose4B除去杂蛋白所需要的时间缩短，用Sepharose4B亲和层析洗脱杂蛋白峰有较长的拖尾现象，按48ml/h.3ml/管计算，洗脱杂蛋白需要6h，而用酸化的Sepharose4B洗脱杂蛋白只需要2.5h，可大大节省了时间。

2、采用半乳糖梯度洗脱毒蛋白的同时将大量凝集素去除

文献报道洗脱毒蛋白时都是使用半乳糖一次性洗脱(见图3、图4)，将毒素与凝胶素混在一起收集，以后再用凝胶过滤除去凝胶素，但很难完全去除凝胶素。本发明采用半乳糖梯度洗脱，在洗脱毒蛋白的同时就可以去除大量凝胶素，简化了纯化步骤.

3、采用新型的DEAE-SepharoseFF离子交换介质获得两种毒蛋白成分

经酸化Sepharose4B得到的两种毒素混合物再经过DEAE-SepharoseFF离子交换层析，结果见图5；两种毒蛋白完全分开，并将极少量的凝集素去除。

试验结果

相思子毒素分离纯化过程中蛋白产率结果见表3。

表3  从100g相思子种子中分离得到的蛋白馏分的产率

从表3可看出，匀浆上清液产率为9.87％，粗提液产率约1％，最后层析纯化的P₁、P₂产率分别为0.07％，0.16％，毒蛋白总产率为0.23％，而文献报道含量为0.19％，可见本发明的纯化方法在产率上得到很大提高。

试验例1本发明方法所分纯化的相思子毒素(Abrin)的毒性及理化性质试验

一试验材料

1、实验动物昆明种小白鼠.雌雄兼用，体重20±2g；新西兰大白兔；购自海淀通利实验养殖厂。

2、仪器DYY-II型稳压流电泳仪(北京六一仪器厂)，双垂直电泳槽(大连捷迈高新技术公司)，日立340型分光光度计(日立公司)，普通离心机(上海医用离心机厂)，日立835-50型氨基酸自动分析仪，ABI-491蛋白序列分析仪，ZabspecTlatform Platform-ESI型质谱仪(英国质谱公司VG TOFSPEC)。

3、试剂标准分子量蛋白，两性电解质(均为上海丽珠东凤生物技术有有限公司出品)，考马斯量兰R-250(Fluka出品)，甘露糖，丙稀酰胺，甲叉双丙稀酰胺(均为Sigma公司出品).SDS，苯酚，H₂SO₄等其它试剂(国产分析纯)。

4、受试样品：本发明实施例1所分离、纯化的相思子毒素(Abrin)。

二试验方法

1、分子量测定

采用SDS-PAGE，HPCE，MALDI-TOF-MS检测。

(1)SDS-PAGE，按Laemmli方法(Laemmli，V.K.Cleavage of structureproteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature.227：680-685，1970.)进行，按Weber方法测定分子量：采用不连续垂直板状电泳，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4.0％，先于20mA电泳1h，待样品进入分离胶后，再调电流至40mA电泳3-4h，电泳完毕，凝胶条以考马斯兰R-250染色。

(2)HPCE：使用未涂渍毛细管，电进样10KV×5秒，分离温度20℃，分离电压15KV，检测波长220nm，电泳方向由负到正。

(3)MALDI-TOF-MS：实验条件如下：激光能量为4档185：加速电压为23608V；检测器电压为1850V；线性方式，正离子：量程，2mV；基质为CHCA。

2.等电点测定

IEF按照文献所公开的方法(张龙翔，张庭芳，李令嫒主编生化实验方法和技术，高等教育出版社，1997，7)进行；两性电解质聚合于7.5％的凝胶中，正极电泳液为1mol/L H₃PO₄，负极为1mol/L NaOH，恒压580伏，电泳2-3h，至电流接近于0.电泳完毕，从胶板一侧切下一条胶条，切成0.5cm的小块，用少量蒸馏水浸泡过夜，测定pH值，绘制pH-cm图谱。

毛细管电泳使用涂渍毛细管，压力进样60sec，聚焦和迁移温度均为27℃，聚焦电压15KV，条件为电流到0.4uA，迁移电压为18KV.检测波长280nm，电泳方向由正到负。

