PL233891B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR - Google Patents
Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR Download PDFInfo
- Publication number
- PL233891B1 PL233891B1 PL415505A PL41550515A PL233891B1 PL 233891 B1 PL233891 B1 PL 233891B1 PL 415505 A PL415505 A PL 415505A PL 41550515 A PL41550515 A PL 41550515A PL 233891 B1 PL233891 B1 PL 233891B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- identification
- time pcr
- curvatum
- nematode
- pcr
- Prior art date
Links
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 18
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title abstract description 4
- 241001650721 Geocenamus Species 0.000 title 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 32
- 241001251426 Mesocriconema curvatum Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 13
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 7
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 241001540470 Mesocriconema Species 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 4
- 241000243771 Bursaphelenchus xylophilus Species 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000294568 Aphelenchoides fragariae Species 0.000 description 2
- 241000243770 Bursaphelenchus Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241001540484 Criconematidae Species 0.000 description 1
- 241001267662 Criconemoides Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001540472 Mesocriconema xenoplax Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000024293 detection of nematode Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie to umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanego gatunku nicienia niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR.
Mesocriconema curvatum jest pasożytem i groźnym szkodnikiem drzew, który żyjąc w przewodach żywicznych, namnaża się. Tym doprowadza do ich zatykania, a w konsekwencji do śmierci rośliny.
Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometryczn ych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również gdy 1-2 nukleotydy sąnieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.
Dotychczas najczęściej stosowaną metodą molekularnej identyfikacji nicieni było PCR. McCuiston J.L, Hudson L.C. Subbotin S.A., Davis E.L., Warfield C.Y Conventional and PCR Detection of Aphelenchoides fragariae in Diverse Ornamental Host Plant Species. J Nematol. Dec 2007; 39(4): 343-355 opracowali startery do identyfikacji Aphelenchoides fragariae.
Stosowano metodę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) wykorzystującą enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności. Burgermeister W., Metge K., Braasch H., Buchbach E. 2005. ITS-RFLP patterns for differentiation of 26 Bursaphelenchus species (Nematoda: Parasitaphelenchidae) and observations on their distribution. Russian Journal of Nematology, 13: 29-42 opracowali metodę PCR-RFLP do identyfikacji 44 gatunków Bursaphelenchus.
PL 233 891 Β1
Do identyfikacji B. xylophylus z powodzeniem stosowano metodę Real Time PCR (Cao AX, Liu XZ, Zhu SF, Lu BS. Detection ofthe Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus, Using a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 2005 May;95(5):566-571; Ye W, Giblin-Davis RM. Molecular characterization and development of real-time PCR assay for pine-wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Parasitaphelenchidae). PLoS One. 2013 Nov 11 ;8(11):e78804. doi:10.1371/joumal.pone.0078804). Identyfikację Mesocriconema curvatum poprzez sekwencjonowanie DNA opisano w publikacji Cordero MA, Robbins RT, Szalanski AL. 2012. Taxonomic and Molecular Identification of Mesocriconema and Criconemoides Species (Nematoda: Criconematidae). Journal of Nematology 44(4):399-426.
Przy aktualnym stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję gatunków nicieni, które dotychczas nie były identyfikowane metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację nicienia Mesocriconema curvatum z dużą czułością i specyficznością oraz dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sondy, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju. Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza, Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | 5’ starter | 3 ’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| Mtsacrtconema iurvalum | MecuT | AGCTGAAACTT AAAGGAATTG | Mecurev | CAACCACCGAA TCATGAA | Mecurs | ATCAATCTGTCAAT CCTTACGGTGTC |
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, metodą PCR, zwłaszcza Real -Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:
| Gatunek | 5' starter | 3’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| Mesocriconema eurva!um | Mecurf | AGCTGAAACTT AAAGGAATTG | Mecure V | CAACCACCGAA TCATGAA | Mecurs | ATCAATCTGTCAAT CCTTACGGTGTC |
Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.
Poniżej podano przykład identyfikacji Mesocriconema curvatum. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju z tej samej rodziny.
PL 233 891 Β1
Przykład 1
Identyfikacja nicieni z gatunku Mesocriconema curyatum
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Mecurf | AGCTGAAACTTAAAGGAATTG |
| Mecurev | CAACCACCGAATCATGAA |
| Mecurs | ATCAATCTGTCAATCCTTACGGTGTC |
Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Mecurf i Mecurev,
- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Mecurs znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE, a 3’-końcu wygaszaczem HBQ1,
- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pomiar fluorescencji | |
| fre-inkubacja | 95 | I80 | - | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | 30 | - |
| przyłączanie | 55 | 30 | pojedynczy | |
| synteza | 72 | 30 | - | |
| Chłodzenie | 40 | 20 | - |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Mesocriconema xenoplax.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 1.
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie Mesocriconema curvatum w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunek nicienia w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.
PL 233 891 Β1
Wykaz sekwencji starterów i sond
Nr startera/sondy Nazwa
Sekwencja
Nr 1
Mecurf
AGCTGAAACTTAAAGGAATTG
Nr 2
Mecurev
CAACCACCGAATCATGAA
Nr 3
Mecurs
ATCAATCTGTCAATCCTTACGGTGTC
Claims (2)
1. Sposób identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji i próby zerowej oraz kontroli negatywnej, znamienny tym, że do identyfikacji gatunku Mesocriconema cun/afum w reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 5’ (nr 1) i 3’ (nr 2) oraz sondę nr 3.
2. Zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 5’ (nr 1) i 3’ (nr 2) oraz sondę nr 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415505A PL233891B1 (pl) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415505A PL233891B1 (pl) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415505A1 PL415505A1 (pl) | 2017-07-03 |
| PL233891B1 true PL233891B1 (pl) | 2019-12-31 |
Family
ID=59201411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415505A PL233891B1 (pl) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL233891B1 (pl) |
-
2015
- 2015-12-23 PL PL415505A patent/PL233891B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL415505A1 (pl) | 2017-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Webster et al. | Rapid diagnostic multiplex PCR (RD-PCR) to discriminate Schistosoma haematobium and S. bovis | |
| JPH10332701A (ja) | 核酸融解温度測定法 | |
| CN108060257A (zh) | 一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及其检测方法 | |
| Alemu | Real-time PCR and its application in plant disease diagnostics | |
| PL233891B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL230914B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231511B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus tiliae, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL232392B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus fraudulentus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL232391B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus hofmanni, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233890B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Rotylenchus buxophilus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233886B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Geocenamus longus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231510B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Rotylenchus capitatus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233892B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus eonymus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233894B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius microdorus, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR | |
| PL232394B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Xiphinema diversicaudatum, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233888B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231513B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus poessneckensis, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231512B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus intermedius, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233885B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius brevidens, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR | |
| PL233837B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR | |
| PL233893B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, ważnego szkodnika roślin uprawnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233889B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL231509B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus tritici, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233839B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR | |
| PL233836B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR |