PL233888B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR - Google Patents
Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR Download PDFInfo
- Publication number
- PL233888B1 PL233888B1 PL415496A PL41549615A PL233888B1 PL 233888 B1 PL233888 B1 PL 233888B1 PL 415496 A PL415496 A PL 415496A PL 41549615 A PL41549615 A PL 41549615A PL 233888 B1 PL233888 B1 PL 233888B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- identification
- time pcr
- real time
- nematode
- pcr
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241001130173 Paralongidorus maximus Species 0.000 title claims abstract description 13
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 32
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 6
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000201425 Longidoridae Species 0.000 description 2
- 241001220360 Longidorus Species 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 241000294568 Aphelenchoides fragariae Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000965849 Delphinium multiplex Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000208367 Euonymus Species 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000522084 Leptocephalus Species 0.000 description 1
- 241000208565 Lignosus Species 0.000 description 1
- 241001021844 Longidorus aetnaeus Species 0.000 description 1
- 241001194824 Longidorus distinctus Species 0.000 description 1
- 241001220357 Longidorus elongatus Species 0.000 description 1
- 241001130178 Longidorus macrosoma Species 0.000 description 1
- 241001096501 Longidorus poessneckensis Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000489861 Maximus Species 0.000 description 1
- 206010027146 Melanoderma Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001130174 Paralongidorus Species 0.000 description 1
- 241000725693 Raspberry ringspot virus Species 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000201423 Xiphinema Species 0.000 description 1
- 241000201421 Xiphinema index Species 0.000 description 1
- 241001423919 Xiphinema vuittenezi Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000024293 detection of nematode Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 244000045561 useful plants Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus, szkodnika drzew i krzewów owocowych, metodą Real Time PCR. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom, rozwiązanie to umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus, szkodzącego drzewom i krzewom owocowych, metodą Real Time PCR.
W Europie wykazano obecność 79 gatunków Longidoridae, z których 13 występuje w Polsce. Przedstawiciele tej rodziny zaliczani są do pasożytów roślin, są również wektorami wirusów atakujących rośliny. Rozmnażają się w glebie. Okres ich rozwoju jest długi i może trwać nawet kilka miesięcy. Mogą pasożytować na wielu roślinach użytkowych. Porażone rośliny są karłowate lub zamierają, szczególnie gdy porażone zostaną we wczesnym stadium swego rozwoju. Niektóre z tych gatunków np.: Longidorus attenuaius, L. elongatus, L. macrosoma mogą przenosić wirusa czarnej plamistości pierścieniowej pomidorów i wirusa pierścieniowej plamistości malin. Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nie identyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primerdimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów.
Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.
Dotychczas najczęściej stosowaną metodą molekularnej identyfikacji nicieni było PCR. McCuiston J.L, Hudson L.C. Subbotin S.A., Davis E.L., Warfield C.Y Conventional and PCR Detection of Aphelenchoides fragariae in Diverse Ornamental Host Plant Species. J Nematol. Dec 2007; 39(4): 343-355 opracowali startery do identyfikacji Apheienchoides fragariae. Wang X, Bosselut N, Castagnone C, Voisin R, Abad P, Esmenjaud D. Multiplex polymerase chain reaction identification of single individuals of the Longidorid nematodes Xiphinema index, X diversicaudatum, X. vuittenezi, and X.
PL 233 888 Β1 italiae using specific primers from ribosomal genes. Phytopathology. 2003; 93:160-166 opisali sekwencje starterów do identyfikacji czterech gatunków Xiphinema.
Stosowano również metodę analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) wykorzystującą enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności co pozwoliło autorom opracować metodę do identyfikacji 11 gatunków: Longidorus aetnaeus, L africanus, L andalusicus, L artemisiae, L caespiticola, L. distinctus, L elongatus, L euonymus, L intermedius, L leptocephalus i L lignosus (Subbotin S.A., Rogozhin E.A., Chizhov V.N. Molecular characterisation and diagnostics of some Longidorus species (Nematoda: Longidoridae) from Russia and other countries using rRNA genes. 2014 Eur J Plant Pathol 138: 377-390).
