CN101557799B - 液体抗狂犬病抗体制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含抗狂犬病病毒抗体的药物抗体制剂，特别是液体药物制剂。所述制剂可用于狂犬病的暴露后预防中。
Description
发明领域
本发明涉及药物。本发明特别涉及特异性抗狂犬病抗体的稳定制剂。
发明背景
在过去的十年中，生物技术领域的进展使得可以鉴别、开发和产生多种抗体用于诊断、预防和治疗许多不同疾病和病症。这种抗体的例子是在WO 2005/118644中描述的抗狂犬病病毒抗体。两种这样的抗体CR57和CR4098的抗体混合剂(cocktail)是特别有利的，可用于狂犬病暴露后预防中。在WO 2005/118644中，制备了这些抗体并用于PBS。
与任何蛋白质一样，抗体的生物学活性例如其结合亲和性或者中和活性依赖于至少核心氨基酸序列的构象完整性保持完整同时保护蛋白质的多个功能基团免于降解。化学和物理不稳定性均可导致抗体降解。因为抗体比传统的有机和无机药物更大且更复杂，因此这种抗体的制剂会出现特殊问题。抗体稳定性可以受到这样的因素影响，即离子强度、pH、温度、重复冷冻/解冻循环、抗体浓度和剪切力。活性抗体可以由于物理不稳定性和化学不稳定性的结果而丧失，所述物理不稳定性包括变性、聚集(可溶及不可溶聚集体形成)、沉淀与吸附，所述化学不稳定性包括例如外消旋化、β-消除或者二硫化物交换、水解、脱酰胺作用和氧化等等。任何这些不稳定性均可以潜在地导致具有降低的生物学活性、增加的毒性和/或增加的免疫原性的抗体副产物或者衍生物的形成。
虽然现有技术领域指出了可适用于产生特定抗体的抗体制剂的许多赋形剂的例子，但是不能预测为了克服特定抗体可能具有的特定的不稳定性问题而应该加入哪些赋形剂以及应该加入的量。此外，难以发现在特定制剂内保持特定抗体的化学和生物学稳定性的最佳条件如抗体浓度、pH和贮存温度。鉴于可以变化的所有因素，找寻用于配制单一的单克隆抗体的合适赋形剂和最佳条件孕育着挑战。显然，找寻用于配制在单一制剂中的两种不同的单克隆抗体的合适赋形剂和最佳条件更加困难重重。特别地，本领域未提供含有两种不同的重组单克隆抗体的长期稳定的药物制剂。
因此，本领域需要揭示这样的制剂，即不仅是一种狂犬病病毒的单克隆抗体、而是甚至两种不同的特定单克隆抗体在长期贮存的情况下也是稳定的。贮存稳定性在转运期间的剪切力作用下以及在改变的气候条件下、特别是在温度和空气湿度增加的情况中也应保持。此外，所述制剂应适于指定的给予途径，应良好耐受并且应具有简单结构。
本发明的目的是提供这种制剂。
发明概述
符合本发明要求的制剂已经令人惊奇地以水溶液形式被发现，其除了包含两种不同的单克隆抗体之外还包含柠檬酸盐缓冲液、张力剂和表面活性剂。令人惊奇地发现磷酸盐缓冲液导致特定抗体的不稳定性，甚至这种不稳定性由于加入表面活性剂而增加。本发明因此提供了特异的抗狂犬病病毒抗体CR57和CR4098或其功能变体的制剂。本发明还涉及包含CR57和CR4098二者或其功能变体的抗体制剂。所述制剂除了含有活性成分(抗体)之外还含有柠檬酸盐缓冲液、张力剂和表面活性剂。本发明的制剂在-70℃和5℃可稳定至少一年。
附图描述
通过HP-SEC测量的在40±2℃/75±5％相对湿度条件下贮存0周(白色柱)、2周(黑色柱)和4周(阴影柱)后抗狂犬病病毒抗体CR57(图1)、CR4098(图2)及CR57与CR4098的混合剂(图3)的稳定性。从左至右检测了如下缓冲液系统：柠檬酸盐(20mM，pH 6.0)、柠檬酸盐(20mM，pH 6.5)、磷酸盐(20mM，pH 7.0)、磷酸盐(20mM，0.01％w/v聚山梨醇酯80，pH 7.0)。
发明详述
本发明的制剂至少包含抗体CR57(重链SEQ ID NO：1和轻链SEQ IDNO：2)和抗体CR4098(重链SEQ ID NO：3和轻链SEQ ID NO：4)之一，优选包含这两种抗体。抗狂犬病病毒单克隆抗体CR57和CR4098的鉴别、分离、制备与鉴定已经在并入本文作参考的WO 2005/118644中详细描述。这些抗体的功能变体基于其高度相似性而可以具有相似的物理化学性质，因此也包含在本发明的范围内。本发明定义的功能变体是指这样的抗体，其与CR59或CR4098具有至少95％、优选至少97％、例如至少98％或99％同源的氨基酸序列且能竞争结合由亲代分子(所述亲代分子分别是CR59和CR4098)识别的靶以及具有狂犬病病毒中和活性。抗体的靶是抗原(对于本发明的抗体而言，其靶是狂犬病病毒，特别是其G蛋白)，也可以进一步定义为表位。所述亲代分子的靶已经在WO 2005/118644中揭示，可以通过本领域技术人员已知的常规方法确定与靶的竞争性结合。优选所述功能变体是人抗体，优选是IgG1分子。在优选的实施方案中，功能变体的氨基酸序列与亲代分子至少95％、97％、98％或99％相同。如本文所用，术语“功能变体”是指这样的单克隆抗体，其包含与亲代单克隆抗体的氨基酸序列相比有一或多个氨基酸被改变的氨基酸序列。所述功能变体可具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。氨基酸修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，例如在编码抗体的核酸中进行定点诱变、分子克隆、寡核苷酸指导的诱变和随机PCR介导的诱变。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或化学性质的氨基酸残基取代的那些。本领域已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，无电荷的极性侧链氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支的侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员已知也可以使用除了上述之外的其他类别氨基酸家族。此外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或化学性质的氨基酸残基置换。相似的较小变化也包括氨基酸缺失或插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以找到关于确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除其免疫学活性的指导。本领域技术人员已知的计算机算法例如Gap或者Bestfit可用于优化对比氨基酸序列以对比及限定相似或相同的氨基酸残基。
