CN101501189A - 具有酯酶活性的蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有酯酶活性的新蛋白质及其突变体、编码它们的核酸序列、表达盒、载体和重组微生物。本发明还涉及用于制备所述蛋白质的方法和其用于有机酯的酶促的，尤其是对映选择性的，酯水解或酯交换中的用途。

Description

具有酯酶活性的蛋白质

技术领域

本发明涉及具有酯酶活性的蛋白质、其功能等价物和突变体、编码它们的核酸序列、表达盒、载体和重组微生物；以及制备所述蛋白质的方法和其在有机酯的酶促的，特别是对映选择性酶促的，酯水解或酯交换中的用途。

背景技术

酯酶和脂肪酶是可以用于工业方法中合成旋光有机化合物的水解酶，其特征在于高底物特异性。通过类似于丝氨酸蛋白酶的机制，它们可以将酰基基团转移至亲核物质例如羰基上或者水解断裂酯键。酯酶、脂肪酶和丝氨酸蛋白酶具有相同的催化三联体——由氨基酸Ser，His和Asp组成的序列基序，其中羰基碳原子受到活性Ser的亲核攻击，并在其它两个氨基酸的参与下导致电荷的分配。酯酶和脂肪酶也可以将酰基基团转移至其它亲核物质例如硫醚的硫基或活化胺上。

脂肪酶水解长链甘油酯，其特征在于表面活化，即，活性位点只有在存在脂质底物时才可以接近。脂肪酶在非水性有机溶剂中是稳定的，并且可以在许多工业方法中用于外消旋物的动力学拆分，即，一种对映体比另一种以实质上更快的速度被转化。所述对映体可以由于不同的物理和化学性质而随后从反应溶液中获得。

Nakamura(Nakamura，K.等，Tetrahedron；Asymmetry 9，(1999)，4429-4439)描述了通过在疏水性溶剂中借助商业可获得的脂肪酶(AmanoAK，AH and PS；Amano Pharmaceuticals Co.Ltd.)通过酯交换作用拆分1-炔-3-醇的外消旋物。在该反应中，对映选择性随着酰基供体的链长而增加，空间大残基(氯代乙酸酯、苯甲酸乙烯酯)对该反应有不利影响。Yang(Yang，H.et al.，J.Org.Chem.64，(1999)，1709-1712)描述了利用来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B作为催化剂，使用乙烯基酯通过酯交换作用对映选择性地制备旋光酸。在该例子中，乙基酯导致明显较低的反应速率和选择性。分离自植物伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)(植物假单胞菌或颖壳假单胞菌)(Pseudomonas plantarii或glumae)DSM 6535的脂肪酶可以利用甲氧基乙酸乙基酯对映选择性地酰化外消旋胺(Balkenhohl，F.et al.，J.prakt.Chem.339，(1997)，381-384)。

酯酶对映选择性催化酯键的形成和断裂(正反应和逆反应)。优选在该酯交换作用中使用乙烯基酯获得旋光醇，这是因为该酯的醇官能在转化后将因互变异构成醛或酮而不再可用，由此可以避免逆反应。与脂肪酶不同，酯酶不是表面活化的，并且其转化具有相对短链长的有机化合物。已经从多种生物中分离到具有不同底物特异性的酯酶。

因此，来自Pseudocardia thermophila FERM-BP-6275的酯酶用于水解旋光苯并二氢吡喃乙酸酯(chromanacetic esters)(EP-A-0 892 044)。

来自酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)的酯酶以低的对映选择性水解窄底物范围的酯(Manco，G.et al.，Biochem.J.332，(1998)，203-212)。

来自曲霉属(Aspergillus)的酰基转移酶1用于在有机非极性溶剂中利用乙烯基酯通过酯交换作用获得仲醇，其中优选转化具有短侧链的仲醇(Faraldos，J.et al.，Synlett 4，(1997)，367-370)。已经从荧光假单胞菌DSM50 106克隆膜结合内酯特异性酯酶(Khalameyzer，V.et al.，Appl.andEnviron.Microbiol.65(2)，1999，477-482)，从大肠杆菌(E.coli)Q突变体克隆乙酰酯酶(Peist，R.et al.，J.Bacteriol.179，(1997)，7679-7686)。然而，对这两种酯酶的对映选择性和底物特异性未有更为细节的研究。红球菌属(Rhodococcus)物种NCBM 11216表达4种酯酶，RR1-RR4，这些酯酶具有不同的特异性。对于从萘酚和酸合成酯，RR1和RR2优选具有短碳链的酸，而RR3和RR4特异地转化具有相对长碳链和空间上相对大残基的酸(Gudelj，M.et al.，J.Mol.Cat.B，Enzymatic 5，(1998)，261-266)。

然而，直到目前，尚未有底物范围广、对映选择性高和能够用于工业过程中的酯酶可用于制备小有机分子例如具有短碳链的旋光醇、酸或酯。

WO-A-02/18560首次描述了能够对映选择性地水解广谱旋光酯的、具有酯酶活性的有用蛋白质，该蛋白质在其中被称作酯酶。更具体地，该文献描述了包含510个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)及其编码序列(SEQID NO：1)。

本发明的一个目的在于提供具有至少一种上述性质的、任选地活性被优化的其它酯酶。

发明概述

所述目的令人惊奇地通过提供具有酯酶活性的蛋白质或其功能性等价蛋白质而实现，其中所述蛋白质具有总长小于510个氨基酸的多肽链，并且其中所述链包含至少一个根据SEQ ID NO：3的部分氨基酸序列。

附图简述

图1显示丁炔醇I酯酶的部分氨基酸序列与来自荧光假单胞菌的内酯特异性酯酶的部分序列的序列比对。查询序列(Query)：本发明克隆LU2898的部分序列。目标序列(sbjct)：荧光假单胞菌酶的部分序列(登录号：O87637)。

图2描述LU2898的克隆流程。

图3描述来自LU2898的丁炔醇酯酶基因与ERGO数据库的比较。黑色显示高同源区域。右侧的文字栏为来自ERGO的注释并指出了相应的E值；E值是序列同源基于偶然的可能性。指出了丁炔醇酯酶基因中的PstI切割位点的位置。为了比较，使用来自颖壳假单胞菌LU2023的非重组酶的氨基酸序列。

图4描述具有335个氨基酸的长度的本发明酯酶(来自克隆LU11147)的酶活性以及衍生自其的活性增加的突变体的酶活性。

发明详述

1.优选实施方案

本发明的第一主题涉及具有酯酶活性的蛋白质或其功能等价蛋白质，其中所述蛋白质具有总长小于510个氨基酸的多肽链并且其中所述链包含至少一个根据SEQ ID NO：3的部分氨基酸序列，所述蛋白质优选具有可以通过参考底物丁酸丁-3-炔-2-基酯的断裂来表征的酯酶活性。

本发明的蛋白质尤其还可以包含至少一个根据SEQ ID NO：4、5或6的另外的部分氨基酸序列。

所述根据SEQ IDNO：3、4、5或6的部分氨基酸序列定义如下(在每一种情况下以氨基酸的单字母代码表示，其中在每一种情况下首个氨基酸对应于具体的氨基末端)：

a)FIETLGLERPVLVGHSLGGAIALAVGLDYPER(SEQ IDNO：3)，

b)IALIAPLTHTETEP(SEQ ID NO：4)，

c)GGGMMGLRPEAFYAASSDLV(SEQ ID NO：5)

d)AIDAIFAPEPV(SEQ ID NO：6)。

本发明的蛋白质尤其可以包含总长度小于450个氨基酸，例如300至445个氨基酸，或者小于350个氨基酸，例如尤其是345至300个氨基酸，尤其是大约330至340个氨基酸，特别是335个氨基酸的多肽链。

特别可以提及的是包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的蛋白质。

本发明还涉及这些新型截短酯酶的活性增强的突变体、和相似制备的包含大约510个氨基酸的WO-A-02/18560中公开的酯酶的突变体、以及它们的功能等价物。

本发明尤其涉及在SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列区域12-20，185-195和258-268中的任何区域中具有至少一个功能性突变，特别是在SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列位置16、190和263中的任何位置中具有至少一个功能性突变的酯酶突变体。

此类突变的非限制性实例是如下单独的氨基酸替代或其任何组合：Leu16Pro，Ile190Thr，Ile190Arg和Ile263Val。

本发明的蛋白质还可以是具有大约60kDa或更少，例如56kDa或更少，或例如55.5kDa或更少的计算分子量的多肽链。例如，具有少于510个氨基酸的截短的丁炔醇酯酶可以具有大约56kDa至20kDa，例如大约55.5至30kDa或55.5至35kDa或55.5至40kDa或40至30kDa，或例如55.5至45kDa或38至34kDa或36.5至35.5kDa的分子量。

根据SEQ ID NO：2的蛋白质的突变体优选具有大约60至40kDa、或56至50kDa或55.5至54kDa的计算分子量。

根据SEQ ID NO：8的蛋白质的突变体优选具有大约38至34kDa、37至35kDa或36.5至35.5kDa的计算分子量。

优选的蛋白质可以从具有保藏号DSM 13176(1999年12月2日由DSMZ保藏)的颖壳假单胞菌(也称作植物伯克霍尔德氏菌)LU2023中获得，并且，如果合适，可以随后进行突变。

具有酯酶活性的本发明蛋白质、功能等价物和突变体还可以催化至少一个如下反应：

a)式I的旋光酯的对映选择性水解，

R¹-COO-R²(I)，

其中

R¹是直链或支链的、任选地单或多取代的C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-链烯基、C₂-C₁₀-炔基，R²是直链或支链的、任选地单或多取代的C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-链烯基、C₂-C₁₀-炔基、C₇-C₁₅-芳烷基、或单环或多环的、任选地单或多取代的芳基；

R¹和/或R²包含至少一个不对称碳；和

b)式I的酯与式II的旋光醇的对映选择性酯交换，

R²-OH(II)，

其中R²具有以上含义之一并且任选地具有至少一个不对称碳。

可以提及的适宜的C₁-C₁₀-烷基基团实例是具有1至10个碳的直链或支链基团，例如，甲基、乙基、异丙基或正丙基、正、异、仲或叔丁基、正戊基或异戊基；以及正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、以及它们的单分支或多分支的类似物。

