CN101519440A - 一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用。具体为所述交叉保护性疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，制备方法：构建pET258质粒而后与以哈氏弧菌T4为模板，用引物VHQF5和VHQR5进行PCR扩增得产物构建的质粒pBTQ连接，转化入大肠杆菌得质粒pEVQ，而后诱导得抗原VhdQ；所述交叉保护性疫苗抗原与B187－PBS培养液混合作为哈氏弧菌和副溶血弧菌交叉保护性疫苗抗原。本发明所得疫苗抗原存在于多种病原性弧菌中，具高度保守性，因而具有交叉保护效应。本发明所得高效原核表达系统，能够用于大量表达上述交叉保护抗原，由此制备的抗原蛋白保有其天然免疫活性，可以直接用于免疫防治。

Description

一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用。

背景技术

弧菌属为革兰氏阴性杆菌，广泛分布于世界各地，尤其是海洋环境中。该属包括多种人类和养殖水生生物病原菌，如霍乱弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，哈氏弧菌等。其中哈氏弧菌(Vibri oharveyi)长期以来为虾类重要病原菌，其感染和传播给我国养虾业造成巨大经济损失。除虾以外，哈氏弧菌还能够感染多种鱼和贝等；最近调查研究表明，该菌近几年来已成为危害我国，尤其是北方，海水养殖业发展的主要病原之一。副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)为重要人类病原菌，同时亦能感染多种养殖水生生物，包括鱼、虾、贝和蟹等。

目前对于这些病原性细菌病的防治主要依赖于抗生素(包括各种化学药物)和疫苗免疫两条途径。虽然人类医学史的发展已证明疫苗免疫为最有效的疾病预防措施，然而对于我国水产养殖业而言由于起步较晚，基础研究相对落后于生产发展等原因，养殖水生生物病害的免疫防治仍是一个亟待解决的问题。目前国际上应用和尝试应用于水产业的疫苗可分为灭活全菌疫苗、减毒疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗等几大类。灭活疫苗虽然安全但往往由于抗原成分和结构在制备过程中被部分破坏而免疫效应较差；减毒疫苗虽然免疫效应强但由于是活菌因而具有一定的潜在性安全隐患；相对而言重组蛋白和基因疫苗在安全性和稳定性上都具有优势，其实际应用价值只受限于其免疫保护效应和传递手段。因而筛选和获得具高效免疫效应的抗原是重组蛋白疫苗构建的关键。另外，由于水产养殖生物病原的多样性和多变性，针对单一病原的特异性疫苗已不能满足产业要求，而对多种不同病原皆具保护效应的交叉疫苗则由于其更大的实际应用价值而成为将来疫苗发展的趋势。

发明内容

本发明目的在于提供一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

交叉保护性疫苗抗原：具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。

抗原制备方法：1)质粒pET258构建：将经BglII/NdeI双酶切的质粒pET25回收的104bp片段与经BglII/NdeI双酶切的质粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌中并在含安卡青霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pET258；

2)质粒pEVQ构建：

a.以哈氏弧菌T4为模板，用引物VHQF55’-CATATGGCGCTTCCACTCAGTGTGG-3’，VHQR55’-CTCGAGGCGGATAACGAGGTAAACC-3’，进行PCR扩增，产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBTQ；

其中所述哈氏弧菌T4于2007年3月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1985，分类命名：哈氏弧菌，拉丁名称：harveyi；

b.将步骤a)的质粒pBTQ用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后电泳，回收1.3kb DNA片段，将其与步骤1)的质粒pET258连接，转化入大肠杆菌，在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pEVQ；

3)质粒pEVQ的诱导表达：将步骤2)的质粒pEVQ转化入大肠杆菌中，在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子即为BL21/pETQ，将BL21/pETQ于含有Kn的LB培养基中过夜培养；而后再将培养液加入到新鲜的含有Kn的LB液体培养基中，于37℃摇动培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃继续摇动培养4-5小时，裂解菌体，离心收集上清，纯化重组蛋白，即为具有序列表SEQ ID No1中的碱基序列的重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ；