3.氨基酸组成分析

日立835-50型氨基酸自动分析仪，样品经6N HCL 110℃，N₂保护下水解24h，离子交换柱分离，茚三酮柱衍生检测。

4、肽链N-末端测定

ABI-491蛋白序列分析仪，反相柱填料为C18，采用Edman降解法测定。

5、含糖定性定量测定

定性测定：采用SDS-PAGE分离蛋白后，用PAS染色，可定性显示糖蛋白条带。

定量测定：采用苯酚-H₂SO₄法，以甘露糖为标准，以每克蛋白含糖量表示。

6、血凝活性测定

按孙册方法进行(孙册，大蒜凝集素的分离纯化及性质研究生物化学及生物物理学报19(3)：188-194，1987)，采集兔抗凝血，1500rpm离心5分钟，去掉血浆，红细胞用生理盐水洗3次，按红细胞压积计算，配成2％的红细胞悬液，待测样品倍比稀释，然后加入等体积红细胞悬液，室温放置4h，肉眼观察结果，以能够引起红细胞凝集的最小浓度表示。

7、毒性测定

昆明种小白鼠，设4-7个剂量组，每组6-8只动物，新西兰大白兔，设4-7个剂量组，每组4只动物，受试样品(毒素)用生理盐水配成适宜浓度，静脉或腹腔给药后观察一周.实验结果用药理学计算与程序中的Bliss法计算LD₅₀。

三试验结果

1分子量测定

(1)SDS-PAGE分析

从图6可以看出，按本发明纯化方法得到的P₁、P₂均达到电泳纯，用2-硫基乙醇处理后P₂出现两条链.推测P₁和凝集素P₃均出现3条链.推测P₁出现3条带可能是亚基的降解产物。图7为SDS-PAGE测定蛋白质分子量标准曲线，根据蛋白质的相对迁移率计算分子量，见表4

表4  所分离蛋白质和亚单位的分子量

(2)HPCE测定

毛细管电泳鉴定P₂纯度，见图8。P₂为单一峰，纯度达到95％，毛细管电泳测定分子量结果见图9、图10。从图9可以得到8种标准蛋白各自的相对迁移率，图10为标准蛋白各自的相对迁移率与其分子量的对数线性关系图，可以得到P₂的分子量为63000，与SDS-PAGE的实验结果相似，表明SDS-PAGE测定的P₂的分子量数据可靠。

(3)MALDI-TOF-MS分析

P₁的MALDI-TOF-MS检测分子量结果见图11。P₁分子量为64000，为单一成分。

2.等电点测定

(1)IEF结果

图12为等电聚胶电泳pH-cm图谱(横坐标为从阴极到阳极的距离，纵坐标为pH值)，P₁，P₂，P₃的等电点分别为6.9，6.2，5.3；三种蛋白均为单一成分。

(2)P₂经毛细管等电聚焦电泳

P₂经毛细管等电聚胶电泳，见图13；可以得到P₂的等电点为6.0-6.2。在聚胶过程中，由于氯离子的加入，阴极的pH值降低，电流逐步加大，已经聚胶成带的蛋白质逐步经过监测器，先是等电点最高的蛋白质，其它的依次通过。

3、氨基酸组成分析

从氨基酸组成分析，P₂成分的大部分氨基酸，如Arg，Lys，asp，thrser，gil，leu，tyr，his的含量与文献报道的AbrinC，Abrina的相应氨基酸含量相似，而Giu含量比文献报道的结果高，Pro，Ala，Met，Iso，Val比文献报道的结果偏低，尤其是Pro，Ala.Met与文献报道的结果差异很大，Pro，Ala含量几乎为文献报道的1/3，MET为文献报道的1/5，原因可能是在酸水解过程中，部分MET被氧化破坏，因为氨基酸组成分析采用酸水解，全部的Trp，大部分Cys，部分Met被氧化破坏掉。

4.N-末端分析

P₂由两条链组成，推测应出现两个N端，实际测得N末端序列只有一个，为IVEKS，与文献报道的Abrin a的一级结构比较，此序列与Abrin a的B链N末端相一致，所以P₂的A链N-末端是封闭的，通过Edman降解法不能测定A链N末端.考虑到Abrin a的A链N末端为Glu，推测P₂的A链N末端封闭基团为焦谷胺酸，可能用焦谷胺酰氨肽酶处理，可以暴露A链N末端游离α-NH₂。

5.糖含量的定性定量测定

SDS-PAGE凝胶电泳后使用高碘酸-Schiff试剂染色，确定亚基的含糖情况。P、₁P₂的2条链均为糖蛋白，而P₂只有1条链是糖蛋白，根据分子量判断，A链没有显示出来，所以P₂的A链不含糖基或含极少量不能显示出来，以甘露糖为标准测得P₁，P₂，P₃的含糖量分别为9.4％，3.3％，10.5％。

