CN101522917A - 借助荧光测定核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于测定存在于样品中的核酸的量的方法，其中：－向样品中加入荧光团，－测量分别响应于至少两个激发波长的光刺激由荧光团在至少两个发射波长发射的荧光强度，和－从测量的荧光强度推导存在于样品中的核酸的量。

Description

借助荧光测定核酸的方法

本申请要求2006年8月11日提交的在先的美国临时申请60/836,949的权益。

发明领域

本发明涉及用于测定存在于样品中的核酸的量的荧光测定法，涉及适合于实施所述方法的荧光测定计，并且涉及用于化合物的荧光测定法的托盘。

发明背景

在血液循环中存在有游离核酸是数年前就已知的[Mandel和Metais，1947；Tan等人，1966]。从这时开始，已经使用例如RIA(放射性免疫测定法)的方法发现，相对于患有良性肿瘤的患者或相对于健康受试者，癌症患者具有高水平的循环DNA[Leon等人，1977；Shapiro等人，1983]。

然而，近些年来，随着高效的分子生物学方法例如实时PCR的开发，考虑将循环的DNA片断用作临床生物标志物的兴趣得到迅速发展。

从癌症患者的血浆中提取的DNA通常具有肿瘤DNA特征[Anker P.等人，1999]例如链不稳定性、存在有特定的致癌基因、肿瘤抑制基因和小随体改变。这个来源于肿瘤细胞的循环DNA的想法是由Kok等人设想的[De Kok等人，1997]，其报道了特征在于特定改变的从肿瘤衍生的DNA可以在患有结肠直肠肿瘤的患者的血清中。因此，这些作者检测了以前已经在原发肿瘤中鉴定的血清的DNA中的某些K-ras点突变。这就是循环DNA的大多数研究集中在从各类癌症患者的肿瘤(组织)或血清提取的DNA的突变的检测、杂合性的丧失、小随体突变和甲基化作用的原因。在血清的游离基因组DNA中检测到的小随体突变和不稳定性提示，其可能是新的潜在标记物，对于监控肿瘤具有重要的特异性。

最近，许多研究试图使用基因组DNA、非基因组DNA、循环DNA浓度的仅有的增加作为诊断标记物或乳腺癌和肺癌的早期形成的标记物，以及用于监控和检查已经接收化学疗法治疗的患者[Sozzi等人，2001]。这种测量会消除或至少减少对更侵入性操作例如活体检查的需要。它还可以用于筛选特定的早期癌症，例如肺癌[Sozzi等人，2003]、乳腺癌[Gal等人，2004]或前列腺癌[Boddy等人，2005；Jung等人，2004]。最后，它还可以用于补充通常用于监控患有癌症或经历化学疗法的患者或经历外科手术、创伤[Lam等人，2003]或心肌梗塞[Chang等人，2003]的患者的标记物的分析。

在血液中主要循环两种DNA：

-与循环的有核细胞有关的DNA；和

-在血浆中游离循环的DNA。

在患有癌症或患有心肌梗塞的患者中，血清中的基因组DNA是片断的，在恶性肿瘤的情况中有大约100个碱基对[Wu等人，2002]的片段，而在心肌梗塞的情况中有大约200个碱基对[Chang等人，2003]的片段。这些片断在没有病变的对照者的血液中没有发现，在所述对照者中，发现循环的DNA为极低的浓度。即使现在，关于DNA被释放到血流中的机理仍知之甚少。Jahr等人[Jahr等人，2001]提出了凋亡和坏死的细胞是这种DNA的主要来源的假设。

目前没有参考文献限定在健康受试者中的这种循环的DNA浓度的限值。许多研究试图估计这个阈值，但是作为方法对它们进行比较是十分困难的，并且得到的结果有不同程度的差异。此外，在不同研究之间所用的单位有所不同：ng/ml、拷贝数/ml、基因组当量/ml(以6.6皮克/ml估计的二倍体细胞中所含DNA的量)、等等。

许多研究组通过探索在预后中的应用前景、特别是试图确定与常规诊断标记物的相关性而测量了循环DNA的水平。到目前为止，所有的研究在以下方面是一致的，即癌症患者中的DNA平均水平比健康对照中显著更高，而与使用血清或是血浆无关。然而，测量的绝对数量在不同研究之间有所不同。这种差异可能是与所分析的癌症类型和所用的不同方法有关。如公布的大量数据所证实的，在血浆中测量的DNA水平低于血清中测量的水平[Thijssen等人，2002]。对于临床重要性，至少两个报告描述了DNA水平和已知的预后因素之间的相关性。在(小细胞或非小细胞)肺癌中，在血浆DNA和血清的LDH活性和神经元特异性烯醇酶(NSE)之间具有紧密的相关性，在每种标记物和患者存活之间具有相似的关系[Fournie等人，1995]。类似地，DNA水平已经与在淋巴结转移性病灶的情况中的临床阶段以及乳腺癌患者的肿瘤大小相关[Shao等人，2001]。最后，重要的是要记住，由于肿瘤的原因，循环DNA的百分率在不同患者之间显著不同[Jahr等人，2001]。

现在有许多用于测量溶液中核酸的方法，并且取决于方法允许根据临床医师和研究人员的不同需要进行改进。这些方法主要包括分光光度测定法[Greenstock等人，1975]—是在所有研究实验室中非常常用的方法，优点在于廉价，但是在临床实践中的主要缺点是极其不灵敏：其不能测量患者中的循环DNA的量。

有其它更灵敏的方法，但是它们都具有使得它们或多或少难以常规使用的特征，部分是因为它们具有在测量之前从生物环境提取DNA的共同的步骤：

·放射免疫测定方法[Leon等人，1975]花费相对长的时间(每个分析系列要几个小时)，必需以一系列测量来进行而不能分散地进行，尤其是，需要被批准处理放射性元素的专门建筑物和工作人员。

·竞争性PCR[Siebert等人，1992；Yap等人，1992]基于相对于已知标准样品的相对显示，是提供检测灵敏度和特异性的多种系列方法的补充。这些方法是使用不便的并且相对机密的；其在医用分析实验室中的常规使用在将来是不可想象的。

·实时的定量PCR[Mulder等人，1994]是涉及测量循环DNA这个问题的各种出版物中的优选方法。其优点是双重的：其对于要显示的目标DNA(在这种情况中为人DNA)是特异性的，并且其现在不再是研究实验室的禁区，可以在许多医院找到设备。然而，它也不是没有缺点：必需进行提取、相对高的操作成本、特定的设备不能用于大规模常规分析、以及灵敏性不足。

·定量的荧光测定法[Greenstock等人，1975]。尽管这种方法没有免除提取步骤，但是其允许更快速地和直接地测量存在于溶液中的游离DNA。然而，使用所述方法所需的技术条件(微量培养板、大量的试剂、测量荧光)使其难以达到期望的灵敏度极限并且不允许识别所检测的DNA的来源(人或非人来源)。