适宜的C₂-C₁₀-链烯基基团实例是具有2至10个碳的上述烷基基团的单或多不饱和类似物，该类似物优选具有1或2个可以位于碳链的任何位置的碳-碳双键。

适宜的C₂-C₁₀-炔基基团实例是具有2至10个碳的上述烷基基团的单或多不饱和类似物，该类似物优选具有1或2个可以位于碳链的任何位置的碳-碳三键。

C₇-C₁₅-芳烷基优选是苯基-C₁-C₅-烷基或萘基-C₁-C₅-烷基。

可以提及的、单环或多环、任选地单或多取代的芳基的实例是被1、2或3个相同或不同的取代基取代的苯基和萘基，取代基选自C₁-C₅-烷基，例如甲基、乙基、异丙基或正丙基、正、异、仲或叔丁基、正戊基或异戊基；羟基、巯基、氨基、硝基或卤素例如F、Br、Cl。

式I的酯可以衍生自例如直链或支链的、任选地单或多不饱和的、任选地取代的C₁-C₁₁-单羧酸。可以提及例如：饱和酸，例如甲酸、乙酸、丙酸和正丁酸及异丁酸、正戊酸及异戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一碳酸；单不饱和酸，例如丙烯酸、巴豆酸；和二不饱和酸，例如山梨酸。如果酸包含双键，则其可以是顺式和反式。

本发明还涉及编码上述蛋白质、功能等价物或突变体的多核苷酸、以及所述多核苷酸的功能等价物、它们的互补多核苷酸、及可以与它们杂交的核酸序列。

本发明尤其涉及包含SEQ ID NO：7的核酸序列中至少30个连续核苷酸残基的核苷酸序列的那些多核苷酸。

本发明还涉及多核苷酸，其中在对应于SEQ ID NO：8的氨基酸位置263的区域中的密码子选自GTT和GTC。

本发明还涉及包含与至少一个调节核酸序列可操作连接的至少一个上述多核苷酸的表达盒。

本发明还涉及用于转化真核或原核宿主的重组载体，该载体包含上述多核苷酸或上述表达盒。

本发明还涉及用于制备上述蛋白质的方法，包括培养内源性产生所述蛋白质的微生物或转化了上述载体的微生物，和从培养物分离所述蛋白质。

在此方面，适宜的方法使用具有保藏号DSM 13176的颖壳假单胞菌(植物伯克霍尔德氏菌)LU2023微生物或衍生自其的微生物。

本发明还涉及可以通过上述方法获得的、如上定义的蛋白质及其功能等价物或突变体。

本发明还涉及具有保藏号DSM 13176的颖壳假单胞菌(植物伯克霍尔德氏菌)LU2023及其变体和突变体。

本发明还涉及带有如上所定义的载体的微生物。

本发明还涉及使用如上所定义的蛋白质(包括功能等价物和突变体)进行对映选择性酯水解的方法，该方法包括：

a)使所述蛋白质与式I的旋光酯的立体异构体混合物接触；和

b)从反应介质获得由任何所述立体异构体的立体选择性水解产生的旋光化合物和/或未水解的酯对映体。

本发明还涉及用于对映选择性酯交换的方法，包括

a)在如上所定义的蛋白质(包括功能等价物和突变体)存在下使式I的酯与式II的旋光醇的立体异构体混合物接触，和从反应介质获得未反应的醇立体异构体；或

b)在如上所定义的蛋白质(包括功能等价物和突变体)存在下使式II的醇与式I的旋光酯的立体异构体混合物接触，和从反应介质获得包含在所述酯中的旋光醇的立体异构体。

根据该方法的一个具体变体，在酯交换中乙烯基酯用作旋光醇的酰化剂。

本发明尤其涉及如上所定义的方法，其中反应介质是有机溶剂。

2.一般术语解释

“酯酶”或“丁炔醇酯酶”或“丁炔醇I酯酶”是催化至少一种本文所述酶转化作用的酶，尤其是至少催化参照物羧酸(特别是丁酸)的丁炔醇酯，例如丁酸丁炔醇酯，如丁酸丁-3-炔2-基酯断裂的酶。

根据本发明，除非另有指明，自具体公开的序列“衍生”的序列或与其“同源”的序列，例如衍生的氨基酸序列或核酸序列，是指与起始序列具有至少80％或至少90％，特别是91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％和99％，同一性的序列。

两个核酸之间的“同一性”指在核酸全长上的核苷酸同一性，尤其是利用Informax的Vector NTI Suite 7.1软件(USA)和Clustal方法(HigginsDG，Sharp PM.微型计算机上快速灵敏的多序列比对，Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2)：151-1)，通过设置如下参数进行比较而计算得出的同一性：

多重比对参数：

空位开放罚分         10

空位延伸罚分         10

空位分隔罚分范围     8

空位分隔罚分         关

比对延迟的％同一性    40

残基特异空位(Residue specific gaps)关

亲水残基空位关

转换权重(Transition weighing)   0

成对比对参数：

FAST算法开

K-tuple大小           1

空位罚分              3

窗口大小              5

最佳对角线数          5

3.本发明的其它实施方案

3.1本发明的蛋白质

本发明不限于具体公开的具有酯酶活性的蛋白质和酶，而是还延伸至其功能等价物。

为了本发明的目的，具体公开的酶的“功能等价物”或类似物是与所述酶不同且具有期望的生物活性如水解活性的多肽。

“功能等价物”例如可以指在所用的酯酶活性测定试验中与包含SEQID NO：8的氨基酸序列的酶的活性相比活性高或低至少1％，例如至少10％或20％，例如至少50％或75％或90％的酶。此外，功能等价物优选在pH4至10是稳定的，其最适pH有利地是pH5至9，如pH6至8，且其最适温度为15℃至80℃或20℃至70℃。

酯酶活性可以利用已知的测定试验检测。非限制性地，可以提及使用参照底物例如丁酸丁炔醇酯，如丁酸丁-3-炔-2-基酯在标准化条件(例如，20mM底物，10mM磷酸缓冲液，pH7.4，T＝20℃)下实施的测定试验。

根据本发明“功能等价物“尤其还可以指与具体提及的序列在上述氨基酸序列的至少一个序列位置上具有不同氨基酸但是仍具有上述生物活性之一的“突变体”。由此，“功能等价物”包括可以通过一个或多个氨基酸添加、替代、缺失和/或倒置而获得的突变体，其中对于所述修饰而言可以发生在任何序列位置，只要它们导致的突变体具有本发明的性质谱即可。功能等价物尤其还存在于突变体和未修饰的多肽之间反应模式定性相同的情况下，即，例如，以不同的速率转化相同的底物。适宜的氨基酸替代的实例总结在下表中：

原始氨基酸                         替代实例

Ala                                Ser

Arg                                Lys

Asn                                Gln；His

Asp                                Glu

Cys                                Ser

Gln                                Asn

Glu                                Asp

Gly                                Pro

His                                Asn；Gln

Ile                                Leu；Val

Leu                                Ile；Val

Lys                                Arg；Gln；Glu

Met                                Leu；Ile

Phe                                Met；Leu；Tyr

Ser                                Thr

Thr                                Ser

Trp                                Tyr

Tyr                                Trp；Phe

Val                                Ile；Leu

根据本发明适于实施突变的单个序列区域的具体实例已经在上面进行过定义，即，SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列区域12-20，185-195和258-268，特别是SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列位置16190和263。

适宜的氨基酸替代的具体实例是Leu16Pro，Ile190Thr，Ile190Arg和Ile263Val。其它修饰是本领域技术人员基于本发明的教导可以容易地提供的。

上述意义的“功能等价物”也可以是所述多肽的“前体”以及所述多肽的“功能衍生物”和“盐”。

“前体”在此是具有或不具有期望生物学活性的、多肽的天然或合成前体。

表述“盐”是指本发明蛋白质分子的羧基基团的盐以及氨基基团的酸加成盐。羧基基团的盐可以以本身已知的方式产生，包括无机盐，例如钠、钙、铵、铁和锌盐，和与有机碱，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等的盐。酸加成盐，例如与无机酸，例如盐酸或硫酸的盐和与有机酸如乙酸和草酸的盐，也包括在本发明中。

本发明多肽的“功能衍生物”也可以使用已知技术在官能性氨基酸侧链基团上或在多肽的N末端或C末端产生。此类衍生物包括例如羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺(可以通过与氨或与伯或仲胺反应获得)；游离氨基基团的N-酰基衍生物(通过与酰基基团反应产生)；或游离羟基基团的O-酰基衍生物(通过与酰基基团反应产生)。

“功能等价物”天然地还包括可以从其它生物获得的多肽以及天然变体。例如，可以通过序列比较确立同源序列区的区域，并可以基于本发明的特定参数确定等价的酶。

“功能等价物”还包括例如展示出期望生物学功能的本发明多肽的片段，优选单个结构域或序列基序。

“功能等价物”还可以是融合蛋白，其以功能性N端或C端连接方式(即，融合蛋白的各部分相互之间无实质上的功能损害)具有上述多肽序列之一或衍生自其的功能等价物和至少一个另外的功能不同的异源序列。该异源序列的非限制实例是例如信号肽、组氨酸锚或酶。

还包括在本发明中的“功能等价物”是具体公开的蛋白质的同源物。按照Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法计算，其与具体公开的氨基酸序列之一具有至少60％，优选至少75％，尤其是至少85％，例如90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％同源性。根据本发明，同源性多肽的同源性百分数尤其是指基于本文具体公开的氨基酸序列之一的总长度的氨基酸残基同一性百分数。

在可能蛋白质糖基化的情况下，本发明的“功能等价物”包括以上所述类型的蛋白质的脱糖基化形式或糖基化形式以及可以通过改变糖基化模式而获得的修饰形式。

本发明蛋白质或多肽的同源物可以通过蛋白质的诱变，如点突变、延伸或截短来制备。

本发明蛋白质的同源物可以通过筛选突变体(如截短突变体)组合文库来鉴定。例如，可以在核酸水平上进行组合诱变，例如，通过酶促连接合成的寡核苷酸的混合物，制备多样化蛋白质变体文库。有大量的方法可以用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同源物的文库。简并基因序列可以在自动DNA合成仪上化学合成，然后可以将合成的基因连接入适宜的表达载体中。利用一组简并基因可以在一个混合物中提供编码一组期望的潜在蛋白质序列的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等(1984)Science 198：1056；Ike等(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。