功能变体与其亲代抗体相比可具有相同或不同(更高或更低)的结合亲和性，但是仍能特异性结合狂犬病病毒或其片段，以及与其亲代抗体相比可具有相同、更高或更低的狂犬病病毒中和活性。
在一个特异的实施方案中，本发明的制剂包含第一种抗狂犬病病毒单克隆抗体和第二种抗狂犬病病毒单克隆抗体，所述第一种抗体具有κ轻链，所述第二种抗体具有λ轻链。这样使得易于确定每种抗体的浓度，因为可以对κ和λ轻链进行特异性ELISA。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单一分子成分的抗体分子制备物。单克隆抗体对于特定表位显示单一的结合特异性和亲和性。本发明制剂中的单克隆抗体(CR57和CR4098及其功能变体)是人抗体且是IgG类抗体，优选IgG1。
产生单克隆抗体的方法为本领域所熟知，见例如并入本文作参考的Antibodies：A Laboratory Manual，Edited by：E.Harlow and D，Lane(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York所述。
术语“特异性结合”是指与抗原或其片段免疫特异性结合，但是与其它抗原非免疫特异性结合。与抗原免疫特异性结合的单克隆抗体可以与其它肽或多肽以较低亲和性结合，例如通过放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIACORE或者本领域已知的其它测定方法确定。与抗原免疫特异性结合的单克隆抗体或其片段可以与相关抗原交叉反应。优选地，与抗原免疫特异性结合的单克隆抗体或其片段与其它抗原不交叉反应。
“药物可接受的赋形剂”是指任何惰性物质，其与活性分子如单克隆抗体组合用以制备适当或适宜的剂型。所述“药物可接受的赋形剂”是在使用剂量和浓度对于接受者无毒性、且与包含单克隆抗体的制剂中的其它成分相容的赋形剂。
术语“副产物”包括不希望得到的产物，其降低或者减少给定制剂中治疗/预防性抗体的比例。典型的副产物包括抗体的聚集体，抗体片段，例如由于脱酰胺作用或水解导致抗体降解而产生的片段，或者其混合物。典型地，聚集体是分子量大于单体抗体分子量的复合物。抗体降解产物可包括例如抗体的片段，例如由于脱酰胺作用或者水解产生的片段。典型地，降解产物是分子量低于单体抗体的复合物。在IgG抗体的情况中，这种降解产物分子量低于大约150kD。
如本文所用，“稳定/稳定化”制剂是指其中的抗体在贮存时基本上保持其物理稳定性/同一性/完整性和/或化学稳定性/同一性和/或完整性和/或生物学活性的制剂。本领域可利用各种测量蛋白质稳定性的分析技术，所述技术在例如Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.DrugDelivery Rev.10：29-90(1993)中综述。稳定性可以在选择的时间在选择的温度及其它贮存条件下测量。稳定性可以通过选自如下的至少一种方法确定：目测，SDS-PAGE，IEF，HPSEC，RFFIT以及κ/λELISA。如果经目测颜色和/或澄清度或者通过UV光散射、SDS-PAGE或者通过(高压)大小排阻层析(HPSEC)测量，单克隆抗体示出无聚集、沉淀和/或变性的迹象时，则其在药物制剂中“保持其物理稳定性”。优选地，当使用本发明的制剂时，通过HPSEC或者测量聚集形成的任何其它合适方法测定，5％或更低、典型为4％或更少、优选3％或更少、更优选2％或更少以及特别是1％或更少的抗体形成聚集体。例如，如果通过HPSEC测量抗体单体在特定制剂中在一定的贮存条件下在一定的预定时间之后具有≥大约90％、优选≥大约95％、特别是≥大约98％的纯度，则认为该抗体在所述特定制剂中是稳定的。因此，CR57和CR4098抗体在本发明的制剂中在5±3℃贮存至少18个月时是稳定的，即HPSEC层析图中单体峰包含＞95％的所有峰的总面积的面积(在表9中可以看出主峰面积甚至＞99％)。化学稳定性可以通过检测和量化蛋白质的化学改变形式而确定。化学改变可包含大小修饰(例如剪切)，这可以例如使用(HP)SEC、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)进行评估。其它类型的化学改变包括电荷改变(例如由于脱酰胺作用的结果而发生)，这可以例如通过离子交换层析方法评估。如果抗体的生物学活性在指定时间是药物制剂在制备时呈现的生物学活性的至少大约90％(在测定误差之内)，则所述药物制剂中所述抗体在指定时间“保持其生物学活性”，这是例如通过抗原结合测定或者病毒中和测定方法确定的。
如本文所用，除非特别指出，则“大约”是指在±10％范围内。
在第一方面中，本发明涉及药物制剂，其包含至少一种活性成分、优选治疗有效量的活性成分以及包含至少一种药物可接受的赋形剂。优选地，所述药物制剂包含柠檬酸盐缓冲液、张力剂、表面活性剂以及两种抗狂犬病病毒单克隆抗体，其中所述抗体彼此不同。所述制剂可以是固体，例如冷冻或冻干的，但是优选是液体，例如水溶液。所述制剂可包含至少两种不同的抗狂犬病病毒单克隆抗体，特别是(i)CR57(具有重链SEQ ID NO：1和轻链SEQ ID NO：2氨基酸序列的抗体)或其功能变体，以及(ii)CR4098(具有重链SEQ ID NO：3和轻链SEQ ID NO：4氨基酸序列的抗体)或其功能变体。
在特定的实施方案中，本发明的制剂具有从大约250IU/ml至大约1500IU/ml的狂犬病病毒中和效力，例如从大约300IU/ml至大约1400IU/ml，典型从大约380IU/ml至大约1350IU/ml。本领域技术人员熟知测量狂犬病病毒中和作用的方法。中和作用可例如如Laboratory techniques in rabies，Edited by：F.-X.Meslin，M.M.Kaplan and H.Koprowski(1996)，第4版第15-17章，World Health Organization，Geneva所述。中和活性的适当且已知的测定方法是RFFIT测定法。
在一个实施方案中，在5±3℃温度下贮存12个月后，本发明制剂的狂犬病病毒中和效力是本发明制剂贮存前的狂犬病病毒中和效力的至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％，尤其是100％。在某些实施方案中，在25±2℃温度下贮存3个月后，本发明制剂的狂犬病病毒中和效力是本发明制剂贮存前的狂犬病病毒中和效力的至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，尤其是100％。