因此，本发明设法提供没有现有技术方法的缺点的用于测定在样品中存在的核酸的量的方法。

因此，本发明的出发点在于本发明人证明了有可能通过向样品加入荧光团和通过在同步分析中、或在响应于至少两个、特别是至少三个相应波长的激发而产生的至少两个、特别是至少三个不同的发射波长测定发射的荧光强度来测定在样品中存在的核酸的量。

发明内容

本发明涉及在至少两个、优选至少三个波长测定在样品中存在的核酸的量的方法，其中：

-向样品添加荧光团，

-分别测量响应于至少两个、优选三个激发波长的光刺激而由至少两个、优选至少三个发射波长发射的荧光强度，和

从至少两个、优选至少三个测量的荧光强度推导存在于样品中的核酸的量。

在前述方法的特定实施方案中，分别测量响应于三个激发波长λ’₁、λ’₂和λ’₃的光刺激而由荧光团在三个发射波长λ₁、λ₂和λ₃发射的荧光强度I₁、I₂和I₃，其中λ₁<λ₂<λ₃和λ₁，λ₂和λ₃是预先确定的。

在前述方法的另一个特定的实施方案中，从以下F值推导核酸的量：

$F=I_2-[\frac{I_1-I_3}{{\mathrm{\&lambda;}}_1-{\mathrm{\&lambda;}}_3}{\mathrm{\&lambda;}}_2-\frac{{\mathrm{\&lambda;}}_1{I}_3-{\mathrm{\&lambda;}}_3{I}_1}{{\mathrm{\&lambda;}}_1-{\mathrm{\&lambda;}}_3}]$

在前述方法的另一个特定的实施方案中，荧光团是

波长如下：

λ’₁＝472±10(优选±5)nm    λ₁＝502±10(优选±5)nm

λ’₂＝496±10(优选±5)nm    λ₂＝526±10(优选±5)nm

λ’₃＝538±10(优选±5)nm    λ₃＝568±10(优选±5)nm

此外，在前述方法的另一个特定的实施方案中，分别测量响应于两个激发波长λ’₁和λ’₂的光刺激而由荧光团在两个发射波长λ₁和λ₂发射的荧光强度I₁和I₂，λ₁和λ₂是预先确定的。

在这里，优选从I₁和I₂之差的绝对值推导核酸的量，即，从以下的F值：

F＝|I₂-I₁|

仍在这种情况中，如果荧光团是则波长如下：

λ’₁＝472±10nm    λ₁＝502±10nm，和

λ’₂＝496±10nm    λ₂＝526±10nm，或

λ’₁＝496±10nm    λ₁＝526±10nm，和

λ’₂＝538±10nm    λ₂＝568±10nm

更具体地说，使用校准曲线从F值推导样品中的核酸的量。

本发明还涉及适合于实现上述定义的方法的荧光测定计，特征在于，其包括：

- 一个或多个用于在两个和/或三个激发波长λ’₁、λ’₂和任选的λ’₃进行光激发的设备；

- 一个或多个用于测量在三个发射波长λ₁、λ₂和任选的λ₃发射的荧光强度I₁、I₂和任选的I₃的设备；

- 允许计算以下F值的计算装置：

F＝|I₂-I₁|和/或 $F=I_2-[\frac{I_1-I_3}{{\mathrm{\&lambda;}}_1-{\mathrm{\&lambda;}}_3}{\mathrm{\&lambda;}}_2-\frac{{\mathrm{\&lambda;}}_1{I}_3-{\mathrm{\&lambda;}}_3{I}_1}{{\mathrm{\&lambda;}}_1-{\mathrm{\&lambda;}}_3}]$

在前述荧光测定计的特定实施方案中，对于三个波长，所述激发和发射波长如下：

λ’₁＝472±10(优选±5)nm    λ₁＝502±10(优选±5)nm

λ’₂＝496±10(优选±5)nm    λ₂＝526±10(优选±5)nm

λ’₃＝538±10(优选±5)nm    λ₃＝568±10(优选±5)nm

在前述荧光测定计的另一个特定实施方案中，对于二个波长，所述激发和发射波长如下：

λ’₁＝472+10nm     λ₁＝502±10nm，和

λ’₂＝496+10nm     λ₂＝526±10nm，或

λ’₁＝496±10nm    λ₁＝526±10nm，和

λ’₂＝538±10nm    λ₂＝568±10nm

本发明还涉及设计用于化合物的荧光测定的托盘，其包括混合和测量器皿，所述混合和测量器皿至少对于用于荧光分析的波长的光是透明的，所述器皿连接于：

·包含荧光团的储库，所述荧光团储库本身连接于包含稀释溶液的储库；并且连接于

·用于使包含待分析化合物的样品体积标准化的储库，所述标准化储库本身连接于用于收集包含待分析化合物的样品的孔。

在上述定义的托盘的特定实施方案中，存在有单向阀，所述单向阀的位置为：

- 在收集孔和标准化储库之间，使得收集的溶液只能够沿标准化储库的方向通过；

- 在标准化储库和混合和测量器皿之间，使得收集的溶液只能够朝向器皿的方向通过；

- 在包含稀释溶液的储库和荧光团储库之间，使得稀释溶液只能够朝向荧光团储库的方向通过；

- 在荧光团储库和混合和测量器皿之间，使得稀释的溶液只能够朝向器皿的方向通过。

在上述定义的托盘的另一个特定的实施方案中，由标准化储库、混合物和测量器皿、荧光团储库和稀释溶液储库组成各个隔室是由充分挠性的材料制成的，以便允许通过对容器施加压力而使器皿中包含的液体移动。

在上述定义的托盘的另一个特定实施方案中，所述该荧光团为

而稀释溶液是Tris-Botrate-EDTA(TBE)缓冲液。

在上述定义的托盘的另一个特定实施方案中，标准化储库与用于选择收集溶液所含的、长度小于1,000个核苷酸的核酸分子的设备耦联。

发明详述

核酸

核酸可以是天然或合成来源的，并且其结合的核苷酸，特别是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，可以是天然的或经过修饰的。优选地，核酸是DNA或RNA，更优选为DNA。另外优选地，核酸链的大小为大于五个碱基。

有利地，样品中具有低分子量链(例如，长度小于1,000个碱基)的核酸的特异性量化(任选地在使用适合的方法选择这些核酸之后)允许量化例如得到所述样品的生物或培养物中由于细胞的凋亡所引起的死亡；可以将如此测量的值与任选地在不使用用于选择小于1,000个碱基对大小的链的任何方法的情况下测量的DNA总量的值相关，以便提供凋亡引起的细胞死亡的百分比。

还可以通过测量总的核酸和通过在使用适合的方法除去低分子量核酸之后测量高分子量的核酸来量化凋亡。然后可以通过减去高分子量核酸得到低分子量核酸的量。

任选地，可以通过低分子量核酸的特异性选择来直接进行量化。然后也可以特异性地测量剩余的高分子量核酸。因此，通过将二者的量相加得到总的核酸。

为了量化凋亡，可以在DNA与荧光团的相互作用之后通过荧光进行低分子量核酸或高分子量核酸以及总的核酸的特异性量化。所述核酸可以预先使用任何适合的方法进行捕获和/或浓集。