其中：培养液与新鲜的含有Kn的LB液体培养基体积比为1:100。

所述步骤2)中PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，58℃60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，65℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应7-10min。所述步骤2)含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基中含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/mlXgal和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。所述将步骤3)重组蛋白纯化为将离心收集上清裂解液于聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶，用0.1M的KC1染色直至胶块上现出透明条带为止，将透明区域切割置于含有6ml蛋白电泳缓冲液的透析袋中，120伏电压进行蛋白质水平电泳2小时，取出透析袋放入1000ml PBS中于4℃进行透析三次，透析完毕后将透析袋取出吸出溶液，而后超滤管离心，收集上清液即为重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ。所述透析袋放入预冷的PBS中透析时，每5小时后换一次PBS；超滤管离心条件为6000g，4℃下离心10-20min。

抗原免疫应用：将所述具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的交叉保护性疫苗抗原与B187-PBS培养液按照体积份数1:100混合作为哈氏弧菌和副溶血弧菌交叉保护性疫苗抗原；其中B187-PBS培养液为菌株B187于LB培养基中于30℃培养至OD₆₀₀为0.8，离心收集上清菌液，而后将其悬浮于PBS中至终浓度为2×10⁸cfu/ml；所述菌株B187于2008年1月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.2331，分类命名：芽孢杆菌；拉丁名称：Bacillus。

本发明具有如下优点：

1.交叉保护性。本发明的疫苗抗原可同时保护动物抵御至少两种不同弧菌的侵染。

2.高效表达，本发明可使目的疫苗抗原蛋白表达量占大肠杆菌总蛋白的95％以上。

3.高回收率。本发明的抗原蛋白回收方法简单，回收率高达90％。

附图说明

图1为重组vhdQ在大肠杆菌中的表达电泳图。(其中泳道1：分子量标准；泳道2：大肠杆菌总蛋白。)

图2为纯化后的重组VhdQ电泳图。(其中：泳道1：分子量标准；泳道2：纯化后的重组VhdQ。)

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

本发明交叉保护性疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.1中的vhdQ碱基序列(参见图2)。

抗原制备方法：

1)质粒pET258的构建

将质粒pET25(购自于美国Novogen公司)用BglII/NdeI双酶切后回收104bp片段；将质粒pET28(购自于美国Novogen公司)用BglII/NdeI双酶切后回收5.3kb片段；将上述两段DNA片段用T4DNA连接酶连接，连接液用Hanahan方法转化入大肠杆菌DH5α后在含有卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，而后筛选抗卡那霉素的转化子，挑取2个转化子，提取质粒，测序验证为正确重组质粒。将该质粒命名为pET258。

2)质粒pEVQ的构建：

a)以哈氏弧菌T4为模板，用下列引物PCR vhdQ基因：VHQF5(5’-CATATGGCGCTTCCACTCAGTGTGG-3’，划线碱基为NdeI位点)，VHQR5(5’-CTCGAGGCGGATAACGAGGTAAACC-3’，划线碱基为XhoI位点)，PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，65℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2小时，连接混合液用Hanahan方法转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/mlXgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside)的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，即为质粒pBTQ。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；所述哈氏弧菌T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1985；

步骤a)中的白色转化子中质粒采用天根质粒提取试剂盒提取，即为质粒pBTQ，该质粒用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结果表明酶切产物为两条带，一条大小约为1.3kb(vhdQ插入片段)即为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列(参见序列表)，另一条为3kb(pBS-T载体)，说明该质粒为正确重组质粒。

