CN101519404B - 15环噻酮衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类新型15-环噻酮衍生物及其生产制备方法，特别涉及下列通式(I)中的化合物，其制备方法以及其在制备治疗性组合物如作为细胞抑制剂的应用。

Description

15环噻酮衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及了新型15环聚酮化合物及其中间体，该聚酮化合物在结构上为天然的埃坡霉素衍生物，本发明还特别涉及它们的制备方法及它们的药物用途，在制备含它们的药物组合物中的应用。
背景技术
埃坡霉素A(EpoA)和埃坡霉素B(EpoB)为一种大环内酯类聚酮化合物衍生的16元环环氧噻酮化合物，其最初从土壤细菌Sorangiumcellulosum菌株Soce90中分离出来，结构式如下所示。[Hofleetal.，1996，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35(13/14)：1567-1569；Gerthetal.，1996.J.Antibiotics49(6)：560-563]。
EpoA：R＝H；EpoB：R＝CH3
埃坡霉素对治疗癌症有巨大的潜能。虽然在结构上不相似，但埃坡霉素族的作用机理和有名的癌症药物紫杉醇(paclitaxel，Taxol)极为相似，包括诱导微管蛋白聚合，以及稳定微管形成。这些化合物表现出对不同癌细胞系的强大细胞杀伤力。特别是，它们对具有多种癌症药物耐药性(MDR)的肿瘤细胞系，尤其是对耐紫杉醇和其它抗癌药物的肿瘤细胞系，显示出引人注目的效果[Altmannetal.，2000.Biochem.Biophys.Acta.1470(3)：M79-91；Bollagetal.，CancerRes.55(11)：2325-2333]。
埃坡霉素A和B的脱氧配对物，也称为埃坡霉素C和D，已经成功地被化学全合成，但也能从天然的埃坡霉素产生菌株S.cellulosum的发酵提取物中，和许多作为微量组分的其它埃坡霉素类似结构一起检测到。目前，人们正致力于开发作为更加有效的化疗试剂的埃坡霉素和其相关结构的类似物，如通过化学半合成可对天然存在的埃坡霉素化合物进行修饰，如。PCT出版物WO99/27890中描述了埃坡霉素B转化成为相应的内酰胺类似物BMS247550的转化反应。
然而，现已发现由埃坡霉素衍生而成的式I的15-元环噻酮内酯或内酰胺化合物具有有益的药理学特性，并且可用于治疗增生性疾病，因此发明新型埃坡霉素衍生物具有持续不断的兴趣。
发明内容
本发明的目的在于提供一系列15-元大环噻酮内酯或内酰胺衍生物；还提供了生产制备的方法，采用化学合成或化学修饰及生物转化等方法从埃坡霉素D或B及4-脱甲基埃坡霉素D或B等化合物中制得本发明的这类新型化合物及其它新型衍生物；本发明进一步提供了这类新型大环噻酮内酯或内酰胺化合物在制备抗肿瘤，抑制细胞过度增长和中止细胞生长的药物组合物中的应用。
本发明提供的聚酮化合物，一类新型15-元环噻酮内酯或内酰胺化合物具有如下通式(I)
其中，
当A-D为下述式(a)的碳碳双键或为式(b)的环氧基团时，R4不存在，
当A-D为C-C单键时，R4为羟基、H，
G选自烷基，取代烷基，取代或未取代的芳基、杂芳基、杂环基、环烷基或
Q选自H、C1-4烷基，NH2或保护基中的任意一种
R1，R2各自独立地选自H，甲基，烷基或取代烷基，也可合起来形成环烷基，
R3，R4，R5，R6，R7，R11，R12，R13，R14，R16，R17各自独立地选自H，羟基，NH2或CH3，烷基或取代烷基；R5，R6也可合起来形成C＝C双键。R12优选烯丙基；
R8各自独立地选自H，羟基，甲基，烷基或取代烷基或NH2，N3，NR13R14；
X为O，S或N-R15，其中R15为H，甲基，NR16R17，烷基或取代烷基，芳基，取代芳基，环烷基，或杂环基
R9选自H，甲基，取代或非取代烷基，芳基，杂芳基，环烷基，杂环基，或噻唑基，吡啶基，噁唑基，异噁唑基，喹啉基，苯并噁唑基，
Rm选自H，甲基，NR16R17，卤代甲基
Rk选自H，甲基，烷基，取代或未取代的氨基烷基，羟基烷基或卤素烷基
R选自H，甲基，三氟甲基，烷基或取代烷基，卤素
W为S或O，NH，N-烷基。
除非另有说明，否则本公开的上下文中通用术语具有下列含义：
任何不对称碳原子均可以以(R)-，(S)-或(R，S)-构型存在，因此本发明化合物可以大量光学、几何和立体异构体形式存在，所有这些异构体及其混合物都包括在本发明的范围内。
烷基，烷氧基优选低级烷基或烷氧基，“低级”表示不超过且包括4个碳原子的基团，其中所述基团为直链或具有一个或多个分支的支链基团。芳基优选具有至少一个氮原子和0或1个氧原子和0或1个硫原子的单-或双环基团的不饱和的杂芳基，并优选是其中连接环具有5-12个，更优选5或6环原子的基团，并且所述杂芳基可未取代或被一个或多个优选自卤素，烷氧基，烷硫基，羟基，烷基，烷酰基取代。优选单-或双环杂芳基选自：噻唑基，吡啶基，噁唑基，喹啉基，苯并噁唑基，苯并噻唑基。