本发明框架内的凋亡量化可以随着实验的进行而在动态条件下进行。实际上，不需要例如停止细胞培养来进行测量，因为测量的是在外部介质(即，培养基)中除去的核酸片断。其余的活细胞允许继续进行实验。因此，有可能根据需要在短时间之后、或者在其后的任何时候进行重复测量。同样地，有可能测量在人或动物中发生的凋亡，测量介质是本文中的任何类型的生物样品。

因此，有可能想到许多的应用领域：例如医疗领域、对动物或细胞培养物进行的实验规程等等。可以在任何类型的液体中测量核酸片断，无论是天然的或非天然的。

一个领域特别地涉及对动物或对细胞培养物进行的药理学研究。特别是包括：

- 试验药物的致死率；

- 确定细胞死亡诱导模式，例如坏死或凋亡；

确定在所用的实验条件下发生第一个细胞死亡而其它细胞保持生存的时间，允许实验继续进行。

另一个领域涉及对细胞培养物进行的科学研究。实际上，有可能研究以下情况对细胞死亡的影响：

代谢途径的刺激或钝化，或

所用的实验条件。

然而，另一个领域涉及对动物进行的实验规程，用于试验以下情况的影响：

- 药物对随机细胞死亡的影响

- 诱导的细胞死亡，或

- 实验条件。

除了上述那些之外，感兴趣的是在对患有诱导细胞死亡的病理学的患者进行的监控或跟踪中量化凋亡，用以诊断它们的病理学或跟踪它们的治疗效果。

一般地说，应用领域为其中需要知道以下内容的情况：细胞死亡是否发生、死亡诱导模式、发生之前的延迟、以及所研究的作用的持续时间。因此，优选将已经通过上述定义的方法测定的核酸的量用于细胞死亡表征的情况中。

样品

样品可以是天然的或合成的来源，为无机的或有机的。优选地，样品是生物样品或生物样品衍生物。更优选地，样品来自于生物样品的稀释。生物样品可以来自动物(特别是人)或来自植物。

还优选地，生物样品选自以下的组：细胞培养物、全血、血清、血浆、血液的有形成分、红细胞、尿、粪便、脑脊液、精液、穿刺液、痰液(expectora)、唾液、支气管和肺泡液体、脓、生殖道分泌物、羊水、胃液、胆汁、胰液、组织活体检查、毛发、皮肤和牙齿、以及淋巴液。

还优选地，样品来源于经历过其中已经发生细胞破裂的生理病理学情况的患者。特别地，样品来源于以下患者：患有或者被怀疑患有癌症的患者、正在经历化疗的患者、经历过外科手术的患者、创伤患者和经历过心肌梗塞的患者。

优选地，包含在生物样品中的核酸来源于生理学或病理学来源的细胞胞溶作用，特别地，核酸来源于凋亡的细胞。

样品特别优选是稀释20到400倍的血浆。

有利地，本发明的方法允许量化任何期望样品内的核酸，无需事先进行核酸的纯化。

荧光团

术语“荧光团”是指容易响应于光激发而发光的化合物。

在本发明中，优选荧光团易于通过与核酸建立弱或强的相互作用或化学键而与其发生相互作用。

通常，可以将与核酸相互作用的荧光团与如下物质相区别：

·嵌入试剂，例如溴化乙锭、碘化丙啶或

·结合于双链DNA的小沟的试剂，例如DAPI和Hoechst试剂(例如Hoechst 33258、Hoechst 34580)；

·与核酸相互作用的各种试剂，例如吖啶橙、7-AAD、LDS 751和羟基脒(hydroxystilbanidine)。

其它实例包括选自以下组的荧光团：SYBR(化学反应性的)、TOTO(花青二聚体)、TO-PRO(花青单体)、SYTO(渗透细胞)和SYTOX(不渗透细胞)家族。

优选地，所述荧光团是核酸嵌入试剂。

术语“核酸嵌入试剂”是指容易被插入到形成核酸链的碱基之间的荧光团。嵌入试剂是本领域技术人员公知的。

因此，发明人特别地表明，

溴化乙锭、试剂Hoechst33258、吖啶橙、和

允许使用本发明的方法进行核酸的量化。

优选地，荧光团因此选自溴化乙锭、试剂Hoechst33258、吖啶橙、

和

更优选地，所述荧光团是

或2-[N-双(3-二甲基氨基丙基)-氨基]-4-[2，3-二氢-3-甲基-(苯并-1，3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+)。

特别是由Molecular Probes出售的。特别地，其在美国专利No.5863753中有所表征。在前述方法中，优选将PicogreendsDNA定量试剂盒(Molecular Probes)的以约1/5,000到约1/80,000的稀释度、特别是约1/20,000的稀释度使用。

在使用溴化乙锭时，可以在上述定义的方法和荧光测定计中使用以下的激发和发射波长：

对于三个波长：

λ’₁＝475±10nm    λ₁＝550±10nm

λ’₂＝520±10nm    λ₂＝595±10nm

λ’₃＝560±10nm    λ₃＝635±10nm

对于两个波长：

λ’₁＝475±10nm    λ₁＝550±10nm

λ’₂＝520±10nm    λ₂＝595±10nm，或

λ’₁＝520±10nm    λ₁＝595±10nm

λ’₂＝560±10nm    λ₂＝635±10nm

在使用Hoechst 33258时，可以在上述定义的方法和荧光测定计中使用以下的激发和发射波长：

对于三个波长：

λ’₁＝315±10nm    λ，＝435±10nm

λ’₂＝350±10nm    λ₂＝470±10nm

λ’₃＝395±10nm    λ₃＝515±10nm

对于两个波长：

λ’₁＝315±10nm    λ₁＝435±10nm

λ’₂＝350±10nm    λ₂＝470±10nm，或

λ’₁＝350±10nm    λ₁＝470±10nm

λ’₂＝395±10nm    λ₂＝515±10nm

在使用SyBr green II时，可以在上述定义的方法和荧光测定计中使用以下的激发和发射波长：

对于三个波长：

λ’₁＝450±10nm    λ₁＝475±10nm

λ’₂＝485±10nm    λ₂＝510±10nm

λ’₃＝525±10nm    λ₃＝550±10nm

对于两个波长：

λ’₁＝450±10nm    λ₁＝475±10nm

λ’₂＝485±10nm    λ’₂＝510±10nm，或

λ’₁＝485±10nm    λ₁＝510±10nm

λ’₂＝525±10nm    λ₂＝550±10nm

在使用Popo1时，可以在上述定义的方法和荧光测定计中使用以下的激发和发射波长：

对于三个波长：

λ’₁＝415±10nm    λ₁＝437±10nm

λ’₂＝435±10nm    λ₂＝457±10nm

λ’₃＝475±10nm    λ₃＝497±10nm

对于两个波长：

λ’₁＝415±10nm    λ₁＝437±10nm

λ’₂＝435±10nm    λ₂＝457±10nm，或

λ’₁＝435±10nm    λ₁＝457±10nm

λ’₂＝475±10nm    λ₂＝497±10nm

同步荧光

术语“同步荧光”是指本领域技术人员公知的荧光测定方法，其中用于接收发射光和激发光的两个单色器同时移动，以便测量对应于激发光和发射光的一组信号，其中激发光和发射光的波长彼此分开恒定的间隔，例如30nm。同步荧光特别是由Lloyd(1971)＂Synchronisedexcitation of fluorescence emission spectra＂Nature physicalScience 231：64-5和由Ficheux等人(1991)＂La spectrofluorescencesynchrone：theorie et applications＂Toxicorama 3:1：8-13定义。

