CN101537345B - 一种改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法，具体步骤为：(1)直接化学修饰：将改性环糊精溶于缓冲溶液中，溶液缓慢流过合成好的有机-无机杂化整体柱，在20～60℃温度下，反应时间为12～24h，反应完成后用水冲洗，将未完全反应得环糊精和溶剂洗出柱外，得到整体色谱固定相；(2)间接键合：间隔臂先与改性环糊精结合再接枝到有机-无机杂化整体基质上去或者先与有机-无机杂化整体基质的相应官能团反应再将环糊精偶联到有机-无机杂化整体基质上去；得到具有不同微化学环境的整体色谱固定相。本发明的优点：性能更加稳定、高效，结构均匀，制备方法更灵活，重复性好；应用范围更广泛。

Description

一种改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法

【技术领域】

本发明涉及色谱固定相技术领域，具体地说，是一种新型改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法。

【背景技术】

手性是生命过程的基本特征，构成生命体的有机分子绝大多数都是手性分子。人们使用的药物绝大多数具有手性，被称为手性药物。研究手性化合物对于科学研究以及人类健康有着重要意义。研究手性化合物首先要分别得到两个对映异构体。手性化合物的分离和提纯也成为人们关注的热点课题。

近20年来，用色谱方法分离手性化合物取得了显著进展，已广泛应用于许多领域，如药物化学、不对称合成和生物分析等，不仅可以测定光学纯度，也可用于大量制备光学异构体。手性色谱技术的核心是设计和制备适用范围广的手性色谱固定相。然而，飞速发展的制药工业对手性药物和中间体的分离的要求对新型手性固定相的开发提出了更多要求。制备更多具有广泛选择性，稳定性好，制备容易的新型手性色谱固定相得到了人们广泛的关注。

适用于手性分离的环糊精及其衍生物键合固定相是现在应用较广的手性色谱固定相，它们大部分具有多种用途，样品容量大，稳定性高，分析速度快的优点。环糊精手性色谱固定相广泛应用于多种分离模式，对于许多类型分析物具有广泛选择性。环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，在其空洞结构中，外侧上端(较大开口端)由C2和C3的仲羟基构成，下端(较小开口端)由C6的伯羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区。它的疏水性空洞内可嵌入各种有机化合物，形成包接复合物，并改变被包接物的物理和化学性质；可以在保持环糊精大环基本骨架不变情况下引入官能团扩大其应用范围。这些优势使得环糊精类手性选择器对多种旋光异构体特别是手性氨基酸都具有卓越分离能力，并在手性多肽和其他手性生物分子的分离中具有极大的潜力。

整体柱，又称棒柱、连续床、原位柱、无塞柱，具有制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、柱效高和可进行快速分离等优点，并在多种分离模式中获得了应用，成功的分离了肽、蛋白质、类固醇、芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等多种物质，其物理性质以及内部微化学环境也得到了广泛的研究。与传统填充柱相比，整体柱能够克服填充柱塞子的制作、高压填充过程以及颗粒孔内传质速度慢等不足，具有重复性好、易于修饰、在宽pH范围稳定等优点。整体柱通常分为聚合物整体柱和硅胶整体柱两类，聚合物整体柱在有机溶剂中的溶胀会导致孔结构的变化，影响柱效和分离效果。硅胶整体柱机械强度理想，在孔结构控制方面有一定优势，但是在多孔内壁引入功能团进行改性非常困难，在干燥和热处理过程中柱床极易收缩和断裂，限制了其应用。有机-无机杂化材料是材料领域的研究热点，采用溶胶-凝胶法，可以在温和的条件下制备有机-无机杂化材料。在无机交联网络中引入有机部分，有机官能团均匀分布于骨架与孔壁，柔韧性好的有机基团提高了材料的机械强度水热稳定性和化学稳定性，材料的表面性质也可以通过反应单体的有机基团进行控制调节。有机基团通过稳定的Si-C键共价连接在硅胶基质上。作为分离材料，杂化材料能够结合硅胶和聚合物基质材料的优势避免其不足。这种杂化硅胶材料可用于制备CEC整体固定相，反应物中加入含官能团的单体，不需要再对基质进一步的衍生，从而提高制备重现性。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种新型改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法，具体步骤为，

一、色谱柱的预处理

(1)毛细管的预处理

将毛细管柱依次用稀酸、稀碱冲洗10～60分钟，用水洗至中性；取氢氟酸充入毛细管，两端封口后静置1～2h，用水洗至中性，氮气或空气吹干备用；

所述的毛细管柱为石英基质，内径为1微米～1毫米；

所述的稀酸选自盐酸，硫酸或者硝酸中的一种，优选为盐酸；其中，盐酸浓度为0.1mol/L；硫酸浓度为0.1mol/L；硝酸浓度为0.1mol/L；

所述的稀碱选自氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液中的一种，氢氧化钠溶液浓度为1mol/L；氢氧化钾溶液浓度为1mol/L；