反应：在根据需要进行的工艺步骤中，原料化合物中不应参与反应的官能团可以未保护的形式存在或可以由一个或多个保护基团保护或完全或部分除去。保护基团的特征是它们本身易于通过溶剂解，还原，光解或通过酶活性除去，并且不存在于最终产物中。保护基团优选本文中提到的低级烷基甲硅烷基型羟基保护基团，且根据需要以类似于本文所述方法引入，并根据需要除去，其中选择性保护或解保护也是可能的。在本文中，有些保护基团在适当使用的地方未提到，熟练技术人员将清楚何时应该或必须使用保护基团。
分子环化可以在常规条件下进行，如X’为羟基，则环化对应于大环内酯化，如X’为NH2获NHR(烷基)，则环化对应于大环内酰胺形成。由酸(或酐)化合物前体(或由被保护的衍生物)与游离羟基，按照M.Yamaguchi等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.1979，52：1989中所描述的条件在合适的溶剂或溶剂混合物中进行大环内酯化反应。内酰胺形成(大环内酰胺化)在将连接羧酸与酰胺键常有的条件下进行，尤其是使用肽化学中常用的标准偶合剂如DCC/HOBt或二苯基磷酰基叠氮化物或溴代三吡咯烷基磷六磷酸盐(PyBroP)进行相应的大环内酰胺的转化。
式(I)中A-D形成为环氧和C-C单键的化合物可以根据本身已知的方法利用化学环氧化由A-D为C-C双键的式(I)化合物制备，如使用过氧化物优选二甲基二环氧乙烷(dioxirane)在合适的溶剂或溶剂混合物中，在降低的温度条件下进行反应。
在本发明的一些实施方案中涉及的优选化合物，当G为
提供下面结构的式(II)的化合物及其盐：
其中，通式II化合物可以利用埃坡霉素或其衍生物通过化学修饰或/和生物转化而制得。如：合成途径1：
首先使用一种来源于微生物的羟基化酶使埃坡霉素或其衍生物的C-14羟基化，如合成途径1。该类C-14羟基化埃坡霉素衍生物L1可通过实施例1中描述的微生物转化方法制得。根据2005年6月22日公开的CN1629283中所公开的，可以容易地获得埃坡霉素C或D，如通过埃坡霉素生物合成基因的P450基因失活导致天然埃坡霉素A和B的产生菌产生主要代谢产物埃坡霉素C或D。根据2004年8月18日公开的CN1521258中所公开的，可以容易地获得4-脱甲基埃坡霉素A及B或C及D，一般情况下，通过埃坡霉素生物合成基因的伸展组件(extendermodule)8中的MT转甲基结构域的失活导致天然埃坡霉素产生菌产生主要代谢产物4-脱甲基埃坡霉素。这两篇专利文献在此引作参考。另一方面，本发明涉及从埃坡霉素衍生物的噁唑(oxazole)对应物(counterpart)，合成其中W是O的结构式(II)中的化合物。根据CN1521258中所述，通过对埃坡霉素产生菌中补充过量的丝氨酸，以有利于噁唑对应物产生的方式调节正常产生噻唑埃坡霉素化合物的产生菌。
通式II化合物进一步优选化合物L4可通过化学反应合成途径2中描述的通用方法由C-14羟基化埃坡霉素衍生物制得。该类化合物L4也可通过实施例2中描述的方法制得。合成途径2：
1.利用14-OH埃坡霉素及衍生物通过使用四(三苯膦)合钯(tetrakis(triphenyphosphine)palladiuminTHF/water中形成烯丙基钯π配对物，接用叠氮化钠处理，形成开环的叠氮化合物，
2.然后用Adam’scatalyst(PtO2)或还原剂如在乙醇中的三苯膦(triphenylphosphine)将叠氮还原成NH2。
3.将式中羧酸与14-OH进行大环内酯化反应，使用Yamaguchi条件，在OC下THF中利用大环内酯化试剂，如1，3，5-三氯苯甲酰氯，和三乙胺处理羟基酸，接着向反应混合物中加入在甲苯溶液中4-(二甲基氨基)吡啶，并升温至75℃，而获得L4化合物或保护的L4中间体。
4.保护基团可以存在于14-OH埃坡霉素化合物的前体中，并且应该保护所涉及的官能团以防止不需要的副反应，如酰化，醚化，氧化，溶剂解和类似的反应。保护基团的特征是它们本身易于通过溶剂解，还原，光解或通过酶活性除去，并且不存在于最终产物中。如首先保护基团可以存在于前体14-OH埃坡霉素的3-，7-，和14-OH游离羟基中，分别为P1，P2和P3，大环内酯化前，14-OH的P3保护基可利用在THF中的AcOH在不导致除去保护基P1，P2的条件下选择性除去，最后式中的羧酸与能14-OH反应大环内酯化，获得保护的L4中间体，利用本领域公知的方法可以进行P1和P2的去保护，当P1和P2是甲硅烷基醚，如TMS、TES或TBS时，可通过使用酸，如二氯甲烷中的HF.吡啶或三氯乙酸处理进行去保护而获得L4。
合成途径2-B：
当通式(II)中R8为NHR15时，R15不为H时，可通过化学反应合成途径2-B中描述的通用方法由C-14羟基化埃坡霉素衍生物制得。
