JP2012228257A - エステラーゼ活性を有するタンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Pseudomonas glumae(Burkholderia plantarii)LU 2023から出発して得られる前記タンパク質を生産する方法およびそれらの酵素的、特にエナンチオ選択的エステ加水分解または有機エステルのエステル交換に対する使用。
【選択図】なし
Description
本発明の第一の主題は、エステラーゼ活性を有するタンパク質またはその機能的に等価なタンパク質であって、前記タンパク質が510個未満のアミノ酸の全長をもつポリペプチド鎖を有しかつ前記鎖が少なくとも1つの配列番号3に記載の部分配列を含む前記タンパク質に関するものであり、前記タンパク質は好ましくは、参照基質としてのエステル、酪酸ブタ-3-イン-2-イルの切断により特徴付ることができるエステラーゼ活性を持つ。
a)FIETLGLERPVLVGHSLGGAIALAVGLDYPER(配列番号3)、
b)IALIAPLTHTETEP(配列番号4)、
c)GGGMMGLRPEAFYAASSDLV(配列番号5)、および
d)AIDAIFAPEPV(配列番号6)
本発明のタンパク質は特に、全長450個未満、例えば300〜445個のアミノ酸(例えば350個未満のアミノ酸、特に300〜345個、特に約330〜340個、とりわけ335個のアミノ酸)を有するポリペプチド鎖を含む。
a)式I:
R1-COO-R2 (I)
[式中、R1は直鎖または分枝鎖の、任意に一置換または多置換されたC1〜C10-アルキル、C2〜C10-アルケニル、C2〜C10-アルキニルであり、そしてR2は直鎖または分枝鎖の、任意に一置換または多置換されたC1〜C10-アルキル、C2〜C10-アルケニル、C2〜C10-アルキニル、C7〜C15-アラルキル、または単環または多環の、任意に一置換または多置換された芳香族基であり、そしてR1および/またはR2は少なくとも1個の不斉炭素を含む]で表わされる光学活性エステルのエナンチオ選択的加水分解;および
b)式Iのエステルと式II:
R2-OH (II)
[式中、R2は上記の意味の1つを有し、任意に、少なくとも1個の不斉炭素を有する]で表わされる光学活性アルコールとのエナンチオ選択的エステル交換
の両反応のうちの少なくとも1つの反応を触媒する。
a)前記タンパク質を、式Iで表される光学活性エステルの立体異性体混合物と接触させるステップ;および
b)前記立体異性体のいずれかの立体選択的加水分解により生成する光学活性化合物および/または加水分解されないエステルエナンチオマーを反応媒体から取得するステップを含んでなる前記方法に関する。
a)式IIで表される光学活性アルコールの立体異性体混合物を、前記タンパク質(機能的等価体および突然変異体を含む)の存在下に、式Iで表されるエステルと接触させ、未反応のアルコール立体異性体を反応媒体から取得するステップ;または
b)式Iで表される光学活性エステルの立体異性体混合物を、前記タンパク質(機能的等価体および突然変異体を含む)の存在下に、式IIで表されるアルコールと接触させ、前記エステルに含まれる光学活性アルコールの立体異性体を反応媒体から取得するステップを含んでなる前記方法に関する。
「エステラーゼ」または「ブチノールエステラーゼ」または「ブチノールIエステラーゼ」は、本明細書に記載した酵素性変換の少なくとも1つ、特に少なくともカルボン酸、特に酪酸の参照ブチノールエステル、例えば酪酸ブタ-3イン-2イルなどのブチノール酪酸エステルの切断を触媒する酵素である。
マルチプル・アラインメント・パラメーター:
ギャップ・オープニング・ペナルティ 10
ギャップ・エキステンション・ペナルティ 10
ギャップ分離ペナルティ範囲 8
ギャップ分離ペナルティ オフ
アラインメント遅れに対する%同一性 40
残基特異的ギャップ オフ
親水残基ギャップ オフ
トランジション重み付け(Transition weighing) 0
ペアワイズ・アラインメントパラメーター:
FASTアルゴリズム オン
K-tuple サイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウインドウサイズ 5
最良対角数(Number of best diagonals) 5
を設定して比較することにより計算した同一性を意味する。
3.1 本発明によるタンパク質
本発明は、具体的に開示したエステラーゼ活性を有するタンパク質および酵素に限定されるものでなく、その機能的等価体も包含する。