本发明的制剂包含表面活性剂，也称作稳定剂。表面活性剂可包括但非限于聚山梨醇酯。本领域技术人员意识到其它表面活性剂例如非离子型或者离子型去污剂也可以用作表面活性剂，只要其是药物可接受的即可，即其适于给予人体。在一个优选的实施方案中，本发明提供了这样的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65或者聚山梨醇酯80，优选聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的量是大约0.0005％w/v至大约0.05％w/v，优选大约0.005％w/v至大约0.03％w/v，更优选大约0.008％w/v至大约0.015％w/v。在一个优选的实施方案中，聚山梨醇酯80的存在量是大约0.01％w/v。
在某些实施方案中，本发明提供了这样的制剂，其中柠檬酸盐缓冲液例如二水柠檬酸钠(sodium citrate dehydrate)(2.5mg/ml)/一水柠檬酸(0.3mg/ml)缓冲液的浓度是大约5mM至大约25mM，优选大约7mM至大约20mM，更优选大约8mM至大约15mM，特别优选大约9mM至大约12mM。在一个优选的实施方案中，所述柠檬酸盐缓冲液的存在浓度是大约10mM。
在某些实施方案中，本发明涉及这样的制剂，其中pH范围是大约5.2至大约6.8，典型是大约5.5至大约6.5，优选大约5.7至大约6.3，更优选大约5.8至大约6.2，特别是大约5.9至大约6.1。在一个优选的实施方案中，所述pH为大约6.0。
在一个特定的非限制性实施方案中，张力剂是氯化钠。正如本领域技术人员所已知，例如其它盐也可以用作张力剂，或者例如糖等也可以用作张力剂，只要其是药物可接受的即可。在本发明的某些实施方案中，所述张力剂的存在量是大约50mM至大约250mM，典型是大约75mM至大约225mM，优选大约100mM至大约200mM，更优选大约125mM至大约175mM。在一个优选的实施方案中，所述张力剂的存在浓度是大约150mM。在某些实施方案中，本发明制剂的渗透压是大约250mOsm/kg至大约350mOsm/kg，优选大约270mOsm/kg至大约330mOsm/kg，更优选大约280mOsm/kg至大约320mOsm/kg，特别优选大约290mOsm/kg至大约310mOsm/kg。在一个优选的实施方案中，所述渗透压是大约300mOsm/kg。换句话说，所述制剂优选是基本等渗的，即与人体血液具有基本相同的渗透压力。等渗性可例如通过使用蒸汽压或者冰冻型渗透压计测量。本发明制剂的渗透压可例如通过一或多种张力剂调节。
本发明制剂中每种抗体的浓度优选是在大约0.1与2.0mg/ml之间，典型是在大约0.1与1mg/ml之间。在某些非限制性实施方案中，每种抗体的浓度是0.15(±20％)mg/ml。在其它非限制性实施方案中，每种抗体的存在浓度是0.3(±20％)mg/ml(即两种抗体共0.6mg/ml)。
在某些实施方案中，两种抗体的(蛋白质)比率在5∶1与1∶5之间，优选在2∶1与1∶2之间，特别是大约1∶1。
此外，本发明的制剂可包含其它赋形剂，包括但不限于氨基酸及其盐、糖、蛋白质、稀释剂、增溶剂、pH调节剂、安抚剂、其它缓冲液、其它无机盐或有机盐、抗氧化剂等。然而，本发明的制剂优选除了柠檬酸盐缓冲液、张力剂和表面活性剂之外几乎不含有其它赋形剂。
在本发明的制剂中，所述抗狂犬病病毒单克隆抗体CR57和CR4098在大约2℃至大约8℃可稳定至少大约1年，典型可稳定至少大约18个月。优选其在大约2-8℃可稳定至少大约2年、更优选3年。
此外，本发明制剂中抗狂犬病病毒单克隆抗体在大约25±2℃可稳定至少2个月。除此之外，本发明制剂中抗狂犬病病毒单克隆抗体在大约40±2℃可稳定至少2周。
在某些实施方案中，所述制剂适于肌内、皮内、皮下、局部注射至伤口或者这些组合方式给予。因此，所述制剂优选是无菌的。生产所述制剂的方法为本领域所熟知，包括例如通过过滤灭菌膜过滤或者对除了抗体之外的制剂成分在大约120℃高压灭菌大约30分钟。
在优选的实施方案中，所述制剂基本上没有内毒素。内毒素是大约10kDa的低分子量复合物，其与革兰氏阴性菌的细胞壁外部结合，在胃肠外给予患者时可产生发热反应。因此，FDA已经规定了在一小时静脉内给予药物的上限是5EU每剂每kg体重(见例如The United StatesPharmacopeial Convention(USP)，Pharmacopeial Forum 26(1)：223(2000))。在某些实施方案中，所述制剂的内毒素浓度低于大约5.0内毒素单位每毫升(EU/ml)(浓度低于大约5.0EU/ml在本文称作基本上没有内毒素)，优选低于大约2.5EU/ml，更优选低于大约1.0EU/ml，甚至更优选低于大约0.5EU/ml，特别是低于大约0.30EU/ml。在某个实施方案中，所述制剂的内毒素浓度范围是大约0.001EU/ml至大约5.0EU/ml。测量内毒素的方法为本领域技术人员所已知，包括但不限于胶凝测定法、比浊(分光光度)测定法和显色测定法。
“暴露后预防”(PEP)是指针对可能暴露于狂犬病动物的人进行预防。可能的暴露包括咬伤暴露(即牙齿对皮肤的任何穿透)包括动物咬伤以及非咬伤暴露。本发明的制剂可以给予需要其的对象用于预防和/或治疗狂犬病病毒感染例如进行暴露后预防。本发明的制剂可以与用于诊断、预防和/或治疗狂犬病病毒的其它分子联合应用。例如，它们可以与狂犬病病毒疫苗共同给予。或者，所述疫苗也可以在给予本发明的制剂之前或之后给予。给予本发明的制剂与疫苗适于进行暴露后预防。狂犬病疫苗包括但不限于纯化的鸡胚细胞(PCEC)疫苗(RabAvert，Rabipur)、人二倍体细胞疫苗(HDCV；Imovax疫苗)或者吸附型狂犬病疫苗(RVA)。优选地，给予一次推注本发明的制剂。暴露后预防的给药方案是先前未进行狂犬病免疫接种的个体在暴露后第0、3、7、14和28天在三角肌通过肌内给予5剂狂犬病疫苗。本发明的制剂应在暴露后第0天或者尽可能迅速地给予伤口内或伤口周围，剩余量在远离疫苗的部位肌内给予。告知未免疫接种的个体给予抗狂犬病病毒抗体。给予治疗有效量的抗体，该量对于狂犬病PEP是有效或者至少部分有效的，即狂犬病病毒被中和。
另一方面，本发明提供了药物单位剂量形式，其包含有效量的本发明制剂，通过给予对象该剂量形式以暴露后预防性治疗对象。在一个优选的实施方案中，所述对象是人。人可以是成年人或者可以是婴幼儿。如本文所用，术语“药物单位剂量形式”是指适于作为单位剂量给予被治疗对象的物理分立单位，每单位含有经计算产生预期治疗/预防作用的预定数量的活性化合物以及含有必需的药物载体、稀释剂或赋形剂。