1.首先通过使用如四(三苯膦)合鈀形成烯丙基钯π配对物，接用伯胺处理，可制备R15NH-的L4-4，其中R15为OH，取代或非取代的烷基、环烷基、芳基，杂芳基、0-烷基。
2.按照M.Yamaguchi等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.1979，52：1989中所描述的条件将进行大环内酯化反应。
3.如果R15为OH，需要将R15-O-TMS除去保护基团获得终产品。
通式II化合物进一步优选化合物L7化合物化学反应合成途径3中描述的通用方法由C-14羟基化埃坡霉素化合物制得，如实施例3中所述。合成途径3：
1.首先可通过用合适的基团如三乙基甲硅烷基，丁基二甲基甲硅烷基等等，保护游离羟基3-和7-OH分别为P1和P2，14-OH的P3保护基可利用在THF中的AcOH在不导致除去保护基P1，P2的条件下选择性除去。
2.将3，7-保护形式的埃坡霉素衍生物通过使用四(三苯膦)合鈀形成烯丙基钯π配对物，接用伯胺处理，或用二苯基磷酰基叠氮化物和二氮杂双环十一-7-烯(DBU)反应制得14-叠氮基埃坡霉素。再用三甲基膦和NH4OH水溶液还原，制得3，7-保护形式的14-氨基-埃坡霉素衍生物
3.将3，7-保护形式的14-氨基-埃坡霉素衍生物在其中内酯羧基被选择性还原的条件下与还原剂，例如二(异丁基)氢化铝(DiBAI-H)反应，获得保护的开环中间体
4.在保护的开环中间体通过使用标准的酰胺键偶合剂如二苯基磷酰基叠氮化物(diphenylphosphorylazid)和碳酸氢钠或EDC/HOBT(1-hydroxybenzotriazole)和在DMF中的1-(3二甲基氨丙基)-3-乙基碳化二亚胺{1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide}或溴代三吡咯烷基磷六磷酸盐(PyBroP)进行相应的大环内酰胺的转化，获得保护的L7中间体，去保护得到L7化合物。
通式II化合物进一步优选化合物L9化合物可通过化学反应合成途径4中描述的通用方法由C-14羟基化埃坡霉素化合物制得。合成途径4：
参照合成途径4，使用通过皂化作用制备相应的开环埃坡霉素羟基酸中间体制备本发明的L9化合物，例如通过在甲醇水溶液中用氢氧化钠或用酯酶(如Pigliveresterase)在DMSO中水解处理，将埃坡霉素衍生物转化为开环的段酸(seco-acid)羟基酸。最后根据Yamaguchi等人方法将14-OH与羧酸进行内酯化作用，得到L9。在工艺上，开环埃坡霉素羟基酸中间体可通过使用叔丁基醇，碳化二亚胺(例如二环己基碳化二亚胺)和4-(二甲基氨基)吡啶作为催化剂，将酸转化为叔丁酯，或通过与三甲基甲硅烷基重氮甲烷反应，将羟基酸转化为它的甲基酯。例如通过硅烷化作用，如三甲基甲硅烷基氯/三甲基甲硅烷基咪唑处理保护甲基酯的15-OH。通过用樟脑磺酸(CSA)在甲醇和二氯甲烷中或氢氧化钠处理之后用乙酸处理，除去中间体的叔丁酯或甲基酯的保护基团。14-OH与羧酸大环内酯化反应后，得到游离羟基被保护的L9中间体，接着进行去保护得到L9。
在本发明的一些实施方案中涉及的优选化合物，当G为
提供下面结构的式(III)的化合物及其盐：
通式(III)化合物，也可通过化学反应合成途径5中描述的通用方法由埃坡霉素D或其衍生物如4-脱甲基埃坡霉素D制得，如实施例4中所描述。合成途径5：
其中，X’为OP3，NR15P或SP’，P1，P2为独立的H或相同或不同的保护基，P3为H或保护基，P为H或N-保护基，P’为H或S-保护基.X为O，NH，NR15或S。
1.使用通过皂化作用制备相应的开环埃坡霉素羟基酸中间体，例如通过在甲醇水溶液中用氢氧化钠或用合适的酯酶(如Pigliveresterase等)水解处理，将埃坡霉素衍生物转化为开环的段酸(seco-acid)羟基酸。
2.开环埃坡霉素羟基酸中间体可通过与烷化剂如三甲基甲硅烷基重氮甲烷(TMSCHN2)反应，将羟基酸转化为它的甲基酯，例如通过硅烷化作用与能引入不同或相同的保护基，如叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯(t-butyldimethylsilyltrifluoromethanesulfonate)，三甲基甲硅烷基氯/三甲基甲硅烷基咪唑处理保护甲基酯的3-，7-和15-游离羟基(P1，P2或/和P3)。
3.保护的L11通过臭氧(ozone)氧化切断12位上的双键，获得化合物如式L12所示。
4.L12与化合物L13通过合适的Wittig烯化作用获得L14，
5.甲基酯的保护基团可通过用一定的碱如氢氧化物(LiOH)处理除去，而获得羧酸化开环埃坡霉素衍生物。将选择性去保护的14-X’与1-羧酸进行大环内酯化或内酰胺化作用，得到3-，7-保护或去保护的L15
6.最后将亚乙基的L15进行环氧化反应获得L16。
在本发明的一些实施方案中涉及的优选化合物，当G为
提供下面结构的式(IV)的化合物及其盐.
