PL233889B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom, rozwiązanie to umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanego gatunku nicienia, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR.

Nicienie pasożytnicze żerujące na grzybni są wyposażone w specjalny aparat gębowy, którym wysysają sok komórkowy z grzybni pieczarek, co prowadzi do jej obumierania. Straty widoczne są zwykle dopiero w dalszych rzutach, lecz jeśli podłoże było bardzo zainfekowane w czasie rozrostu grzybni, to mogą one pojawić się wcześniej. W razie występowania nicieni pasożytniczych jedynym sposobem ich eliminacji jest gotowanie podłoża na półkach po zakończeniu uprawy i uprzątnięcie wszelkich jego resztek z pieczarkami, a drewniane półki należy ponownie impregnować. Groźnymi dla uprawy grzybów są Aphelenchus avenae, Aphelenchoides composticola i Paraphelenchus myceliophthorus oraz inne nicienie należące do Aphelenchoides.

lentyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.

Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.

Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragm entu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYT O9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primerdimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.

Identyfikacja gatunków należących do rodzaju Aphelenchoides (A.besseyi, A.fragariae, A.ritzemabosi, A.subtenuis) metodą real time PCR została opisana w pracy Rybarczyk-Mydłowska K, Mooyman P, van Megen H, van den Elsen S, Vervoort M, Veenhuizen P, van Doorn J, Dees R, Karssen G, Bakker J, Helder J. 2012 Small Subunit Ribosomal DNA-Based Phylogenetic Analysis of Foliar Nematodes (Aphelenchoides spp.) and Their Quantitative Detection in Complex DNA Backgrounds. Nematology 102(12): 1153-1160, natomiast do identyfikacji Paraphelenchus myceliophthorus dotych

PL 233 889 Β1 czas stosowano tylko tradycyjne metody morfologiczne i morfometryczne. Identyfikacja tych gatunków za pomocą PCR została zaproponowana przez autorów po raz pierwszy.

W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nie identyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywanie nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji;

b) wypłukanie nicieni z gleby;

c) izolację DNA;

d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;

e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza, Real Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:

Gatunek	5’ starter	3' starter	Sonda
Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja
Paraphelenchus myc e tiophlhorus	Pmyfv	GTGCATTTGCGAGTA ATG	Pmyrv	CAACCAGGTTTCT CCAAA	Pmys	CGCACATCAGATGACCTA ACCACA

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Paraphelenchus myceliophthorus, metodą PCR, zwłaszcza Real Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:

Gatunek	5' starter	3’ starter	Sonda
Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja
Paraphelenchu.i myceliophthorus	Pmyfv	GTGCATTTGCGAGTA ATG	Pmyrv	CAACCAGGTTTCT CCAAA	Pmys	CGCACATCASATGACCTfi ACCACA

Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.

Poniżej podano przykład identyfikacji Paraphelenchus myceliophthorus. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju z tej samej rodziny.

Przykład

Identyfikacja nicienia Paraphelenchus myceliophthorus.

DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:

PL 233 889 Β1

Starter/sonda	Sekwencja
Pmyfv	GTGCATTTGCGAGTAATG
Pmyrv	CAACCAGGTTTCTCCAAA
Pmys	CGCACATCAGATGACCTAACCACA

Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:

- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,

- 2 μ10,0 μΜ każdego zc starterów Pmyfv i Pmyrv,

-1 μΙ 4.0 μΜ sondy Pmys znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE, a 3’-końcu wygaszaczem HBQ1,

- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),

- 2 μΙ DNA.

Mieszaniny reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ. umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:

I	Etap	Temperatura |CC|	| Czas js!	Pomiar fluoresccncji
| Pre-mkutaja		95	uo	-
5 ί	denaturacja	95	| 30	*
j Ampłitlkacja	przyłączanie	' 55	{ ' 30	pojedynczy
i	synteza	72	] 30	................... ....................... '
f Chłodzenie		40	] 20

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Paraphelenchus pseudoparientinus.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 1.

Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykręcie Paraphelenchus myceliophthorus w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przegotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real Time PCR. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz studium rozwoju.

Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicienie w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR.

Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.

Wykaz sekwencji starterów i sond

Nr startera/sondy	Nazwa	Sekwencja
Nr 1	Pmyfv	GTGCATTTGCGAGTAATG
Nr 2	Pmyrv	CAACCAGGTTTCTCCAAA
Nr 3	Pmys	CGCACATCAGATGACCTAACCACA

PL 233 889 B1

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji;

b) wypłukanie nicieni z gleby;

c) izolację DNA;

d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;

e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, znamienny tym, że do identyfikacji gatunku Paraphelenchus myceliophthorus w reakcji PCR, zwłaszcza Real Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 5' (nr) i 3' (nr 2) oraz sondę nr 3.

2. Zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliopthours, metodą PCR, zwłaszcza Real Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 5' (nr 1) i 3' (nr 2) oraz sondę nr 3.