在现有技术中，已知几种技术可以用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物，和用于从cDNA文库中筛选具有选择的性质的基因产物。这些技术可以经改动而适应于快速筛选通过组合诱变本发明同源物而产生的基因文库。最常用于筛选大型基因文库的、基于高通量分析的技术包括在可复制表达载体中克隆基因文库，用所得载体文库转化适宜细胞，和在如下条件下表达组合基因，其中在所述条件下对期望活性的检测将利于分离包含编码所检测到的产物的基因的载体。递归整体诱变(RecursiveEnsemble Mutagenesis，REM)，一种增加文库中功能性突变体的频率的技术，可以与这些筛选试验联用以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89：7811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。

本发明酯酶的功能等价物的其它实例包含例如衍生自SEQ ID NO：3，4，5或6的至少一个部分序列，其中与具体公开的部分序列相比一个或多个氨基酸已被替代、缺失、倒置或添加，并且其中酯酶活性与天然蛋白质的酯酶活性相差不超过±90％或±50％，优选不超过±30％。

本发明酯酶尤其可以从保藏号DSM13176的颖壳假单胞菌LU2023获得。其它菌株变体可以例如从颖壳假单胞菌LU8093起始，通过选择，例如在具有乙酸乙基苯基酯作为唯一碳源的极限培养基板上培养而获得。

3.2编码核酸序列

本发明还涉及编码具有酯酶活性的酶的核酸序列。优选包含SEQ IDNO：7的序列的核酸序列；或衍生自SEQ ID NO：8的氨基酸序列的核酸序列。

本文中提及的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)均可以以本身已知的方式，通过从核苷酸结构单元化学合成的方式，例如，通过双链的重叠互补的各单个核酸结构单元的片段缩合来产生。寡核苷酸的化学合成可以例如以已知方式，通过亚磷酰胺法(Voet，Voet，2nd edition，Wiley Press，New York，pages 896-897)进行。收集合成的寡核苷酸、利用DNA聚合酶的Klenow片段补平缺口、和连接反应、以及一般的克隆技术描述在Sambrook等(1989)，Molecular Cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中。

本发明还涉及可以例如使用人工核苷酸类似物获得的、编码上述任何多肽和其功能等价物的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。

本发明不仅涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物活性片段的分离的核酸分子，还涉及可以用作例如杂交探针或引物用于鉴定或扩增本发明编码核酸的核酸片段。

本发明核酸分子还可以包括来自编码遗传区3’和/或5’末端的非翻译序列。

本发明还涉及与具体公开的核苷酸序列或其片段互补的核酸分子。

从本发明核苷酸序列可以制备探针和引物用于鉴定和/或克隆其它细胞类型和生物中的同源序列。此类探针和引物一般包含在“严紧”条件(见下述)下与本发明核酸序列之有义链或相应的反义链中的至少大约12个，优选至少大约25个，例如大约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区。

“分离的“核酸分子与其天然来源中存在的其它核酸分子相分离，并且如果其通过重组技术生产则还可以基本上不含有其它细胞物质或培养基，或者如果通过化学合成则还可以不含化学前体或其它化学药品。

本发明核酸分子可以利用标准分子生物学技术和本发明提供的序列信息分离。例如，可以从适宜的cDNA文库，使用具体公开的完整序列之一或其片段作为杂交探针，并利用标准杂交技术(见例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述)，分离cDNA。此外，可以使用基于所公开的序列之一构建的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应分离包含该序列或其片段的核酸分子。可以将以此方式扩增的核酸克隆入适宜载体，并可以通过DNA序列分析进行表征。本发明的寡核苷酸也可以通过标准合成方法，例如使用自动DNA合成仪制备。

本发明核酸序列，例如SEQ ID NO：7或其衍生物、这些序列的同源物或部分，可以例如通过通常的杂交技术或PCR技术从其它细菌，例如通过基因组或cDNA文库分离。这些DNA序列将在标准条件下与本发明序列杂交。

“杂交”是指多核苷酸或寡核苷酸能够在标准条件下与几乎互补的序列结合，而在这些条件下非互补的配偶体之间不发生非特异性结合。为此，序列可以具有90-100％互补性。互补序列能够彼此特异性结合的性质可以用于例如Northern印迹或Southern印迹中或用于PCR或RT-PCR的引物结合中。

短寡核苷酸的保守区可以有利地用于杂交。然而，也可以使用本发明核酸的更长片段或完整序列用于杂交。这些标准条件因所用核酸(寡核苷酸、较长的片段或完整序列)或因用于杂交的核酸的类型——DNA或RNA——而异。例如，对于DNA:DNA杂交体，解链温度比具有相同长度的DNA:RNA杂交体的解链温度低大约10℃.

例如，取决于具体核酸，标准条件可以意味着在具有0.1至5 x SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2)浓度的水性缓冲溶液中，或者额外地还存在50％甲酰胺的情况下，42至58℃的温度，例如，在5xSSC，50％甲酰胺中42℃。有利地，对于DNA:DNA杂交体，杂交条件是0.1 x SSC和大约20至45℃，优选地大约30至45℃。对于DNA:RNA杂交体，杂交条件有利地是0.1 x SSC和大约30℃至55℃，优选地大约45℃至55℃.。上述杂交温度是针对长度大约100个核苷酸且具有50％G+C含量的核酸在不存在甲酰胺的情况下计算的解链温度值的实例。DNA杂交的实验条件描述在相关遗传教科书中，例如，Sambrook等，＂MolecularCloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989，并且可以使用本领域技术人员已知的公式，例如，根据核酸的长度、杂交体的类型或G+C含量计算。本领域技术人员可以从以下教科书中获得有关杂交的其它信息：Ausubel等(eds)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York；Hames和Higgins(eds)，1985，Nucleic AcidsHybridization：A Practical Approach，IRL Press at Oxford UniversityPress，Oxford；Brown(ed)，1991，Essential Molecular Biology：A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。

“杂交”尤其可以使用严紧条件进行。该杂交条件例如描述在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，in：Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，9.31-9.57页或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。

“严紧”杂交条件尤其指：在由50％甲酰胺，5 x SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5 x Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20g/ml变性剪切的鲑精DNA组成的溶液中42℃温育过夜，之后用0.1 x SSC于65℃洗涤杂交滤膜。

本发明还涉及具体公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。

因此，本发明的其它核酸序列可以例如从SEQ ID NO；7衍生并可以与其相差一个或多个核苷酸的添加、替换、插入或缺失，但仍编码具有期望性质谱的多肽。

本发明还涵盖包含“沉默”突变或与具体公开的序列相比根据特定来源或宿主生物的密码子使用已发生改变的核酸序列，以及天然变体，例如其剪接变体或等位基因变体。

本发明还涉及可以通过保守核苷酸替代(即，目的氨基酸被具有相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸置换)获得的序列。

本发明还涉及由于序列多态性衍生自具体公开的核酸的分子。这些遗传多态性可以因自然变异而存在于一个群体的个体之间。这些天然变异通常在一个基因的核苷酸序列中造成1至5％的变异。

具有本发明SEQ ID NO：7序列的核酸序列的衍生物是指例如在衍生的氨基酸的水平上、在全长序列范围上、具有至少60％同源性、优选地至少80％同源性、非常特别优选地至少90％同源性(关于氨基酸水平上的同源性，应参考以上就多肽给出的细节描述)的等位基因变体。有利地，同源性在序列的部分区域可以更高。

此外，衍生物也应理解为指本发明核酸序列，尤其是SEQ ID NO：7序列的同源物，例如真菌或细菌同源物、截短序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如，SEQ ID NO：7的同源物可以在DNA水平上、在SEQ ID NO：7的全长DNA区域上，具有至少40％、优选地至少60％、特别优选地至少70％、非常优选地至少80％同源性。

此外，衍生物应理解为还指例如与启动子的融合物。位于所述核苷酸序列上游的启动子可以通过至少一个核苷酸改变、至少一个插入、倒置和/或缺失进行改变而不损害启动子的功能性或功效。而且，可以通过改变启动子的序列或者将其完全置换成更有效的启动子(甚至不同属生物的启动子)，增加启动子的功效。

3.3 本发明构建体

本发明还涉及表达构建体，其包含在调节核酸序列的遗传控制下的编码本发明多肽的核酸序列；并涉及包含至少一个所述表达构建体的载体。

根据本发明，“表达单位“是指具有表达活性的核酸，其包含本文所定义的启动子并且在与待表达的核酸或基因功能性连接后可以调节该核酸或该基因的表达，即，转录和翻译。在本文中，因此，其也称作“调节核酸序列”。除了启动子外，还可以存在其它调节元件例如增加子。

根据本发明，“表达盒”或“表达构建体”是指与待表达的核酸或待表达的基因功能性连接的表达单位。因此，与表达单位不同，表达盒不仅包含调节转录和翻译的核酸序列还包含应作为转录和翻译的结果表达为蛋白质的核酸序列。

在本发明中，术语“表达”或“过表达”是指微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性的出现或增加。为此，可以例如将基因插入基因组、将现有基因置换成另一基因、增加(一个或多个)基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因、以及任选地可以将这些手段组合。

优选地，本发明构建体包含位于相应编码序列5’上游的启动子和3’下游的终止序列、以及任选地其它有用的调节元件，其中所有元件均与编码序列可操作连接。

“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”在本发明中是指与待转录的核酸功能性连接并调节该核酸的转录的核酸。