合成途径6：
通式IV化合物，也可通过化学反应合成途径6中描述的通用方法由L12和L17(优选Rm＝CH3)制得。合成方法相同于化学反应合成途径5中描述的通用方法4，5，6。
在本发明的其他实施方案中，根据合成合成途径7中详细描述的合成利用式(IV)化合物可以制备化合物L22，见实施例5。其中R9优选为
例如A.Rivkin等人在J.Am.Chem.Soc.2003，125：2899中描述了其中P1和P2是羟基保护基的酮L20化合物与合适的维蒂希内鎓盐的反应得到保护的化合物，接着去保护得到式L22的化合物。
通过相应的磷鎓盐与强碱反应可制备维蒂希内鎓盐，所述强碱如双(三甲基甲硅烷基)氨化钾(KHMDS)或钠(NaHMDS)，丁基锂，氢化钠或类似物，或根据本领域公知的其他方法制备维蒂希内鎓盐。通过烷基卤化物与三芳基-或三烷基膦(如三苯基膦或三丁基膦的反应可以制备磷鎓盐，见实施例6。
在本发明的一些实施方案中，膦鎓盐L23(当L13为L23时，L13中R8为OP3)，可通过按合成途径8所示而制备。合成途径8：
通过标准的Wittig烯化作用(Meng，D.，等人J.Org.Chem.，1996，61：7999)
1.通过有机金属试剂如用X’-烯丙基溴化镁处理。
2.通过用在DMF中的三乙基氯硅烷(triethylsilylchloride)将游离羟基用TES保护基保护OP3。在通过Sharpless法与AD-mix-a反应，随后用乙酸乙酯中的四醋酸铅(leadtetraacetate)氧化断裂键，再用还原剂如在甲醇中的硼氢化钠(sodiumborohydride)还原。
3.通过与在甲苯(toluene)中的I，咪唑(imidazole)和三苯膦反应。
4.通过与三苯膦在乙氰中回流反应。
在本发明的一些实施方案中，膦鎓盐L24(当L13为L24时，L13中R8为NR15P)，可通过按合成途径9所示而制备。
1.通过使用脱水条件如催化量的对甲苯磺酸及共沸除去水，可用胺处理制得。
2.通过用烯丙基化试剂如3-X’-烯丙基溴化镁处理
3.以下的合成方法相同于化学反应合成途径8中描述的通用方法3，4，5。
在本发明的一些实施方案中，当L13中R9为噻唑或吡啶或合成途径9中原料物为噻唑或吡啶醛化合物时，可以通过使用已知方法(Taylar，R.E.TetrahedronLett.1997，38：2061)或按合成途径9-B所示而制备噻唑醛或吡啶
醛，再按合成途径8或9所示方法制备R9为噻唑或吡啶的膦鎓盐化合物。
在本发明的一些实施方案中，膦鎓盐L25(当L17为L25时，L17中X’＝NR15P，R8为甲基)，可通过按合成合成途径10所示而制备。合成途径10：
1.通过用烯乙基甘氨酸N-保护，P为适合于N保护的叔丁基羧基(t-butyloxycarbonyl)。
2.当R15不为H时，通过在碱如氢氧化钠的存在下用卤代烷使化合物N-烷基化。
3.使用N.O-二甲基羟胺和标准的偶合剂如EDCI和HOBT处理。
4.用有机金属试剂如烷基或芳基卤化镁或异羟污酸酯处理。
5.以下的合成方法相同于化学反应合成途径8中描述的通用方法3，4，5。
在本发明的一些实施方案中，膦鎓盐L26(当L17为L26时，L17中X’＝OP3，R8为甲基)，可通过按合成合成途径11所示而制备。合成途径11：
1.通过用硝酸处理烯乙基甘氨酸。
2.通过用在DMF中的三乙基氯硅烷(triethylsilylchloride)将游离羟基用TES保护基保护OP3。
3.使用N.O-二甲基羟胺和标准的偶合剂如EDCI和HOBT处理。
4.用有机金属试剂如烷基或芳基卤化镁或异羟污酸酯处理。
5.以下的合成方法相同于化学反应合成途径8中描述的通用方法3，4，5。
本发明的通式(I)中涉及的优选化合物及其盐，也可以通过合成合成途径12和12B所示的化学全合成而制备。合成途径12：
合成途径12B
如其中P1为氧保护基如叔丁基二甲基甲硅烷基的L28的化合物可按已知方法(即，Nicolaou，K.C.等Angew.Chem.Int.Ed.Engl.{应用化学-国际英文版}1997，36：166)由式L27化合物制备。式29化合物可按已知方法(即，Schinzer，D.等Eur.Chem.Chron.1996，1：7)制备。式L28化合物和式29-A化合物的醛醇缩合反应可得式L30-A化合物。当式L31中X’为-OH时，通过使用标准的酯化剂如DCC和DMAP反应，可由式L30化合物和式31化合物偶合；或当L31中X’为NHR15时，通过使用标准的酰胺键偶合剂如DCC，BOP，EDC/HOBT，PyBroP可由式L30-A化合物和式L31-A化合物偶合；再通过使用Grubbs(RuCl2(＝CHPh)(PCY3)2；见Grubbs.等Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34：2039或Schrock催化剂(见Schrock，R.R.等J.Am.Chem.Soc.1990，112-3875)进行键烯闭环复分解反应，制得式L32化合物(合成途径12)。
或可由式L28化合物和式29-B化合物的醛醇缩合反应可得式L30-B化合物(当R11，R12为甲基时，L30-B为L12)。可由式L30-B化合物和式L31-B化合物，通过合适的Wittig烯化作用偶合，再进行大环内酯或酰胺化作用。当式L31中X’为-OH时，通过使用标准的酯化剂如DCC和DMAP反应，进行大环内酯化制得式L32化合物；或当L31中X’为NHR15时，通过使用标准的酰胺键偶合剂如DCC，BOP，EDC/HOBT，PyBroP进行大环酰胺化制得式L32化合物。见合成途径12B。
合成途径13：