所述单位剂量形式可以是包含所述制剂的容器。合适的容器包括但不限于密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管。所述容器可以是由各种材质制成，例如玻璃或塑料，且可具有无菌存取端(例如该容器可以是具有皮下注射针可穿透的塞子的小瓶)。在一个优选的实施方案中，所述容器是小瓶。所述小瓶优选包含大约0.3ml至大约3ml体积。优选地，所述小瓶含有大约0.1mg至大约2.0mg量的抗狂犬病病毒抗体。在一个实施方案中，所述小瓶每瓶含有共750-2000IU的狂犬病病毒中和单克隆抗体。这种类型的小瓶可适用于给予成人，而每瓶共含有250-750IU狂犬病病毒中和单克隆抗体的小瓶适用于给予婴幼儿。所述抗体在本发明的制剂中典型以治疗有效量配制。可以对给药方案进行调整以提供最佳的预期应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是10-30IU/kg体重，如大约20IU/kg体重。
所述药物单位剂量形式可以存在于试剂盒中，所述试剂盒中进一步包含使用说明书。所述试剂盒可进一步包括包含药物可接受的赋形剂的更多容器，且包括为商业和使用观点所需的其它材料，包括过滤器、针头、注射器。与所述试剂盒连带的是说明书，其通常包含在治疗、预防或诊断产品的商业包装中，含有关于例如与这种治疗、预防或诊断产品的使用相关的适应症、用法、剂量、制造、给予、禁忌症和/或警告的信息。在某些实施方案中，所述试剂盒包含使用达到大约5IU/kg至大约40IU/kg、例如20IU/kg剂量所需的合适体积的说明书。
此外，本发明涉及改善一种制剂中的两种抗狂犬病病毒单克隆抗体的贮存的方法，通过将抗体(CR57和CR4098或其功能变体)配制成本发明的液体药物制剂而进行。所述制剂可以在大约2℃至大约40℃的温度贮存，例如在大约2-8℃之间贮存。然而，所述制剂也可以在低于2℃的温度下贮存，例如在大约-20℃、-70℃等温度贮存。通过将抗体在本发明的特异制剂中贮存降低了抗体的副产物形成量。就实际应用而言，优选在混合之前将CR57与CR4098抗体单独冷冻贮存，例如在-70±10℃冷冻贮存，而终产物(CR57与CR4098的混合剂)优选以液体形式在5±3℃贮存。
另一方面，本发明还涉及液体药物制剂，其包含单一的抗狂犬病病毒单克隆抗体，即抗体CR57或者CR4098或者其一的功能变体。优选地，这些制剂包含如上所述的所有特征和赋形剂。因此，在优选的实施方案中，它们含有柠檬酸盐缓冲液(5-25mM)，pH为5.5-6.5，例如pH为大约6.0；含有张力剂(例如氯化钠，50-250mM，例如大约150mM)；包含表面活性剂，例如聚山梨醇酯80(0.0005％-0.05％，例如大约0.01％)，且优选基本上是等渗、无菌的并且基本上没有内毒素。下文指出了可能与上述包含两种不同抗狂犬病病毒单克隆抗体的制剂不同的特征和赋形剂。
在某些实施方案中，本发明的制剂可以包含单一的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其量为大约0.1mg/ml至大约6.0mg/ml，典型为大约1.0mg/ml至大约4.0mg/ml，例如大约2.0mg/ml至大约3.0mg/ml。在特定的实施方案中，所述制剂的狂犬病病毒中和效力范围是大约300IU/mg至大约1600IU/mg，例如是大约500IU/mg至大约1250IU/mg。包含上述单一抗体的制剂可以与另一种组合/混合以获得包含两种抗体即抗体混合剂的本发明制剂。
实施例
为了阐述本发明提供了如下实施例。所述实施例不以任何方式限制本发明的范围。除非特别指出，通常本发明采用常规的化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学如抗体技术和标准多肽制备技术，如Sambrook，Fritsch and Maniatis，Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)，volume 51，Ed.：Paul S.，Humana Press(1996)、Antibody Engineering：APractical Approach(Practical Approach Series，169)，Eds.：McCafferty J.et al.，Humana Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)以及Current Protocols inMolecular Biology，Eds.Ausubel et al.，John Wiley & Sons(1992)中所述技术。
CR57和CR4098抗体的氨基酸序列在表10中示出。这些中和性抗狂犬病病毒抗体的鉴别、克隆、制备与鉴定已经在WO 2005/118644中详细描述。所述抗体以基本相似的方式大规模生产。将稳定表达抗狂犬病病毒抗体的PER.C6细胞的起始培养物解冻，培养该细胞并扩增培养物并用于接种生物反应器。首先将该生物反应器以分批模式(bach mode)运转，随后以补料分批模式(fed-batch mode)运转。收获含有各自抗体的培养基并通过离心和过滤澄清，之后进行进一步下游处理。所述下游纯化过程由标准的层析和过滤步骤组成，随后缓冲液交换成无聚山梨醇酯80的配制缓冲液并浓缩获得希望的抗体浓度。在加入聚山梨醇酯80和过滤之后，将获得的药物物质(抗体CR57或者抗体CR4098)在-80℃贮存直至进一步使用。为了生产药物制品，将药物物质用配制缓冲液稀释，测量抗体浓度，混合两种抗体稀释液并过滤，之后最终填充。
为了进行稳定性研究，制备并分析药物物质(单一抗体)与药物制品(抗体混合剂)的不同制剂。使用本领域熟知的各种分析方法在不同时间点和温度分析不同制剂的样品。
使用HPSEC、SDS-PAGE(还原性与非还原性)、蛋白质浓度(A280)、IEF、外观、pH和渗透压评估不同配制缓冲液对于CR57抗体、CR4098抗体及其混合物的稳定化作用。
HPSEC用于部分评定由于聚集或者蛋白酶解而导致的抗体降解产物的存在情况。SDS-PAGE用于部分评定完整抗体的完整性以及杂质和潜在的降解产物的存在情况。测量蛋白质浓度以评定所述制剂的蛋白质浓度在可接受范围内的保持情况。IEF用于评定所述制剂中可能存在的抗体同种型的存在和完整性并对其进行全程监测以评定由于脱酰胺作用或者唾液酸丧失而可能发生的变化。基于目测所述制剂的澄清度、颜色和颗粒物的存在观察其外观。测量pH以评定所述制剂的pH保持在可接受的大约5.5至大约6.5的范围内。测量渗透压以评定所述制剂的渗透压保持在可接受的大约250mOsm/kg至大约350mOsm/kg范围内。
