CN101509011A - 一种含有免疫球蛋白基因的载体、构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于分子生物学领域的一种含有免疫球蛋白基因的载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明也公开了该载体的构建方法，使用该载体能显著延长重组蛋白药物在体内半衰期，从而可以延长药效、减少患者用药次数、降低成本。

Description

一种含有免疫球蛋白基因的载体、构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种载体，具体地涉及一种含有免疫球蛋白基因的载体及其构建方法，并以葡激酶(staphylokinase SAK)的融合表达为例，说明该载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。

背景技术

利用DNA体外重组技术获得目的蛋白是蛋白质结构功能和生物工程医药研究的基础。基因组学和蛋白组学研究的不断深入，极大地拓展了新型蛋白质药物的研究领域。经过几十年的探索，外源基因在原核细胞中的高效表达技术已经比较成熟，已有大量通过该表达的重组蛋白应用于临床。然而目前临床上使用的第一代基因工程蛋白药物，大多数存在半衰期短、需要频繁给药才能达到治疗效果，增加了患者治疗成本，严重降低了患者的生活质量等问题，从某些方面来说限制了重组蛋白药物的临床应用。因此延长重组蛋白在体内的半衰期，降低外源蛋白的免疫原性是重组蛋白药物研究需要迫切解决的问题。

IgG(Immunoglobulin gamma)型的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可长达21天，与基因工程蛋白药物相比，Fc融合蛋白具有半衰期长、亲和力高和免疫源性低等优势。将人IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合形成融合蛋白以延长半衰期已有报道(Capon DJ，Chamow SM，Mordenti J，et al.Nature，1989，337，525～531；Chamow SM，Ashkenazi A，TrendsBiotechnol，1996，14(2)：52～60)，由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出的体外药物代谢动力学特性与同类型的人IgG相当。这种制备融合蛋白的方法已用于一些重要的细胞因子如IL-2和IFNa-2a和可溶性受体如TNF-Rc和L-5-Rc(Landolfi NF.US PatentNo.5349053；SmithCA，Goodwin RG，Beckmann MP.US PatentNo.6224867)，由此制备的一些药物已成功地使用在临床上并用于治疗一些特定疾病。据此，我们希望采用基因工程技术制备一种能融合表达IgG Fc片段的载体，以期提供高效的应用平台，使外源基因能方便地与IgG Fc片段融合，融合IgG Fc片段的重组蛋白不仅具有多肽或蛋白所特有的生物学功能，而且兼备较长血清半衰期等特性(HodgesTL，Antimicro-Agonts-Chemother，1991，35：2580-2586)。

到目前为止，尚未见到利用人IgG1Fc段构建融合表达载体的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有免疫球蛋白基因的载体。

本发明的目的也在于提供该载体的构建方法。

本发明的目的还在于提供一种包含该载体的转化体。

本发明的目的还在于提供该载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。

本发明的一种含有免疫球蛋白基因的载体，包含编码免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该载体被命名为pBV220/Fc。

所述编码免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因来源于人，其核苷酸序列为SEQ IDNo.1中的7-717bp。

本发明的转化体为含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体。

所述pBV220/Fc融合表达载体具备XholI、BamHI、SalI、HincII、PstI、HindIII多克隆酶切位点。

所述载体的构建方法，按如下操作步骤进行：

(1)根据来源于人的IgG1基因序列，设计并合成针对上述基因序列的引物，以来源于人的基因组或基因组文库为模板，通过PCR方法扩增目的产物；

(2)用T₄连接酶将回收后的目的产物，与pEASY-T载体连接，经转化和筛选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定；

(3)测序正确的连接产物和pBV220载体分别经EcoRI和BamHI双酶切后用T₄连接酶连接，经转化和筛选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定，最终获得重组载体，命名为pBV220/Fc。

所述的引物如下：

上游引物：

5′-GGAATTCCATGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC-3′(SEQ ID No.2)

下游引物：

5′-TAAATGAGTGCGACGGGGCGGTGGCGGATCGCTCGAGGCGGGATCCCGCCCG-3′(SEQ ID No.3)

所述下游引物中包括编码5肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头(linker)的基因序列CGATCCGCCACCGCC。

所述模板为人胎肝cDNA文库。

该载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。

利用本发明的载体表达融合蛋白能使目的蛋白的分子量增加约21kD，其中，编码IG1 Fc的基因为1666bp，同时利用IgG1 Fc蛋白形成天然的二聚体结构，增加了整个蛋白的空间结构。体内动物实验结果表明，由IgG Fc连接的融合蛋白可以显著的延长其血浆半衰期。