L31化合物可以通过合成合成途径13所示的合成反应由醛化合物而制备。通过与烯乙基化试剂如烯乙基溴化镁处理，使其中G为烷基，取代烷基，芳基，杂芳基，二环杂芳基或G优选为下列各式的醛化合物烯乙基化，制得X’为OH的L31-A化合物，当L31-A中X’为NHR15时，使其中G为烷基，取代烷基，芳基，杂芳基，二环杂芳基或G优选为下列各式的醛化合物与胺在脱水条件下反应，在通过与烯乙基化试剂如烯乙基溴化镁处理，使G化合物烯乙基化，制得X’为NHR15的L31-A化合物。由L31-A化合物可按合成方法相同于化学反应合成途径8中描述的通用方法3，4，5合成制得L31-B膦鎓盐。
当G为苯并噻唑时，可根据下列合成途径14制得苯并噻唑醛化合物或通过实施例8中所描述，制得醛化合物L33，再通过合成途径13制得L31化合物。
通式(I)化合物进一步优选化合物为环氧化物(12，13-环氧衍生物)。该类化合物可通过实施例9中描述的本发明反应式15的化学环氧化方法制得。
通式(I)化合物进一步优选12-羟基化衍生物。该类化合物可通过化学反应式16中描述化学改性的通用方法制得式I的C-12羟基化合物。
在其他实施方案中，本发明提供通式(I)中具有下面结构的的化合物。
利用本领域技术人员公知的常规分析方法可以筛选本发明的化合物。如根据Skehan等，J.Natl.CancerInst.1990，82：1107中公开的通过SRB分析可以测定化合物的细胞毒性，该篇文献在此引作参考。
利用本领域技术人员公知的常规分析方法可以对本发明的化合物筛选微管蛋白聚合作用。如根据Gianakakou等，Intl.J.Cancer，1998，75：63中公开的方法对化合物筛选微管蛋白聚合作用，该篇文献在此引作参考。
本发明进一步提供了具有通式(I)的15-环噻酮衍生物在制备抗肿瘤，抑制细胞过度增长和中止细胞生长的药物组合物中的应用。
本发明的化合物可以是自由形式或者药物可接受的载体，如前体药(produrg)和本发明化合物的盐和酯。化合物可以是任何形态的，如固态，半固态或液态。本发明所述的化合物可与药学上可接受的载体或稀释剂配制成用于口服，静脉给药或皮下给药的制剂，可按标准方法，使用适用于所需的给药方式的固体或液体载体，稀释剂和添加剂，配制药物组合物，对于口服制剂，本发明化合物可以片剂、胶囊、颗粒、粉末等形式给药，本发明化合物的剂量范围为约0.05到200mg/kg/天，可单剂量或2到5分剂量形式给药。
本发明的化合物可以采用其它如已知的制备低水溶性药物的制剂方法制得。例如，化合物可以和维生素E和/或PEG聚丙烯酸衍生物形成乳剂(参见文献WO00/71163和US6458373B1)。通常，先将本发明的化合物溶于乙醇，然后加入维生素E和/或PEG聚丙烯酸衍生物形成治疗剂溶液。将乙醇去除，然后形成前体乳剂或者加入含表面活性剂(稳定剂)的水溶液来形成前体乳剂。用于静脉注射的给药方式，可将前体乳剂分散形成均匀的乳剂。用于口服药剂，前体乳剂一般置于凝胶胶囊中。
基于其作用为微管蛋白解聚抑制剂的功效，式I的化合物的作用机理和癌症药物紫杉醇(paclitaxel)和埃坡霉素极为相同，主要是通过诱导微管蛋白聚合以及稳定微管装配(microtubuleassembly)，从而干扰细胞微管的功能。这就导致了对细胞分裂和细胞迁移以及胞内的信号传递和蛋白分泌的抑制，因为这些行为都有赖于微管快速和高效的解聚。因此式I的化合物可有效对抗许多增生性疾病，如实体瘤疾病、液体肿瘤疾病(如白血病)等。
本发明化合物可用于治疗癌症，包括头部和颈部；肝和胆部的癌症；乳腺癌，卵巢癌，泌尿生殖癌，结肠直肠癌，肺癌，脑癌，肾癌，白血病，胃癌，肝癌，神经胶质瘤、恶性肿瘤，以及淋巴瘤。该方法包括给癌症患者使用治疗有效量的本发明化合物。如果必要的话，该方法可以重复，以防止癌扩散或者是根治癌症。尤其是由于它们的抗血管生成活性。式I化合物可用于可能的组合的治疗剂尤其是一种或多种抗增殖、抑制细胞生长或细胞毒性化合物另一方面，本发明的化合物和组合物能与其它抗癌药物或疗法共同使用。另一方面，本发明的化合物可用于治疗以细胞过度增生为特征的非癌类疾病。在本发明的一方面，本发明描述的化合物用于包覆支架，类似于线-网管，用于中止细胞生长，以及防止再狭窄或动脉的再阻塞。临床试验上，本发明的化合物会导致一种或几种如下现象：(i)增加动脉血流；(ii)减轻疾病的临床症状；(iii)降低心瓣手术后的再狭窄速率；或(iv)阻止/减轻慢性动脉硬化症的进程。
实施例
实施例1产生14-羟基化埃坡霉素衍生物的生物转化
用1小瓶(1ml)冻存管的Streptomycesp.ATCC55098菌株接种5ml发酵培养基(发酵培养基配方为：30g/Lwholebrewersyeast；15g/LcomsteepLiquor，1g/LCaCO3，45g/LCornStarch，23.8g/LHEPES，20g/LDextrin(Lo-dex5).用NaOH调pH7.0。灭菌消毒后使用)。培养物在30℃摇床上培养2天。将2.5ml的培养物转移到烧瓶内50ml的发酵培养基中，然后在30℃下培养24小时，加入5-10mg的埃坡霉素D或适当的本发明化合物到培养液中，继续培养2到3天。从培养物中分离出转化产物并回收14-羟基化埃坡霉素衍生物。例如，14-羟基埃坡霉素D作为主要生物转化产物从起始化合物的埃坡霉素D中分离出来。
14-羟基埃坡霉素D(C27H42NO6S)的MS(ESI+)：508[M+H]+
实施例2.15-环噻酮内酯化合物的制备
步骤1：用催化量的四(三苯基磷)合钯(0.58g)在氩气中处理容于55ml脱气化的四氢呋喃(THF)/水(10∶1v/v)溶液中的14-OH埃坡霉素D(2.62g)，并将该悬悬浮液在25C及Ar下搅拌30分钟，将所得的亮黄色均相溶液立即用和叠氮化钠(0.49g)的脱气水(25ml)溶液处理。反应在45℃保持1小时，然后用50ml水稀释，并用乙酸乙酯提取。用饱和NaCl液洗涤提取物，用Na2SO4干燥，过滤后蒸发。用SiO2色谱提纯产物。
步骤2a：环境温度下，在氩气中用三甲基磷1.0M的甲苯(3ml)溶液处理容于15mlTHF/水(10∶1)溶液的上述步骤1产物(565mg，15-叠氮化物)2小时。浓缩混合物，用SiO2色谱提纯产物。