本発明のエステラーゼの機能的等価体のさらなる例には、例えば、配列番号3、4、5または6から誘導された少なくとも1つの部分配列であって、1個以上のアミノ酸が具体的に示した部分配列と比較して置換、欠失、逆転または付加されていて、かつ天然のタンパク質のエステラーゼ活性と±90%または±50%以下、好ましくは±30%以下しか異ならないエステラーゼ活性を有する前記部分配列が含まれる。
本発明はさらに、エステラーゼ活性をもつ酵素をコードする核酸配列に関する。配列番号7による配列を含む核酸配列;または配列番号8によるアミノ酸配列から誘導される核酸配列が好ましい。
本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝子制御のもとで、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物;ならびにこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むベクターに関する。
状況に応じて、用語「微生物」は出発微生物(野生型)または遺伝的に改変した組換え微生物またはそれらの両方を意味する。
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドまたはその機能的な生物学的活性断片を遺伝子組換え生産する方法であって、ポリペプチド産生微生物を培養し、適宜、ポリペプチドの発現を誘導し、そしてポリペプチドを培養物から単離することによる前記方法に関する。ポリペプチドはまた、所望であれば、この方法で工業的規模で生産することもできる。
本発明はまた、エステラーゼを用いるエナンチオ選択的エステル加水分解法にも関し、この方法は、本発明のエステラーゼを、式Iで表される光学活性エステルの立体異性体混合物と接触させ、2種の立体異性体のいずれかの立体選択的加水分解により生成する光学活性化合物および/または加水分解されないエステルエナンチオマーを反応媒体から取得する。しかし、該エステラーゼは、光学的に活性でない式Iのエステルを加水分解することも可能である。
特に断らない限り、本発明の範囲内で行ったクローニングのステップ、例えば、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、核酸のニトロセルロースおよびナイロン膜への転移、DNA断片の連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖、および組換えDNAの配列分析は、Sambrookら(1989、前記引用)に記載の通り行った。
このスクリーニングの開始点は、リパーゼ産生株であるPseudomonas (Burkholderia) glumae LU 8093であった。この菌株から得られたリパーゼにより、いくつかの興味深い反応を実施することができる(Balkenhohl, F. et al., J. prakt. Chem. 339, (1997), 381-384)。しかし、乳酸エステル、メチル酪酸エステルおよびフェニル酢酸エステルはこのリパーゼの基質ではなく、この菌株はこれらのエステルをどうしても加水分解することができない。
エステラーゼを得るために、Pseudomonas glumae LU 2023を14Lのスケールで培養し、活性バイオマスを収穫した。
温度 28℃
空気供給量 7 L/分
攪拌 600rpm
発酵実施時間 約24時間
内蔵pHおよびpO2の測定
前培養および主培養用の培地
Springer酵母自己分解物質65% 15 g/l
硫酸マグネシウム×7水 1.6 g/l
塩化カルシウム×2水 0.02 g/l
リン酸二水素カリウム 3.5 g/l
リン酸水素二カリウム 3.5 g/l
リン酸水素二アンモニウム 5 g/l
Pluriol P2000消泡剤 6 ml
上記の成分を脱イオン水に溶解し、この溶液を25%濃度のアンモニア水を用いてpH6.5に調整した。5 ml/lの微量元素溶液および2 g/lグルコースを別々に滅菌濾過した。
