CN101507725A - 千金藤碱及其盐酸盐在制备抗乙肝病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及千金藤碱及其盐酸盐在医药领域的用途。即以千金藤碱或盐酸千金藤碱为有效成分制备成抗乙肝病毒药物。本发明研究表明,CH对细胞的半数毒性浓度(TC50)为2.09μg·ml-1;CH能抑制细胞内的HBV DNA合成(P<0.01),并呈剂量依赖性,剂量大于0.5μg·mL-1时能对细胞上清液中HBV DNA的抑制率超过50%,CH的IC50为0.324μg·mL-1,治疗指数TI=6.45,2.0<TI<10.0,CH有较强的抑制HBV DNA合成作用,为有效低毒类药物。本发明开拓了千金藤碱及其盐酸盐新的医药用途,其制备原料来源丰富、廉价、毒副作用小,制备工艺简单,并可做成口服剂型、注射剂型、片剂等,使用方便。
Description
技术领域
本发明涉及千金藤碱及其盐酸盐的用途,尤其涉及千金藤碱及其盐酸盐在医药领域的用途。
背景技术
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高,据统计全世界无症状携带者(HBsAg携带者)超过2.8亿,我国占1亿以上。对慢性HBV感染,病毒复制指标持续阳性者,抗病毒治疗是一项重要措施。目前抗病毒药物,效果都不十分满意。应用后可暂时抑制HBV复制,停药后这种抑制作用消失,使原被抑制的指标又回复到原水平。有些药物作用较慢,需较长时间才能看到效果。
千金藤碱(Cepharanthine)是从防己科千金藤属植物的块根中提取分离出的一种生物碱,其加盐酸成盐可得一种双苄基异喹啉类单体化合物,即盐酸千金藤碱(Cepharanthine Hydrochlori,CH),其分子式为C37H38N2O6·2HCl,结构式如下:
已知千金藤碱/盐酸千金藤碱除了有升高由于化疗导致的白细胞减少外,还具有抗肿瘤作用,逆转化疗引起的多药耐药,而且在抗炎镇痛,抑制脂质过氧化反应等方面也具有很好的治疗效果;据报道千金藤碱还可抑制SARS-CoV病毒引起的细胞病变作用,抑制HIV-I复制,抑制HSV-1对Vero细胞的致病变作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供千金藤碱及其盐酸盐的一种新用途,即在制备药物中的应用。
实际上,本发明是以千金藤碱或盐酸千金藤碱为有效成分制备成抗乙肝病毒药物,可采用常规的制备工艺,制备成不同的药物剂型供患者使用,如制成口服剂型、胶囊、粉剂、针剂等剂型。千金藤碱或盐酸千金藤碱对细胞有一定的毒性,根据细胞存活率,计算药物CH对细胞的半数毒性浓度(TC50)为2.09μg·mL-1;荧光定量PCR结果发现,CH能抑制细胞内的HBV DNA合成(P<0.01),并呈剂量依赖性,剂量大于0.5μg·mL-1时能对细胞上清液中HBV DNA的抑制率超过50%。计算CH的半数抑制率IC50为0.324μg·mL-1,治疗指数TI=TC50/IC50=6.45,2.0<TI<10.0。因此可以认为CH有较强的抑制HBV DNA合成作用,为有效低毒类药物。
1.千金藤碱和盐酸千金藤碱制备方法:
将地不容块根粉用稀酸浸泡提取,提得的酸水液用碱溶液调节呈碱性,滤集析出的粗生物碱,再经苯加成精制后过氧化铝柱,减压蒸干溶剂得千金藤碱,千金藤碱溶解后与浓盐酸反应即得盐酸千金藤碱粗品,将析出的盐酸千金藤碱粗品重结晶精制,真空干燥即得盐酸千金藤碱金藤碱原料药(参见:1.黄加鑫,陈嬿.地不容中生物碱的分离与鉴定,药学学报,1979,14(10):612~616;2.陈正庆,杨素聆,丁绪亮.地不容的非酚性生物碱,南京医学院学报,1985,5(3):203~208;3.The Merck Index(13版),No.1997.)。
2.盐酸千金藤碱注射剂制备方法:
取按重量份计注射用原料药1份,用200份的50℃的水混匀使溶解,过滤,灌封,灭菌,检漏,即得盐酸千金藤碱注射剂(规格:10mg/2mL)。