步骤2b.在氩气中用三苯磷(19mg)处理容于15mlTHF/水(10∶1)溶液的上述步骤1产物(565mg，15-叠氮化物)2小时。浓缩混合物，用SiO2色谱提纯产物。
步骤3.大环内酯化作用，室温下，将三乙胺和2，4，6-三氯苯甲酰氯加入到步骤2中产品的THF溶液中。20分钟后，用甲苯稀释混合物并用4小时滴加给温热的在甲苯中的4-(二甲基氨基)吡啶溶液。加入完成后，浓缩混合物，用SiO2色谱提纯产物。15-环噻酮内酯化合物(C27H42N2O5S)的MS(ESI+)：507[M+H]+
实施例3.15-环噻酮内酰胺化合物的制备
1.将1.5ml干躁THF中的3，7-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-14-OHepothiloneD(30mg)的溶液冷却至0℃，并用二苯基磷酰基叠氮化物(15.5微升)处理5分钟后，加入1，8-二氮杂(5.4.0)双环十一-7-烯(DBU)8.8微升，并且在0℃下将反应搅拌2小时，然后温热至室温反应搅拌20小时。将溶液倒入30ml乙酸乙酯，并用2×10ml水洗涤，合并的水相用乙酸乙酯(2×15ml)萃取，然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱提纯3，7-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)保护的14-叠氮基埃坡霉素产品。
2a.将0.3ml的THF中上述步骤的叠氮化物(14mg)和三甲基膦(33微升的1MTHF溶液)的溶液搅拌5分钟，然后用80微升水处理并再搅拌3小时，叠氮化物全部耗尽，加入50微升28％的NH4OH水溶液时磷酰亚胺完全转化为胺。25℃室温搅拌1小时后，将混合物的溶剂用真空蒸发至干，在硅胶上进行色谱分离(10％甲醇的氯仿溶液)，得到3，7-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)保护的14-氨基埃坡霉素产品。
2b.另一种方法：将林德乐催化剂18mg悬浮在0.5ml乙醇中并且使其饱和，随后加入溶于乙醇-甲醇混合物中的上述步骤的叠氮化物，室温下搅拌30分钟，该混悬液经硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤，真空干燥。
3.室温下，用1N的NaOH处理上述步骤2产品的甲醇溶液，通过TLC或HPLC监测，并且通过加入pH4的磷酸盐缓冲液终止反应，真空蒸发除去甲醇，用乙酸乙酯萃取含水残余物，然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。
4a.将上述步骤3产品(540mg)容于15ml乙腈/二甲基甲酰胺(20∶1v/v)溶液冷却到0℃，继而用1-羟基苯并三唑(0.135g)和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(0.5g)处理。将混合物加热到环境温度下并保持12小时，然后用水稀释并用乙酸乙酯提取。继而用水，饱和NaHCO3，以及饱和NaCl液洗涤提取物，然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱提纯产品以获得保护的15-环噻酮内酰胺化合物。将保护的产品溶解于1∶1三氟乙酸和二氯甲烷中去保护获得终产物。
4b.另一种方法：在OC及Ar下，用固体(0.42g)和二苯基磷酰基叠氮化物(diphenylphosphorylazid，0.54ml)处理上述步骤2化合物(0.33g)脱气DMF(250ml)溶液，将所得悬浮液在4C搅拌24小时，在0℃用磷酸盐缓冲液(250ml，pH7.0)稀释，用乙酸乙酯(4×100ml)萃取，将有机相用10％氯化锂水溶液(2×100ml)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱提纯产品。15-环噻酮内酰胺化合物(C27H42N2O5S)的MS(ESI+)：507[M+H]+
实施例4.15-环噻酮化合物的制备
1.开环：将埃坡霉素D(8.4mg)溶解在125微升的DMSO，并用5mlpH7.0的磷酸缓冲液稀释，加入猪肝脂酶(Pigliveresterase)200单位37C水解过夜而获得。混合物用1NHCl调PH＝4.5，在用2×5ml二氯甲烷(dichloromethane)提取，提取物用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱法(含1％乙酸的乙酸乙酯洗脱)提纯产品。MS(ESI+)：510[M+H]+
2.羧酸甲基化：1mg上述步骤1产品溶于0.5ml的2∶7甲醇∶甲苯(methanol:toluene)的混合液中，加入2滴三甲基硅烷基重氮甲烷(trimethylsilyldiazomethane)，25C处理10分钟后，让混合物蒸干，进行SiO2色谱提纯，得到纯的产品。MS(ESI+)：524[M+H]+
3.游离羟基保护：上述步骤2产品20.4mg溶于2ml无水二氯甲烷，加入2，6-二甲基吡啶(2，6-lutidine)(23微升)冷却至-14C，滴加叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸盐(t-Butyldimethysilyltriflate)(32微升)，反应30分钟后，继续加入2，6-二甲基吡啶(2，6-lutidine)(33微升)和叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸盐(t-Butyldimethysilyltriflate)(65微升)，反应12小时后，加人饱和NaHCO3(5ml)，用2×5ml二氯甲烷提取，提取物用然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱提纯产品(三3，7，15-TBS-EpoD)。MS(ESI+)：852[M+H-CH3]+