Pseudomonas glumae LU 2023細胞(100 ml、湿重量:50 g)を4℃、3000rpmでガラスビーズミル(100mlのガラスビーズ、直径:0.5mm)で溶解した。遠心分離(10,000rpm、30分)して、ガラスビーズを洗浄した後、上清(300ml)を塩化マンガン沈降(pH7〜7.5;最終濃度:50mM)に付した。もう一回遠心分離した後、上清をpH8.0に調整し、EDTAを50mMの濃度で添加した。この容量をQ−Sepharose(300ml)クロマトグラフィーで精製した。サンプルをアプライした後、カラムを50mMトリス/HClで洗浄した。対象となる画分を集めて、限外濾過(100 kDa)により濃縮した。モレキュラーシーブ・クロマトグラフィー(直径:5cm、高さ:90cm;材料:S−300)にかけて非特異的エステラーゼからブチノール加水分解性エステラーゼを分離した。得られた活性画分は濁っており、再度濃縮した。このエステラーゼは明らかに膜と結合していた。次いで、膜画分をまずプロテアーゼ(トリプシン、重量比:1:50から1:100)で消化した。この操作により、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動において2,3のバンドを別にすれば、膜画分から全タンパク質が消失した。活性は保存されていた。前記バンドを未変性ゲル電気泳動(0.04%のSDS)で互いに分離し、活性アッセイにより未変性ゲル中のエステラーゼを同定した。前記エステラーゼをゲルから溶出した後に、変性SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたところ、きれいな1本のバンドとして現れた。
様々な方法を固定化のために用いた。
手順(標準手法)
100単位のエステラーゼを、リン酸バッファー(200ml、10mM、pH7.4)中で20mmolのブチノール酪酸エステル(酪酸1-メチルプロパ-2-イニル)と攪拌しながら反応させた。pHを連続測定して、水酸化ナトリウム溶液の添加により約pH 7.4に維持した。表1に示した時間にサンプルを採取し、メチルt-ブチルエーテル(MTBE)で2回抽出し、有機相をGC(Chiraldex GTA)により分析した。エステラーゼを膜濾過により反応混合物から分離した。
標準手法
100単位のエステラーゼを、リン酸バッファー(200ml、10mM、pH7.4)中で20mmolのブチノールエステルと攪拌しながら反応させた。pHを連続的に測定し、連続滴定によりpH 7.0に維持した。サンプルを採取し、メチルt-ブチルエーテル(MTBE)で2回抽出し、有機相をGC(Chiraldex GTA)により分析した。
ラセミ体分割の品質と反応速度は、酸部分の大きさおよび疎水性に依存した。ブチノールエステラーゼの最良の基質は、ブチノールの酪酸エステルとブチノールのメチル酪酸エステルであった。リパーゼはこれらの基質には不活性である。このことは、n-デカン酸ブチニルのような長鎖エステルにも当てはまる。
10mmolのrac-ブチノールと5mmolの酪酸ビニルを50mlのメチルt-ブチルエーテル(MTBE)に溶解し、ケイソウ土に担持された9単位のブチノールIエステラーゼ(3.3g)と混合し、この混合物を室温で24時間振とうした。濾過後、溶媒を除去し、生成物の混合物をGCにより特徴づけた。
a)染色体DNAの取得:
LU2023(前記実施例1および2を参照)を100mlのFP培地(Becton Dickinson GmbH)で28℃および180rpmにて24時間増殖した。細胞を遠心分離(2000rpm/5分間)によって収穫し、5mlの溶解バッファー1(0.41Mスクロース、0.01M MgSO4 *7H2O、50ml/L M12培地(10×conc.)、10ml/L 10%KH2PO4 pH 6.7、2.5 mg/mlリゾチーム[使用の直前に加える])に再懸濁し、そして37℃にてほぼ4時間インキュベートした。遠心分離(2000rpm/20分間)の後、得られるプロトプラストを、5mlのリゾチームを含まない溶解バッファー1で洗浄(2000rpm/20分間)し、10mM TRIS-HCl pH8.0に再懸濁した。
1μgの染色体DNAを120U PstIを用いて37℃にて180分間消化した。0.4μgのpUC19(例えば New England Biolabs)を160UのPstI(37℃にて1時間)により制限酵素切断し、次いでアルカリホスファターゼ(37℃にて1時間+不活性化(65℃にて15分間))により脱リン酸した。DNA断片をラピッドライゲーションキット(Roche)を用いて連結した(2時間、室温にて)。ライゲーション混合物を、製造業者の情報に従って形質転換コンピテント大腸菌(Stratagene)中に形質転換した。細胞をIPTG/X-Gal FPプレート(100μg/mlアンピシリンを含有するFP培地)にストリーク接種し、37℃にて16時間インキュベートした。白色のコロニーをアンピシリンを含有する新しいFPプレートにストリーク接種した。