3.盐酸千金藤碱冻干粉针剂的制备
取按重量份计盐酸干金藤碱1~10份,用1000~4000份的50~60℃的水混匀使盐酸千金藤碱溶解,再加入冻干赋形剂(如甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或乳糖等)10~400份混合均匀后,过滤除菌,测盐酸千金藤碱含量后冻干,即制得盐酸千金藤碱冻干粉针剂。
为了更好地理解本发明的实质,下面以盐酸千金藤碱的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
1.主要试验材料
①HepG2.2.15细胞株:由广州暨南大学生物医药研究开发基地提供,本研究室自行传代培养供实验使用。实验药物盐酸千金藤碱由河南省医药科学研究院药化室制备(制备方法如上所述)。
②主要试剂:拉米夫定(3TC,贺普丁片),葛兰素-史克制药(苏州)有限公司产品;DMEM培养基,Hyclone海克隆生物化学制品有限公司;FBS,Hyclone海克隆生物化学制品有限公司;胰蛋白酶,美国Amersco公司;MTT,美国Sigma公司;G418,美国invitrogen公司;HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒,深圳匹基生物工程股份有限公司;乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒,上海科华生物技术有限公司;乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒,上海科华生物技术有限公司。
③主要仪器及器皿:生物安全柜Hfsafe-1200TE Class II Type B2,香港力康发展有限公司;水套式二氧化碳培养箱HF160W,香港力康发展有限公司;酶标仪168-1000XC,美国BI0 RAD;荧光PCR检测仪,美国Roche LightCycler1.5;全自动灭菌器HVE-50,日本HIRAYAMA;96孔培养板,24孔培养板,50mL细胞培养瓶,美国corning公司。
2.盐酸千金藤碱(CH)对细胞的毒性试验
根据Mosmann建立的MTT比色法检测药物对HepG2.2.15细胞的毒性。细胞长满培养瓶后,加入0.25%胰蛋白酶,消化后加入培养液吹打成单细胞,加入细胞计数板计数,浓度为1×105个/mL后接种于96孔细胞培养板每孔100ul,每个浓度设三个复孔,置CO2培养箱(37℃,5.0% CO2)中培养24小时。细胞长成单层后加入含有不同浓度药物的培养基,并设不含药物的正常细胞为对照组。连续培养72小时,每孔加入MTT 10ul,于CO2培养箱(37℃,5.0% CO2)中继续培养。4小时后,弃去上清液,每孔加入DMSO 200ul,用微量振荡器充分震荡,使结晶紫充分溶解。用酶标仪(检测波长490nm,参考波长630nm)读取各孔OD值,记录结果。计算CH对HepG2.2.15细胞的抑制百分率:
由表可以看出盐酸千金藤碱给药组对细胞有一定的毒性。根据细胞存活率,计算药物CH对细胞的半数毒性浓度(TC50)为2.09μg·mL-1。
表1 CH对HepG2.2.15细胞的毒性作用(x±s,n=3)
注:A:CH 5.0μg·mL-1;B:CH 2.5μg·mL-1;C:CH 1.25μg·mL-1;D:CH 0.63μg·mL-1;
3.药物对HBV抑制实验
选择小于CH TC50的一系列浓度1μg·mL-1,0.5μg·mL-1,0.25μg·mL-1,0.125μg·mL-1作为试验浓度,检测其对细胞培养液中HBV DNA以及表面抗原和e抗原的影响。选用对数生长期的HepG2.2.15细胞,胰酶消化成单细胞悬液,按照2×104个·mL-1的浓度接种于24孔板,每孔1mL,每个浓度3个孔。1d后待细胞贴于孔底,吸去旧的培养基,加入含有不同药物浓度的培养基,并设加完全培养基的细胞为正常对照,之后根据细胞生长情况可适当更换培养基。收集第三天、第六天、第九天的细胞上清液,于-20℃保存。用ELISA方法测定第三天、第六天、第九天的e抗原和表面抗原,用荧光定量PCR方法测定第九天的HBV DNA拷贝值。