4.分子断裂：上述步骤3产品6.4mg溶于2ml无水二氯甲烷，冷却至-78C，将臭氧(Ozone)通过溶液约2分钟，溶液变为浅兰色。加入三苯基瞵(Triphenylphosphine)(8mg)，然后在30分钟内温热至室温，让混合物蒸干，进行SiO2色谱提纯，得到纯的产品。MS(ESI+)：573[M+H]+
5.磷鎓盐的制备：小分子化合物L24(其中R9为噻唑，X’＝OP3，R15＝H)，可按实施方案中合成途径9的通用方法制备而得。
6.Wittig：上述步骤5产品18mg溶于0.5ml无水四氢呋喃(tetrahydrofuran)，冷却至0℃，加入二(三甲硅基)氨基钠(Sodiumbis(trimethylsilyl)amide)(31微升)，溶液变为棕色，混合物冷却至-20C，加入溶于0.5ml无水THF上述步骤4产品7.3mg，反应10分钟后，加入饱和NaHCO3(4ml)，用2×2ml二氯甲烷提取，提取物然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱提纯产品。MS(ESI+)：867[M+H-CH3]+
7.去甲基酯：上述步骤6产品2.2mg溶于0.5ml叔丁醇/水(t-butylalcohol/water)(2∶1)，用1MLiOH(40微升)处理，反应在室温下搅拌48小时。用SiO2色谱提纯产品。
8.14-OH去保护(去P3)：将上述步骤7产品溶解于乙晴，水和乙酸的混合物，通过TLC或HPLC监测反应，起始物一旦消失，真空下将混合物蒸发至干。或将上述步骤7化合物用去甲硅烷基试剂或惰性溶剂中的酸或其混合物如TASF或THF中的HF。吡啶水解，得到选择性去甲硅烷基化的。
9.大环内酯化作用：室温下，将87微升三乙胺和68微升2，4，6-三氯苯甲酰氯(Aldrich)加入到步骤9中羟基酸产品0.216克在3毫升THF溶液中。在0C下搅拌1小时，然后在室温下经4小时滴加给温热的在甲苯中的0.354克N，N-(二甲基氨基)-吡啶溶液。加入完成后，再搅拌2小时，蒸发浓缩混合物，用SiO2色谱提纯产物。
10.去保护：将保护的产品(67mg)溶解于1.5ml的THF并在0C下用氟化氢-吡啶(0.6ml)处理。20分钟后，让反应温热至室温，保持3.5小时，然后冷却回0C。缓慢加入甲氧基三甲基硅烷(6ml)，让混合物升至室温并蒸发至油状物，将该油状物进行SiO2色谱提纯，得到纯的产品。15-环噻酮内酯化合物(C27H42N2O5S)的MS(ESI+)：507[M+H]+
11.环氧化：将上述步骤10产品按实施例9进行化学环氧化反应而制得化15-环环氧噻酮化合物(C27H42N2O6S)的MS(ESI+)：523[M+H]+
实施例515-环噻酮内酰胺化合物的制备
-30C下，向3mlTHF中的2-甲基噻唑-4-甲基三正丁基氯化物(0.64g)的溶液经10分钟滴加甲苯(1.5ml)中的0.5M双(三甲基甲硅烷基)氨化钾(KHMDS)溶液。让该溶液经40分钟温热至0C，然后冷却至-70C，并且经10分钟滴加1ml在THF中的式L20酮化合物(85mg)的溶液(A.Rivkin等人在J.Am.Chem.Soc.2003，125：2899.)20分钟后，让混合物经1小时温热至-30℃。保持2小时。通过加入人饱和的氯化铵水溶液终止反应并且用乙酸乙酯萃取，提取物然后用盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱提纯得到保护的产品。
将保护的产品(67mg)溶解于1.5ml的THF并在0℃下用氟化氢-吡啶(0.6ml)处理。20分钟后，让反应温热至室温，保持3.5小时，然后冷却回0℃。缓慢加入甲氧基三甲基硅烷(6ml)，让混合物升至室温并蒸发至油状物，将该油状物进行SiO2色谱提纯，得到纯的产品。15-环噻酮内酰胺化合物(C26H40N2O4S)的MS(ESI+)：477[M+H]+
实施例6(2-甲基4-噻唑)甲基三丁基膦氯化物的制备
30mmol的1.3-二氯丙酮和30mmol的硫代乙酰胺的混合物溶于21ml的无水乙醇，并在氮气下回流过夜。真空下浓缩，残余物溶于100ml水中，调水溶液pH8.0，然后用乙醚萃取。依次用加人饱和NaHCO3(4ml)，用2×2ml二氯甲烷提取，提取物然后用饱和的NaHCO3，水，盐水洗涤，有机相拥Na2SO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱提纯产品2-甲基-4-氯甲基噻唑。
向3ml苯中的557mg的2-甲基-4-氯甲基噻唑(滴加三正丁基膦。得到的溶液在氮气下回流过夜，真空下浓缩溶液，通过加入1∶1(v/v)乙醚和己烷混合物结晶残余物。然后过滤固体，用少量己烷洗涤后干燥，获得的膦盐为白色固体物。
实施例715-环吡啶内酰胺化合物的制备
制备(2-吡啶基)甲基三正丁基膦氯化物。氮气下，向15ml苯中10mmol的2-(氯甲基)-吡啶溶液滴加10mmol三正丁基膦，将得到的溶液回流18小时后冷却至室温。真空下浓缩溶液；采取必要的措施减少与空气接住。通过向残余物加入乙醚生成白色固体。过滤掉母液，氮气下用乙醚将白色固体真空干燥，得到白色粉末产物。
根据实施例5的方法制备化合物，用(2-吡啶基)甲基三正丁基膦氯化物与式L20酮反应。在终止前将反应温热至-10℃。得到纯的产品。15-环吡啶内酰胺化合物(C27H40N2O4)的MS(ESI+)：457[M+H]+
实施例8苯并噻唑膦鎓盐化合物的制备