在第一项研究中检测不同的缓冲液系统。为此将在柠檬酸盐缓冲液中配制的抗狂犬病病毒抗体制剂与在磷酸盐缓冲液中配制的抗狂犬病病毒抗体制剂进行对比。如HPSEC分析所示出，包含在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)或者20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.5)中的CR57(0.1mg/ml)、CR4098(0.15mg/ml)或CR57(0.1mg/ml)与CR4098(0.15mg/ml)的混合物/混合剂(1∶1.5混合物)的制剂在5±3℃/环境相对湿度、25±2℃/60±5％相对湿度以及40±2℃/75±5％相对湿度的条件下贮存直至4周是稳定的。通过HPSEC确定，所有制剂均具有＞96％的抗体单体纯度(面积％)(见图1-3)。在20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中包含CR57(0.1mg/ml)、CR4098(0.15mg/ml)或者CR57(0.1mg/ml)与CR4098(0.15mg/ml)的混合物(1∶1.5混合物)的制剂与相同时间及相同温度条件下在柠檬酸盐缓冲液中的制剂相比在40±2℃/75±5％相对湿度贮存直至4周条件下其抗体单体的纯度明显较低(见图1-3)。当将聚山梨醇酯80(0.01％w/v)加入磷酸盐缓冲液中时，在40±2℃/75±5％相对湿度贮存直至4周的条件下，抗体单体的纯度进一步降低，对于CR4098而言降低至大约70％，对于CR57及混合物而言降低至大约85％(见图1-3)。该结果显然示出单独的抗体以及抗体混合物的稳定性在柠檬酸盐缓冲液中优于在磷酸盐缓冲液中的稳定性。在磷酸盐缓冲液中，抗体通过断裂而降解。所述抗体在包含pH 6.0和pH 6.5的柠檬酸盐缓冲液的制剂中相同程度稳定。此外，总结出在磷酸盐缓冲液中加入聚山梨醇酯80产生额外的抗体杂质。基于HPSEC的结果通过其它分析方法证实，所述其它分析方法包括IEF和SDS-PAGE(还原性和非还原性)(数据未示出)。基于研究结果，柠檬酸盐缓冲液用作缓冲液系统。
为了确定所述制剂的最佳表面活性剂浓度，分析了包含不同聚山梨醇酯80浓度的基于柠檬酸盐的制剂(见表1)。所述制剂如下制备。基本如上所述制备抗体CR57和CR4098(药物物质)。将它们用0.1μm滤器过滤。通过A280蛋白质浓度测定法测定蛋白质浓度在过滤之前与之后是相同的。CR57的浓度为2.5mg/ml，CR4098的浓度为1.0mg/ml。随后制备含有10mM柠檬酸盐(pH 6.0)和50mM氯化钠的缓冲液以及含有10mM柠檬酸盐(pH6.0)、50mM氯化钠和5％聚山梨醇酯80的缓冲液。如表2所述制备所述制剂。用含有10mM柠檬酸盐(pH 6.0)和50mM氯化钠的缓冲液达到终体积。确定所有制剂的渗透压，加入氯化钠以使得所述制剂的渗透压达到大约300mOsm/kg(等渗的)，即所述制剂中氯化钠的终浓度为150mM。最后，用0.22μm滤器对所有制剂进行过滤，并滤出(400μl)到2ml Eppendorf杯中用于所有检测，除了外观测试、摇动研究和pH分析之外，其中使用用20mm塞子盖上并用铝帽密封的5ml注射瓶(填充2ml样品)。将所述制剂在5±3℃/环境相对湿度、25±2℃/60±5％相对湿度或者40±2℃/75±5％相对湿度条件下贮存在稳定性盒中。在指定时间点取两种样品，根据表3所示时间表进行分析。
如上所述，通过A280蛋白质浓度确定法测定蛋白质浓度在过滤之前与之后是相同的。
HPSEC分析的结果示于表4。使用等度洗脱方法通过HPSEC分离蛋白质成分，这样可以快速分析和高度分辨蛋白质成分，且还具有改善的重复性。结果示出在t＝0周时，通过HPSEC确定所有制剂的纯度均为98-100％。在5±3℃/环境相对湿度(即2-8℃/环境相对湿度)条件下，所有制剂在t＝13周(以及在t＝0与t＝13周之间所有中间时间点)均示出与在t＝0周相似的纯度，表明在这个温度下的稳定性为至少13周。仅制剂2在t＝8和t＝13周的纯度略低于98％。此外，从表4中可以总结出，所有制剂在25±2℃/60±5％相对湿度在所有时间点均示出纯度高于95％，表明所述抗体在这个温度下也稳定至少13周。在升高温度40±2℃/75±5％相对湿度条件下，所有制剂在前两周均示出纯度＞95％，表明所述抗体在这个升高的温度下可稳定至少两周。在超过两周的所有时间点，所有制剂均示出纯度高于大约90％，表明所述抗体在这个升高的温度下相对稳定至少13周。这种方法发现的杂质包括抗体单体的聚集体和片段。该结果进一步表明具有0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂与具有0.03％(w/v)聚山梨醇酯80的相似制剂相比具有较高的纯度(对比制剂1与2，制剂3与4，以及制剂5与6的纯度)。在这两种聚山梨醇酯浓度下观测到相同杂质。
SDS-PAGE分析的结果与HPSEC的数据一致。基于非还原性和还原性SDS-PAGE分析，在5±3℃/环境相对湿度和25±2℃/60±5％相对湿度条件下贮存的制剂当与参考标准对比时示出在所有时间点均无明显降解迹象，而在40±2℃/75±5％相对湿度条件下贮存的制剂在不同时间点示出一些微弱降解(数据未示出)。所有制剂在不同聚山梨醇酯80浓度之间未观测到差异。
通过SDS-PAGE对抗体样品的鉴别仅证实抗体的完整性，但是其未例证抗体的天然或变性状态。IEF例证了抗体的pI，有助于显示抗体构象的微不均一性。IEF与SDS-PAGE的组合是检测抗体结构和性质中微小差异的有力工具。基于IEF结果，发现所有制剂在不同聚山梨醇酯80浓度之间无显著差异(数据未示出)。当所述制剂在40±2℃/75±5％相对湿度条件下贮存时，在t＝6周时间点观测到较小的降解(很可能由于脱酰胺作用导致)。
对在5±3℃/环境相对湿度、25±2℃/60±5％相对湿度和40±2℃/75±5％相对湿度条件下贮存的所有制剂的澄清度和颜色进行目测，示出所述制剂在直至t＝13周几乎没有颗粒，尽管观测到当在较高温度贮存时具有颗粒的制剂量略有增加。包含CR57和CR4098及0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂与包含CR57和CR4098及0.03％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂相比含有较少的颗粒。摇动研究表明每个制剂的外观无差异。所有制剂的pH值在贮存期间在指定温度和时间无明显变化。
在稳定性研究期间，当保持在25±2℃/60±5％相对湿度和40±2℃/75±5％相对湿度条件下时，所有制剂的渗透压数值均示出极小量增加。包含0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂与包含0.03％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂相比无显著差异。