“功能性”或“可操作”连接在此是指例如具有启动子活性的核酸之一与待转录的核酸序列以及任选地其它调节元件例如确保核酸转录的核酸序列以及例如终止子顺序排列，该排列方式导致每一个调节元件都可以在核酸序列的转录过程中实现其功能。这并不一定要求化学意义上的直接连接。例如，遗传控制序列，如增强子序列，也可以从距靶序列较远的位置或者甚至从其它DNA分子上对靶序列产生作用。优选的排列方式是待转录的核酸序列位于启动子序列的下游(即，3’端)以便两个序列彼此共价连接。启动子序列和待转基因表达的核酸序列之间的距离可以小于200碱基对、或小于100碱基对或小于50碱基对。

除了启动子和终止子外，可以提及的其它调节元件的实例是引导序列、增强子、多腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列描述在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。

本发明核酸构建体尤其可以包含SEQ ID NO：7的序列或其衍生物和同源物以及可以衍生自SEQ ID NO：8的核酸序列，有利地这些序列已经与用于控制如增加基因表达的一个或多个调节信号可操作地或功能性地连接。

除了上述调节序列外，这些序列的天然调节作用仍可以存在于实际结构基因的上游，任选地可以进行遗传改变以便关闭天然调节作用和增加基因的表达。然而，核酸构建体也可以具有较简单的设计，即，在编码序列(例如SEQ ID NO：7或其同源物)的上游不插入任何额外的调节信号并且不除去天然启动子及其调解作用。相反地，可以突变天然调解序列以使调解作用不再发生和增加基因表达。

有利的是，优选的核酸构建体还可以包含一个或多个与启动子功能性连接的上述增强子序列，以允许增加核酸序列的表达。也可以将其它有利的序列，例如其它调解元件或终止子，插在DNA序列的3’末端。构建体中可以包含本发明核酸的一个或多个拷贝。构建体也可以包含其它标记，例如抗生素抗性或辅源营养互补基因，任选地用于构建体的选择。

适宜调节序列的实例包含在启动子中，所述启动子例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacI^q、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaP_BAD)SP6、λ-P_R或λ-P_L启动子，它们可以有利地用于革兰氏阴性细菌中。其它有利的调节序列包含在例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中，以及酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。也可以将人工启动子用于调节。

例如，有利地，将核酸构建体插入宿主生物的载体中，例如质粒或噬菌体，以允许基因在宿主中最佳表达。除了质粒和噬菌体外，载体还应理解为指本领域技术人员已知的所有其它载体，即，例如，病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、质粒、粘粒、和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或可以随染色体复制。这些载体是本发明的再一实施方案。

适宜的质粒例如是，在大肠杆菌(E.coli)中，pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11orpBdCI；在链霉菌(Streptomyces)中，pIJ101，pIJ364，pIJ702或pIJ361；在芽孢杆菌(Bacillus)中，pUB110，pC194或pBD214；在棒状杆菌(Corynebacterium)中，pSA77或pAJ667；在真菌中，pALS1，pIL2或pBB116；在酵母中，2αM，pAG-1，YEp6，YEp13或pEMBLYe23；或在植物中，pLGV23，pGHlac⁺，pBIN19，pAK2004或pDH51。上述质粒是可选的可能质粒的一小部分。其它质粒是本领域技术人员熟知的，并且可以参见例如教科书克隆载体(Eds.Pouwels P.H.等Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)。

在载体的再一实施方案中，包含本发明核酸构建体或本发明核酸的载体也可以有利地以线性DNA的形式引入微生物中并通过异源或同源重组整合在宿主生物的基因组中。该线性DNA可以包含线性化的载体例如质粒或仅仅是本发明的核酸构建体或核酸。

为了异源基因在生物中的最佳表达，有利的是依据生物的具体密码子使用来改变核酸序列。密码子使用可以容易地通过计算机评价所述生物的其它已知基因来确定。

本发明表达盒可以基于适宜启动子与适宜编码核苷酸序列以及终止信号或多腺苷酸化信号的融合而制备。为此，可以使用通常的重组和克隆技术，这些技术描述在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)；以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中。

有利地，可以将重组核酸构建体或基因构建体插入用于在适宜宿主生物中表达的宿主特异性载体中，这样使得基因可以在宿主中获得最佳表达。载体是本领域技术人员熟知的并可以参见例如“Cloning Vectors”(PouwelsP.H.et al.，Publ.Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)。

3.4 可以用于本发明的微生物

根据上下文，术语“微生物”是指起始微生物(野生型)或遗传修饰性重组微生物，或两者。

利用本发明载体，可以制备转染了例如至少一个本发明载体并可以用于产生本发明多肽的重组微生物。有利地，可以将上述本发明重组构建体插入适宜的宿主系统并表达。优选地，可以使用本领域技术人员熟知的一般克隆和转染方法，例如，共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以便在特定表达系统中实现所述核酸的表达。适宜的系统描述在例如Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等，Publ.WileyInterscience，New York 1997，或Sambrook等Molecular Cloning：ALaboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中。

原则上，任何原核或真核生物均可以考虑用作本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物。有利地，使用微生物，例如细菌、真菌或酵母作为宿主生物。有利的是，使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌，特别优选埃希氏杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。极其特别优选物种大肠杆菌。也可以在以下组中找到其它有利的细菌：α-变形菌纲(proteobacteria)，β-变形菌纲或γ-变形菌纲。

在此，本发明宿主生物(一个或多个)优选包含至少一个编码如上所定义的具有酯酶活性的酶的本发明所述核酸序列、核酸构建体或载体。

依据宿主生物，可以以本领域技术人员已知的方式培养或培育用于本发明方法中的生物。通常，在包含碳源(通常为糖的形式)、氮源(通常为有机氮源形式如酵母提取物或盐的形式如硫酸铵)、痕量元素如铁、锰和镁盐以及如果合适的话维生素的液体培养基中，在0℃至100℃，优选地10℃至60℃，充氧培养微生物。液体营养培养基的pH可以维持在固定值，即，在培养过程中可以调节或不调节。可以分批、半分批或连续地进行培养。养分可以在发酵开始时提供或者可以随后、半连续地或连续地提供。酮可以在培养过程中，或者有利地在培养后，直接加入。可以通过实施例中描述的方法从生物体分离酶，或者可以在反应中使用粗提取物形式的酶。

3.5 酯酶的重组生产

本发明还涉及通过培养多肽生产性微生物、酌情诱导多肽表达和从培养物中分离多肽，重组生产本发明多肽或其生物学活性功能片段的方法。如果期望，也可以以此方式工业规模生产所述多肽。

可以连续地或在分批工艺中或在补料分批或重复补料分批工艺中分批地培养根据本发明制备的微生物。已知培养方法的综述参见Chmiel著的教科书(Bioprocesstechnik1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或参见Storhas著的教科书(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。

所用培养基必须以合适方式满足具体菌株的需要。有关用于不同微生物的培养基的描述可以参见美国生物技术学会的手册＂Manual of Methodsfor General Bacteriology＂(Washington D.C.，USA，1981)。

可用于本发明的这些培养基一般包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或痕量元素。

优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、淀粉或纤维素。糖也可以通过复杂化合物，例如糖蜜或糖精炼的其它副产物，加入培养基。也可能有利的是，添加多种碳源的混合物。其它可能碳源是油和脂肪，例如大豆油、葵花油、花生油和可可油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸，醇例如甘油、甲醇或乙醇，和有机酸例如乙酸或乳酸。

氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气或铵盐，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸、或复杂氮源，例如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其它。这些氮源可以单独地或以混合物形式使用。

可以存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。

无机含硫化合物，例如，硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，以及有机硫化合物，例如硫醇(mercaptans及thiols)，可以用作硫源。

磷酸、磷酸二氢钾、或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。

可以将螯合剂加入培养基以将金属离子保持在溶液中。特别适宜的螯合剂包括二羟基苯酚类，例如，儿茶酚或原儿茶酸酯，或有机酸如柠檬酸。

本发明所用发酵培养基通常也包含其它生长因子，例如维生素或生长促进剂，包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐常常来自培养基的复杂成分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外，适宜的前体可以加入培养基中。培养基中化合物的精确组成强烈地取决于具体实验，并且必须针对每一个具体情况单独地确定。有关培养基优化的信息可以参见教科书＂Applied Microbiol.Physiology，APractical Approach＂(Publ.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)p.53-73，ISBN 0 19 963577 3)。生长培养基也可以从供应商，例如Standard1(Merck)或BHI(Brain heart infusion，DIFCO)等获得。

所有培养基成分均通过加热(20min，1.5bar，121℃)或通过过滤除菌进行灭菌。这些成分可以一起灭菌，或者如果必要的话分开灭菌。所有培养基成分都可以在培养开始时存在，或者任选地可以连续地或以分批补料的方式添加。

培养温度通常为15℃至45℃，优选20℃至40℃，并且可以在实验过程中保持恒定或者可以变化。培养基的pH应当在5至8.5的范围，优选大约7.0。用于生长的pH可以在生长过程中通过添加碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸，进行控制。可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯以控制泡沫形成。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中加入具有选择性作用的适宜物质，例如抗生素。将氧气或含氧气的气体混合物，例如空气，加入培养基以维持有氧条件。培养温度通常为20℃至45℃。可以连续培养直至形成最多的期望产物。通常这在10小时至160小时内达到。

然后，进一步加工发酵液。取决于需要，可以从发酵液中通过分离技术，例如离心、过滤、滗析或这些方法的组合，完全地或部分地分离出生物质，或者可以将生物质完全留在发酵液中。

如果多肽不分泌至培养基中，则也可以将细胞破碎并且而可以从裂解物中通过已知用于分离蛋白质的技术获得产物。可以任选地利用高频超声、利用高压，例如，在弗氏压碎器中，利用渗透裂解作用、利用去污剂、溶解酶或有机溶剂的作用、利用匀浆器、或利用所列几种方法的组合，破碎细胞。

可以使用已知的层析方法，例如分子筛层析(凝胶过滤)、Q-Sepharose层析、离子交换层析和疏水层析、以及利用其它常规方法例如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳，纯化多肽。适宜的方法描述在例如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York或者Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，NewYork，Heidelberg，Berlin中。