ATGAAAAAACCATTGCTTGCGTTAACCGTTCTATCTTTAAGCTTGGGTTCAATCATCACCCCAGTCACCGCAACAGCGGC

GCTTCCACTCAGTGTGGATGGGGAGCAGTTACCTAGTCTTGCCCCAATGCTCGAAAAAGTAACCCCTGCGGTTGTGAGTA

TTGCGGTCGAAGGCAAACAAGTTCAAACCAGTCGTATTCCAGAGCAGTTTCAGTTCTTCTTTGGTCCTGATTTCCCGACA

GAACAAACTCGTGAGCGTCCGTTCCGAGGTTTAGGTTCTGGTGTCATTATTGACGCTAAGAAAGGTCGAATCGTAACGAA

CTATCACGTCATCAAAGGCGCTGATGACATTCGTGTCCGTCTATATGATGGCAGAGAGTACGATGCAGAACTCGTCGGCG

GAGACGAGATGTCAGACATTGCCTTGCTTAAGCTCGAAAAAGCTAAAGACCTGACACAAATTAAAGTCGCGGATTCAGAC

AAACTACGCGTAGGTGATTTTACCGTAGCCATTGGTAACCCGTTTGGTCTAGGTCAGACAGTGACATCCGGCATCGTTTC

TGCACTGGGTCGAAGCGGCTTAAATGTCGAAAACTTTGAAAACTTCATTCAAACCGATGCAGCAATTAACAGTGGTAACT

CCGGTGGTGCTTTGGTTAATCTCAATGGTGAACTGATCGGCATCAACACCGCCATTCTTGGTCCAAACGGAGGCAACGTC

GGTATTGGCTTTGCAATTCCGTCCAACATGATGAAGAACCTAACTGATCAAATATTGGAGTTTGGTGAAGTAAAACGCGG

CATGCTTGGTGTTCAAGGTGGTGAAGTCACTTCTGAGTTGGCAGAAGCTCTGGGCTATGAATCAAGTAAAGGTGCCTTTG

TTAGTCAAGTGGTTCCGGACAGTGCCGCTGACAAGGCTGGTCTAAAAGCTGGTGATGTCATCGTTTCGATTAATGGCAAA

GCGATTGATACGTTCGCCGAGCTTCGCGCGAAAGTCGCAACCTTAGGGGCTGGTAAAAAAGTCACGCTTGGCGTTGTCCG

AGACGGTAAGAAGAAGAGCTTTGATGTGACCTTGGGAGAATCAACCAATGTCAAAGCGAAGGCTGAGACTCTACATGAAG

GGCTCAAAGGCGCTGAACTTAGCAATACGACACCAAGTGATTCTATCCAAGGTGTGAAGGTAACGAGCGTTGCTGAGAAC

TCGCCAGCAGCACAATATCAGTTGGCAGAAGGCGACATTATCATTGGTGTAAACCGTAAACGCGTGAAGAACTTAGCGGA

GTTACGTGCGATTGTAGAGAAGCATCAAGGTGTACTCGCGATCAACGTTCAACGCGGCGATCGAACGGTTTACCTCGTTA

TCCGCTAA

(a)序列特征：

●长度：1368bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：哈氏弧菌T4

b.将步骤a)的质粒pBTQ用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，回收1.3kb DNA片段；将该片段与步骤1)的质粒pET258连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，而后筛选抗卡那霉素的转化子，挑取2个转化子，提取质粒，将其命名为pEVQ；该质粒用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结果表明酶切产物为两条带，一条大小约为1.3kb，另一条为5.3kb，说明该质粒为正确重组质粒。

3)pEVQ的诱导表达

将上述步骤2)的质粒pEVQ用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，而后筛选抗卡那霉素的转化子，挑取一个转化子，将其命名为BL21/pEVQ。将BL21/pEVQ于含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速160rpm摇动培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，37℃继续以转速160rpm摇动培养5hr。而后将细菌培养液离心(5000g，4℃，10min)，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液离心(10000g，30min，4℃)，回收上清。即得含有序列表SEQ ID No1中的碱基序列的交叉保护性疫苗抗原VhdQ的大肠杆菌总蛋白。取10ul所获得的上清加入等体积的2×蛋白上样缓冲液，并在沸水中加热5-10min。而后将上述处理后的上清加入到0.1％SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶中，用120伏电压进行垂直蛋白电泳1-2小时。取下凝胶，用考马氏亮兰染色(参见图1)。

根据上述蛋白条带的亮度计算VhdQ在大肠杆菌中的表达量占宿主细菌总蛋白的95％以上。

其中：2x蛋白上样缓冲液成分为100mM Tris(pH6.8)，4％(质量百分比)SDS，0.2％(质量百分比)溴酚蓝(bromophenol blue)，20％(体积百分比)甘油，2％(体积百分比)β-疏基乙醇(β-mercaptoethanol)；裂解液成分：10mM NaH₂PO₄，10mM Tris，8M尿素，pH8.0；上述电泳缓冲液成分为：0.3％ Tris，1.88％甘氨酸，0.1％ SDS。

