CN101532012B - 一种快速抽提纯化rna的试剂盒以及方法 - Google Patents
一种快速抽提纯化rna的试剂盒以及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种快速抽提纯化RNA的试剂盒及方法。本发明的试剂盒包括：裂解液、前处理液、RNA结合液、RNA洗液I和II、以及RNA过滤柱和结合柱。本发明的方法包括裂解、前处理、过滤、结合RNA、清洗提纯和洗脱等步骤。本发明摒弃了以往经典的酸性酚法及大公司的Trizol法，创造了一种全新的RNA抽提纯化方法，它使抽提纯化的时间大大缩短，只需10分钟，即可从各种材料中提纯可用于下游各种实验的高纯度RNA，如：cDNA的转录、Northern blot、RNAi等。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种快速抽提纯化RNA的试剂盒及方法。
背景技术
RNA是遗传的基本物质之一，也是蛋白合成的模板，分离高纯度的RNA是现代分子生物学研究(包括临床医学诊断等)和分子治疗(如：RNAi治疗)的必要技术手段，也是不可逾越的试验过程。RNA具有易降解，难纯化的特点。它极易被无处不在RNase降解，也很容易在抽提过程中被DNA和蛋白污染；传统的方法，如：AGPC法或酸性酚法、氯化铯密度梯度离心法等以及现在常用的Trizol法，必须用到毒性极强的酚和氯仿等，对环境和试验人员易造成危害。并且操作过程复杂、操作时间长，这样都容易导致提纯的RNA被污染降解，并且这些方法对操作环境的要求都十分的苛刻，为了保证RNA不被污染，在提取之前，需要做大量的配液、处理环境及耗材的工作，费时又费力，增加的提取成本，且不利于大规模操作，限制了大规模临床检测应用及分子和基因组学的发展。
发明内容
因此，为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。
本发明的目的为提供一种快速抽提纯化RNA的试剂盒。
本发明的另一目的为提供一种快速抽提纯化RNA的方法。
根据本发明的快速抽提纯化RNA的试剂盒包括：
1)样品裂解液，
所述裂解液针对含多糖的材料的配方为：
4.0-6M GuCl
20-80mM MES-NaOH，pH 5.2-6.5
10-50mM柠檬酸钠
0.1-0.6％TritonX-100
0.5-2％N-月桂酰肌氨酸
5-20ul/mlβ-巯基乙醇
所述裂解液针对其它材料的配方为：
3.5-5.5M GuSCN
20-80mM MES-NaOH，pH5.2-6.3
10-50mM柠檬酸钠
0.1-0.6％TritonX-100
0.5-2％N-月桂酰肌氨酸
5-20ul/mlβ-巯基乙醇；
2)RNA结合柱前处理溶液，其配方为：
3.5-4.5M LiCl
0.005-0.02M HCl
0.05-0.3％TritonX-100；
3)RNA结合溶液，其配方为；
a)200-500mM MES pH4.5-5.5
b)90-100％乙醇，且a∶b＝1-5∶95-99；
4)RNA洗液I，其配方为：
50-200mM MES-NaOH，pH5～6，
3.5-4.5M GuSCN
0.1-1％TritonX-100
15-30％乙醇；
5)RNA洗液II，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇
0.5-1.5％丙酮
0.005-0.05％DEPC，
对于其它材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇和0.005-0.05％DEPC；
6)Rnase-free H2O；
7)RNA过滤柱。
8)RNA结合柱。
根据本发明的试剂盒，所述RNA结合柱的材料为二氧化硅纤维膜。
根据本发明的试剂盒，所述RNA过滤柱的过滤介质为1μM孔径的氧化铝滤片。
根据本发明的试剂盒，所述RNA结合柱由孔径为0.5μM的酸化玻璃纤维材料制成。
根据本发明的快速抽提纯化RNA的方法包括以下步骤：
1)裂解样品，将样品研磨，并加入样品裂解液进行裂解，
所述裂解液针对含多糖的材料的配方为：
4.0-6M GuCl
20-80mM MES-NaOH，pH 5.2-6.5
10-50mM柠檬酸钠
0.1-0.6％TritonX-100
0.5-2％N-月桂酰肌氨酸
5-20ul/mlβ-巯基乙醇
所述裂解液针对其它材料的配方为：
3.5-5.5M GuSCN
20-80mM MES-NaOH，pH5.2-6.3
10-50mM柠檬酸钠
0.1-0.6％TritonX-100
0.5-2％N-月桂酰肌氨酸
5-20ul/mlβ-巯基乙醇；
2)前处理，将200μLRNA结合柱前处理液注入RNA结合柱中，然后离心去除溶液，
所述RNA结合柱前处理溶液的配方为：
35-4.5M LiCl
0.005-0.02M HCl
0.05-0.3％TritonX-100；
3)过滤，将裂解样品用过滤柱过滤，在滤液中加入0.5倍体积的RNA结合溶液并混匀，
所述RNA结合液的配方为：
a)200-500mM MES pH4.5-5.5
b)90-100％乙醇，且a∶b＝1-5∶95-99；
4)结合RNA，将步骤3)获得的溶液加入到RNA结合柱上，并离心去除溶液；
5)清洗提纯RNA，加500μLRNA洗液I于RNA结合柱中，并离心去除溶液，然后再加750μLRNA洗液II于RNA结合柱中，并离心去除溶液，
所述RNA洗液I的配方为：