为了分离重组蛋白，可以有利地利用以确定的核苷酸序列延长cDNA并由此编码修饰多肽或融合蛋白的载体系统或寡核苷酸，它们可以用于例如简化纯化。适宜的此类修饰是例如，起锚作用的所谓的“标签”，例如，称作六组氨酸锚的修饰，或者可以被抗体识别为抗原的表位(参见例如Harlow，E.and Lane，D.，1988，Antibodies：A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor(N.Y.)Press)。这些锚可以提供蛋白质在(例如用于装柱的)固相支持物，例如聚合物基质上的附着，或者可以用在微量滴定板上或一些其它支持物上。

同时，这些锚还可以用于蛋白质的识别。为了识别蛋白质，也可以使用普通标记，例如荧光染料和在与底物反应后形成可检测反应产物的酶标记、或放射性标记，这些标记可以单独使用或者与锚联用以衍生化蛋白质。

3.6 本发明酯酶的应用

本发明还涉及使用酯酶进行对应选择性酯水解的方法，该方法包括使酯酶与式I的旋光酯的立体异构体混合物接触和从反应介质中获得由两种立体异构体之任一的立体选择性水解产生的旋光化合物和/或未水解的酯对映体。然而，酯酶也可以水解非旋光性的式I酯。

本发明还涉及用于对映选择性酯交换的方法，该方法包括在酯酶存在下使式II的旋光醇的立体异构体混合物与式I的酯接触，和从反应介质中获得未反应的醇立体异构体，或者在所述酯酶存在下使式I的旋光酯的立体异构体混合物与式II的醇接触，和从反应介质中获得包含在所述酯中的旋光醇的立体异构体。在酯交换中乙烯基酯优选用作旋光醇的酰化剂。这是有利的，原因是在转化后，乙烯基酯的醇官能将由于互变异构作用不再可用于逆反应。酯酶也可以催化其中酯和醇均无旋光性的酯交换作用。

酯水解的优选底物是乙醇、丙醇、丁醇，特别优选地丁炔醇(丁炔醇酯，1-甲基-丙-2-炔醇的酯)与羧酸，例如，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、乳酸、2-乙基己酸、3-甲基丁酸、甲氧基乙酸、2-甲基丙酸、2-丁烯酸、3-氯代丙酸和2-甲基戊酸，的酯。特别优选丁酸丁炔酯和甲基丁酸丁炔酯。

在酯交换中优选的醇是乙醇、丙醇和丁醇，尤其优选丁炔醇。

在酯交换中优选的酯是乙烯基酯，例如乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯和丁酸乙烯酯。

用于以上方法的反应介质是有机溶剂，例如，烷、醚、甲苯、二噁烷、甲基异丁基酮、甲基叔丁基醚(MTBE)等。在酯水解中，也可以使用从所用的缓冲溶液和有机溶剂，例如MTBE和庚烷或甲苯制成的混合物。

外消旋物的拆分，即，对映选择性，和反应速率可以通过酸部分的大小和疏水性来影响。

本发明反应优选在室温在pH6至9，特别优选pH7.0至7.4进行。酯酶可以以分离的或纯化的酶形式、以表达酯酶的微生物细胞形式、以所述微生物的培养物上清液、细胞裂解物或提取物的形式、或以固定化酯酶的形式使用。可以从反应溶液中通过本领域技术人员已知的化学或物理分离方法，分离反应产物。可以从反应混合物中通过膜过滤分离酯酶。

可以利用聚丙烯酰胺、褐藻酸或角叉菜聚糖固定酯酶。也可以通过已知方法使酯酶共价结合或吸附在适宜载体上。优选通过在硅藻土上冻干或通过硫酸铵沉淀，固定酯酶。

实验部分

除非另行指明，在本发明范围内实施的克隆步骤，例如，限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、核酸向硝酸纤维素和尼龙膜的转移、DNA片段的连接、微生物的转化、微生物的培养、噬菌体的繁殖和重组DNA序列分析，可以按照Sambrook等(1989)，如上引文所述进行。

实施例1

选择表达酯酶的颖壳假单胞菌突变体

筛选的起点是产生脂肪酶的菌株颖壳假单胞菌(伯克霍尔德氏菌)LU8093。利用由所述菌株产生的脂肪酶可以实施许多有意义的反应(Balkenhohl，F.et al.，J.prakt.Chem.339，(1997)，381-384)。然而，乳酸酯、甲基丁酸酯和苯乙酸酯不是该脂肪酶的底物，并且不能被所述菌株以任何其它方式水解。

然而，这些水解产物可以用作碳源。因此，寻找能水解所述酯并能够使用水解产物作为碳源生长的LU8093的突变体。因此，具有新酯酶活性的突变体应当可以通过在所述酯上的生长而彰显出自己。

选择条件：将LU8093在培养基上培养16小时，离心收获。细胞用盐水洗涤2次。将10⁶个细胞种在含有0.5或1.0g/l苯乙酸乙酯作为唯一碳源的极限培养基平板上。然而，最初并没有生长。仅在4至6天后可以识别出单菌落。它们的数目在随后的天数里进一步增加。

从以此方式获得的酯酶阳性突变体中，选择出突变体LU2023。令人惊奇地，该新酯酶活性也适用于选择性水解小的有机分子。例如，已经证实对丁炔醇酯的选择性水解。

实施例2

颖壳假单胞菌LU2023的发酵

为了获得酯酶，以14-l的规模培养颖壳假单胞菌LU2023，收获活性生物质。

在实验室，在具有M12矿物盐培养基和1g/l EPA的琼脂平板上划线培养颖壳假单胞菌LU2023，28℃温育36至48小时。然后4℃贮存平板4周。

在Infors xxy 141发酵罐中进行菌株发酵。对于预培养，接种250ml培养基2至3Pt环，200rpm和28℃孵育24小时。主培养在以下条件下进行：

温度28℃

供气7l/min

搅拌600rpm

发酵运行时间大约24h

内置pH和pO₂测量

用于预培养和主培养的培养基：

15g/l Springer酵母自溶物65％

1.6g/l硫酸镁 x 7水

0.02g/l氯化钙 x 2水

3.5g/l磷酸二氢钾

3.5g/l磷酸氢二钾

5g/l磷酸氢二铵

6ml Pluriol P2000消泡剂

将以上成分溶解在去离子水中，用25％浓度的氨溶液调整溶液至pH6.5。单独地对5ml/l痕量元素溶液和2g/l葡萄糖进行过滤除菌。

在灭菌和完全培养基后，将0.5g/l苯乙酸乙酯加入发酵罐中。添加Pluriol P2000控制在发酵过程中出现的泡沫。当发酵罐中的pO₂再次增加至高于85％时，终止发酵。然后在低于15℃的温度以大约9000至10000g离心发酵罐内容物，弃去清澈的流出物。将细胞物质冷冻在-16℃。

实施例3

从颖壳假单胞菌LU2023纯化酯酶

在玻璃砂磨机(100ml玻璃珠，直径：0.5mm)中4℃和3000rpm裂解颖壳假单胞菌(LU2023)细胞(100ml，湿重：50g)。离心(10000rpm，30min)并洗涤玻璃珠后，对上清液(300ml)进行氯化锰沉淀(pH7至7.5；终浓度：50mM)。再次离心后，调整上清液至pH8.0，以50mM浓度加入EDTA。以Q-Sepharose(300ml)层析纯化该体积。加样后，用50mM Tris/HCl洗涤柱子。收集目的级分，并超滤(100kDa)浓缩。通过分子筛层析(直径：5cm，高：90cm；物质：S-300)从非特异性酯酶中分离丁炔醇水解酯酶。所得活性级分是混浊的，再次浓缩。明显地，该酯酶是膜结合性的。然后首先通过蛋白酶(胰蛋白酶，重量比：1:50至1:100)消化该膜级分。这造成除了在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的少数条带外其它所有蛋白均自该膜级分中消失。活性被保留下来。所述条带通过非变性凝胶电泳(0.4％SDS)彼此分离，活性测定试验在该非变性凝胶中鉴定到所述酯酶。从凝胶中洗脱该酯酶，然后该酯酶在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为一条清晰条带。

通过印迹将以此方式纯化的蛋白质转移至PVDF膜上，并测序，或者在胰蛋白酶切割后通过反向HPLC分离肽并测序。由于蛋白质的氨基端被封闭，故仅获得胰蛋白酶消化肽段。多个氨基酸序列显示出与来自洛菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的黏康酸环化异构酶EC5.5.1.1以及来自荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的内酯酯酶具有弱同源性。具有序列AIDAIFAPEGV的肽显示出与果胶酯酶(EC 3.1.1.11)同源。

图1显示本发明序列的部分氨基酸序列与来自荧光假单胞菌的内酯特异性酯酶的部分序列的序列比对。

实施例4

酯酶的固定化

使用多种方法进行固定。

1.在硅藻土存在下用丙酮沉淀以实质性失活酯酶。将25mg蛋白质与3.5g硅藻土(Merck)混合，加入1.41丙酮(-20℃)10分钟。然后通过G3玻璃吸滤器移出荷载了的支持物，用冷丙酮洗涤过滤残留物并干燥。

2.酯酶不结合Accurel(Akzo)。

3.可以通过冻干将酯酶(2.3单位/g，EPA测定法)固定在硅藻土上。为此，将酶溶液与硅藻土混合，-80℃冷冻。随后，冻干法干燥固体物质。

4.利用硫酸铵沉淀固定酯酶(454毫单位/g，EPA测定法)。为此，以80％饱和硫酸铵在硅藻土存在下沉淀该酶。

实施例5

使用来自颖壳假单胞菌LU2023的酯酶进行外消旋物拆分

操作过程(标准方法)

在搅拌下在磷酸缓冲液(200ml，10mM，pH7.4)中使100单位酯酶与20mmol丁酸丁炔醇酯(丁酸1-甲基丙-2-炔基酯)反应。连续测量pH并通过添加氢氧化钠溶液保持在大约pH7.4。在表1所示时间，取样并用甲基叔丁基醚(MTBE)提取两次，并通过GC(Chiraldex GTA)分析有机相。可以通过膜过滤从反应混合物中移出该酯酶。

随着较不优选的酯对映体的浓度增加，有越多的该对映体被转化。在大约45分钟后，这造成反应混合物中S-丁炔醇的ee的下降。该产物的ee在大约30至40分钟后达到其最大值，84％(83-97.9％)。在90分钟的过程中底物的ee增加至超过99％。ee(对映体过量)定义为以百分数表示的优选转化的对映体的量减去以百分数表示的较不优选转化的对映体的量。在大多数情况下，这相应于光学纯度。在30分钟内pH的下降是线性的。从大约100分钟以后，pH的改变可忽略不计。

提取后，水相中残余的酯酶活性仍为大约50％。

表1

 

时间	产物(S)-丁炔醇的ee	底物(R)-丁炔醇酯的ee	％酯转化(校正的)
				0min	Nd	5.20	nd
7min	Nd	10.20	nd
				13min	75.50	20.40	12
20min	81.80	29.10	16
				26min	83.90	42.00	22
32min	84.60	53.70	27
				45min	84.00	78.80	36
70min	70.80	97.10	47
				90min	69.60	99.10	52
121min	63.10	99.40	56
				150min	52.00	99.50	67

表1显示酯酶转化丁酸丁炔醇酯时的时间依赖性对映体过量。根据Cahn，Prelog和Ingold的R/S约定，R和S构型定义手性分子的两种对映体。该转化是转化的酯在反应混合物中的比例。

实施例6

酯酶特异性对酯的酸部分的大小和疏水性/电荷的依赖性

标准方法

在搅拌下在磷酸缓冲液(200ml，10mM，pH7.4)中使100单位酯酶与20mmol丁炔醇酯反应。连续测量pH，并通过连续滴定将其保持在pH7.0。取出的样品用甲基叔丁基醚(MTBE)提取两次，通过GC(Chiraldex GTA)分析有机相。

结果

外消旋物拆分的质量和反应速度取决于酸部分的大小和疏水性。丁炔醇酯酶的最佳底物是丁酸丁炔醇酯和甲基丁酸丁炔醇酯。脂肪酶对于这些底物是无活性的。对于长链酯，例如正癸酸丁炔酯，这也是事实。

表2

 

酸成分

ee[％]

转化[％]

E

 

乙酸	73(S)	48	12
				丁酸	95(S)	36	67
戊酸	74(S)	47	13
				己酸	66(S)	44	8
辛酸	64(S)	43	8
				2-乙基己酸	无转化
苯乙酸	51(S)	12	3
				3-苯基丙酸	73(S)	44	11
3-环己基丙酸	22(S)	18	2

表2显示酯酶的酯转化的对映体过量取决于转化的酯的酸部分。

实施例7

使用酯酶在有机介质中进行酯交换

将10mmol外消旋-丁炔醇和5mmol丁酸乙烯基酯溶解在50ml甲基叔丁基醚(MTBE)中，与硅藻土支持物上的9单位酯酶(3.3g)混合，室温振荡混合物24小时。过滤后，除去溶剂，通过GC表征产物混合物。

以47％转化率，剩余(R)-丁炔醇(18％ee)和(S)-丁炔醇的丁酸酯(45％ee)。

在甲基异丁基酮中，以43％转化率获得了具有16％ee的(R)-丁炔醇和具有52％ee的(S)-丁炔醇的丁酸酯。

表3显示以酯酶转化酯时的对映体过量取决于转化的酯的酸部分

表3

 

混合

底物

pH

温度

缓冲体系

添加剂

ee1)

 

物编号			[℃]	溶液[mmol/l]
							8	正癸酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	54.37
14	正戊酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	80.40
							15	2-乙基己酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	81.77
16	丁酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	83.90
							17	丁酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	0.5％Triton	80.83
18	正己酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	0.5％Triton	78.63
							19	正辛酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	0.5％Triton	74.70
20	丁酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	10％正丙醇	87.47
							21	丁酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	1M NaCl	85.70
23	正戊酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	0.5％Triton	84.40
							24	丁酸丁炔酯	6.0	RT	磷酸10	无	85.37
25	丁酸丁炔酯	8.0	RT	Tris10	无	85.33
							26	丁酸丁炔酯	7.0	10	磷酸10	无	85.90
27	丁酸丁炔酯	7.0	37	磷酸10	无	75.67
							28	3-甲基丁酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	90.50
29	甲氧基乙酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	76.33
							31	丁酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	85.00
32	丁酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	2-相体系	84.93
							33	3-甲基丁酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	2-相体系	92.70
34	2-甲基丙酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	89.17
							35	2-丁烯酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	76.03
36	3-氯代丙酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	71.13
							40	2-甲基戊酸丁炔酯	7.0	RT	磷酸10	无	85.93

1)S-丁炔醇的ee的3个最佳值的平均值

实施例8：

制备菌株LU2023的基因文库和克隆LU2898

a)获得染色体DNA：

在100ml FP培养基(Becton Dickinson GmbH)中28℃和180rpm培养LU2023(参见以上实施例1和2)24小时。离心(2000rpm/5min)收获细胞，重悬浮于5ml裂解缓冲液1(0.41M蔗糖，0.01M MgSO₄＊7H₂O，50ml/L M12培养基(10x浓度)，10ml/L 10％KH₂PO₄pH6.7，2.5mg/ml溶菌酶[临用前加入])中，37℃温育大约4小时。离心(2000rpm/20min)后，在无溶菌酶的5ml裂解缓冲液1中洗涤所得的原生质体(2000rpm/20min)，重悬浮于10mM TRIS-HCl pH8.0中。

用10mM TRIS-HCl pH8.0(3000rpm/5min)再次洗涤后，沉淀重悬于4ml TE缓冲液(10mM TRIS-HCl，1mM EDTA，pH8)中，与SDS(10％w/v)和NaCl(5M)各0.5ml混合。之后加入100μl蛋白酶K溶液(200μg/ml)，37℃温育16小时。之后，向溶液中加入TE缓冲液至终体积10ml。该溶液与苯酚1:1混合。离心(4000rpm/5min)后，移出上相，与苯酚、氯仿和异戊醇(12:12:1)的混合物混合。移出上相，与一体积氯仿异戊醇(24:1)混合。重复该过程直至上相清澈。

通过加入2体积乙醇和1/50体积CH₃COONa(3M)在-20℃从上相沉淀DNA(持续时间：大约30min)，离心(12000rpm，30min，4℃)沉淀，重悬于TE缓冲液中。37℃以RNase(1ml的20μg/ml溶液)水解RNA1小时。然后在TE缓冲液中4℃透析该溶液3次，每次1小时。通过添加乙醇(2体积加1/3体积LiCl，2M)并在-20℃温育30分钟，在每0.4ml的等分试样中沉淀DNA。离心(15000rpm，30min，4℃)沉淀DNA，然后干燥。将0.4ml等分试样的DNA重悬在0.5ml TE缓冲液中。

b)DNA的限制性消化和克隆

用120U PstI于37℃消化1μg染色体DNA180min。用160U PstI限制性消化0.4μg的pUC19(如，New England Biolabs)(1h，37℃)，之后用碱性磷酸酶脱磷酸化(1h，37℃加上65℃灭活15分钟)。使用快速连接试剂盒(Roche)连接DNA片段(室温2h)。根据厂商信息，用连接混合物转化转化感受态大肠杆菌(Stratagene)。在IPTG/X-Gal FP(含有100μg/ml氨苄青霉素的FP培养基)平板上划线培养细胞，37℃温育16小时。在含有氨苄青霉素的新鲜FP平板上划线培养白色菌落。

c)基因文库筛选

使用无菌绒垫将菌落转移至Whatman滤纸上。将滤膜置于2.5ml试验溶液(10mM TRIS＊HCl，pH7.5，0.01％溴甲酚紫，0.1％外消旋酯[外消旋-乳酸甲酯(MEE)或外消旋-甲基丁酸乙酯或外消旋-苯乙酸乙酯])中。细胞具有酯酶活性的菌落在5分钟内由蓝色变成黄色。分析的2900个菌落中，有一个造成强烈的颜色变化。该菌株称作LU2898。图2显示了LU2898的克隆策略的示意图。

实施例9

LU2898的重组DNA的序列分析

来自LU2898的质粒具有7.7kb插入物。大肠杆菌LU2898的包含丁炔醇酯酶基因的质粒被完全测序。在DNA数据库中的第一次检索获得了一个开放阅读框(位置1394至2923)，其中该插入物与水解酶同源。

用LU2898丁炔醇酯酶的DNA序列检索ERGO数据库(IntegratedGenomics，Inc.1999-2004，Chicago，USA)。发现仅来自该丁炔醇酯酶基因的1384-2397bp的区域与已知水解酶有同源性。

来自1384-2397bp的区域明显地是期望的丁炔醇酯酶的DNA。另一个良好的指示是GXSXG基序，该基序是丝氨酸羧基酯酶所典型的，其位于LU2023丁炔醇酯酶的氨基酸位置127-131中。

LU2898丁炔醇酯酶基因与洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)水解酶之间的良好相符性自大约位置2400起终止。该阅读框再往下与NADP还原酶的3’端有非常明显的同源性。

这些结果显示在附图3中。图3总结了ERGO分析结果。LU2898丁炔醇酯酶中同源性的突然转变与PstI切割位点相重合。对于所选的克隆策略，PstI限制性酶的切割位点是预料之外的。该酶被用于完全切割LU2023染色体DNA以制备质粒文库。在完全水解后，应不再存在内部的PstI识别位点。在LU2898质粒中发现PstI切割位点可能可以通过如下进行解释：由所述PstI限制性消化产生的不同基因片段在质粒构建过程中彼此连接并最终连入pUC19的PstI切割位点中，这意味着定为丁炔醇酯酶的该阅读框可能仅是颖壳假单胞菌LU2023中的实际基因的一部分。该丁炔醇酯酶基因已在PstI位点处被中断，随后与NADP还原酶基因的片段连接。

该假设得到蛋白质测序数据的支持。已经纯化了颖壳假单胞菌LU2023丁炔醇酯酶。通过Edman降解法确定了该蛋白质的氨基酸序列。除了少数N端和C端氨基酸外，整个序列是已知的。其对应于衍生自LU2898的DNA数据的丁炔醇酯酶的第一部分的氨基酸序列。实验确定的丁炔醇酯酶的分子量，41.3kDa，明显地低于源自重组LU2898丁炔醇酯酶基因的DNA序列的值。根据该DNA序列数据，丁炔醇酯酶应具有55kDa的分子量。