6.血凝活性

以兔红细胞为凝血活性测定的材料，测得P₁，P₂，P₃引起红细胞凝集的最小浓度分别为19μg/ml，2.5μg/ml，0.3μg/ml。

7、本发明所分离的云南Abrin与国外Abrin比较

据理化性质分析，本发明所分离的P₁类似于Wei，C等人分离的AbrinA，Olsnes，S.等人分离Abrin，b，它们均为含糖量高，凝集红细胞活性低，等电点较高，毒性相对低的毒素。但是，从分子量比较，质谱检测P₁的分子量为64000，而Abrin A为60100，Abrin b为67000，差别很大。

据理化性质分析，本发明所分离的P₂类似于Wei，C等人分离的Abrin C、Olsnes，S.等人分离的Abrin a，它们均为含糖量低，凝集红细胞活性高的毒素。P₂的毒性结果，ip小鼠，观察期为3天，LD₅₀为4.02μg/kg，比文献报道的性质相似的毒素毒性高，Abrin C LD₅₀为8μg/kg，Abrin a的LD₅₀为10μg/kg，可能由于相思子种子产地的差异，分离纯化的毒素不同。。

本发明采用5种方法(SDS-PAGE，HPCE，MALDI-TOF-MS，IEF，N-末端分子)鉴定毒素的纯度，P₁成分通过SDS-PAGE鉴定，完整蛋白为单一成分，但二硫键裂解后有3个亚基.通过质谱分析完整蛋白含有单一成分，所以P₁成分的3个亚基中有一个可能为肽链降解产物，可能是在样品保存或处理过程中形成的。P₂成分通过4种方法鉴定均为单一成分.

综合毒性与理化性质分析，本发明分离的P₁P₂可能为中国云南产相思子中特有的毒素，与文献报道的性质类似的毒素均有差异。印度学者分离的AbrinII被认为是目前毒性最大的相思子毒素，为LD₅₀2.4μg/kg(ip小鼠)，对Sepharose4B无结合活性，而本发明所分离的P₂成分却有很强的结合活性，显然两者并不相同。

试验例2本发明所分离的相思子毒素体外抗肿瘤活性试验

一、试验材料

受试样品：本发明实施例1所分离的相思子毒素，白色粉末，用DMSO溶解；

药品及试剂：RPMI1640购自GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT购自Sigma。

细胞株：KB(人口腔上皮癌)，KB/VCR(人口腔上皮癌耐药细胞)，A2780(人卵巢癌细胞)，A549(人肺腺癌细胞)，HCT-8(人结肠癌细胞)，Bel7402(人肝癌细胞)。A549/Taxol(人肺腺癌耐药细胞)，CNE-2Z(人鼻咽癌细胞)，PC-3M(人前列腺癌细胞)，BGC803(人胃癌细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，CaEs-17(人食管癌细胞)(中国医学科学研究院肿瘤研究所)。

仪器：BIORAD550型酶标仪。

二、试验方法

MTT法测定：收集生长良好的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养基制成1×10⁴/ml细胞悬液，于96孔培养板内接种，每孔100μl(含1000肿瘤细胞)，置37℃，5％CO₂温箱内培养24h后加药，实验设空白对照及溶剂对照，阳性对照药为顺铂。受试样品设5-6个浓度，每浓度3个平行孔，置37℃，5％CO₂温箱内培养4天。弃去培养液，每孔加入MTT溶液(0.4mg/ml，RPMI1640配制)100μl，37℃孵育4小时。弃去上清夜，每孔加入DMSO 150μl，溶解Fomazan颗粒，轻度震荡后，用550型酶标仪在检测波长540nm，参考波长450nm下测定OD值。

结果计算：以药物不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(IC₅₀)。

三、试验结果

试验结果见表5。

表5  MTT法人癌细胞杀伤实验结果(X±SD)

试验结果表明：受试样品相思子毒素对Bel7402等10余种肿瘤细胞均有很强的抑制作用。

试验例3本发明所分离的相思子毒素对动物移植性肿瘤抑制作用的观察试验

一、试验材料

1、受试样品：本发明实施例所分离的相思子毒素(P₁、P₂)，白色粉末。

2、实验动物：中国医学科学院实验动物中心繁育的KM，C57BL品系二级实验动物和中国医学科学院肿瘤所生产的SPF级BALB/C系裸鼠。体重18-22g或16-18g(裸鼠)，合格证号分别为医动字第01-3001，01-3004号和京动许字(1999)第015号。实验动物设施合格证号为：京动管准字(1994)第103号，动物实验设施合格证号为：京动管准字(1996)第007号。