①CH对HepG2.2.15细胞上清液中HBeAg和HBsAg的影响
a)实验准备:从冷藏环境中取出试剂盒,在室温下平衡30分钟,同时将浓缩洗涤液稀释20倍。
b)加待测标本:加入待测标本每孔0.05mL,并设HBeAg和HbsAg阳性对照及阴性对照各2孔,空白对照1孔。
c)加酶结合物:每孔0.05mL,空白对照孔不加,充分混匀,置恒温箱中37℃孵育30min。
d)洗板:弃去反应板各孔内液体,拍干;用洗涤液注满每孔,静置5-10s,弃去孔内洗涤液,拍干,如此反复五次,拍干。
e)加显色剂:先加显色剂A,每孔0.05mL,再加显色剂B,每孔0.05mL;充分混匀,放置37℃避光孵育15min。
f)终止反应:每孔加入终止液0.05mL,混匀。
g)测定:用酶标仪读数,选择双波长450/630nm,读取各孔OD值。
h)结果判定:首先按照COV=阴性对照平均OD值×2.1计算Cutoff值,如果标本OD值≥COV为阳性,标本OD值≤COV为阴性。
通过ELISA试剂盒测定CH对HepG2.2.15细胞分泌表面抗原和e抗原的影响,发现CH四个剂量组都对表面抗原和e抗原都有一定的抑制作用,并且有浓度和时间依赖性(见表2、表3)。CH作用的第九天,1μg·mL-1剂量组对表面抗原的抑制将近一半,对e抗原的抑制作用也达到了40%。
表2 CH在不同的时间点对HBsAg的影响
表3 CH在不同的时间点对HBeAg的影响
②用荧光定量PCR法测CH对HepG2.2.15细胞中HBV DNA拷贝数的影响
HBV-DNA检测有助于判断HBV感染者病毒复制程度及传染性大小,较灵敏评价抗病毒药物的疗效。
a)样本处理:取100ul各药物处理组的细胞上清液,分别加入0.5mL离心管中;向各管中加入100ulDNA提取液I,振荡混匀,13000rpm离心10min;吸弃液体;再加入25ul DNA提取液II,振荡混匀至沉淀完全溶解,2000rpm离心10sec,沸水浴10min;13000rpm离心10min,保留上清液备用。
b)扩增试剂准备:从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶,室温融化并混合均匀后,2000rpm离心10sec。设所需要的Roche毛细管管数为n(n=样本数+2管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性工作标准品)可每个测试反应体系配置如下表4:
表4 反应体系配置
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积离心管中,充分混匀均匀,2000rpm离心10sec,向设定的Roche毛细管中分别加入18ul。
c)加样:样本和阳性工作标准品使用前室温解冻,震荡混匀。在所设定的n个Roche毛细管中分别加入5.1步骤中处理过的样本,阴性对照,强阳性对照和临界阳性对照上清液以及阳性工作标准液(5.0×104copies/mL,5.0×105copies/mL,5.0×106copies/mL,5.0×107copies/mL)2ul,盖紧管盖,连同Roche专用金属反应管套放在离心机中,于2000rpm离心10sec。将毛细管排好放入荧光PCR检测仪内。
d)PCR扩增:循环条件设置见表5,选择仪器F1通道进行检测。
表5 PCR扩增循环条件
e)结果判断
按照试剂盒说明书设定结果分析条件。若样本拷贝值在5.0×102copies/mL~5.0×107copies/mL,测定结果有效,可直接使用相应的拷贝数,若样本拷贝数超过这个范围,需要稀释,测定结果以稀释倍数进行校正。
f)计算IC50:按照下式计算化合物对HBV DNA的半数抑制率IC50:
g)计算治疗指数(TI):计算TI=TC50/IC50。TI<1.0表明受试样品无效,1.0≤TI≤2.0为低效有毒即弱阳性,2.0<TI<10.0为有效低毒即阳性,TI≥10.0为高效低毒即强阳性。