利用数据库分析发现了该丁炔醇酯酶未被全长克隆的证据。来自LU2898的质粒不包含该丁炔醇酯酶基因的3’端。

实施例10

发现包含截短的335AA丁炔醇酯酶突变体的克隆LU11147

利用来自LU2898的质粒的序列数据设计以下PCR引物：

                Hind|||

Breu0811：GGCGAGAAGCTTAGAAATCATGATCGTCCA(SEQ ID NO：20)

                Xba1

Breu0812：GGATCCTCTAGAGTCTCACTGCAGCGCGCC(SEQ ID NO：21)

使用这些寡核苷酸通过PCR扩增来自LU2898的与酯酶具有上述同源性的DNA。

PCR条件：

5μl         10＊Taq聚合酶缓冲液

125ng       引物Breu0811

125ng       引物Breu0812

2μl         dNTP(10mM)

50ng        来自LU11147的质粒DNA

2.5μl       DMSO

添加50μL    H₂O

热启动使用：0.5U Taq-DNA聚合酶(Roche Diagnostics)

PCR温度程序：

用HindIII和XbaI限制性消化后，将PCR产物连接入适宜制备的pUC19(如New England Biolabs)中。

以此方式制备的质粒载体之后用于转化大肠杆菌XL1 blue。根据厂商信息，用连接混合物转化转化感受态大肠杆菌(Stratagene)。在IPTG/X-GalFP板(含有100μg/ml氨苄青霉素的FP培养基)上划线培养细胞，37℃温育16小时。从转化体制备质粒DNA(Birnboim et al.，Nucleic AcidsResearch，1979，7，1513)，利用HindIII和XbaI的对照限制性消化，检查该PCR产物的成功插入。

实施例11

表达截短的335AA丁炔醇酯酶

随后，使用NdeI和HindIII切割位点，将该酯酶基因克隆入载体pDHE1650(描述于WO-A-2004/050877)。

为此，首先使用以下正向和反向引物，扩增该酯酶基因：

Breu1499 TATACATATGATCGTCCAACTGATCGCCATCGTG，

Breu1500 ATTTAAGCTTTTACTGCAGCGCGCCGGCCTGCGTGACCTC

之后使用NdeI和HindIII限制性消化。将插入物连接入事先已经用相同的限制性酶(NdeI和HindIII)进行过预消化的pDHE1650载体。以相同的方式，以本发明的酯酶基因置换pDHE1650中存在的占据该位置的基因。分离两个转化体，以本身已知的方法通过DNA沉淀提取质粒。所述质粒称为pDHE1650-Est2和pDHE1615-Est4。

为了表达蛋白质，利用TSS法([Chung CT，Niemela SL和MillerRH，1989.一步制备感受态大肠杆菌：在相同溶液中转化和储存细菌细胞.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：2172-2175)，用带有酯酶基因的质粒转化大肠杆菌TG1(DSMZ No.6056)。分离单菌落，在5ml的LB/Amp/Tet/Spec/Cm培养基(＝根据Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular cloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989的LB培养基加上100μg/ml氨苄青霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml链霉素和20μg/ml氯霉素)中37℃，250rpm繁殖过夜。向补加有10ml/l痕量元素溶液的100ml的LB/Amp/Tet/Spec/Cm培养基中接种500μl过夜培养物，并在37℃和200rpm繁殖。(痕量元素溶液的组成如下：FeSO₄＊H₂O 200mg/l，ZnSO₄＊7H₂O 10mg/l，MnCl₂＊4H₂O 3mg/l，H₃BO₃30mg/l，CoCl₂＊6H₂O 20mg/l，CuCl₂＊6H₂O 1mg/l，NiCl₂＊6H₂O 2mg/l，Na₂MoO₄＊2H₂O3mg/l，Titriplex III 500mg/l)。一旦OD₆₀₀值达到0.5至0.6，用1mM L-鼠李糖诱导蛋白表达。温度降低至30℃，而转动速度保持在200rpm。过夜培养培养物。随后，离心(15min，4℃，3220g)细胞，在-20℃贮存细胞沉淀过夜。

将细胞沉淀(50ml的TB培养物)重悬在磷酸钠缓冲液(25mM，离子强度154mM，pH7.5)中，以破坏细胞。匀浆(1500bar，两下(2passages))破碎细胞。离心(30min，4℃，20817g)除去细胞碎片。将上清液上样至Protein200 Plus Labchip，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer分析蛋白质。将移出的细胞碎片重悬在8M尿素中，之后离心(30min，4℃，20 817g)以除去不溶颗粒。将清澈的上清液(膜级分)上样至Protein 200 Plus-Labchip，并利用Agilent 2100 Bioanalyzer分析蛋白质。

实施例12

制备丁炔醇酯酶(335AA)突变体

a)材料

所用的所有材料均适用于分析目的，或具有更高的品质，并购自Sigma-Aldrich Chemie，Taufkirchen，Germany，Applichem(Darmstadt，Germany)和Carl Roth(Karlsruhe，Germany)。

热循环仪(Mastercycler gradient，Eppendorf，Hamburg，Germany)和薄壁PCR管(Multi-Ultra管；0.2ml；Carl Roth)用于所有PCR实验。PCR体积在所有情况下均为50μl；通过多个50μl PCR混合物，制备更大体积。所用DNA的量通过NanoDrop光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)定量。

b)将丁炔醇酯酶基因克隆至pASK-IBA7载体中

利用如下引物扩增pASK-IBA7载体(IBA GmbH，

,Germany)(SEQ ID NO：19，用于表达具有N端Strep-标签的蛋白质的质粒)：

正向引物

5’-TTTTTGCCCTCGTTATCTAGATTT-3’(SEQ ID NO：9)

反向引物

5’-CCGGAATTCCGGTATCTAACTAAGCTTGACCTG-3’(SEQ ID NO：10)

50μl PCR混合物(95℃3min；1个循环//95℃30s，56.2℃45s，72℃7min；30个循环//72℃10min；1个循环)包含：20pmol正向引物，20pmol反向引物，每种dNTP(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)各0.2mM，150ng的pASK-IBA7质粒和2.5U Pfu DNA聚合酶(Fermentas GmbH，St.Leon-Rot，Germany)。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，通过凝胶纯化产物，在此在与上述相同的条件下扩增。凝胶纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen)后，用40U的EcoRI(New England Biolabs GmbH，Frankfurt，Germany)在100μl反应混合物中37℃消化2μg DNA产物4小时。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)PCR纯化消化后的产物。

使用以下引物扩增丁炔醇酯酶基因：

正向引物

5’-[Phos]GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3’(SEQ ID NO：11)

反向引物

5’-CCGGAATTCCGGTCACTGCAGCGCGCCGGCCTG-3’(SEQ ID NO：12)。

50μl PCR混合物(95℃2min；1个循环//95℃30s，59℃45s，72℃3min；30个循环//72℃10min；1个循环)包含：20pmol正向引物，20pmol反向引物，每种dNTP(Roche Diagnostics GmbH)各0.2mM；150ng质粒LU11147(pUC19载体，带有丁炔醇酯酶基因)，0.02％DMSO和2.5UPfu DNA聚合酶(Fermentas)。凝胶纯化(QIAquick凝胶纯化试剂盒，Qiagen)后，用40U EcoRI(New England Biolabs GmbH，Frankfurt，Germany)在100μl反应混合物中37℃消化2μg DNA产物4小时。消化后的产物利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行PCR纯化。

将该丁炔醇酯酶基因使用平端和EcoRI切割位点连接入载体。反应混合物(20μl)包含：20ng载体、120ng插入物和2U T4DNA连接酶(RocheDiagnostics GmbH)。首先室温温育反应混合物1小时，之后在冰箱中过夜温育。所得质粒称作DASK-IBA7酯酶。

c)制备第一丁炔醇酯酶突变体文库

首先利用易错PCR(95℃2min；1个循环//95℃30s，59℃45s，72℃3min；40个循环//72℃10min)扩增丁炔醇酯酶基因。使用如下引物：

正向引物：

5’-CGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAA-3’(SEQ ID NO：13)

反向引物：

5’-TTCACTTCACAGGTCAAGCTTAGTTAG-3’(SEQ ID NO：14).

反应混合物(50μl)包含：20pmol正向引物，20pmol反向引物，每种dNTP(Roche Diagnostics GmbH)各0.2mM，100ng质粒pASK-IBA7酯酶，0.02％DMSO，0.1mM MnCl₂和2.5U Taq DNA聚合酶(Qiagen)。凝胶纯化(QIAquick凝胶纯化试剂盒；Qiagen)后，用40U EcoRI(New EnglandBiolabs GmbH)和30U XbaI(New England Biolabs GmbH)双重消化4μgDNA。PCR纯化产物(QIAquick PCR纯化试剂盒；Qiagen)，之后，将产物连接入EcoRI-和XbaI-预先消化的pASK-IBA7质粒中。使用TSS法[Chung CT，Niemela SL和Miller RH，1989.一步制备感受态大肠杆菌：在相同溶液中转化和贮存细菌细胞.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：2172-2175.]，用突变体文库转化大肠杆菌XL2Blue(Stratagene，Amsterdam)。

d)表达丁炔醇酯酶突变体文库

使用牙签挑取LBamp平板(＝根据Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989的LB培养基加上10g/l琼脂和100μg/mL氨苄青霉素)上的菌落，转移至含有150μl LB_amp培养基的96孔微量滴定板。在微量板摇床(Multitron II；Infors GmbH，Einsbach，Germany；37℃，900rpm和70％湿度)上培养后，使用system Duetz(Kühner，Birsfelden，Switzerland)将每个培养物各～5μl转移至具有2ml孔的板子中，所述孔包含550μl TB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(Becton Dickinson GmbH)。在Multitron II摇床(Infors GmbH；30℃和500rpm及70％湿度)中培养克隆8小时。通过每孔加入含有2.4μg/ml无水四环素(IBA GmbH)的50μlTB，诱导蛋白质表达。在Multitron II摇床(Infors GmbH；30℃和500rpm)中再培养克隆6小时。

e)pH指示试验(96-孔格式)：

使用Multimek96-道自动移液器(Beckman Coulter，Krefeld，Germany)，将每孔的50μl TB培养物转移至96孔试验板。使用Multimek96(Beckman Coulter)，在试验板的每孔中加入100μl底物溶液(25mMNaH₂PO₄缓冲液，pH7.5，用NaCl调整至离子强度154mM，包含0.05％Triton X-100，7.5μg/ml荧光素钠和285mM丁酸丁-3-炔-2-基酯)，起始水解反应。底物溶液在使用前剧烈搅动5分钟。使用Tecan Safire(TecanGmbH，Crailsheim，Germany)观察荧光信号降低的动力学(消光485nm，发射520nm)10分钟。从起始斜率确定活性。筛选930个克隆后，鉴定到克隆8H1为改良突变体。

f)第二丁炔醇酯酶突变体文库：

除了使用8H1作为亲本基因外，在与上述完全相同的条件下，产生第二丁炔醇酯酶突变体文库。如上所述表达和筛选文库。筛选1116个克隆后，鉴定到8C9克隆是改良突变体。

g)在氨基酸位置190和263的饱和诱变：

使用如下改良的QuikChange方案(Stratagene)，在氨基酸位置190和263进行饱和诱变。对于氨基酸位置190使用如下诱变引物：

5’-GGCATCCCGATCATGNNNCTGCAAAGCCGCAAG-3’(SEQ ID NO：15)