附图说明

图1为从胎肝库提取的IgG1Fc的PCR产物电泳图；

图2为pEASY-T/Fc克隆的酶切鉴定电泳图；

图3为载体pBV220和pBV220/Fc重组载体的酶切鉴定电泳图；

1：pBV220/EcoRI+BamHI酶切；2：pBV220-Fc/EcoRI+BamHI酶切

图4为pBV220/Fc/SAK表达电泳图；

1.蛋白Marker；

2.pBV220/Fc/SAK/DH5α诱导表达全菌；

3.pBV220/Fc/SAK/DH5α诱导表达破碎上清；

4.pBV220/Fc/SAK/DH5α诱导表达破碎沉淀；

图5为SAK及Fc-SAK蛋白溶栓活性测定；

1A，4A重组蛋白Fc-SAK；1B，4B，1C，4C重组蛋白SAK；2，3活性标准品

图6为SAK及Fc-SAK血药-时间曲线图；

图7为pBV220载体示意图；

图8为pBV220/Fc重组载体结构图；

图9为pBV220/Fc构建流程图；

图10为SAK基因扩增产物电泳图。

具体实施方式

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第二版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

实施1 重组载体pBV220/Fc的构建

1、钓取编码人免疫球蛋白IgG1(Human lmmunoglobulin gamma-1)重链恒定区Fc片段的基因

具体方法如下：

根据已报道来源于人的IgG1基因序列(Genbank登录号为BC006402)，设计合成特异性引物，钓取的Fc片段位于上述已知序列的816-1523bp位置，引物如下：

上游引物：

ATGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC-3’(S EQID No.2)

             EcoR I

下游引物：

G

CGATCCGCCACCGCCCCGTCGCACTCATTTACCC

             BamH I       Xhol         I接头(linker)

G-3′(SEQ ID No.3)

上游引物含有EcoR I酶切位点，下游引物带有编码5肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头(linker)的基因，该基因编码的5个氨基酸具有疏水性和低电荷效应，下游引物还带有Xhol I和BamH I位点。

以人胎肝cDNA文库(购自Takara)为模板，用上述的一对引物进行PCR扩增，引入单克隆酶切位点，获得带有接头(linker)的Fc cDNA，PCR产物长度为796bp。

PCR反应体系如下：

人胎肝库                           1ul

上游引物(10umol/l)                 2ul

下游引物(10umol/l)                 2ul

10×buffer                         5ul

2.5mmol dNTP                       4ul

Pyrobest高保真酶(TaKaRa)           0.5ul

水                                 加至50ul

PCR反应参数均为：

PCR产物使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，如图1所示。

将跑胶后的PCR产物使用凝胶回收试剂盒(购自：北京东盛生物试剂有限公司)进行回收。

2、含IgG Fc重组质粒的构建

回收产物与pEASY-T载体通过T₄连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取白斑在LB液体培养基中培养16小时，提质粒，使用EcoR I内切酶进行酶切鉴定，如图2所示，最后将酶切正确的克隆测序鉴定。

测序正确的质粒用限制性内切酶EcoRI和BamHI(Takara公司)进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段IG 1Fc，747bp，pBV220载体(中国科学院病毒研究所候云德院士厚赠，结构如图7)也用上述两种酶进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收3657bp的载体片段，将回收的目的基因与载体片段按3:1的比例在T₄连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂含有氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆在LB液体培养基中培养16小时，提质粒，使用EcoRI和BamHI内切酶进行酶切鉴定，结果如图3所示，利用T7启动子引物对酶切正确的重组质粒进行测序鉴定，测序公司为上海生物公司，测序正确的为pBV220/Fc重组载体，结构图如图8所示。其中质粒DNA的提取、酶切反应、连接反应、感受态的制备及转化等操作均参照《分子克隆实验指南》第二版，构建载体的整个流程图如图9所示。

pBV220/Fc融合表达载体具备XholI、BamHI、SalI、HincII、PstI、HindIII多克隆酶切位点。

实施例2 以葡激酶(staphylokinase，SA K)的融合表达为例，说明该载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用

天然葡激酶(staphylokinase，Sak)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成。葡激酶本身不具有酶活性，其可与血栓表面的纤溶酶原1:1结合形成复合物，并进一步激活纤溶系统。由于Sak激活纤溶酶具有纤维蛋白专一性，出血倾向较低，Sak的溶栓作用并不影响血浆中纤维蛋白原和纤溶酶原以及α2-抗纤溶酶的水平而且对陈旧性血栓和富含血小板血栓的溶解作用比传统溶栓药物更强，因此Sak是一种很有希望的溶栓剂。