实施例2

将上述所得交叉保护性疫苗抗原VhdQ采用下述方法纯化：将实施例1步骤3)所收集的离心上清裂解液于0.1％SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(120伏，1-2小时)。取下凝胶，用0.1M的KCl染色直至胶块上现出透明条带为止。将VhdQ所在透明区域用手术刀片切割下，置于含有6ml蛋白电泳缓冲液(电泳缓冲液成分为：0.3％ Tris，1.88％甘氨酸，0.1％SDS)的透析袋(MWCO：10000 Dalton，购自上海生物工程公司)中，120伏电压进行蛋白质水平电泳。2小时后将透析袋取出，放入预冷的1000ml PBS中于40C进行透析。每5小时后换一次新鲜PBS，共换三次。透析完毕后将透析袋取出，弃掉里面的胶块，将溶液小心吸出，即为含有重组VhdQ的溶液。将该溶液用AMICON超滤管(购于美国MILLIPORE公司)离心(6000g，4℃)10-20min，收集液体部分，即为纯化后的重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ。用0.1％ SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所回收的重组VhdQ，发现回收效率约达90％，其纯度近于100％(参见图2)。将所得纯化后的重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ中加入等体积的甘油，存放于-20℃保存。与用常规的商业nicke1-nitrilotriacetic acid beads(美国Qiagen公司)进行纯化相比较，上述方法在回收效率和回收纯度上分别提高了约24％和31％。

其中PBS组成成分为：0.8g NaCl，0.02g KCl，0.358g Na₂HPO_4·12H₂O，0.024g NaH₂PO₄。

实施例3 重组VhdQ的免疫应用

步骤1)重组亚单位VhdQ疫苗抗原混合液及重组亚单位VhdQ强化免疫混合液的制备。将菌株B187于LB培养基中于300C培养至OD₆₀₀为0.8，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为2×10⁸cfu/ml，即为B187-PBS。将10ul(浓度为25mg/ml)上述实施例2获得的重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ与1ml B187-PBS混合，即为重组亚单位VhdQ疫苗抗原混合液。将10ul(浓度为25mg/ml)上述实施例2获得的重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ与1ml PBS混合，即为重组亚单位VhdQ强化免疫混合液。所述菌株B187保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2331。

步骤2)重组亚单位VhdQ疫苗抗原的免疫注射。将168条牙鲆(每条重约11g)随机分为4组，每组42条。将这4组分别命名为A，B，C，和D组。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)的重组亚单位VhdQ疫苗抗原混合液。A和C组即为试验组。将B和D组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)的B187-PBS。B和D组即为对照组。22天后将A和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul重组亚单位VhdQ强化免疫混合液；将B和D组的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS。

步骤3)哈氏弧菌和副溶血弧菌菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养哈氏弧菌T4和副溶血弧菌2164(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1.2164)至OD₆₀₀为0.5，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度分别为5 x 10⁸cfu/ml(哈氏弧菌T4)和8 x 10⁸cfu/ml(副溶血弧菌2164)。其中副溶血弧菌2164购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为1.2164。

步骤4)重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ针对哈氏弧菌和副溶血弧菌的免疫保护效应检测。在步骤2)第一次免疫注射后的第34天，用上述步骤3)的哈氏弧菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B两组鱼，用上述步骤3)的副溶血弧菌悬液腹腔注射步骤2)C和D两组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。14天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，13条；B组，37条；C组，15条，D组，40条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：

RPS＝100×(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)

由此得出重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ针对哈氏弧菌和副溶血弧菌的免疫保护效率分别为64.9％和62.5％。其能够保护牙鲆抵御哈氏弧菌和副溶血弧菌侵染。

实施例4

与实施例1不同之处：

抗原制备方法：1)质粒pET258的构建：将连接后的连接液用Hanahan方法转化入大肠杆菌DH5α后在含有卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固体培养基上培养18小时。

2)质粒pEVQ的构建：

a)以哈氏弧菌T4为模板，PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，65℃ 60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接8小时，连接混合液用Hanahan方法转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养24小时。

b.将步骤a)的质粒pBTQ用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，回收1.3kb DNA片段；将该片段与步骤1)的质粒pET258连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18小时。