在上述定义的方法中，可以通过同步荧光测量所述两个或三个荧光强度，或者，一旦已经测定激发波长和发射波长，通过测量响应于给定激发波长决定的在发射波长发射的光的两个或三个强度来简单地测量所述两个或三个荧光强度。

因此，可以通过同步荧光测定λ₁、λ₂和任选的λ₃作为标记同步光谱斜率变化的点，特别是同步光谱斜率的拐点或断点。

应该理解，斜率断点标记新的斜率与峰前各点的平均斜率值之间的界限，所述新的斜率在统计上不同于先前值限定的背景的值；还必须允许这个平均值周围各点的变化性。

更具体地说，如果将三个波长作为基础，λ₂表示观察到荧光发射强度峰的发射波长，这个峰是由对应于λ₁和λ₃的两个拐点或斜率断点所围绕的。

其中从同步荧光光谱测定λ₁，λ₂，λ₃，λ’₁，λ’₂和λ’₃的方法在以下实施例中对于

的具体情况进行阐述。简而言之，λ₁、λ₂和λ₃可以更具体地分别对应于：

-在使用SHIMADZU RF 535型荧光测定计读取读数时，则对应于代表核酸和荧光团的溶液的同步荧光光谱的单个曲线的斜率的拐点；

-在使用SAFAS Xenius型荧光测定计读取读数时，则对应于代表核酸和荧光团的溶液的同步荧光光谱的单个曲线的斜率的断点；

有利地，本发明的方法允许限制或者防止瑞利干涉现象。

或者，如果使用两个波长作为基础，则λ₁或λ₂表示观察到荧光发射强度峰的发射波长，而另一个表示观察到刚好在所述发射强度峰之前或之后的斜率的拐点或断点的发射波长。图15和16举例说明λ₁和λ₂的选择。优选地，λ₁和λ₂之一表示观察到荧光发射强度峰的发射波长，而另一个表示观察到刚好在所述发射强度峰之前的斜率的拐点或断点的发射波长。

尽管仅使用两个波长不如使用三个波长那样精确，但是它也允许限制和防止瑞利干涉现象，同时容易实施。

荧光测定计

对于本发明的荧光测定计，激发灯泡的功率优选为使得允许在激发波长以小于10％的精度读取约2.5ng/ml的低浓度DNA。优选地，所用的单色器的带宽不超过+/-5nm。发射光，特别是相对于发射光的方向为90°发射的光，优选通过适合的系统捕获并且引导到发射单色器，以便选择对于该测量为特异性的波长。

优选F值由计算机使用其内存中所储存的算法来计算。此外，优选本发明的荧光测定计装备有允许储存数据(例如每个测量组的标定曲线)的系统。还优选地，本发明的荧光测定计在经过计算和使用储存的标定曲线之后提供在样品中包含的核酸的量。

此外，优选本发明的荧光测定计装备有用于显示结果的系统以及用于生成和输出数据的系统例如打印机(或用于连接打印机的设备)。此外，还优选地，所述荧光测定计能够将样品和任何试剂混合，并且能够将它们朝向其中进行测量的读取器皿输送。本发明的荧光测定计优选具有数字或字母数字的小键盘，以便允许输入例如得到要计算其中包含的核酸的量的一个或多个样品的患者的识别符；在分析结束时，这个识别符可以呈现在使用打印机打印的报告中。此外，也可能为荧光测定计装备允许读取包含待分析样品的容器所带的条形码的系统。如果样品包含在允许使用荧光测定计进行测量的容器中，例如本发明的托盘，则所述条形码可以包括该容器的至少一个生产批次编号。这个数字也可以在分析结束时呈现在使用打印机印刷的报告上。

本发明的荧光测定计优选装备有至少一个用于通过电源或电池(用于移动应用)提供电力的设备，以及至少一个用于连接于计算机系统的设备。如果荧光测定计装备有多个连接设备，则这些连接设备优选具有几种不同的标准。在移动应用时，优选荧光测定计尽可能结构紧凑，例如具有以下尺寸：H<15cm；L<25cm；W<20cm，并且尽可能轻，以便在不使用户不便的情况下能够安装在例如实验室操作台上，并且能够容易地移动。

最后，优选荧光测定计装备有允许转移和混合试剂的系统，特别是在将所述系统与本发明的托盘一起使用的情况下。

托盘

本发明的托盘包括本发明的方法所需的所有设备和试剂，即，荧光团、任选的稀释剂、测量器皿、用于收集样品的系统和用于有效实施该方法所必不可少的任何东西。

对于本发明的托盘，有利地使用挠性材料，以便允许将包含在托盘中的各种试剂(样品、缓冲液、荧光团)的混合物混合，例如通过压力-真空或机械压力来混合。

优选托盘的各种隔室(孔、储库、器皿)通过毛细管连接，并且从一个隔室到另一个隔室的流通优选通过挤压例如缓冲液储库、荧光团储库和/或标准化储库来实现。缓冲液通过荧光团储库的流通允许荧光团被稀释，并且混合物整体地被朝向器皿推动。可以在将托盘被放置在荧光测定计中之前或之后将可以事先稀释或未事先稀释的样品放置在托盘的孔中。优选地，将精确的样品体积放置在孔中，然后将最佳确定的量的样品经由标准化储库引导向器皿，以便在其中与荧光团混合。然后可以通过例如使器皿经过压力-真空或机械压力而进行在器皿中的混合。本发明的托盘是有利的，因为其允许进行荧光团浓溶液和缓冲液的即时混合，以便达到对于荧光来说最佳的最终稀释；它还允许荧光团和样品的匀化，以及在适当的情况中允许适当稀释样品和测量发射的荧光。

附图简述

图1：稀释到1/100的血浆中所含DNA的同步荧光光谱。Y轴表示荧光强度(UF)，X轴表示发射波长(nm)。

图2：具有1/4,000稀释的TBE1X缓冲液(pH 8.4)健康患者血浆中的DNA的荧光强度，Δλ＝50nm。血浆稀释到1/100。Y轴表示荧光强度(UF)，X轴表示发射波长(nm)。

图3：具有1/4,000稀释的

TBE1X缓冲液(pH 8.4)患病患者血浆中的DNA的荧光强度，Δλ＝50nm。血浆稀释到1/100。Y轴表示荧光强度(UF)，X轴表示发射波长(nm)。

图4：具有1/20,000稀释的

TBE1X缓冲液(pH 8.4)健康患者血浆中的DNA的荧光强度，Δλ＝50nm。血浆稀释到1/100。Y轴表示荧光强度(UF)，X轴表示发射波长(nm)。

图5：具有1/20,000稀释的TBE1X缓冲液(pH 8.4)患病患者血浆中的DNA的荧光强度，Δλ＝50nm。血浆稀释到1/100。Y轴表示荧光强度(UF)，X轴表示发射波长(nm)。