5’-CTTGCGGCTTTGCAGNNNCATGATCGGGATGCC-3’(SEQ ID NO：16)

对于氨基酸位置263使用如下诱变引物：

5’-GGGCGCCAGGACGCGNNNCTCGATTTCCACAAG-3’(SEQ ID NO：17)

5’-CTTGTGGAAATCGAGNNNCGCGTCCTGGCGCCC-3’(SEQ ID NO：18)

50μl PCR混合物(95℃30s；1个循环//95℃30s，55℃1min，68℃4min45s；18个循环)包含：每种引物各20pmol的混合物，每种dNTP(Roche Diagnostics GmbH)各0.2mM，50ng质粒8C9(起始DNA)和2.5UPfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)。PCR后，使用40U DpnI(NewEngland Biolabs GmbH)37℃消化甲基化的和半甲基化的亲本DNA2至3小时。产物进行PCR纯化(QIAquick PCR纯化试剂盒；Qiagen)，然后使用TSS法[Chung CT，同上引文].转化大肠杆菌XL2Blue(Stratagene)。

以和上述相同的方式表达和筛选两个文库。每个文库各筛选186个克隆后，鉴定到两个克隆是改良突变体。其被命名为Est190-1B2和Est263-2D6。

h)在摇瓶中表达蛋白质

挑取新鲜转化的菌落，使用Multitron-II摇床(Infors GmbH；37℃，250rpm)，在5ml LB_amp培养基中生长过夜培养物。用所述过夜培养物800μl接种100ml TB_amp培养基，在Multitron-II摇床(Infors GmbH；37℃，200rpm)中培养。一旦OD₆₀₀值达到0.5至0.6，加入25μl无水四环素(0.2mg/ml在DMF中的贮存液)，诱导蛋白质表达。再培养培养物12小时(Multitron-II摇床，Infors GmbH；30℃，200rpm)。3220g在4℃离心30min移出细胞，测定湿细胞量。-20℃贮存细胞沉淀直至进一步表征前。

i)使用pH stat表征蛋白质：

使用pH stat(716DMS Titrino，Deutsche Metrohm GmbH&Co.，Filderstadt，Germany)测量丁炔醇酯酶的水解活性。

首先将细胞沉淀重悬于适宜体积的磷酸钠缓冲液(25mM磷酸二氢钠缓冲液，pH7.5，用NaCl调整离子强度至154mM)，以获得0.1g湿细胞量/ml的细胞浓度。预备20ml底物溶液，其包含磷酸钠缓冲液(25mMNaH₂PO₄缓冲液pH7.5，NaCl调整离子强度至154mM)，0.05％TritonX-100和350mM丁酸丁-3-炔-2-基酯。底物溶液在使用前剧烈搅动5分钟。

开始水解反应前，用1N NaOH调整底物溶液(20ml)的pH至pH7.5。通过加入0.01g湿细胞量，开始反应。在生物转化过程中用0.1N NaOH滴定，维持pH7.5。水解活性与NaOH的滴定速度(每单位时间加入的体积)相关。

结果描述在附图4中。分析了下表中所列的酶和突变体。关于氨基酸序列和核酸序列中的具体突变的信息同样可以在下表中找到。

序列表

<110>巴斯大欧洲公司

<120>具有酯酶活性的蛋白质

<130>M/47154

<160>21

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1530

<212>DNA

<213>颖壳假单胞菌(Pseudomonas glumae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1530)

<400>1

<210>2

<211>510

<212>PRT

<213>颖壳假单胞菌

<400>2

<210>3

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>部分序列

<400>3

<210>4

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>部分序列

<400>4

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>部分序列

<400>5

<210>6

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>部分序列

<400>6

<210>7

<211>1005

<212>DNA

<213>颖壳假单胞菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1005)

<400>7

<210>8

<211>335

<212>PRT

<213>颖壳假单胞菌

<400>8

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>10

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>11

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>12

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>13

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>14

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(18)

<223>n是a，c，g，或t

<400>15

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(18)

<223>n是a，c，g，或t

<400>16

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(18)

<223>n是a，c，g，或t

<400>17

<210>18

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(18)

<223>n是a，c，g，或t

<400>18

<210>19

<211>3246

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pASK-IBA7

<400>19

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>20

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>21

Claims (26)

1.具有酯酶活性的蛋白质或其功能等价蛋白质，其中所述蛋白质具有总长小于510个氨基酸的多肽链，并且其中所述链包含至少一个根据SEQID NO：3的部分氨基酸序列。

2.权利要求1的蛋白质，其中所述蛋白质具有能够通过断裂丁酸丁-3-炔-2-基酯来表征的酯酶活性。

3.根据前述权利要求之一的蛋白质，其还包含至少一个根据SEQ IDNO：4，5或6的另外的部分氨基酸序列。

4.根据前述权利要求之任一的蛋白质，其包含总长小于450或小于350个氨基酸的多肽链。

5.根据前述权利要求之任一的蛋白质，其包含总长大约335个氨基酸的多肽链。

6.根据权利要求5的蛋白质，其包含根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

7.在SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列区域12-20、185-195和258-268中的任何区域中具有至少一个功能性突变的酯酶突变体。

8.权利要求7的突变体，其在SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列位置16、190和263中的任何位置中包含至少一个功能性突变。

9.权利要求8的蛋白质，其包含以下氨基酸替代中的至少一个：Leu16Pro，Ile190Thr，Ile190Arg和Ile263Val。

10.根据前述权利要求之任一的蛋白质，其包含具有大约60kDa或更少的计算分子量的多肽链。

11.根据前述权利要求之任一的蛋白质，其中所述蛋白质可以从具有保藏号DSM 13176的颖壳假单胞菌(植物伯克霍尔德氏菌)Lu2023起始获得。

12.根据前述权利要求之任一的蛋白质，其中所述蛋白质催化至少一个以下反应：

a)式I的旋光酯的对映选择性水解，

R¹-COO-R²     (I)，

其中，

R¹是直链或支链的、任选地单或多取代的C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-链烯基、C₂-C₁₀-炔基，R²是直链或支链的、任选地单或多取代的C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-链烯基、C₂-C₁₀-炔基、C₇-C₁₅-芳烷基、或单环或多环的、任选地单或多取代的芳族基团，

R¹和/或R²包含至少一个不对称碳；和

b)式I的酯和式II的旋光醇的对映选择性酯交换，

R²-OH     (II)，

其中R²具有如上含义之一且任选地具有至少一个不对称碳。

13.编码前述权利要求之任一的蛋白质的多核苷酸及其功能等价物、其互补多核苷酸、和可以与其杂交的核酸序列。

14.权利要求13的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：7的核酸序列中至少30个连续核苷酸残基的核苷酸序列。

15.权利要求14的多核苷酸，其中相应于SEQ ID NO：8的氨基酸位置263的区域中的密码子选自GTT和GTC。

16.包含与至少一个调节核酸序列可操作连接的、至少一个权利要求13-15之任一的多核苷酸的表达盒。

17.用于转化真核或原核宿主的重组载体，其包含权利要求13至15之任一的多核苷酸或权利要求16的表达盒。

18.制备权利要求1-12之任一的蛋白质的方法，其包括培养内源性产生所述蛋白质的微生物或转化了权利要求17的载体的微生物和从培养物中分离所述蛋白质。

19.权利要求18的方法，其中微生物是具有保藏号DSM 13176的颖壳假单胞菌(植物伯克霍尔德氏菌)Lu 2023。

20.可以通过权利要求18或19的方法获得的蛋白质。

21.具有保藏号DSM 13176的颖壳假单胞菌(植物伯克霍尔德氏菌)Lu 2023及其变体和突变体。

22.微生物，其中所述微生物带有权利要求17的载体。

23.使用权利要求1至12之任一的蛋白质进行对映选择性酯水解的方法，该方法包括

a)使所述蛋白质与式I的旋光酯的立体异构体混合物接触；和

b)从反应介质中获得由所述立体异构体之任一的立体选择性水解产生的旋光化合物和/或未水解的酯对映体。

24.用于对映选择性酯交换的方法，该方法包括：

a)在权利要求1-12之任一的蛋白质存在下使式II的旋光醇的立体异构体混合物与式I的酯接触，和从反应介质中获得未反应的醇立体异构体；或

b)在权利要求1-12之任一的蛋白质存在下使式I的旋光酯的立体异构体混合物与式II的醇接触，和从反应介质中获得包含在所述酯中的旋光醇的立体异构体。

25.权利要求24的方法，其包括在酯交换中使用乙烯基酯作为旋光醇的酰化剂。

26.权利要求23-25之任一的方法，其包括使用有机溶剂作为反应介质。

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