将10.5克N-溴代琥珀酰亚胺加入8克二甲基苯丙噻唑(Fluka，Buchs)在50毫升四氯化碳溶液中，用钨灯辐照并加热4小时至80℃。将反应混合物冷却至室温后，过滤并蒸发溶剂，获得的油物用100毫升50％乙酸水溶液和23，4克六亚甲基四胺混合，加热2小时至110℃。然后用水终止反应，然后用乙酸乙酯萃取。提取物依次用饱和的NaHCO3，水，盐水反萃取，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。用SiO2色谱提纯产品。
根据合成途径8描述的方法2，3，4，5，用二甲基苯丙噻唑醛与烯乙基溴化镁反应，P3保护，Sharpless还原，I化，最后甲二基苯丙噻唑碘化物与三苯基膦反应可以制备二甲基苯丙噻唑磷鎓盐。
实施例9化学环氧化反应
本实施例描述了当A-Q连在一起形成C＝C双键的式I化合物的环氧化反应。在-78℃，滴加二甲基二环氧乙烷溶液(丙酮中0.1M，17ml)到本发明的脱氧化合物(505mg)的10mlCH2Cl2溶液中。将混合物加热到-50℃，保持1小时，之后加入另一部分二甲基二环氧乙烷溶液(5ml)，反应在-50℃下继续1.5小时。在-50℃的N2蒸汽中干燥反应物。用SiO2色谱提纯产物。
这种通用方法适用于从本发明的其它化合物制造相应的12，13-环氧衍生物。
实施例10
生物活性的测定
采用硫罗丹明B(SRB)试验，筛选本发明的选择性化合物对四种不同的肿瘤细胞品系的抗癌活性。在SRB分析中，使培养的细胞被胰蛋白酶化，然后计数，并用生长培养基稀释到合适的浓度(5000-7500细胞/100μl)。将100μl/孔的细胞悬浮液加入96-孔的微量滴定板中接种细胞。20小时后，将在生长培养基中稀释成2×1000nM至2×0.001nM的100μl测试的化合物加到每个孔中。经过3天的培养后，用100μl10％的三氯乙酸，在4℃下固定细胞1小时，然后用0.2％SRB/1％乙酸在室温下染色20分钟。用1％的乙酸漂洗未结合的染料，用200μl，10mM的Tris碱溶解结合的SRB。结合染料的量通过测定波长515nm的OD值来推算。结合染料的量与总的细胞蛋白量成正比。数据用KaleidaGraph程序分析并计算半数抑制浓度(IC50)。平行测定埃坡霉素D和B以作比较。本发明中测试的选择化合物的细胞毒性试验结果如下所示。本发明的其它化合物也可用相似的方法测定。
用细胞水平的(cell-based)微管蛋白聚合试验测定作用机理。试验中，在37℃下，用1μM本发明的化合物对培养于35mm培养皿中的MCF-7细胞处理1小时。用2mL不含Ca和Mg的PBS洗涤细胞两遍，在室温下用300μL的裂解液(20MmTris，ph6.8，1mMMgCl2，2mMEDTA，1％TritonX-100，加上蛋白酶抑制剂)处理细胞5-10分钟而使细胞裂解。将裂解液转移到1.5-mL的Eppendorf管中。室温下，裂解液在18000g离心12分钟。将含有可溶性或未聚合的微管蛋白的上清液与含不溶性或聚合的微管蛋白的粒状沉淀分离，并转移到新管中。然后用300μL的裂解液重新悬浮粒状沉淀。通过SDS-PAGE和用β-微管蛋白抗体(Sigma)进行免疫印迹分析每个样品，，然后用NIHImage程序分析印迹上β-微管蛋白信号的量，从而测定细胞中微管蛋白聚合的变化。
微管蛋白聚合试验说明15环噻唑衍生物具有与埃坡霉素相同的作用机理，在测试条件下与埃坡霉素有相似的动力学和效用。本发明的其它化合物也可用相同方法测定。

Claims (13)

1.具有如下所示结构的15-环噻酮衍生物及其立体异构体，
其中，A—D为下式(b)所示的环氧基团，R4不存在，
G选自C1-4烷基，或
Q选自H、C1-4烷基或NH2中的任意一种；
R1，R2各自独立地选自H，C1-4烷基；
R3，R5，R6，R7，R11各自独立地选自H，羟基，NH2，C1-4烷基；R5，R6也可合起来形成C＝C双键；
R8选自H，羟基，C1-4烷基或N3，NR13R14，其中R13，R14选自H，C1-4烷基；
R12选自H，羟基，NH2，C1-4烷基，烯丙基；
X为O；
R9选自H，C1-4烷基，或吡啶基，异噁唑基，喹啉基，苯并噁唑基；
Rm选自H，甲基，NR16R17，卤代甲基，其中R16和R17选自H，C1-4烷基；
Rk选自H，C1-4烷基，氨基C1-4烷基，羟基C1-4烷基或卤素C1-4烷基；
R选自H，三氟甲基，C1-4烷基，卤素；
W为S或O，NH，N-C1-4烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R12为烯丙基。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物G选自
4.如权利要求1所述的化合物，其具有如下所示的结构，
其中，X为O，R8如权利要求1所定义。
5.如权利要求1所述的化合物，其具有如下所示的结构，
其中，Q1对应于权利要求1中的Q，Q2为H。
6.如权利要求1所述的化合物，其具有如下所示的结构，
其中，Q1对应于权利要求1中的Q，Q2为H。
7.如权利要求1所述的化合物，其具有如下所示的结构，
其中，X为O，R12为H，C1-4烷基，烯丙基。
8.如权利要求7所示的化合物，其中R12为烯丙基。
9.选自下列各式所示的化合物：
10.药物组合物，包含权利要求1所述的化合物或其存在成盐基团时的其可药用盐以及一种或多种常规药用载体和/或稀释剂。
11.根据权利要求10的组合物，其除了权利要求1所述的化合物外，还含有一种或多种活性药物。
12.权利要求1所述的化合物以及一种或多种活性药物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物组合物中的用途。
13.权利要求1所述的化合物或权利要求10所述的药物组合物在制备抗肿瘤，抑制细胞过度增长和中止细胞生长的治疗增殖疾病的药物中的应用，其中所述增殖疾病包括肿瘤，多发性硬化，类风湿性关节炎，动脉粥样硬化和再狭窄。
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