图6：在三个不同Δλ(50nm、35nm和30nm)时血浆DNA的荧光强度，TBE1X缓冲液(pH 8.4)。Y轴表示荧光强度(UF)，X轴表示发射波长(nm)。

图7：荧光强度(Y轴，任何期望的单位)作为DNA浓度(X轴，ng/ml)的函数的线性。

图8：使用同步荧光测定法测量的DNA浓度(Y轴，拷贝数/ml)与使用试剂盒从前列腺癌患者提取的DNA(TBE1X缓冲液(pH 8.4)、稀释到1/20,000的

)的实时PCR测量的DNA浓度(X轴，拷贝数/ml)之间的相关性。

图9：通过实时PCR测量的拷贝数和作为图8所示结果的通过实时PCR得到的拷贝数的函数的通过同步荧光测定法测量的拷贝数之间的相互关系。

图10：使用同步荧光测定法测量的DNA浓度(Y轴，拷贝数/ml)和使用试剂盒对从前列腺癌患者提取的DNA(TBE1X缓冲液(pH 8.4)、稀释到1/20,000的

)进行实时PCR测量的DNA浓度(X轴，拷贝数/ml)之间的相关性；相对于图8中的结果只保留了从基因组拷贝数/ml大于100的患者提取的DNA浓度。

图11：使用实时PCR测量的DNA浓度(Y轴，拷贝数/ml)与对从前列腺癌和结肠癌患者纯化的DNA(TBE1X缓冲液(pH 11.4)稀释到1/20,000的

)进行同步荧光测定法测量的DNA浓度(X轴，拷贝数/ml)之间的相关性。

图12：使用实时PCR测量的DNA浓度(Y轴，拷贝数/ml)与对从基因组拷贝数/ml大于100的前列腺癌患者得到的不经制备样品的血浆DNA进行同步荧光测定法测量的DNA浓度(X轴，拷贝数/ml)之间的相关性。TBE1X缓冲液(pH 8.4)，稀释到1/20,000。

图13：使用同步荧光测定法测量的DNA浓度(Y轴，拷贝数/ml)与对从前列腺癌患者得到的不经制备样品的血浆DNA进行三波长或差示荧光测定法测量的DNA浓度(X轴，ng/ml)之间的相关性，TBE1X缓冲液(pH 8.4)，

稀释到1/20,000。

图14：使用Shimadzu RF 535光谱荧光计(上面的曲线)和SafasXenius光谱荧光计(下面的曲线)测量的血浆中DNA的同步光谱，血浆中，

稀释到1/20,000，TBE 1X缓冲液(pH 8.4)。血浆稀释到1/100。Y轴表示荧光强度(UF)，X轴表示发射波长(nm)。提供了用于确定λ₁、λ₂和λ₃的绘图方法。

图15和16表示根据本发明的方法使用两个波长的荧光强度(I₁、I₂)进行荧光(F)测定的实例。

参考以下实施例更具体地描述本发明，所述实施例只用于说明而不产生任何限制。

具体实施方式

实施例

设备

从离心的全血将血浆或血清收集在肝素化的EDTA管中，然后倾析；TBE 1X缓冲液(pH 8.5)(Tris 90mM、硼酸90nM、EDTA 2mM)；聚乙烯溶血管，丙烯酸器皿；同步荧光测定计(Shimadzu RF 535读取器，DR-3数据分析器)；

(dsDNA定量试剂盒，MolecularProbes)；标准范围内的已知浓度的标准DNA。

方法

A-同步荧光测定法的原理

a)与常规荧光测定法有关的难点

通常与常规的荧光测定检测有关的主要难点涉及由激发波长与发射波长邻近引起的瑞利散射。这种影响在分析复杂的和含蛋白质的培养基例如血清的情况中特别严重。

在测定常规的荧光光谱时，一个单色器进行扫描光谱，而第二个单色器保持固定。为了产生发射光谱，选择激发波长(对于

为480nm)，而选择再发射光的单色器会扫描超过这个界限，例如480到620nm。

在测量开始时，如果两个单色器设置为相同的波长，则发射单色器接受来自包含样品的器皿的非常强大的光信号，所述光信号与由溶液中化合物分子散射的光相对应。在散射过程中，略多色的光具有至少与激发光相同的波长，并且由此妨碍发射光强度的测量。实际上，在荧光现象中，激发光不是单色的，而是对应于由激发光单色器选择的一组波长：单色光照射读取器皿。然后溶液中样品发射的荧光是多色的并且对应于一组波长。然后通过发射单色器选择这种散射光并且进行测量。在两个单色器的情况中，激发光单色器和发射光单色器设置为相同的波长，要测量两类光，散射光和发射光。测量发射光的强度是不可能的。这是瑞利干涉。

这个散射光具有比荧光发射的光大得多的强度，因此能够将其掩盖，由此使得任何测定都是随机的甚至是不可能进行。需要在充分远离激发波长的波长测量发射的光的强度，以便不受这种干涉的干扰。因此，在这些情况下不可能精确地测量由非常接近的波长所衍生的信号。

为了消除常规荧光中的这种寄生现象，需要：

-减小光狭缝的宽度，以便减少其覆盖范围(尽管这样会降低光束的强度并且由此必然地降低分析的灵敏度)；

-或者移动激发波长(尽管这样降低受激分子的发荧光率，并且由此同样地降低分析的灵敏度)。

b)同步荧光测定法的贡献

方法的原理

在产生同步光谱期间，分光荧光计同时移动两个单色器。在这种情况中，产生激发光谱或发射光谱不再是问题，而测量与激发光和发射光相对应的一组信号是问题，激发光和发射光的波长彼此相隔恒定的间隔(称为Δλ；在目前的情况中为30nm)。

优点

1)消除了由瑞利散射引起的干涉

两个单色器扫描光谱，同时以相同的速度相差恒定的间隔移动。在这种情况中，不再可能受到瑞利散射的干扰，因为两个单色器永不处于相同的波长。激发和发射光学系统中狭缝的部分覆盖可以引起残余的干涉。然而，这种干涉的强度在分析过程中几乎是恒定的并且作为光谱上的线状背景出现。在测量特定信号的高度时，其通过切线的方法容易地除去。

2)减小谱带宽度

如果测量过程中所用的激发和发射波长是允许荧光最大收率的波长，则再发射的强度处于峰的位置。另一方面，在远离这些波长移动时，再发射光的强度变弱，因为在激发期间吸收的光的强度减小并且在发射过程中荧光的收率减小。在同步荧光过程中，将两种现象汇总，使得再发射光的变化更大。这引起相对于在常规光谱中得到的那些，在光谱上的发射频带宽度有所减小。

B-在三个波长测量特定的荧光

前述论点使得从同步荧光技术衍生的技术能够外推。本发明人根据对许多不同疾病患者得到的数百份DNA测量结果发现，在同步光谱中观察到的波谷总是存在的，并且特别地，总是在相同波长具有最小值。