コロニーを、無菌ベルベットクッションを用いてWhatman濾紙に移した。フィルターを2.5mlのアッセイ溶液(10mM TRIS*HCl、pH7.5、0.01%ブロモクレゾール・パープル、0.1%ラセミエステル[rac-乳酸メチル(MEE)またはrac-メチル酪酸エチルまたはrac-フェニル酢酸エチル])中に置いた。エステラーゼ活性をもつ細胞のコロニーは青色から黄色へ5分間以内に変色する。試験した2900個のコロニーのなかで、強い変色を生じるものが1つあった。この菌株をLU2898と名付けた。図2はLU2898のクローニング計画を表す模式図である。
LU2898から得たプラスミドは7.7kbインサートを有する。大腸菌LU2898のブチノールエステラーゼ遺伝子を保有するプラスミドを完全に配列決定した。DNAデータベースの最初の検索は、加水分解酵素と相同性を有するインサートをもつオープンリーディングフレーム(位置1394〜2923)を生じた。
次のPCRプライマーを設計するためにLU2898由来のプラスミドの配列データを利用した。
Breu0811: GGCGAGAAGCTTAGAAATCATGATCGTCCA (配列番号20)
XbaI
Breu0812: GGATCCTCTAGAGTCTCACTGCAGCGCGCC (配列番号21)
これらのオリゴヌクレオチドを用いてPCRを使い、以上記載した相同性をエステラーゼに対して有するLU2898由来のDNAを増幅した。
10*Taqポリメラーゼバッファー 5μl
プライマーBreu0811 125ng
プライマーBreu0812 125ng
dNTP(10mM) 2μl
LU11147由来のプラスミドDNA 50ng
DMSO 2.5μl、および
H20 50μ
Taq-DNAポリメラーゼ(Roche Diagnostics)0.5Uを加えてホットスタート。
5分間、95℃,
45秒、55℃,
3分間、72℃、(30サイクル)
30秒、95℃、
45秒、55℃,
10分間、72℃,
∞、4℃
HindIIIとXbaIによる制限酵素切断の後、PCR産物を、適当に調製したpUC19(例えばNew England Biolabs)中にライゲートした。
次いでエステラーゼ遺伝子をベクターpDHE1650(WO-A-2004/050877に記載)中にNdeIとHindIII切断部位を用いてクローニングした。
Breu1499 TATACATATGATCGTCCAACTGATCGCCATCGTG、
Breu1500 ATTTAAGCTTTTACTGCAGCGCGCCGGCCTGCGTGACCTC
を用いて増幅し、次いでNdeIとHindIIIを用いて制限酵素切断を行った。インサートを、同じ制限酵素(NdeIとHindIII)により予め消化しておいたpDHE1650ベクター中にライゲートした。同じ方法で、pDHE1650中に存在する場所ホルダー遺伝子を本発明のエステラーゼ遺伝子と置き換えた。2つの形質転換体を単離し、プラスミドを公知の方法でDNA沈降により抽出した。前記プラスミドをpDHE1650-Est2およびpDHE1615-Est4と名付けた。
a)材料
使用した全ての化学品は分析用に好適であるかまたはより高品質であって、Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany, Applichem(Darmstadt, Germany)およびCarl Roth(Karlsruhe、Germany)から購入したものである。
pASK-IBA7ベクター(IBAGmbH、Goettingen、Germany)(配列番号19、N-末端Strep-タグによるタンパク質発現用のプラスミド)を次のプライマー:
フォワードプライマー
5'-TTTTTGCCCTCGTTATCTAGATTT-3'(配列番号9)
リバースプライマー
5'-CCGGAATTCCGGTATCTAACTAAGCTTGACCTG-3'(配列番号10)
を用いて増幅した。
フォワードプライマー
5’-[Phos]GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3’(配列番号11)
リバースプライマー
5’-CCGGAATTCCGGTCACTGCAGCGCGCCGGCCTG-3’(配列番号12).
を用いて増幅した。
ブチノールエステラーゼ遺伝子を最初にエラープローンPCR(95℃ 2分間;1サイクル//95℃ 30秒、59℃ 45秒、72℃ 3分間;40サイクル//72℃ 10分間)を用いて増幅した。次のプライマー:
フォワード プライマー:
5’-CGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAA-3’ (配列番号13)
リバース プライマー:
5’-TTCACTTCACAGGTCAAGCTTAGTTAG-3’ (配列番号14).