1、SAK克隆入重组表达载体pBV220/Fc的方法

利用上述重组表达载体pBV220/Fc中引入的单克隆酶切位点XholI和BamHI，设计SAK相应的引物上下游分别带有XholI和BamHI酶切位点。根据已报道的SAK基因序列(Genbank登录号为GC515445)，设计合成SAK基因特异性引物，引物如下：

上游引物：

CGTCAAGTTCATTCGACAAAGGAAAATATAGAAAAGGCGATGACGCGA

  XholI

G-3’(SEQ ID No.4)

下游引物：

CTATGAGTGTACCACCATTGGAAGA-3’(SEQ ID No.5)

    BamHI

以pBV220-SAK(构建方法参照邹民吉等，军事医学科学院院刊，1998，22(4)：257-292)为模板，利用上述引物PCR扩增SAK基因，扩增片段的长度为408bp。

PCR反应体系如下：

pBV220/SAK                                  1ul

上游引物(10umol/l)                          2ul

下游引物(10umol/l)                          2ul

10×buffer                                  5ul

2.5mmol dNTP                                4ul

Pyrobest高保真酶(TaKaRa)                    0.5ul

水                                          加至50ul

PCR反应参数均为：

PCR产物使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，如图10所示。

扩增产物经回收后，利用限制性内切酶XholI和BamHI酶切后与经相同酶切的pBV220/Fc载体连接，制备重组质粒，转化感受态细胞DH5α，涂板(氨苄青霉素抗性)，筛选阳性克隆并测序，具体操作步骤同实施例1，最终得到重组载体pBV220/Fc/SAK。

2、pBV220/Fc/SAK和pBV220/SAK在大肠杆菌中的表达与纯化

按CaCl₂转化法将表达载体pBV220/Fc/SAK转化E.coli DH5α。按以下步骤表达和纯化：转化菌落经30℃过夜活化16小时，然后以2％比例接种于LB液体培养基中，30℃培养至对数生长期(OD₆₀₀＝0.4～0.6)，立即转入42℃水浴摇床，200rpm培养4hr，诱导目的蛋白在E.coliDH5α中表达。诱导表达培养物于4℃，12,000rpm离心15min，将沉淀重悬于1:10PB(100mmol/LNa₂HPO₄，，100mmol/L NaH₂PO₄)中，以超声波破碎菌体(0.4kW功率破碎10s间隙10s，总长40min)，离心12000rpm/min离心10min4℃，分别收取沉淀和上清，进行15％SDS-PAGE电泳，获得30kD左右的融合蛋白，分析此蛋白在DH5α中的表达分布情况。蛋白电泳结果如图4所示。结果表明该融合蛋白在DH5α中以包涵体形式表达。超声处理后得到的包涵体经2mol/L尿素洗涤2次，8mol/L尿素变性溶解，所用柱子为凝胶过滤层析柱(购自AmershamBiosciences公司)，以Sephacryl-200(S-200)为填料对溶解上清进行凝胶过滤层析，洗脱剂为8mol/L尿素，采用15％SDS-PAGE分析各洗脱峰对应的样品纯度。纯化的样品在复性缓冲液(100mmol/L Na₂HPO₄，100mmol/L NaH₂PO₄，0.1mmol/L GSSG，1mmol/L GSH，0.1％PEG)中4℃稀释复性72hr，之后以62μg/mL PEG6000缓慢浓缩。经Lowry法测定，得到蛋白样品浓度为4.25mg/mL。

Lowry法原理为，蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu²⁺鳌合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线，并测定样品中蛋白质的浓度。步骤1，用不同浓度的蛋白标准品绘制标准曲线；步骤2，稀释待测样品至合适浓度，加入碱性铜试剂工作液，充分混匀，25℃水浴10min后加入Folin-酚试剂，25℃水浴30min，紫外660nm测定吸光值；步骤3，根据所测样品吸光值与标准曲线作对比，计算出样品实际浓度。

pBV220-SAK(中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所实验室保存)在大肠杆菌中的表达与纯化步骤同pBV220/Fc/SAK，得到重组蛋白浓度为4mg/mL。

3融合蛋白Fc-SAK的活性鉴定

使用琼脂糖-纤维蛋白平板溶圈法(Saksela O，Anal Biochem，1981，111：276-282.)测定重组蛋白溶栓活性。Bradford法测定重组蛋白含量，生理盐水将重组蛋白Fc-SAK稀释至5μg/ml后点样每孔6μl(如图5的1A，4A)，重组蛋白SAK稀释至5μg/ml后点样每孔6μl(如图5的1B，4B，1C，4C)，点样平板在黑色背景下纵横两次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数为横坐标，以溶圈直径的平均数的对数为纵坐标，利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线，根据样品的溶圈直径可以求得样品的活性。使用上述方法测定重组蛋白Fc-SAK的溶栓活性为2.616×10⁴AU/mg；重组蛋白SAK的溶栓活性为2.689×10⁴AU/mg；测定中使用的葡激酶蛋白标准品(购自中国生物制品鉴定)如图5的2和3，其浓度从左到右依次为：500AU/mL，250AU/mL，125AU/mL，62.5AU/mL，31.25AU/mL。