因此，在图1中所示的同步光谱上可以看到三个主要的点：两个拐点：在504nm的“I₁”和在570nm的“I₃”。通过将两个点I₁和I₃连接来计算荧光强度“F”(任意单位)，然后通过测量峰直到直线I₁I₃的交点的高度来测定在526nm发射峰的荧光强度。直线I₁I₃下的信号高度对应于由瑞利散射引起的干扰信号，其不用测量。

称为切线技术的这种技术使得能够消除由瑞利散射引起的背景噪声，并且给出荧光信号的非常好的近似值。

因此，本发明人由此推断，有可能开发仅利用这三个荧光发射波长的新技术。

因此，进行以下测量：

发射I₁：λ’₁＝472nm    λ₁＝502nm

发射I₂：λ’₂＝496nm    λ₂＝526nm

发射I₃：λ’₃＝538nm    λ₃＝568nm

然后，由于主要读数波长(λ₂＝526nm)的瑞利效应，需要外推荧光值“I_R”。基于测量结果I₁和I₃计算这个荧光。因为荧光峰不是完美地对称的，根据下式计算荧光I_R：

(0.6 x I₁)+(0.4 x I₃)＝I_R

然后按照以下方式基于主要波长的测量结果I_R计算对于DNA“F”为特异性的荧光：

F＝I₂-I_R

图14表明，确定荧光的这种方法可以与所用的荧光分光计无关而通用。

C-操作模式

的制备

将在ethynol/TBE的50％混合物(v/v)中稀释50倍的

的储备溶液在

管中等分(120μl)，然后在避光的情况下储存在-20℃的冷却器中。

实验设计

将储存在冷却器(-20℃)中的等分样品的血浆解冻，并且使其回温到实验室的环境温度(15-25℃)，然后在TBE1X缓冲液中稀释(10-300倍)，最终体积＝450μl)。在分析之前将这些稀释物储存在冰中。

用滴管吸取40ml的TBE 1X缓冲液，然后向其中加入即时解冻的100μl 

(产生20,000的最终稀释系数)，将混合物在避光的情况下储存在冰中。

在开始测量之前使荧光分光计启动至少20到30分钟，并且如下编程：

-在激发过程中，单色器从400扫描到600nm；

-在发射过程中，单色器从430扫描到630nm。

为了进行测量，采用以下操作：

- 量取1.9ml稀释到1/20,000的

并且转移到工作台上的避光的溶血管中；

- 然后加入100μl的血浆/血清稀释物(最终容积＝2ml)，将混合物涡旋8-12秒，并且置于工作台上2-3分钟，之后将混合物快速泵入到丙烯酸小池中，以便开始记录光谱。

总是根据含有

的已知浓度的标准DNA获得标准范围，选择的范围点是：2.5ng；25ng和50ng/ml。

N.B.应该在测量之前至少24小时制备TBE 1X缓冲液，并且应该保持在工作台上，这样显著地减少瑞利散射现象。

D-结果

A-实验条件的完善

1-缓冲液的选择

由于

在DNA的双螺旋结构中配合在碱基之间，该缓冲液的这种性质会影响荧光信号。因此试验了在实验室中通常能够找到的各种类型的缓冲液。

- TBE1X缓冲液(三(羟基甲基胺)氨基甲烷1M，EDTA 0.1mM，pH＝7.5)：使用

的常规缓冲液

- 10mM磷酸二氢钾缓冲液，pH＝7.8：磷酸盐缓冲液具有显著的荧光，使其不可能以充分的精度测量存在于标准样品或血浆中的DNA的浓度。

- TBE1X缓冲液(90mM三(羟基甲基胺)氨基甲烷，90mM硼酸，2mM EDTA，pH＝8.5)；缓冲液TBE1X具有轻微残留的荧光，但是特别的是，它在试验波长没有荧光峰。因此，将其用在本发明的分析中是有利的。

2-pH的选择

在不同pH对前述三种缓冲液进行试验：5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5。

这些区域中pH的改变不改变荧光光谱。

3-试剂稀释度的选择：

在极其稀释的介质中进行所述荧光测定技术，以便限制常规的干涉现象：自动抑制作用、猝灭、衰减和竞争，还包含瑞利散射。

本发明人测定了给出最强烈信号的试剂的最低浓度。

试验了

的以下浓度：1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,000、1/4,000、1/8,000、1/12,000、1/20,000。

更弱的稀释度产生强度更低的信号。过于强的稀释度给出的信号可重复性差得多并且在试验的DNA浓度具有不成比例的生长。

从1/4,000的稀释度开始信号变得可以检测到，但是该技术缺乏灵敏度。在这个稀释度，不可能将对照血浆(图2)和患病患者的血浆(图3)区别开来。

发现1/20,000的

稀释度得到最佳的结果。在这个试剂稀释度，该技术表现为灵敏的和线性的，并且也可能在对照血浆(图4)和患病患者的血浆(图5)之间进行区分。

4-血浆稀释度的选择

为了避免与生物学基质有关的干扰，重要的是使用尽可能强烈稀释的样品来进行试验。使用了稀释到1/20、1/50/1/100、1/150、1/200、1/300、1/400的血浆。

使用稀释到1/100的血浆得到最佳结果。

即使在乳白色的或者混浊的血浆的情况中仍没有观察到与血浆的浊度有关，或者与溶血、黄疸或高蛋白血有关的混浊(haze)。

这个稀释度允许以充分的精度测量对照血浆。

5-激发光和发射光之间的波长差的选择

的生产商建议的峰激发和发射波长分别是485和530nm。这些波长以及它们的45nm的差的选择可能是由于分于的性质，但是也可能是由于与读取器皿中光的散射有关的材料应力。45nm差的选择可能是来自于与大多数荧光测定计有关的技术应力，所述大多数荧光测定计只能在激发和发射波长相差40nm时限制瑞利干涉。

如果情况是这样，则它们不会是最大荧光波长而是最佳灵敏度和最小干涉之间的折中波长。

使用同步荧光，在显著地限制瑞利干涉的同时，还允许使用最大荧光波长相差小于10nm的分子。

因此，试验了20、25、30、35、40、45、50和55nm的差。

在激发波长和发射波长之间的差为30nm时得到最佳的灵敏度(图6)。

6-

随时间的稳定性

测量的可重复性如下：

 

浓度nm/ml	5
		平均值	4.5
标准偏差	0.026
		CV％	0.59

CV％＝(标准偏差/平均值)x100

它们的可再现性如下：

 

浓度nm/ml	2	60
			平均值	5.1	66.85
标准偏差	0.9	2.96
			CV％	5.57	4.43

该技术的精确度适用于临床生物学。

b-同步荧光技术的性质

1-精确度

精度包括可重复性和可再现性试验。

可重复性

通过在同一天使用相同的试剂制备物对各种类型的样品测量10次进行试验。

本发明人使用不同浓度的三个标准样品以及两个患者血浆样品：第一个是冷冻一周的，第二个是新鲜的血浆。

表示为CV ％(标准偏差/平均数)*100)的结果汇集在下表中：

 