を用いた。
LBampプレート(=Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989によるLB培地+10g/l寒天および100μg/mアンピシリン)上のコロニーを、つまようじを用いて拾い、150μlのLBamp培地を含有する96ウエルのマイクロタイタープレートへ移した。マイクロプレート振とう機(Multitron II; Infors GmbH、Einsbach、Germany;37℃、900rpmおよび70%湿度)で培養した後、ほぼ5μlの各培養物をDuetzシステム (Kuehner, Birsfelden, Switzerland) を用いて、550μlのTB培地と100μg ml アンピシリン (Becton Dickinson GmbH)を含有する2mlウエルのプレートへ移した。クローンを、Multitron II振とう機(Infors GmbH;30℃および500rpmおよび70%湿度)で8時間培養した。タンパク質発現を、2.4μg/ml無水テトラサイクリン(IBA GmbH)を含む50μl TBを各ウエルに加えることにより誘導した。クローンをさらに6時間、Multitron II振とう機(Infors GmbH; 30℃および500 rpm)で8時間培養した。
各ウエルからの50μl TB培養物を96-ウエルアッセイプレートに、Multimek 96-チャネル自動ピペッター(Beckman Coulter、Krefeld、Germany)を用いて移した。アッセイプレートの各ウエルにMultimek 96(Beckman Coulter)を用いて、100μlの基質溶液(25mM NaH2PO4 バッファー、pH 7.5、NaClにより調節してイオン強度154mM、0.05% Triton X-100、7.5μg/mlフルオレセイン-ナトリウムおよび285mM酪酸ブタ-3-イン-2-イルを含む)を加えることにより加水分解反応を開始した。使用前に5分間、基質溶液を激しく攪拌した。フルオレッセンス・シグナル(吸光485nm、発光520nm)の低下の反応速度を、Tecan Safire (Tecan GmbH、 Crailsheim、Germany)を用いて10分間観察した。活性を初期スロープから決定した。930クローンのスクリーニング後、クローン8H1が改良された突然変異体であると同定した。
第2のブチノールエステラーゼ突然変異体ライブラリーを、8H1を親遺伝子として用いたことを除くと、以上の記載と正確に同じ条件下で作製した。ライブラリーを以上のように発現し、スクリーニングした。1116クローンのスクリーニング後、クローン8C9が改良された突然変異体であると同定した。
アミノ酸位置190および263の飽和突然変異誘発を、次の改変QuikChangeプロトコル(Stratagene)を用いて実施した。アミノ酸位置190に対しては次の突然変異誘発プライマー:
5’-GGCATCCCGATCATGNNNCTGCAAAGCCGCAAG-3’ (配列番号15)
5’-CTTGCGGCTTTGCAGNNNCATGATCGGGATGCC-3’ (配列番号16)
を用いた。アミノ酸位置263に対しては次の突然変異誘発プライマー:
5’-GGGCGCCAGGACGCGNNNCTCGATTTCCACAAG-3’ (配列番号17)
5’-CTTGTGGAAATCGAGNNNCGCGTCCTGGCGCCC-3’ (配列番号18)
を用いた。
一晩培養物を5 mlのLBamp 培地中でMultitron-II振とう機(Infors GmbH; 37℃、250 rpm)を用いて新しく形質転換したコロニーを拾うことにより増殖した。100mlのTBamp培地に800μlの前記一晩培養物を接種し、Multitron-II振とう機(Infors GmbH;37℃、200rpm)中で培養した。0.5〜0.6のOD600値に達すると、タンパク質発現を25μlの無水テトラサイクリン(DMF中の0.2 mg/mlのストック溶液)を加えることにより誘導した。培養物をさらに12時間増殖した(Multitron-II振とう機、Infors GmbH; 30℃、200 rpm)。細胞を遠心分離(3220 gおよび4℃にて30 分間)により取り除き、湿細胞塊を測定した。細胞ペレットを-20℃にて保存して、さらなる特徴付けを行った。
ブチノールエステラーゼの加水分解活性を、pHスタット(716 DMS Titrino、Deutsche Metrohm GmbH & Co.、Filderstadt、Germany)を用いて測定した。
Claims (26)
- エステラーゼ活性を有するタンパク質またはその機能的に等価なタンパク質であって、前記タンパク質が510個未満のアミノ酸の全長をもつポリペプチド鎖を有しかつ前記鎖が少なくとも1つの配列番号3に記載のアミノ酸部分配列を含む前記タンパク質。
- エステル、酪酸ブタ-3-イン-2-イルの切断により特徴付けることができるエステラーゼ活性をもつ、請求項1に記載のタンパク質。
- 少なくとも1つのさらなる、配列番号 4、5または6に記載のアミノ酸部分配列をさらに含む、請求項1または2に記載のタンパク質。
- 全長が450個未満または350個未満のアミノ酸のポリペプチド鎖を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 全長が約335個のアミノ酸のポリペプチド鎖を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 配列番号8に記載のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載のタンパク質。