荧光定量PCR结果发现(参见表6和图1),CH能抑制细胞内的HBV DNA合成(P<0.01),并呈剂量依赖性。剂量大于0.5μg·mL-1时能对细胞上清液中HBVDNA的抑制率超过50%。计算CH的IC50为0.324μg·mL-1,所以治疗指数TI=TC50/IC50=6.45,2.0<TI<10.0。认为CH在体外细胞培养体系中有较强的抑制HBV DNA合成作用,为有效低毒类药物。
表6 CH给药后第九天对Hep G2.2.15细胞上清液中HBV DNA拷贝数的影响(x±s×105,n=3)
与正常对照组细胞HBV DNA拷贝数比较,*P<0.01
从以上结果可以得出本发明的优点在于:
1.本发明对已知盐酸千金藤碱/千金藤碱(素)挖掘了新的医药用途,开拓了一个新的应用领域。
2.本发明的盐酸千金藤碱/千金藤碱(素)安全低毒,稳定性好,药理作用强,预示着很好的药用前景。
3.本发明的产品原料来源丰富、廉价、毒副作用小,制备工艺简单,并可做成口服剂型、注射剂型、片剂等,使用方便。
4.本发明采用国内外通用的HepG2.2.15细胞株在体外来检测盐酸千金藤碱/千金藤碱(素)抗乙肝病毒作用,通过一系列实验数据表明,盐酸千金藤碱具有明显的抗乙肝病毒效果。
附图说明
图1CH给药后第九天对HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA拷贝数的影响(3TC:10μg·mL-1,CHl:2μg·mL-1,CH2:1μg·mL-1,CH3:0.5μg·mL-1,CH4:0.25μg·mL-1)
具体实施方式
实施例1 盐酸千金藤碱注射剂制备方法:
量取注射用水1500mL,加热至约50℃,加入10.0g的注射用原料药,溶解。加入0.1%的针用活性炭,搅匀,保温15分钟,过滤。用适量注射用水洗涤后,加至2000mL,G4垂熔玻璃漏斗精滤,灌封,灭菌,检漏,即得盐酸千金藤碱注射剂。(规格:10mg/2mL)。
实施例2 千金藤碱供试液制备方法:
将千金藤碱用适量0.1mol/L盐酸溶解,用蒸馏水配制成5mg/mL,用1.0mol/L NaOH调节PH至3.5~4.0并稀释至所需浓度。
实施例3 盐酸千金藤碱冻干粉针剂制备:
取注射用盐酸千金藤碱(素)原料1.1克(纯度99%),加入注射用水(50℃)1000mL,搅拌溶解,再加甘露醇10克,搅拌使溶解,0.22gm的微孔滤膜过滤除菌,测盐酸千金藤碱(素)含量达到标示量的99%以上即分装,2mL/瓶。进行冷冻干燥,冻干条件为冻干温度-20~-35℃,真空度50~200Pa,时间24小时。然后出箱,封口,检漏,贴标签。
实施例4 盐酸千金藤碱片剂制备:
盐酸千金藤碱500mg,乳糖3.0g,淀粉1.28g,羟基丙酰纤维素200mg和硬脂酸镁20mg,混合,制粒,压片(规格:每片100mg)。
实施例5 盐酸千金藤碱胶囊制备:
盐酸千金藤碱500mg,乳糖2.5mg,淀粉1.75mg,结晶纤维素240mg和硬脂酸钙10mg,混合,充填于囊形成胶囊(规格:每粒10mg)。
Claims (3)
1.千金藤碱及其盐酸盐在制备抗乙肝病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的盐酸千金藤碱在制备抗乙肝病毒药物中的应用,其特征在于,制备药物的剂型是口服液、胶囊、散剂、片剂、针剂中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的盐酸千金藤碱在制备抗乙肝病毒药物中的应用,其特征在于,盐酸千金藤碱用于制备抗乙肝病毒的冻干粉针剂。
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C10 | Entry into substantive examination | ||
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090819 |