CN101502526A - 桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物在预防或治疗高尿酸血症和痛风中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的组分和新用途。动物试验结果表明：桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物对高尿酸血症模型动物血中尿酸有显著的降低作用，而对正常动物正常水平血中尿酸无显著抑制作用，具有很好的安全性。利用桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物配以相关辅料，用常规的制剂方法可制成预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品，以及以该化合物为活性成分的用于预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品组合物，疗效稳定，安全可靠。

Description

桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物在预防或治疗高尿酸血症和痛风中的应用

技术领域

本发明涉及桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物，具体涉及桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物组分和在制备预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品中的新用途，以及以该化合物为活性成分的用于预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品组合物。

背景技术

痛风是由于嘌呤类物质代谢紊乱，产生尿酸过多或尿酸排泄减少，血尿酸浓度持续增高导致尿酸盐结晶沉积软组织所致的一组代谢性疾病。其临床表现为反复发作的关节炎，痛风石形成和关节畸形，严重者可导致关节活动障碍，累及肾脏时可引起慢性间质性肾炎和尿酸性肾石病。尿酸水平升高是痛风的生化基础，无症状性高尿酸血症是痛风发生的前期状态，痛风必伴有高尿酸血症。近年来，痛风和高尿酸血症的发病率呈上升趋势，发病年龄呈现低龄化，给社会带来巨大的负担，并且与高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志。痛风症状以反复下肢关节红肿热痛为主，在中医辨证上多属湿热痹范畴。其病机或因先天禀赋不足，或因后天饮食不节，脏腑功能失调，分清别浊失常，于是湿、热、瘀、浊诸症随之产生。

西医对痛风和高尿酸血症的治疗主要有阻止内源性嘌呤合成的药物(如别嘌呤醇)及促尿酸排泄(丙磺舒、苯溴马龙)的药物。单用别嘌呤醇和丙磺舒均可使血尿酸降低，但毒副作用大，患者往往不能坚持长期服用以致不易控制病情。

中药治疗痛风、高尿酸血症倍受关注，有分阶段论治，也有专方治疗，近年来，由于中医药治疗痛风疗效确切，方法多而毒副反应少，显示出较大的优势，而越来越受到人们的关注。

桑枝(Ramulus mori)是桑科植物桑(Morus alba L.)的一年生干燥嫩枝，作为民间常用中草药，中国药典记载桑枝具有祛风湿、利关节、行水之功效，适用于风寒湿痹、四肢拘挛、脚气浮肿之病症。其所含化学成分种类较多，主要有多糖、黄酮类化合物、香豆素类化合物、生物碱，此外还含有挥发油、氨基酸、有机酸及各种维生素等。另有报道桑枝中含有二苯乙烯类化合物桑皮苷。虽然桑枝有较好的临床基础，但一直没有找到适当的成分进行质量监控。

发明内容

本发明目的是公开桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的组分和其在制备预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或保健食品中的应用，以及以该化合物为活性成分的用于预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品组合物。

本发明的技术解决方案之一公开了桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的组分，桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物组分为黄酮类化合物重量比含量为30％-70％；二苯乙烯类化合物重量比含量为30％-70％。

本发明的技术解决方案之二：提供桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物在制备预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或保健食品中的用途，以及以该化合物为活性成分的用于预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品组合物。包括了以本发明所述的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物，配以常用的药用辅料(如：赋形剂、助溶剂、控释剂)，制成各种剂型包括口服液、注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、微囊剂，用于制备预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或保健食品。

桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的制备是：桑枝通过水醇法，大孔吸附树脂柱洗脱得到的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物，以Quercetin-3-O-β-D-mannopyranoside为对照品经紫外分光光度法和HPLC法分别测得黄酮类化合物含量为30％-70％；以桑皮苷为对照品经紫外分光光度法和HPLC法分别测得二苯乙烯类化合物含量为30％-70％。

本发明所得桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的组分可作为临床制剂原料的质量标准，亦可作为制剂的质量标准。

本发明用于预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品组合物，含有预防或治疗高尿酸血症和痛风有效量的桑皮苷化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体；用该化合物作为药效成分来制备预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品制剂，可单独或与制药可接受的赋形剂等结合，按照常规方法制成口服液、胶囊剂、片剂、颗粒剂等剂型，优选的是靶向剂型。

本发明的化合物的药物组合物可用于制备预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇等。另外还可以组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、颗粒剂、胶囊剂等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊剂、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂，特别优选在肠道的特定部位释放的制剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明化合物的使用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化，确定其日剂量，可以一次或多次施用。

本发明的优点是，提供了降尿酸作用的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物，用于制备预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或保健食品，以及以该化合物为活性成分的用于预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品组合物。与针对痛风和高尿酸血症的发明比较，本发明提供的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物药效成分明确(黄酮类化合物含量为30％-70％和二苯乙烯类化合物含量为30％-70％)，降尿酸作用显著，可以作为质量标准，方便可靠，为其临床应用提供过了科学依据。

为更好的理解木发明的实质，下面用桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的提取分离、药理实验及结果来说明其在制备预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或保健食品中的应用。

附图说明：

图1为ER对小鼠高尿酸血症血清尿酸水平的影响结果图；

图2为ER对小鼠肝脏尿酸水平的影响结果图；

图3为ER对小鼠高尿酸血症肝脏XOD的影响结果图；

图4为肝脏XOD蛋白水平结果图；

图5为肾脏URAT1蛋白水平结果图；

图6为肝脏XOD mRNA水平结果图；

图7为肾脏URAT1 mRNA水平结果图。

具体实施方式：

实施例1：

桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的制备：

(1)取干燥桑枝，热回流三次，每次加7倍60％乙醇，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液经减压浓缩至每ml药液含有0.5g药材，放冷，过滤，弃去药渣。