3)pEVQ的诱导表达

将上述步骤2)的质粒pEVQ用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18小时，而后筛选抗卡那霉素的转化子，挑取一个转化子，将其命名为BL21/pEVQ。将BL21/pEVQ于含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速160rpm摇动培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃继续以转速160rpm摇动培养4hr。

实施例5

与实施例1不同之处：

抗原制备方法：1)质粒pET258的构建：将连接后的连接液用Hanahan方法转化入大肠杆菌DH5后在含有卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固体培养基上培养20小时。

2)质粒pEVQ的构建：

a)以哈氏弧菌T4为模板，PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，65℃ 60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应8min。PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接6小时，连接混合液用Hanahan方法转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养22小时。

b.将步骤a)的质粒pBTQ用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，回收1.3kb DNA片段；将该片段与步骤1)的质粒pET258连接，连接液转化入大肠杆菌DH5后在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养20小时。

实施例6

与实施例1不同之处：

抗原制备方法：1)质粒pET258的构建：将连接后的连接液用Hanahan方法转化入大肠杆菌DH5后在含有卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固体培养基上培养22小时。

2)质粒pEVQ的构建：

a)以哈氏弧菌T4为模板，PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，65℃ 60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应9min。PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接4小时，连接混合液用Hanahan方法转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养20小时。

b.将步骤a)的质粒pBTQ用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，回收1.3kb DNA片段；将该片段与步骤1)的质粒pET258连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养22小时。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1368

<212>DNA

<213>哈氏弧菌T4

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1368)

<223>

<400>1

<210>2

<211>455

<212>PRT

<213>哈氏弧菌T4

<400>2

Claims (7)

1.一种交叉保护性疫苗抗原，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。

2.一种按权利要求1所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：

1)质粒pET258构建：将经BglII/NdeI双酶切的质粒pET25回收的104bp片段与经BglII/NdeI双酶切的质粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌中并在含安卡青霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pET258；

2)质粒pEVQ构建：

a.以哈氏弧菌T4为模板，用引物VHQF5 5’-CATATGGCGCTTCCACTCAGTGTGG-3’，VHQR5 5’-CTCGAGGCGGATAACGAGGTAAACC-3’，进行PCR扩增，产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBTQ；

其中所述哈氏弧菌T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1985；

b.将步骤a)的质粒pBTQ用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后电泳，回收1.3kb DNA片段，将其与步骤1)的质粒pET258连接，转化入大肠杆菌，在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pEVQ；

3)质粒pEVQ的诱导表达：将步骤2)的质粒pEVQ转化入大肠杆菌中，在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子即为BL21/pETQ，将BL21/pETQ于含有Kn的LB培养基中过夜培养；而后再将培养液加入到新鲜的含有Kn的LB液体培养基中，于37℃摇动培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃继续摇动培养4-5小时，裂解菌体，离心收集上清，纯化重组蛋白，即为具有序列表SEQ ID No1中的碱基序列的重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ。

3.按权利要求2所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，65℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应7-10min。

4.按权利要求2所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：所述步骤2)含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基中含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

5.按按权利要求2所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：所述将步骤3)重组蛋白纯化为将离心收集上清裂解液于聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶，用0.1M的KCl染色直至胶块上现出透明条带为止，将透明区域切割置于含有6ml蛋白电泳缓冲液的透析袋中，120伏电压进行蛋白质水平电泳2小时，取出透析袋放入1000ml PBS中于4℃进行透析三次，透析完毕后将透析袋取出吸出溶液，而后超滤管离心，收集上清液即为重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ。

6.按权利要求5所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：所述透析袋放入预冷的PBS中透析时，每5小时后换一次PBS；超滤管离心条件为6000g，4℃下离心10-20min。

7.一种按权利要求1所述交叉保护性疫苗抗原免疫应用，其特征在于：将所述具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的交叉保护性疫苗抗原与B187-PBS培养液按照体积份数1:100混合作为哈氏弧菌和副溶血弧菌交叉保护性疫苗抗原；

其中B187-PBS培养液为菌株B187于LB培养基中于30℃培养至OD₆₀₀为0.8，离心收集上清菌液，而后将其悬浮于PBS中至终浓度为2×10⁸cfu/ml；所述菌株B187保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2331。

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