总之，研究结果表明单一抗狂犬病病毒抗体以及抗狂犬病病毒抗体的混合物/混合剂在5±3℃/环境相对湿度、25±2℃/60±5％相对湿度和40±2℃/75±5％相对湿度条件下在包含0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的基于柠檬酸盐的制剂中在13周后均具有最好的稳定性。
在进一步的研究中，对在5±3℃和-70±10℃这两个温度下贮存的制剂进行研究，所述制剂包含柠檬酸盐(10mM，pH 6.0)、氯化钠(150mM)、0.01％(w/v)聚山梨醇酯80以及单一抗体CR57(1.2mg/ml)或者CR4098(1.2mg/ml)。将制剂(250μl)填入1.2ml试管中进行IEF、SDS-PAGE(还原性和非还原性)和HPSEC分析。对于pH和外观分析，使用充填2ml制剂的2ml试管。所述制剂在5±3℃或者-70±10℃贮存在稳定性盒中。在指定时间点(1、2和3个月)取样分析。研究结果见表5和表6。
对在这两个温度下的CR57和CR4098制剂的SDS-PAGE分析(还原性和非还原性分析均进行)表明抗体的完整性保持至少3个月，与t＝0月相比观测到无额外降解条带。这些结果通过IEF和HPSEC这两种分析证实，示出在5±3℃/环境相对湿度或者-70±10℃条件下所述抗体结构和聚集体水平在3个月后与t＝0月无差异。另外，蛋白质浓度和pH随着时间无显著变化。对每个制剂进行目测均示出清澈无色液体，几乎没有颗粒。
对在-70±10℃贮存的制剂在贮存1个月或3个月后进行一次额外的冷冻/解冻循环，基于上述测定示出与t＝0月相比无显著差异，所述测定即SDS-PAGE(还原性和非还原性)、HPSEC、IEF、外观、OD280和pH(数据未示出)。
总而言之，结果表明抗体CR57和CR4098在5±3℃/环境相对湿度和在-70±10℃条件下在包含柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)、聚山梨醇酯80(0.01％w/v)和氯化钠(150mM)的制剂中是稳定的，从而证实上述结果。另外，在-70±10℃贮存的抗体样品在长期贮存后(t＝1或t＝3月)的额外冷冻/解冻循环对于抗体CR57或CR4098的稳定性无影响。
在相似的稳定性研究中，对在5±3℃和-70±10℃这两个温度下贮存超过3个月的制剂进行了研究，所述制剂包含柠檬酸盐(10mM，pH6.0)、氯化钠(150mM)、0.01％(w/v)聚山梨醇酯80和单一抗体CR57(2.47mg/ml)或者CR4098(2.48mg/ml)。通过0.22μm滤器过滤制剂，并滤出到聚丙烯试管(4ml)中。另外，对在两个不同温度即5±3℃和-70±10℃下贮存直至6个月的CR57与CR4098抗体组合进行研究，所述组合基于蛋白质含量(每种抗体0.3mg/ml，总蛋白质浓度为0.6mg/ml)以1∶1比率组合。通过0.22μm滤器过滤包含抗体混合剂/混合物的制剂并滤出到玻璃小瓶(2.6ml)中。使用如下分析方法检测所述制剂：SDS-PAGE(还原性和非还原性)、IEF、HPSEC、RFFIT、外观、pH(见表7和表8)。对具有CR57/CR4098组合的制剂还进行κ/λELISA和渗透压检测(见表9)。此外，确定包含单一抗体或者抗体混合剂的制剂在t＝0月的内毒素水平。使用胶凝技术，通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测定法评定内毒素水平。包含CR57的制剂含有＜0.30EU/ml，包含CR4098的制剂含有＜0.30EU/ml，包含两种抗体的混合剂的制剂含有＜0.24EU/ml。将所述制剂在-70±10℃、5±3℃、25±2℃或者40±2℃温度在稳定性盒中贮存指定时间。
分析贮存6个月以上的含有单一抗体的制剂并与在t＝0月获得的初始结果对比。在-70±10℃和5±3℃温度贮存1、2、3和6个月的CR57和CR4098制剂的IEF及SDS-PAGE条带模式分别与在t＝0月的CR57和CR4098制剂的条带模式相似(见表7和表8)。检测到无额外条带。在-70±10℃和5±3℃温度贮存6个月的这两种抗体的HPSEC模式与在t＝0月的模式非常相似。“主峰面积＞95％”的目标说明(target specification)在所有情况中均符合。二聚体峰保持＜1％(表面面积)，在检测的任何样品中均无降解峰。
基于这三种方法获得的结果总结出CR57和CR4098在指定制剂中在-70±10℃和5±3℃温度贮存6个月期间均未发生降解。
此外，在-70±10℃和5±3℃贮存的所述制剂中CR57和CR4098的蛋白质含量和pH在6个月的检测时期均是稳定的。效力分析(RFFIT-测定)表明在两种检测条件下(即-70±10℃和5±3℃)这两种抗体在第2、3和6个月时间点与在t＝0月和t＝1月时间点相比增加的效力值。这种效力的明显增加是由于在该测定中用作阳性参考的不稳定SRIG对照样品引起的(见Laboratory techniques in rabies，Edited by：F.-X.Meslin，M.M.Kaplan and H.Koprowski(1996)，4th edition，Chapters 15-17，World Health Organization，Geneva.)。这种作用通过将该结果表示为50％中和终点效价而消除(数据未示出)。基于这些结果总结出指定制剂中CR57和CR4098在这两种贮存条件下示出直至至少6个月的稳定终点效价及因此的稳定效力。
总之，基于这些结果认为在包含柠檬酸盐(10mM，pH6.0)、氯化钠(150mM)和0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂中CR57和CR4098在-70±10℃的实时贮存条件下稳定至少6个月以及在5±3℃的加速条件下稳定至少6个月。
分析在更长期贮存后的稳定性。基于SDS-PAGE(NR+R)、IEF、HP-SEC、RFFIT和OD280获得的稳定性结果总结出在包含柠檬酸盐(10mM，pH 6.0)、氯化钠(150mM)和0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂中CR57和CR4098在-70±10℃贮存条件下稳定至少18个月以及在5±3℃加速条件下稳定至少12个月(在9个月后发现相似结果，数据未示出)。
分析贮存超过6个月的含有抗体CR57和CR4098的混合剂的制剂并与在t＝0月获得的初始结果对比。6个月后，在5±3℃和25±2℃贮存的所述混合剂的外观保持在目标说明范围内，即所述混合剂/混合物是澄清无色液体，几乎没有颗粒(见表9)。此外，观测到当在40±2℃贮存直至3个月时所述抗体混合剂仍保持在目标说明范围内。
监测在5±3℃和25±2℃在t＝0月和t＝6月的pH和渗透压，以及在40℃±2℃的1和3个月时间点的pH和渗透压。所有数据均在目标说明范围内。
此外，所述抗体混合剂示出在5±3℃和25±2℃直至6个月的稳定效力(见表9)。在40±2℃贮存3个月后获得略微降低的效力值。所有数据均在大约380至大约1350IU/ml的目标说明范围内。
如通过OD280确定，所述抗体混合剂中存在的总蛋白质量在40±2℃贮存3个月以及在5±3℃和25±2℃贮存6个月期间是稳定的。
IgGκ和λELISA结果(即以抗体混合剂中两种抗体的比率表示)在5±3℃和25±2℃温度贮存直至6个月保持在目标说明范围内，在40±2℃贮存直至3个月保持在目标说明范围内。基于这些结果总结出抗体混合剂中CR57和CR4098含量在5±3℃和25±2℃贮存6个月以及在40±2℃贮存3个月期间不改变。在5±3℃贮存6个月的抗体混合剂的IEF凝胶模式与在t＝0月时相似(见表9)。在25±2℃贮存的样品中在3和6个月后观测到额外条带，在40±2℃贮存的样品中在1和3个月后检测到几条额外条带(见表9)。在升高的贮存温度获得的这些额外条带可能是降解的最初指征。
6个月后，在5±3℃贮存的抗体混合剂的SDS-PAGE(还原性和非还原性)条带模式与在t＝0月的条带模式相似(见表9)。经检测无额外条带。在25±2℃贮存直至3个月的抗体混合剂在还原性SDS-PAGE条件下示出与在t＝0月的条带模式相同的条带模式。在非还原性条件下，在25±2℃贮存3个月后观测到大小为大约43kDa的微弱条带。在25±2℃贮存6个月后，还原性和非还原性SDS-PAGE分析示出～40kDa的微弱条带。通过SDS-PAGE分析(还原性和非还原性)在40±2℃贮存的抗体混合剂获得相似结果。此外，在这个贮存条件下检测到大小为10-15kDa的较小条带。基于这些结果总结出在25±2℃和40±2℃温度下CR57和CR4098的重链和/或轻链随时间可能发生一些降解。
在5±3℃和在25±2℃温度贮存直至6个月的抗体混合剂的HPSEC模式与在t＝0月时的模式非常相似。“主峰面积＞95％”的目标说明在所有情况中均符合(见表9)。二聚体峰保持＜1％(表面面积)，在检测的任何样品中均无降解峰。与在所述两个较低温度下贮存的抗体混合剂相比，在40±2℃贮存的抗体混合剂在3个月后示出较少降解，以及略微增加的二聚体峰(2.6％(表面面积))。然而，即使在40±2℃，“主峰面积＞95％”的目标说明在检测的所有贮存时期均符合(见表9)。
基于后三种方法获得的结果总结出在5±3℃或者25±2℃温度贮存6个月期间所述抗体混合剂中的抗体未发生明显降解，在40±2℃温度贮存直至3个月后观测到一些较微弱的聚集和降解。
简而言之，总结出所述抗体混合剂在5±3℃及25±2℃贮存条件下稳定至少6个月，在40±2℃贮存条件下稳定至少3个月。
基于12个月后通过SDS-PAGE(NR+R)、IEF、HP-SEC、RFFIT、κ/λELISA获得的结果(在9个月后获得相似结果；数据未示出)总结出所述抗体混合剂在5±3℃贮存条件下稳定至少12个月。
基于18个月后的分析测定获得的结果(SDS-PAGE、IEF、HP-SEC、ELISA；数据未示出)总结出所述抗体混合剂在5±3℃贮存条件下稳定至少18个月。
表1：抗体制剂的成分
| 编号 | 抗体 | 柠檬酸盐缓冲液(mM) | NaCl(mM) | 聚山梨醇酯80(％w/v) | pH |
| 1 | 0.3mg/mlCR57 | 10 | 150 | 0.01 | 6.0 |
| 2 | 0.3mg/ml CR57 | 10 | 150 | 0.03 | 6.0 |
| 3 | 0.3mg/ml CR4098 | 10 | 150 | 0.01 | 6.0 |
| 4 | 0.3mg/ml CR4098 | 10 | 150 | 0.03 | 6.0 |
| 5 | 0.3mg/ml CR57+0.3mg/ml CR4098 | 10 | 150 | 0.01 | 6.0 |
| 6 | 0.3mg/ml CR57+0.3mg/ml CR4098 | 10 | 150 | 0.03 | 6.0 |
表2：制剂的制备
| 编号 | 抗体CR57(2.5mg/ml)(ml) | 抗体CR4098(1.0mg/ml)(ml) | 5％w/v聚山梨醇酯80(ml) | 终体积(ml) |
| 1 | 4.20 | 0.00 | 0.70 | 35.00 |
| 2 | 4.20 | 0.00 | 2.10 | 35.00 |
| 3 | 0.00 | 10.50 | 0.70 | 35.00 |
| 4 | 0.00 | 10.50 | 2.10 | 35.00 |
| 5 | 4.20 | 10.50 | 0.70 | 35.00 |
| 6 | 4.20 | 10.50 | 2.10 | 35.00 |
表3：在指定时间点利用指定方法对各种制剂样品的分析
| 时间点(周) | 5±3℃/环境相对湿度 | 25±2℃/60±5％相对湿度 | 40±2℃/75±5％相对湿度 |
| 0 | A-G | A-G | A-G |
| 2 | B，E | B，E | B，E |
| 6 | B-E | B-E | B-E |
| 8 | B-E | B-E | B-E |
| 13 | C-E | C-E | C-E |
A：蛋白质浓度(A280)
B：HPSEC
C：SDS-PAGE(还原性与非还原性)
D：IEF
E：外观
F：pH
G：渗透压
表4：通过HPSEC确定的抗体单体的纯度(面积％)
ND：未确定
表5：在指定时间点利用指定方法对各种制剂样品的分析
-：未检测到意料之外的条带
表6：在指定时间点利用指定方法对各种制剂样品的分析
+：认可的(清澈无色且几乎无颗粒)
ND：未确定
表7：CR57的稳定性检测
ND：未确定
#：CR57工作标准(WS)和CR4098WS
+：符合目标说明
表8：CR4098的稳定性检测
ND：未确定
#：CR57工作标准(WS)和CR4098WS
+：符合目标说明
表9：抗体混合剂的稳定性检测
ND：未确定
#：工作标准(WS)CR57和CR4098抗体混合剂
+：符合目标说明
+1：清澈无色液体，＞10个颗粒/ml
+2：条带模式与WS#相当且含有微弱的其它杂质条带，大小为大约43kDa
+3：条带模式与WS#相当且含有微弱的其它杂质条带，大小为大约10、15和43kDa
+4：偏差、微弱条带看起来为大约40kDa
+5：条带模式与WS#相当且含有微弱的其他杂质条带，大小为大约10kDa、15kDa以及25-50kDa
+6：条带模式符合WS#；在8.0-8.5pI区域的较高染色强度
+7：偏差、微弱条带看起来低于pI 7.5，在8.0-8.5pI区域的不同染色强度
+8：条带模式符合WS#以及微弱的其它条带(pI 7.2，7.3，8.6)
+9：条带模式符合WS#以及微弱的其它条带(pI范围6.3-7.4和pI 8.6)
表10：CR57和CR4098的序列
A.CR57
重链(SEQ ID NO：1)
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFN RYTVNWVRQA PGQGLEWMGG IIPIFGTANY 60
AQRFQGRLTI TADESTSTAY MELSSLRSDD TAVYFCAREN LDNSGTYYYF SGWFDPWGQG 120
TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF 180
PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP 240
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK 300
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT 360
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL 420
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 457
轻链(SEQIDNO：2)
QSALTQPRSV SGSPGQSVTI SCTGTSSDIG GYNFVSWYQQ HPGKAPKLMI YDATKRPSGV 60
PDRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYYC CSYAGDYTPG VVFGGGTKLT VLGQPKAAPS 120
VTLFPPSSEE LQANKATLVC LISDFYPGAV TVAWKADSSP VKAGVETTTP SKQSNNKYAA 180
SSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQ VTHEGSTVEK TVAPTECS 218
B.CR4098
重链(SEQIDNO：3)
QVQLVESGGG AVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAV ILYDGSDKFY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVA VAGTHFDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG 180
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP 240
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 300
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM 360
TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ 420
QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK 449
轻链(SEQIDNO：4)
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NDLGWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ LNSYPPTFGG GTKVEIKTVA APSVFIFPPS 120
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL 180
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 213
Claims (13)
1.两种抗狂犬病单克隆抗体的药物制剂，其在2℃至8℃之间的温度下稳定至少12个月，所述制剂包含：
(i)0.3mg/ml的抗狂犬病病毒单克隆抗体CR57，其重链序列示于SEQID NO：1，其轻链序列示于SEQ ID NO：2；及
(ii)0.3mg/ml的抗狂犬病病毒单克隆抗体CR4098，其重链序列示于SEQ ID NO：3，其轻链序列示于SEQ ID NO：4；
其中所述制剂包含10mM的柠檬酸盐缓冲液、浓度为150mM的氯化钠和0.01％w/v的聚山梨醇酯80，其中pH为6.0。
2.权利要求1的制剂，其中渗透压为300mOsm/kg。
3.权利要求1的制剂，其中所述制剂是无菌的。
4.权利要求1的制剂，其中所述制剂没有内毒素。
5.权利要求1的制剂，其中在40±2℃温度及相对湿度75±5％条件下贮存两周后通过HPSEC确定的所述制剂的抗体单体的纯度为至少95％。
6.一种包含有效量的权利要求1-5任一项的制剂的药物单位剂量形式，通过给予对象该剂量形式以在暴露后预防性治疗该对象。
7.一种改善一种制剂中两种抗狂犬病病毒单克隆抗体的贮存的方法，包括将所述抗体配制为权利要求1-5任一项的药物制剂。
8.权利要求7的方法，其中所述制剂贮存在2℃至40℃。
9.权利要求8的方法，其中所述制剂贮存在2℃至8℃。
10.权利要求7-9任一项的方法，其中所述抗体副产物形成量降低。
11.权利要求10的方法，其中通过HPSEC测量在2℃至8℃温度贮存12个月内，5％或者更少的抗体形成聚集体。
12.重链序列示于SEQ ID NO：1和轻链序列示于SEQ ID NO：2的抗狂犬病病毒单克隆抗体CR57的药物制剂，该制剂在2℃与8℃之间以及在-60℃与-80℃之间的温度下稳定至少18个月，其中所述制剂包含0.3mg/ml的所述抗狂犬病病毒单克隆抗体CR57、10mM的柠檬酸盐缓冲液、浓度为150mM的氯化钠和0.01％w/v的聚山梨醇酯80，其中pH为6.0。
13.重链序列示于SEQ ID NO：3和轻链序列示于SEQ ID NO：4的抗狂犬病病毒单克隆抗体CR4098的药物制剂，该制剂在2℃与8℃之间以及在-60℃与-80℃之间的温度下稳定至少18个月，其中所述制剂包含0.3mg/ml的所述抗狂犬病病毒单克隆抗体CR4098、10mM的柠檬酸盐缓冲液、浓度为150mM的氯化钠和0.01％w/v的聚山梨醇酯80，其中pH为6.0。
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