样品类型	CV％
		标准样品1(5ng/ml)	6.7
标准样品2(50ng/ml)	2.4
		标准样品3(100ng/ml)	2.3
患者1(冷冻的)(215ng/ml)	2.8
		患者2(新鲜的)(1,110ng/ml)	3.5

可再现性

通过使用每天重构的试剂在20个不同的日期分析20次进行该试验。

本发明人使用不同浓度的三个标准样品以及以等分样品冷冻的血浆样品。

结果汇集在以下表中：

 

样品类型	CV％
		标准样品1(5ng/ml)	15
标准样品2(50ng/ml)	2.4
		标准样品3(100ng/ml)	5.9
患者1(冷冻的)(245ng/ml)	4.8

2-准确性

根据以下方法进行试验。通过光度计技术(260nm)分析两个纯化的DNA样品(通过RNA或蛋白质的存在来校正)。这些测定值用作分析的参照。然后通过同步荧光测定法的方法分析这些纯化的DNA样品。

下表表示方法的精确度，表示为相对于光度测量法测定的DNA的百分比。

 

浓度，ng/ml	精确度，％
		15	102
77	106
		159	93

3-检测阈值

根据以下方法计算检测阈值。测量只含TBE 1X缓冲液的20个实例。然后计算这十次测定的平均值，并为这个平均值加上得到的测量值的三倍标准偏差。

这样测量的阈值是3.5ng/ml。

4-灵敏度阈值

可以以20％的充分精度检测到的第一个DNA浓度是4ng/ml。发现它是相对令人满意的。健康受试者的血浆浓度是大约2到6ng/ml的循环DNA。在医院中，病理学数值比这些正常值高得多。

5-线性试验

从4ng/ml直到至少5,000ng/ml的DNA，该技术都是线性的(图7)。

c-涉及测量三个荧光点的技术的性质

通过这种方法得到的结果在所有的点都与同步荧光技术的结果相同(图13)。

结论：这些第一试验表明，同步荧光测定方法或涉及测量三个荧光点的方法是可用于临床生物学的可靠的技术。

以下将这些结果与定量PCR的结果进行比较。

d-在各种癌症(前列腺癌、结肠癌)中通过同步荧光测定方法测定循环的DNA

在第一阶段，对相同的DNA提取物进行试验，以便关于纯化的提取物验证该方法，并且检验其相对于参考分析(定量PCR)的相关性。然后，在第二阶段，直接对于患者的血浆验证这个方法，总是通过与参照技术进行对比来验证。

1-在各种癌症中使用试剂盒对于提取的DNA进行PCR对荧光测定法的相关性的检验

前列腺癌

相关性是优异的，但是在低DNA浓度观察到点群的变形(图8)。

通过图9中的结果之间的比率图对这个变形进行分析。观察到点群的明显变形。在基因组的100拷贝/ml的数值以下，PCR技术似乎是缺乏灵敏度，而同步荧光测定法则与之相反。

在基因组的100拷贝/ml的阈值以上，相关性保持为优异的(图10)。

处于不同阶段的前列腺癌和结肠癌

对得自前列腺癌或结肠癌的患病患者的样品进行第二系列的测量。与前述系列中一样，在定量PCR技术中发现基因组的100拷贝/ml的阈值(图11)。

2-关于血浆DNA的PCR与荧光测定法的相关性

该研究还在没有经过预加工的生物样品上进行验证。本发明人使用得自前列腺癌或结肠癌的患者的冷冻血浆。更特别地使用了基因组的拷贝数>100拷贝数/ml的样品(n＝32)并且直接在血浆中量化DNA(图12)。

观察到相关性是优异的，并且与使用提取的DNA得到的相关性处于相同的水平。

e-在各种癌症(前列腺癌、结肠癌)中通过涉及三个荧光点的方法测定循环的DNA

同时使用同步荧光测定法进行测量，本发明人通过涉及三个荧光点的方法分析每个血浆中的循环DNA浓度，而没有事先对DNA进行预加工(图13)。

发现相关性是优异的并且与同步荧光所得到的完全相同。因此，用于测定循环DNA的两种新技术是完全等价的并且与参照技术(定量PCR)完美地相关。

讨论

定量PCR目前是用于测量循环DNA的量的最广泛使用的方法。然而，这种方法相对昂贵，专业化并且不适合在医疗急症中心使用。

由于其特别的原理，PCR非常显著地扩增存在于样品中的所有DNA。在将得自DNA浓度呈现轻微改变的患者的样品之间进行区分是极其困难的，因为它们以几乎相同的比例扩增。然而，在这种情况中，PCR技术缺乏灵敏度。需要患者呈现DNA浓度的明显增加，以便将其与对照进行区分，或者将其二者彼此区分。

此外，在定量PCR中，在富含酶和大分子(引物、纯化的DNA片断、荧光团等)的复杂的反应介质中测量荧光，有在分析中诱导显著干扰的危险。众所周知，介质浓度越大，则荧光读数的能力越小。在这种情况中，可能的主要的干扰类型如下：

- 自动抑制作用。在高浓度时可能有荧光的自动抑制作用，是由于分子之间的碰撞次数增加(所述碰撞消耗接收的能量)，或者是由于形成了不产生荧光的聚合物。

- 荧光或猝灭的抑制。在高度浓缩或非均质的复杂介质中，有荧光或猝灭阻抑现象的危险，这是由于发荧光的分子与溶剂或另一种溶质之间的相互作用引起的。荧光的收率和/或荧光的持续时间减小。从使用的观点，这意味着在存在抑制性物质时化合物的荧光性较小。这在分析没有预先纯化的生物培养基中进行分析的过程中是一个缺点。另外，消光并不总是均匀的。

- 衰减(光致漂白)。这是荧光染料的荧光的损失，所述损失是由于导致分子被破坏的光的过度激发引起的，或者是由于通过其反应性形式与另一个分子偶联引起反应的缺乏而引起的。

- 竞争。这是由于特异性物质或玻璃器皿的污染物的自动荧光引起的。

在定量PCR中，如果在与同步荧光技术大约相同的浓度分析DNA，则其中荧光团要浓度更大1,000倍。另外，引物的分子和聚合酶的分子具有充分的浓度来使它们干涉发射的光。

介质中分子的这种高浓度还促进与溶液中分子散射入射光有关的瑞利效应。激发波长和发射波长的相差越小(只间隔45nm)，则灵敏度越高，在选择灯的强度和选择读取狭缝方面导致显著的技术限制。

所有这些因素使得本发明人寻找基于在稀释得多的介质中进行分析的新技术。

常规的荧光技术的选择显著地提高分析的灵敏度并且避免了提取和扩增的阶段，所述提取和扩增必然伴随干涉、技术可变性和处理误差的最大危险。

选择同步荧光测定法确保了分析的优异的特异性，并且通过允许使用最大激发发射波长允许进一步提高分析灵敏度。

实施这一方法显示，在同步光谱中存在三个关键点。对所有这些数据的分析还向本发明人保证了这些点的稳定性。它们总是存在的并且总是处于相同的波长。因此，通过只测量三个荧光强度并且开发用于精确测量度与DNA为特异性的荧光的计算式来开发新的测量策略。这种新的技术具有与同步荧光测定法中实现的同样优异的分析性质，特别是在其灵敏度方面。