- 配列番号2または8のアミノ酸配列領域12〜20、185〜195および258〜268のいずれかに少なくとも1つの機能的突然変異を有する、エステラーゼ突然変異体。
- 配列番号2または8のアミノ酸配列の16、190および263位のいずれかに少なくとも1つの機能的突然変異を含む、請求項7に記載の突然変異体。
- 次のアミノ酸置換:Leu16Pro、Ile190Thr、Ile190ArgおよびIle263Valの少なくとも1つを含む、請求項8に記載のタンパク質。
- 約60kDa以下の計算分子量を有するポリペプチド鎖を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 受託番号DSM 13176をもつPseudomonas glumae (Burkholderia plantarii) LU 2023から出発して得られる、請求項1〜10のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 次の反応:
a)式I:
R1-COO-R2 (I)
[式中、R1は直鎖または分枝鎖の、任意に一置換または多置換されたC1〜C10-アルキル、C2〜C10-アルケニル、C2〜C10-アルキニルであり、そしてR2は直鎖または分枝鎖の、任意に一置換または多置換されたC1〜C10-アルキル、C2〜C10-アルケニル、C2〜C10-アルキニル、C7〜C15-アラルキル、または単環または多環の、任意に一置換または多置換された芳香族基であり、R1および/またはR2は少なくとも1個の不斉炭素を含む]
で表わされる光学活性エステルのエナンチオ選択的加水分解;および
b)式Iのエステルと式II:
R2-OH (II)
[式中、R2は前記の意味の1つを有し、任意に、少なくとも1個の不斉炭素を有する]
で表わされる光学活性アルコールとのエナンチオ選択的エステル交換
の両反応のうちの少なくとも1つの反応を触媒する、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質およびまたその機能的等価体をコードするポリヌクレオチド、それらと相補的なポリヌクレオチド、ならびにそれらとハイブリダイズしうる核酸配列。
- 配列番号7に記載の核酸配列中の少なくとも30個の連続ヌクレオチド残基のヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号8のアミノ酸の263位に対応する領域のコドンがGTTおよびGTCのなかから選択される、請求項14に記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの調節核酸配列と機能しうる形で連結された請求項13〜15のいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現カセット。
- 真核生物のまたは原核生物の宿主を形質転換するための組換えベクターであって、請求項13〜15のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項16に記載の発現カセットを含む前記組換えベクター。
- 前記タンパク質を内因的に産生する微生物または請求項17に記載のベクターを用いて形質転換した微生物を培養するステップ、および前記タンパク質を該培養物から単離するステップを含んでなる、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質を調製する方法。
- 微生物が受託番号DSM13176をもつPseudomonas glumae(Burkholderia plantarii)LU2023である、請求項18に記載の方法。
- 請求項18および19のいずれか1項に記載の方法により得ることができるタンパク質。
- 受託番号DSM13176をもつ微生物Pseudomonas glumae(Burkholderia plantarii)LU2023ならびにその変異体および突然変異体。
- 請求項17に記載のベクターを保有する微生物。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質を用いるエナンチオ選択的エステル加水分解法であって、
a)前記タンパク質を、式Iで表される光学活性エステルの立体異性体混合物と接触させるステップ;および
b)前記立体異性体のいずれかの立体選択的加水分解により生成する光学活性化合物および/または加水分解されないエステルエナンチオマーを反応媒体から取得するステップを含んでなる前記方法。 - エナンチオ選択的エステル交換法であって、
a)式IIで表される光学活性アルコールの立体異性体混合物を、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質の存在下に、式Iで表されるエステルと接触させ、未反応のアルコール立体異性体を反応媒体から取得するステップ;または
b)式Iで表される光学活性エステルの立体異性体混合物を、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質の存在下に、式IIで表されるアルコールと接触させ、前記エステルに含まれる光学活性アルコールの立体異性体を反応媒体から取得するステップを含んでなる前記方法。 - エステル交換のために、ビニルエステルを光学活性アルコールに対するアシル化剤として用いるステップを含んでなる、請求項24に記載の方法。
- 有機溶媒を反応媒体として用いることを含んでなる、請求項23〜25のいずれか1項に記載の方法。
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