4融合蛋白Fc-SAK的半衰期分析

1)选择雄性大耳白兔20只，分成两组，每组10只，皮下注射给药，分别注射等量的Fc-SAK、SAK(实施例2的纯化产物)，注射剂量为200ug/kg，分别于注射0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、12.0小时后，经耳缘静脉采血400μL，1％肝素钠抗凝，血液于4℃放置10min后，5000rpm，离心10min，收集血浆，-20℃保存，集中检测。

2)按SAK ELISA试剂盒(购自：Uscn life Science & Technology company)说明书检测不同时间点血浆中药物浓度：用Microsoft Excel 2003软件绘制血药-时间曲线(如图6所示)，采用统计矩方法进行初步药代动力学分析；不同蛋白间比较用Student’st-检验进行统计分析。本实验采用统计矩方法进行初步药代动力学分析，表1中显示IgG Fc-SAK的半衰期较SAK生物半衰期得到了显著的延长，与SAK相比延长了1倍。

表1 不同时间点血浆中药物浓度

 

样品时间(h)	SAK(pg/mL)	FC-SAK(pg/mL)
			0.25	50.79±17.18	45.68±15.13
0.5	305.75±21.61	251.77±19.26
			1	375.41±18.76	381.63±12.56
2	349.23±8.09	330.87±15.50
			3	215.56±7.87	245.27±8.22
4	121.41±9.47	175.61±20.31
			5	78.42±14.53	146.59±10.83
6	57.29±14.52	120.14±8.39
			8	40.56±23.39	79.66±8.02
12	25.76±7.20	55.17±19.59

参考文献：

1Capon DJ，Chamow SM，Mordenti J，et al.Designing CD4 immunoadhesinsforAIDS therapy.Nature，1989，337(6207)：525～531.

2Chamow SM，Ashkenazi A.Immunoadhesins：principles and applications.TrendsBiotechnol，1996，14(2)：52～60.

3Landolfi NF.Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses.USPatentNo.5349053.

4Smith CA，Goodwin RG，Beckmann MP.Tumor necrosis factor2 alpha and betareceptors.US PatentNo.6224867.

5Hodges TL.Phase I study of recombinant human CD4-immunoglobulin Gtherapy of patient with AIDS and AIDS-related complex.Antimicro-Agonts-Chemother，1991，35：2580-2586.

6J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1996.

7邹民吉，王嘉玺等，葡激酶基因的分离及其在大肠杆菌中的高效表达，军事医学科学院院刊，1998，22(4)：257-292.

8Saksela O，Radial caseinolysis in agarose：a simple method for detection ofplasminogen activator in the presence of inhibitory substances and serum[J].AnalBiochem，1981，111：276-282.

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120>一种含有免疫球蛋白基因的载体、构建方法及其应用

<130>34

<160>5

<170>PatentIn version3.5

<210>1

<211>4404

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>包括来源于人编码IG 1Fc片段的基因的重组质粒

<400>1

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>用于扩增IG1Fc基因的上游引物

<400>2

<210>3

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>用于扩增IG1Fc基因的下游引物

<400>3

<210>4

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial Seq uence

<220>

<223>用于扩增SAK基因的上游引物

<400>4

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>用于扩增SAK基因的下游引物

<400>5

Claims (7)

1、一种含有免疫球蛋白基因的载体，包含编码免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2、根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述编码免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因来源于人。

3、一种转化体，其特征在于，所述转化体含有核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的载体。

4、一种含有免疫球蛋白基因的载体的构建方法，其特征在于，由如下操作步骤构成：

(1)根据来源于人的IgG1基因序列，设计并合成针对上述基因序列的引物，以来源于人的基因组或基因组文库为模板，通过PCR方法扩增目的产物；

(2)用T₄连接酶将回收后的扩增产物，与pEASY-T载体连接，经转化和筛选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定；

(3)测序正确的连接产物和pBV220载体分别经EcoRI和BamHI双酶切后用T₄连接酶连接，经转化和筛选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定，最终获得重组载体。

5、根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的引物为：上游引物如SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No.3所示。

6、根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述模板为人胎肝cDNA文库。

7、权利要求1所述的载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。

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