二、试验方法

每次试验分5组，即空白对照组(H₂O 20ml/kg，PO)、阳性对照药组(环磷酰胺CTX 30mg/kg，ip)，受试样品低剂量组(50μg/kg)、受试样品中剂量组(75μg/kg)、受试样品高剂量组(100μg/kg)；口服给药，每组10动物，小鼠性别根据肿瘤性质采用雄性或雌性。每次试验的50只小鼠接种肿瘤后24h，将动物随机分为5组，每组10只，分组标号后，按体重计算给药剂量，并开始给药，每天1次，给药次、10次或14次。

药效评定根据公式：肿瘤生长抑制率＝(1-治疗组瘤重/对照组瘤重)×100％

如抑瘤率超过30％，则进行t测定

三、试验结果：试验结果分别见表7-表13。

表7  受试样品相思子毒素对小鼠移植性肿瘤S180的抑瘤活性观察

与对照组比较，***P＜0.001，**P＜0.01

表8受试样品相思子毒素对小鼠移植性肿瘤Ehrlish癌实体型抑瘤活性观察

与对照组比较，***P＜0.001，*P＜0.05

表9受试样品相思子毒素对小鼠移植性肿瘤H22抑瘤作用观察

与对照组比较，***P＜0.001

表10受试样品相思子毒素对小鼠移植性肿瘤肺癌Lewis抑瘤作用观察

与对照组比较，***P＜0.001

表11受试样品相思子毒素对裸鼠移植的人成骨肉瘤OS732抑瘤作用观察

与对照组比较，***P＜0.001

表12受试样品相思子毒素对津白小鼠移植性乳腺癌CA891的抑瘤作用观察

与对照组比较，***P＜0.001

表13受试样品相思子毒素对小鼠移植性肿瘤艾氏实体瘤抑瘤活性观察

与对照组比较，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

对动物移植性肿瘤抑制作用的观察试验结果表明：本发明所分离的相思子毒素能有效的抑制动物移植性肿瘤的增殖活性。

Claims (10)

1、一种分离、纯化云南相思子(Abrus precatorius L.)毒素P₁、P₂的方法，包括：

(1)将云南相思子粗毒素上酸化的Sepharose4B亲和层析柱，先用初始平衡缓冲洗脱掉杂蛋白，然后用半乳糖梯度洗脱液进行梯度洗脱，收集半乳糖梯度洗脱液的前面两个在280nm处有吸收的峰；

(2)将步骤(1)所收集的洗脱液浓缩后加样于DEAE-SepharoseFF凝胶面上，先用洗脱平衡液洗脱掉杂蛋白；然后用含0-0.5mol/L NaCL的10mmol/LTris-HCL进行梯度洗脱，分别收集在280nm处有吸收的前两个较大的峰，分别浓缩后进行脱盐处理，即得P₁、P₂。

2、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的酸化的Sepharose4B亲和层析柱按照以下方法制备得到：将凝胶Sepharose4B酸化处理，经洗涤、脱气、平衡后装层析柱。

3、按照权利要求2的方法，其特征在于：所述的酸化处理是用盐酸处理凝胶Sepharose4B 5-6小时。

4、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的初始平衡缓冲液是10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4；所述的半乳糖梯度洗脱液为含0-0.5mol/L半乳糖的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4；步骤(2)中所述的洗脱平衡液为10mmol/L的Tris-HCL pH为7.0；

5、按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的脱盐处理如下：以规格为30×2.0cm的SephadexG-25为脱盐柱，将浓缩液上脱盐柱后用水洗脱，流速为0.8ml/min，280nm检测，收集第一主峰。

6、权利要求1-5任何一项方法所分离、纯化得到的云南相思子毒素。

7、按照权利要求6的云南相思子毒素，其特征在于：所述的相思子毒素由P₁和P₂组成；其中，P₁分子量为64000，等电点为6.9，含糖量为9.4％；P₂的分子量在62000-63000之间，等电点为6.0-6.2，含糖量为3.3％。

8、权利要求6的云南相思子毒素在制备抗肿瘤药物中的用途。

9、按照权利要求6的云南相思子毒素，其特征在于：将所述的云南相思子毒素加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形剂或载体后，以常规的药物制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂。

10、一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：该药物组合物由治疗上有效剂量的权利要求6所述的云南相思子毒素和药学上可接受的载体或辅料组成。

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