Przy aktualnym stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję gatunków nicieni, które dotychczas nie były identyfikowane metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację nicienia Paralongidorus maximus z dużą czułością i specyficznością oraz dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sondy, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju. Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus w próbce, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji Paralongidorus maximus w reakcji PCR, zwłaszcza, Real Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:
| Gatunek | 5' starter | 3’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| Paralongidorus maximus | Pmaxfv | ccgtcctaatcgct TGTC | Pma,xrv | GTACGAACCTCCACC AGA | Pmax3 | CTCTGGCTTCGCTCTG CTCA |
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus, metodą PCR, zwłaszcza Real Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:
| Gatunek | 5' starter | 3’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| Paralongidorus mazimus | Pmaxfv | CCGTCGTAATCGCT TGTC | Pmaxrv | CTACGAACCTCCACC AGA | Pmaxs | CTCTGGCTTCGCTCTG CTCA |
Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.
Poniżej podano przykład identyfikacji Paralongidorus maximus. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany.
Przykład
Identyfikacja nicienia Paraloneidorus maximus.
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:
PL 233 888 Β1
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Pmaxfv | CCGTCCTAATCGCTTGTC |
| Pmaxrv | CTACGAACCTCCACCAGA |
| Pmaxs | CTCTGGCTTCGCTCTGCTCA |
Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Pmaxfv i Pmaxrv,
- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Pmaxs znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE, a 3’- końcu wygaszaczem HBQ1,
- 10μ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pomiar fluorescencji | |
| Pre-inkubacja | 95 | 180 | - | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | .10 | - |
| przyłączanie | 55 | 30 | pojedynczy | |
| synteza | 72 | 30 | - | |
| Chłodzenie | 40 | 20 | - |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicienia Longidorus poessneckensis.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 1
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicienia Paralongidorus maximus w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real Time PCR. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunku niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicienie w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.
Wykaz sekwencji starterów i sond
Nr startera/sondy
Nr 1
Nr 2
Nr 3
Nazwa
Pmaxfv
Pmaxrv
Pmaxs
Sekwencja
CCGTCCTAATCGCTTGTC
CTACGAACCTCCACCAGA
CTCTGGCTTCGCTCTGCTCA
PL 233 888 B1
Claims (2)
1. Sposób identyfikacji nicienia, Paralongidorus maximus w próbce, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zasosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplikacjami próby zerowej oraz kontroli negatywnej, znamienny tym, że do identyfikacji gatunku Paralongidorus maximus w reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 5' (nr) i 3' (nr 2) oraz sondę nr 3.
2. Zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 5' (nr 1) i 3' (nr 2) oraz sondę nr 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415496A PL233888B1 (pl) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415496A PL233888B1 (pl) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415496A1 PL415496A1 (pl) | 2017-07-03 |
| PL233888B1 true PL233888B1 (pl) | 2019-12-31 |
Family
ID=59201381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415496A PL233888B1 (pl) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL233888B1 (pl) |
-
2015
- 2015-12-23 PL PL415496A patent/PL233888B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL415496A1 (pl) | 2017-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Webster et al. | Rapid diagnostic multiplex PCR (RD-PCR) to discriminate Schistosoma haematobium and S. bovis | |
| CN102586461B (zh) | 一种北方根结线虫lamp快速检测方法及应用 | |
| CN102174650B (zh) | 一种象耳豆根结线虫lamp快速检测方法及应用 | |
| US11795514B2 (en) | Isothermal based-dual functional oligonucleotide including reporter dye, and quencher for isothermal nucleic acid amplification and measurement methods using | |
| KR102128651B1 (ko) | 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 검출세트 및 검출방법 | |
| KR101624026B1 (ko) | 사과갈색무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| RU2573937C1 (ru) | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВОЛОДУШКИ МНОГОЖИЛЬЧАТОЙ (Bupleurum multinerve DC.) | |
| PL233888B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233892B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus eonymus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231513B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus poessneckensis, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231512B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus intermedius, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL232394B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Xiphinema diversicaudatum, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233837B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR | |
| PL233836B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR | |
| PL230914B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL230915B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR | |
| PL233886B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Geocenamus longus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231511B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus tiliae, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233891B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL232392B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus fraudulentus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233894B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius microdorus, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR | |
| PL232391B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus hofmanni, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233893B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, ważnego szkodnika roślin uprawnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233885B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius brevidens, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR | |
| Lee et al. | Development of in-field-diagnosis of Aspergillus flavus by Loop-Mediated Isothermal Amplification in Honeybee |