更好的DNA分析灵敏度允许在患者的随访中更早的发现率升高。在较年长的受试者(>65岁)的情况中尤其是这样，其中(数据未表示)似乎是正常值随年龄递增。这可能会允许这种分析的应用范围得以扩展。

开发的这种技术是非常令人满意的。它们是非常精确的并且分析范围非常符合临床要求。另外，它们与最通常使用的技术(实时定量PCR)有非常好的相关性。实现的各种相关性证明了我们的结果具有优异的临床关联性。基因组的100拷贝数/ml的阈值接近于目前是定量PCR中病理学测定阈值的基因组的150拷贝数/ml的阈值。这近似地对应于我们的技术的基因组的15,000拷贝数/ml，这是在文献中也发现的数值。

因此，本发明人能够确定两种用于省略DNA提取和扩增阶段的新技术，并且这允许显著地缩短分析时间到几分钟。

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Claims (24)

1.用于测定存在于样品中的核酸的量的方法，其中：

-向样品加入荧光团，

-测量分别响应于至少两个激发波长的光刺激而由荧光团在至少两个发射波长发射的荧光强度，和

-从测量的至少两个荧光强度推导存在于样品中的核酸的量。

2.权利要求1的方法，其中核酸是天然或合成来源的。

3.权利要求1或2的方法，其中核酸是DNA或RNA。

4.权利要求1到3中任一项的方法，其中样品是天然或合成来源的。

5.权利要求1到4中任一项的方法，其中样品是生物样品或生物样品衍生物。

6.权利要求5的方法，其中样品是通过稀释衍生自生物样品。

7.权利要求1到6中任一项的方法，其中样品来源于经历了可能发生细胞破裂的生理病理学状况的患者。

8.权利要求5到7中任一项的方法，其中已经确定的核酸的量被用于细胞死亡表征的情况中。

9.权利要求1到8中任一项的方法，其中荧光团是核酸嵌入试剂。10.权利要求1到9中任一项的方法，其中荧光团是

([N-双(3-二甲基氨基丙基)-氨基]-4-[2，3-二氢-3-甲基-(苯并-1，3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+)。

11.权利要求1到10中任一项的方法，其中分别测量响应于三个激发波长λ’₁、λ’₂和λ’₃的光刺激而由荧光团在三个发射波长λ₁、λ₂和λ₃发射的荧光强度I₁、I₂和I₃，其中λ₁<λ₂<λ₃和λ₁，λ₂和λ₃是预先确定的。

12.权利要求11的方法，其中从以下F值推导核酸的量：

$f=I_2-[\frac{I_1-I_3}{{\mathrm{\&lambda;}}_1-{\mathrm{\&lambda;}}_3}{\mathrm{\&lambda;}}_2-\frac{{\mathrm{\&lambda;}}_1{I}_3-{\mathrm{\&lambda;}}_3{I}_1}{{\mathrm{\&lambda;}}_1-{\mathrm{\&lambda;}}_3}]$

13.权利要求11或12的方法，其中荧光团是

，并且波长如下：

λ’₁＝472±10nm  λ₁＝502±10nm

λ’₂＝496±10nm  λ₂＝526±10nm

λ’₃＝538±10nm  λ₃＝568±10nm。

14.权利要求1到10中任一项的方法，其中分别测量响应于两个激发波长λ’₁和λ’₂的光刺激而由荧光团在两个发射波长λ₁和λ₂发射的荧光强度I₁和I₂，其中λ’₁和λ’₂是预先确定的。

15.权利要求14的方法，其中优选从I₁和I₂之间的差的绝对值推导核酸的量，I₁和I₂之间的差的绝对值即以下的F值：

F＝|I₂-I₁|。

16.权利要求14或15的方法，其中荧光团是，并且波长如下：

λ’₁＝472±10nm  λ₁＝502±10nm，和

λ’₂＝496±10nm  λ₂＝526±10nm，或

λ’₁＝496±10nm  λ₁＝526±10nm，和

λ’₂＝538±10nm  λ₂＝568±10nm。

17.权利要求12或15的方法，其中使用校准曲线从F值推导样品中核酸的量。

18.适合于实施权利要求10到17中任一项定义的方法的荧光测定计，特征在于，其包括：

-一个或多个用于在两个和/或三个激发波长λ’₁、λ’₂和任选的λ’₃进行光激发的设备；

-一个或多个用于测量在三个发射波长λ₁、λ₂和任选的λ₃发射的荧光强度I₁、I₂和任选的I₃的设备；

-允许计算以下F值的计算装置：

F＝|I₂-I₁|和/或 $F=I_2-[\frac{I_1-I_3}{{\mathrm{\&lambda;}}_1-{\mathrm{\&lambda;}}_3}{\mathrm{\&lambda;}}_2-\frac{{\mathrm{\&lambda;}}_1{I}_3-{\mathrm{\&lambda;}}_3{I}_1}{{\mathrm{\&lambda;}}_1-{\mathrm{\&lambda;}}_3}]$

19.权利要求18的荧光测定计，其中激发波长和发射波长如下：

λ’₁＝472±10nm  λ₁＝502±10nm

λ’₂＝496±10nm  λ₂＝526±10nm

λ’₃＝538±10nm  λ₃＝568±10nm。

20.权利要求18的荧光测定计，其中激发波长和发射波长如下：

λ’₁＝472±10nm  λ₁＝502±10nm，和

λ’₂＝496±10nm  λ₂＝526±10nm，或

λ’₁＝496±10nm  λ₁＝526±10nm，和

λ’₂＝538±10nm  λ₂＝568±10nm。

21.设计用于化合物的荧光测定法的托盘，包括混合和测量器皿，其允许器皿的内部和外部进行光交换，并且所述器皿连接于：

·包含荧光团的储库，所述荧光团储库本身连接于包含稀释溶液的储库；并且所述器皿连接于

·用于使包含待分析化合物的样品的体积标准化的储库，所述标准化储库本身连接于用于收集包含待分析化合物的样品的孔。

22.权利要求21的托盘，其中设置了单向阀，所述单向阀的位置为：

-在收集孔和标准化储库之间，使得收集的溶液只能够沿标准化储库的方向通过；

-在标准化储库和混合和测量器皿之间，使得收集的溶液只能够沿器皿的方向通过；

-在包含稀释溶液的储库和荧光团储库之间，使得稀释溶液只能够沿荧光团储库的方向通过；

-在荧光团储库和混合和测量器皿之间，使得稀释溶液只能够沿器皿的方向通过。

23.权利要求21或22的托盘，其中由标准化储库、混合和测量器皿、荧光团储库和稀释溶液储库组成的各个隔室是由充分挠性的材料制成的，以便允许通过对容器施加压力而使容器中包含的液体移动。

24.权利要求21到23中任一项的托盘，其中荧光团是

，和稀释溶液为Tris-Botrate-EDTA(TBE)缓冲液。

25.权利要求21到24中任一项的托盘，其中标准化储库与用于选择收集溶液中所含的、长度小于1,000个核苷酸的核酸分子的设备耦联。

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