50-200mM MES-NaOH，pH5～6，
3.5-4.5M GuSCN
0.1-1％TritonX-100
15-30％乙醇，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇
0.5-1.5％丙酮
0.005-0.05％DEPC，
对于其它材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇和0.005-0.05％DEPC；
6)洗脱RNA，向经步骤5)处理的RNA结合柱中加入Rnase-free的H2O，静止，并离心收集溶液，得到高纯度的RNA。
根据本发明的方法，所述RNA过滤柱的过滤介质为1μM孔径的氧化铝滤片。
根据本发明的方法，所述RNA结合柱由孔径为0.5μM的酸化玻璃纤维材料制成。
本发明摒弃了以往经典的酸性酚法及大公司的Trizol法，创造了一种全新的RNA抽提纯化方法，它使抽提纯化的时间大大缩短，只需10分钟，即可从各种材料中提纯可用于下游各种实验的高纯度RNA，如：cDNA的转录、Northern blot、RNAi等。
综上，本发明具有以下优点：
1、摒弃以往商用“Trizol”法、氯化铯密度梯度离心法和酸性酚法所用的酚抽提步骤，采用温和变性剂裂解法，辅助氧化铝剪切，不使用任何对环境造成污染的药品。
2、不离心沉淀收集收集样品，直接裂解，一步过滤，一步结合，两步特异清洗纯化。
3、采用特殊的全新溶液配方前处理二氧化硅纤维膜，使蛋白、DNA等杂质更易清除，而且RNA更易结合。
4、大大缩短抽分离提纯时间，10分钟即可完成。
5、此法为RNA抽提的自动化和大规模化奠定了技术基础。
具体实施方式
实施例使用本发明的试剂盒快速抽提纯化烟草叶的总RNA
一、配制溶液
配制以下溶液：
1)样品裂解液，
针对含多糖的材料的裂解液：
5M GuCl
50mM Mes-NaOH，pH 6.3
20mM柠檬酸钠
0.5％TritonX-100
1％N-月桂酰肌氨酸
10ul/mlβ-巯基乙醇
针对其它材料的裂解液：
4.25M GuSCN
50mM MES-NaOH，pH 6.3
20mM柠檬酸钠
0.5％TritonX-100
0.5％N-月桂酰肌氨酸
10ul/mlβ-巯基乙醇；
2)RNA结合柱前处理溶液：
4M LiCl
0.01M HCl
0.1％TritonX-100；
3)RNA结合溶液，其配方为；
a)500mM MES pH5.0
b)100％乙醇，且a∶b＝1∶96；
4)RNA洗液I：
100mM MES-NaOH，pH5～6，
4M GuSCN
0.7％TritonX-100
20％乙醇；
5)RNA洗液II，
对于植物材料的洗液II：
78％乙醇
1％丙酮
0.01％DEPC，
对于其它材料的洗液II为：
78％乙醇和0.01％DEPC；
6)Rnase-free H2O；
二、提取烟草的总RNA
1、裂解样品
取样品(约为50mg)放入液氮轮动磨碎，加入裂解液450μl，剧烈震荡，温育60℃，静置2分钟。
2、同时前处理DNA结合柱：将200μL DNA前处理溶液加入柱中，11000rpm离心10秒，弃除溶液。
3、过滤
将裂解样品用RNA过滤柱过滤(剪切基因组DNA)，滤液中加入0.5倍体积的结合溶液，混匀。
4、特异结合RNA
将以上得到的所有样品上样到RNA结合柱上，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。
5、清洗提纯RNA
加500μl洗液I于RNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μl洗液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
6、洗脱高纯度RNA
将已结合RNA的干燥柱，加入RNAse-free的H2O，静置1分钟，11,000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度RNA约为50μL(0.4μg/μL)。
实施例二提取酵母细胞的总RNA
以与实施例一相同的方法，提取酵母细胞的总RNA。
实施例三使用本发明的试剂盒快速抽提纯化烟草叶的总RNA
一、配制溶液
配制以下溶液：
1)样品裂解液，
针对含多糖的材料的裂解液：
4.0M GuCl
20mM Mes-NaOH，pH 6.3
10mM柠檬酸钠
0.1％TritonX-100
0.5％N-月桂酰肌氨酸
5ul/mlβ-巯基乙醇
针对其它材料的裂解液：
3.5M GuSCN
20mM MES-NaOH，pH 5.2
10mM柠檬酸钠
0.1％TritonX-100
0.5％N-月桂酰肌氨酸
5ul/mlβ-巯基乙醇；
2)RNA结合柱前处理溶液：
3.5M LiCl
0.005M HCl
0.05％TritonX-100；
3)RNA结合溶液，其配方为；
a)200mM MES pH5.0
b)90％乙醇，且a∶b＝1∶96；
4)RNA洗液I：
50mM MES-NaOH，pH5～6，
3.5M GuSCN
0.1％TritonX-100
15％乙醇；
5)RNA洗液II，
对于植物材料的洗液II：
70％乙醇
0.5％丙酮
0.005％DEPC，
对于其它材料的洗液II为：
70％乙醇和0.005％DEPC；
6)Rnase-free H2O；
二、提取烟草的总RNA
1、裂解样品
取样品(约为50mg)放入液氮轮动磨碎，加入裂解液450μl，剧烈震荡，温育60℃，静置2分钟。
2、同时前处理DNA结合柱：将200μL DNA前处理溶液加入柱中，11000rpm离心10秒，弃除溶液。
3、过滤
将裂解样品用RNA过滤柱过滤(剪切基因组DNA)，滤液中加入0.5倍体积的结合溶液，混匀。
4、特异结合RNA
将以上得到的所有样品上样到RNA结合柱上，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。
5、清洗提纯RNA
加500μl洗液I于RNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μl洗液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
6、洗脱高纯度RNA
将已结合RNA的干燥柱，加入RNAse-free的H2O，静置1分钟，11,000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度RNA约为50μL(0.4μg/μL)。
实施例四使用本发明的试剂盒快速抽提纯化烟草叶的总RNA
一、配制溶液
配制以下溶液：
1)样品裂解液，
针对含多糖的材料的裂解液：
6M GuCl
80mM Mes-NaOH，pH 6.3
50mM柠檬酸钠
0.6％TritonX-100
2％N-月桂酰肌氨酸
20ul/mlβ-巯基乙醇
针对其它材料的裂解液：
5.5M GuSCN
80mM MES-NaOH，pH 6.3
50mM柠檬酸钠
0.6％TritonX-100
2％N-月桂酰肌氨酸
20ul/mlβ-巯基乙醇；
2)RNA结合柱前处理溶液：
4.5M LiCl
0.02M HCl
0.3％TritonX-100；
3)RNA结合溶液，其配方为；
a)500mM MES pH5.5
b)100％乙醇，且a∶b＝1∶96；
4)RNA洗液I：
200mM MES-NaOH，pH5～6，
4.5M GuSCN
1％TritonX-100
30％乙醇；
5)RNA洗液II，
对于植物材料的洗液II：
85％乙醇
1.5％丙酮
0.05％DEPC，
对于其它材料的洗液II为：
85％乙醇和0.05％DEPC；
6)Rnase-free H2O；
二、提取烟草的总RNA
1、裂解样品
取样品(约为50mg)放入液氮轮动磨碎，加入裂解液450μl，剧烈震荡，温育60℃，静置2分钟。
2、同时前处理DNA结合柱：将200μL DNA前处理溶液加入柱中，11000rpm离心10秒，弃除溶液。
3、过滤
将裂解样品用RNA过滤柱过滤(剪切基因组DNA)，滤液中加入0.5倍体积的结合溶液，混匀。
4、特异结合RNA
将以上得到的所有样品上样到RNA结合柱上，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。
5、清洗提纯RNA
加500μl洗液I于RNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μl洗液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
6、洗脱高纯度RNA
将已结合RNA的干燥柱，加入RNAse-free的H2O，静置1分钟，11,000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度RNA约为50μL(0.4μg/μL)。
Claims (6)
1.一种快速RNA抽提纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：
1)样品裂解液，
所述裂解液针对含多糖的材料的配方为：
4.0-6M GuCl
20-80mM MES-NaOH，pH 5.2-6.5
10-50mM柠檬酸钠
0.1-0.6％ TritonX-100
0.5-2％N-月桂酰肌氨酸
5-20ul/ml β-巯基乙醇
所述裂解液针对其它材料的配方为：
3.5-5.5M GuSCN
20-80mM MES-NaOH，pH5.2-6.3
10-50mM柠檬酸钠
0.1-0.6％ TritonX-100
0.5-2％N-月桂酰肌氨酸
5-20ul/ml β-巯基乙醇；
2)RNA结合柱前处理溶液，其配方为：
3.5-4.5M LiCl
0.005-0.02M HCl
0.05-0.3％ TritonX-100；
3)RNA结合溶液，其配方为；
a)200-500mM MES pH4.5-5.5
b)90-100％乙醇，且a∶b＝1∶96；
4)RNA洗液I，其配方为：
50-200mM MES-NaOH，pH5～6，
3.5-4.5M GuSCN
0.1-1％ TritonX-100
15-30％乙醇；
5)RNA洗液II，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇
0.5-1.5％丙酮
0.005-0.05％DEPC，
对于其它材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇和0.005-0.05％DEPC；
6)Rnase-free H2O；
7)RNA过滤柱；以及
8)RNA结合柱，所述RNA结合柱的材料为二氧化硅纤维膜。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA过滤柱的过滤介质为0.5-2微米孔径的氧化铝滤片。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA结合柱由孔径为0.3-0.8微米的酸化玻璃纤维材料制成。