(2)取滤液，按流速为1—4BV/h上已预处理好的HPD-600型大孔吸附树脂柱，以2—6倍量柱床体积的蒸馏水洗脱，流速为1--4BV/h，弃去水洗脱液，再以2—6倍量柱床体积的60％乙醇按1—4BV/h的速度洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，减压干燥，得干浸膏。

(3)以桑皮苷为对照品，按照药典法测定桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物中二苯乙烯类化合物含量30％-70％。

(4)以Quercetin-3-O-β-D-mannopyranoside为对照品，按照药典法测定桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物中黄酮类化合物含量为30％-70％。

实施例2

桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物对高尿酸血症和正常小鼠的影响：

氧嗪酸钾盐是一种尿酸酶抑制剂，可诱导抑制尿酸分解，增加体内血清尿酸水平，造成高尿酸血症动物模型，国际上普遍用其评价药物的抗高尿酸血症和痛风作用。本发明亦采用高尿酸血症模型动物验证药物的降尿酸疗效，疗效可靠，效果显著。

1.实验动物：昆明种小鼠，体重24±2g，雄性。

2.药物配制：桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物(ER)(黄酮类化合物含量为30％-70％和二苯乙烯类化合物含量为30％-70％)、别嘌呤醇分散于生理盐水中，用于灌胃给药，给药剂量分别为低剂量300mg/kg、高剂量为600mg/kg，Apu＝5mg/kg。

3.实验材料：HPD—600型大孔吸附树脂，Trizol Reagment(Invigen)，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC，M-MLV反转录酶，PCR试剂盒，RIPA裂解液，尿酸试剂盒，肌酐试剂盒。

4.实验仪器：高速冷冻离心机，高速匀浆机，Bio-radio-rad垂直电泳槽，MBI-PCR仪、水平电泳槽等.

5.实验模型：高尿酸血症模型。

6.模型的建立：动物适应环境1周后，灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg；对照给予等体积生理盐水，造模周期7天。

7.给药：造模期间同时给药，在给予氧嗪酸钾盐造模/生理盐水对照1h后，分组灌胃给予桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物(ER)两个剂量300mg/kg、600mg/kg，别嘌呤醇(Apu)5mg/kg，对照组给予生理盐水。

8.小鼠处死及组织的保存：小鼠灌胃给予桑皮苷/生理盐水后1h处死，取血、尿液，冰台上分离肝脏、肾脏组织，组织经液氮冷冻后保存于-80℃，待测。

9.蛋白质印迹法(Western-blotting)：提取小鼠肝脏、肾脏组织刷状缘膜蛋白，提取蛋白经12％的SDS-PAGE胶电泳分离后，PVDF转膜，封闭液封闭1小时后加入mURAT1抗体(根据NCBI数据库mURAT1蛋白序列制备，使用浓度为1∶4000)4℃孵育过夜，二抗(1∶4000)室温摇床孵育1小时，HRP-ECL发光，暗室曝光显影。胶片扫描后对图片灰度分析。

11.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：鼠组织(肝脏或肾脏)0.1g加入1ml的Trizol Reagent(Invitrogen)，按照试剂盒的要求提取RNA，RNA逆转录到cDNA模板，根据NCBI数据库mURAT1基因设计引物，进行mURAT1目的基因扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后UV成像，对图片进行灰度分析。

12.实验结果：

(1)ER对小鼠高尿酸血症血清尿酸水平的影响，结果见图1。

⁺⁺⁺P<0.001，⁺⁺P<0.01，⁺P<0.05与空白组比较；^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05与模型组比较

(2)ER对小鼠肝脏尿酸水平的影响，结果见图2。

⁺⁺⁺P<0.001，⁺⁺P<0.01，⁺P<0.05与空白组比较；^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05与模型组比较

(3)ER对小鼠高尿酸血症肝脏XOD的影响，结果见图3。

⁺⁺⁺P<0.001，⁺⁺P<0.01，⁺P<0.05与空白组比较；^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05与模型组比较

(4)蛋白质印迹法Western-blotting

a.肝脏XOD蛋白水平，结果见图4。

b.肾脏URAT1蛋白水平，结果见图5。

⁺⁺⁺P<0.001，⁺⁺P<0.01，⁺P<0.05与空白组比较；^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05与模型组比较

(5)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

a.肝脏XOD mRNA水平，结果见图6。

b.肾脏URAT1mRNA水平，结果见图7。

⁺⁺⁺P<0.001，⁺⁺P<0.01，⁺P<0.05与空白组比较；^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05与模型组比较

结果小结：桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物可显著降低高尿酸血症模型下动物血清尿酸水平、肝脏尿酸水平，而对正常动物血清尿酸水平和肝脏尿酸水平无显著影响，表明桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物可安全有效地治疗和预防高尿酸血症和痛风。桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物能显著抑制模型小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)的活性及其mRNA和蛋白表达、肾脏mURAT1mRNA和蛋白表达，表明桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的降尿酸作用与其抑制XOD活性和尿酸重新吸收转运子mURAT1mRNA和蛋白表达有关，以降低高尿酸血症动物尿酸合成和增加排泄，达到降尿酸作用。

Claims (3)

1.桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物，包括桑枝黄酮和二苯乙烯类化合物，其特征在于，所述的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物中黄酮类化合物重量比含量为30％-70％，二苯乙烯类化合物重量比含量30％-70％。

2.权利要求1所述的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物在制备预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品中的应用。

3.用于预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品组合物，其中含有预防或治疗高尿酸血症和痛风有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体；用该化合物作为药效成分来制备预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品制剂，可单独或与制药可接受的赋形剂等结合，按照常规方法制成口服液、胶囊剂、片剂、颗粒剂、靶向制剂等剂型。

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