所述的氢氟酸浓度为10～20％；

(2)不锈钢柱的预处理

不锈钢柱管用热NaOH水溶液抽洗4～5次，以除去管内壁的油渍和污物，用水冲洗至中性，最后用丙酮、乙醚等有机溶剂冲洗2～3次，烘干备用；

所述的NaOH水溶液浓度为50g/L～100g/L，温度为40～70℃；

二、整体固定相基质的制备

将四乙氧基硅烷(TEOS)，带有机官能团的硅烷化试剂，溶剂，超分子模板混合均匀，其中，带有机官能团的硅烷化试剂与溶剂摩尔比是1∶4～1∶8，超声脱气后，充入预先处理过的不锈钢柱管或毛细管中，两端封口，在20～40℃温度下反应；反应完成后，依次用乙醇、水洗去表面活性剂、残余的反应试剂以及小分子聚合物；

所述的带有机官能团的硅烷化试剂选自带有氨基、环氧基、醛基、异氰酸酯基硅烷化试剂中的一种，其浓度根据硅烷化试剂的种类不同调整；

所述的溶剂选自甲醇、乙醇、水中的一种或两种，其含量根据需要制备的整体基质的孔隙率调整；

所述的带有机官能团的硅烷化试剂与溶剂摩尔比根据采用的带有机官能团的硅烷化试剂的种类决定，范围为1∶4～1∶8；

所述的表面活性剂选自阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂中的一种，其种类根据有机官能团的硅烷化试剂种类选择，所用用量根据需要制备的整体基质的孔径大小调整；

所述反应温度为20～40℃，反应时间为12～24h；

三、手性选择器的引入

(1)直接化学修饰

将改性环糊精溶于缓冲溶液中，溶液缓慢流过合成好的有机-无机杂化整体柱，在20～60℃温度下，反应完成后用过量的水冲洗，将未完全反应得环糊精和溶剂洗出柱外，得到整体色谱固定相；图1为天冬氨酸-β-CD直接化学修饰带有环氧基团的有机-无机杂化整体柱；

改性环糊精为在保持环糊精大环基本骨架不变情况下引人各种官能团，所得到具有不同性质或功能的产物，如带有氨基酸、氨基、羰基、醛基等反应性基团的环糊精衍生物；其浓度根据该种改性环糊精的溶解度调整；

所述的缓冲溶液为具有一定pH值和缓冲能力的NaOH溶液或者Na₂CO₃溶液，缓冲溶液的pH与浓度根据改性环糊精的种类调整；

所述的反应温度为20～60℃，12～24h；

(2)间接键合

控制改变间隔臂的种类和长度克服环糊精庞大且具有较复杂的三维结构产生的空间阻碍作用，得到具有不同微化学环境的手性固定相；

间隔臂可先与改性环糊精结合再接枝到有机-无机杂化整体基质上去，也可以先与有机-无机杂化整体基质的相应官能团反应再将环糊精偶联到有机-无机杂化整体基质上去；图2所示为采用戊二醛作为间隔臂将改性环糊精对带有环氧基团或氨基的有机-无机杂化整体基质进行间接表面化学修饰；多种异氰酸酯，带不同官能团的三乙氧基硅烷及琥珀酰亚胺碳酸盐，戊二醛等均可作为间隔臂；

具体步骤为：

将作为间隔臂的化合物溶于缓冲溶液中，上述溶液缓慢流过合成好的有机-无机杂化整体基质，在20～60℃温度下，反应完成后用过量的水冲洗，将未完全反应得间隔臂洗出柱外；充入改性β-CD溶液，在20～60℃温度下反应，反应完成后过量的水清洗除去未反应物质；

所述的间隔臂为多种异氰酸酯，带不同官能团的三乙氧基硅烷及琥珀酰亚胺碳酸盐，戊二醛等能分别与有机无机杂化整体材料及改性环糊精所带活性官能团反应的化合物；其浓度根据其溶解度和反应活性调整；

所述的改性环糊精为在保持环糊精大环基本骨架不变情况下引人各种官能团，所得到具有不同性质或功能的产物，如带有氨基酸、氨基、羰基、醛基等反应性基团的环糊精衍生物；其浓度根据该种改性环糊精的溶解度调整；

所述的缓冲溶液为具有一定pH值和缓冲能力的NaOH溶液或者Na₂CO₃溶液等，缓冲溶液的pH与浓度根据反应物的种类调整；

所述反应温度为20～60℃，12～24h；

本发明制备的手性整体柱的评价：

将所制备的不锈钢色谱柱或毛细管柱安装到相应的色谱仪器上，通入适当流动相，采用多种手性样品对所制备的固定相的手性分离能力进行评价；

所述流动相为磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液等盐溶液与甲醇、乙腈等有机溶剂的混合物，其混合比例根据不同有机-无机杂化整体基质及改性环糊精种类调整；