4.一种快速抽提纯化RNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)裂解样品，将样品研磨，并加入样品裂解液进行裂解，
所述裂解液针对含多糖的材料的配方为：
4.0-6M GuCl
20-80mM MES-NaOH，pH 5.2-6.5
10-50mM柠檬酸钠
0.1-0.6％TritonX-100
0.5-2％N-月桂酰肌氨酸
5-20ul/ml β-巯基乙醇
所述裂解液针对其它材料的配方为：
3.5-5.5M GuSCN
20-80mM MES-NaOH，pH5.2-6.3
10-50mM柠檬酸钠
0.1-0.6％TritonX-100
0.5-2％N-月桂酰肌氨酸
5-20ul/ml β-巯基乙醇
2)前处理，将200μL RNA结合柱前处理液注入RNA结合柱中，然后离心去除溶液，
所述RNA结合柱前处理溶液的配方为：
35-4.5M LiCl
0.005-0.02M HCl
0.05-0.3％TritonX-100；
3)过滤，将裂解样品用过滤柱过滤，在滤液中加入0.5倍体积的RNA结合溶液并混匀，
所述RNA结合液的配方为：
a)200-500mM MES pH4.5-5.5
b)90-100％乙醇，且a∶b＝1-5∶95-99；
4)结合RNA，将步骤3)获得的溶液加入到RNA结合柱上，并离心去除溶液；
5)清洗提纯RNA，加500μLRNA洗液I于RNA结合柱中，并离心去除溶液，然后再加750μLRNA洗液II于RNA结合柱中，并离心去除溶液，
所述RNA洗液I的配方为：
50-200mM MES-NaOH，pH5～6，
3.5-4.5M GuSCN
0.1-1％TritonX-100
15-30％乙醇，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇
0.5-1.5％丙酮
0.005-0.05％DEPC，
对于其它材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇和0.005-0.05％DEPC；
6)洗脱RNA，向经步骤5)处理的RNA结合柱中加入Rnase-free的H2O，静止，并离心收集溶液，得到高纯度的RNA，
其中，所述RNA结合柱的材料为二氧化硅纤维膜。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RNA过滤柱的过滤介质为0.5-2微米孔径的氧化铝滤片。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RNA结合柱由孔径为0.3-0.8微米的酸化玻璃纤维材料制成。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006015326A2 (en) * | 2004-07-30 | 2006-02-09 | Agencourt Bioscience Corporation | Methods of isolating nucleic acids using multifunctional group-coated solid phase carriers |
| WO2007014138A2 (en) * | 2005-07-22 | 2007-02-01 | Argylla Technologies, Llc | Nanoparticles for manipulation of biopolymers and methods thereof |
| WO2007035750A1 (en) * | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Agencourt Bioscience Corporation | Method for isolating nucleic acids |
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|---|---|---|---|---|
| WO2006015326A2 (en) * | 2004-07-30 | 2006-02-09 | Agencourt Bioscience Corporation | Methods of isolating nucleic acids using multifunctional group-coated solid phase carriers |
| WO2007014138A2 (en) * | 2005-07-22 | 2007-02-01 | Argylla Technologies, Llc | Nanoparticles for manipulation of biopolymers and methods thereof |
| WO2007035750A1 (en) * | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Agencourt Bioscience Corporation | Method for isolating nucleic acids |
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