所述手性样品为手性氨基酸、手性药物、手性多肽等多种不同性质手性化合物。

本发明采用改性环糊精作为手性选择器，利用整体色谱柱易于进行表面修饰和制备重复性好的特点，结合自组装和表面化学修饰的方法，根据分离需要调整孔径和孔分布与环糊精分子匹配，以此进一步可以控制主客体分子的特异物理作用，制备环糊精整体手性色谱固定相；研究其对于不同类型手性化合物选择性及其内在手性识别机制，将制备的整体手性色谱固定相用HPLC，毛细管电色谱等多种分离方式对手性氨基酸，手性多肽及其他手性生物分子进行分离。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

(1)将改性环糊精手性选择器与原位聚合有机-无机杂化整体色谱柱相结合制备新型手性色谱固定相，在方法上有较强的创新性；

(2)本发明充分利用改性环糊精对手性分子的手性选择性，应用范围更广泛；

(3)本发明与传统的手性分离柱相比，手性杂化整体色谱柱更加稳定、高效、结构均匀，制备方法更灵活，重复性好；

(4)本发明结合带有不同官能团的原位聚合有机-无机杂化整体材料对孔径和表面微环境的精确控制，对研究不同结构基质的整体手性固定相的分离机理具有重要意义。

【附图说明】

图1天冬氨酸-β-CD直接化学修饰带有环氧基团的有机-无机杂化整体柱；

图2间接化学修饰化学合成路线图；

图3天冬氨酸改性环糊精键合整体柱分离DL-苯丙氨酸；

图4氨基改性环糊精键合环氧基整体柱分离DL-Trp。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种新型改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法的具体实施方式。

实施例1

将0.0900g四乙氧基硅烷(TEOS)，0.1300g 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)，0.1700g乙醇，0.0314g水，0.0072g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)混合均匀，超声脱气后，充入预先处理过的毛细管中，两端封口，常温下反应10h。依次用乙醇，水洗去表面活性剂、残余的反应试剂以及小分子聚合物，得到整体色谱固定相。将10％戊二醛溶液(乙醇/水＝50/50)缓慢流过带氨基丙基有机-无机杂化硅胶整体柱柱体，反应12h后水清洗；充入asp-β-CD溶液(乙醇/水＝50/50，0.03g/ml)，常温反应12h后水清洗；2％NaBH₄磷酸盐缓冲溶液(pH8.2)反应2h后过量水清洗。图3为天冬氨酸改性环糊精键合整体柱分离DL-苯丙氨酸。

实施例2

180μL甲醇和25μL 0.1M HCl混合均匀后，加入94μL四乙氧基硅烷(TEOS)，68μL环氧基三乙氧基硅烷(ETES)，30μL十二胺的甲醇溶液(0.01g/100μL)，混合均匀后，充入预先处理过的毛细管中，两端封口，常温下放置12h，然后于40℃干燥48h。最后用无水乙醇冲洗除去十二胺。将适量改性β-CD溶于0.1MNa₂CO₃，pH为10.5缓冲溶液(NH₂-β-CD 0.1g/ml)缓慢流过柱体，70℃反应16h，反应完成后用过量的水冲洗。图4为氨基改性环糊精键合环氧基整体柱分离DL-Trp。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)直接化学修饰：将改性环糊精溶于缓冲溶液中，溶液缓慢流过合成好的有机-无机杂化整体柱，在20～60℃温度下，反应时间为12～24h，反应完成后用水冲洗，将未完全反应的环糊精和溶剂洗出柱外，得到整体色谱固定相；

(2)间接键合：间隔臂先与改性环糊精结合再接枝到有机-无机杂化整体基质上去或者先与有机-无机杂化整体基质的相应官能团反应再将环糊精偶联到有机-无机杂化整体基质上去；得到具有不同微化学环境的整体色谱固定相；

所述的间隔臂选自多种异氰酸酯，带不同官能团的三乙氧基硅烷及琥珀酰亚胺碳酸盐或者戊二醛中的一种。

2.如权利要求1所述的一种改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的缓冲溶液为NaOH溶液或者Na₂CO₃溶液。

3.如权利要求1所述的一种改性环糊精手性杂化整体色谱固定相的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的间接键合，采用间隔臂将改性环糊精对带有氨基、环氧基、醛基、或异氰酸酯基的有机-无机杂化整体基质进行间接表面化学修饰；将作为间隔臂的化合物溶于缓冲溶液中，上述溶液缓慢流过合成好的有机-无机杂化整体基质，在20～60℃温度下，反应完成后用过量的水冲洗，将未完全反应的间隔臂洗出柱外；充入改性β-CD溶液，在20～60℃温度下反应，反应时间为12～24h，反应完成后过量的水清洗除去未反应物质，得到整体色谱固定相；

所述的缓冲溶液为NaOH溶液或者Na₂CO₃溶液。

4.如权利要求1所述的一种改性环糊精手性杂化整体色谱固定相在手性化合物分离中的应用。

Images