CN101495864B - Ctl和nk功能性选择的细胞的诊断和治疗应用 - Google Patents

Ctl和nk功能性选择的细胞的诊断和治疗应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了基于使用由于能够在靶细胞中诱导裂解作用而被选择出的效应细胞(例如CTL和NK细胞)的新型治疗和诊断方法。具体地，本发明教导如何按照它们的裂解特性选择免疫系统效应细胞株。本发明还教导了如何能够通过考虑所显示的内容来改进用于检查治疗疫苗活性的诊断程序。最后，显示了如何通过利用该方法改进目前使用的细胞治疗法。

Description

CTL和NK功能性选择的细胞的诊断和治疗应用
发明领域
本发明提议了基于使用效应细胞(例如CTL和NK细胞)的新型治疗和诊断方法，所述效应细胞是由于能够在靶细胞中诱导裂解作用而被选择出的。具体地，本发明教导如何基于它们的裂解特性而选择免疫系统效应细胞株系。本发明还教导了如何能够通过考虑所显示的内容来改进用于检查治疗疫苗活性的诊断程序。最后，还显示了如何能够利用该方法来改进目前使用的细胞治疗法。
应该注意，在此和以下，通过术语“效应细胞”或，更一般地，通过术语“效应器”应理解为意指对“靶”粒子起作用的粒子(细胞或属微生物体)，依次定义为这样的细胞或属微生物体，在所述细胞或属微生物体上表达由效应器诱导的修饰。
技术状况
免疫系统的一些重要工作特性是由被认为“稀少的”细胞组的作用所决定的。在这种情形中，“稀少的”应该理解为意指在已知亚群中具有千分之一或更小的频率的细胞亚群。例如，已知疾病诸如肿瘤疾病的进程能够通过在具有恰当特征的靶细胞中具有诱导裂解作用特性的免疫系统细胞亚组来进行对比。同样已知所述效应细胞是稀少的，因此该作用如果不通过恰当的治疗方法进行刺激，则不是非常有效的。
在治疗领域中，现在通过与通过“处于极限的”稀释进行的克隆选择相结合的预-纯化分离CTL和NK细胞(10)。这些策略，即使它们是有效的并已经达到了应用成功的要求，但是，是复杂、漫长和昂贵的。此外，克隆选择策略不一定总是能够起作用的，因为在许多情形中，待攻击的靶细胞(例如属于肿瘤)的受体的特征是未知或仅部分已知的。
在这点上，
1.已知在肿瘤-特异性肽是已知的情形中，预选择肿瘤-特异性CTL群体是可能的，且已经记述在治疗方案中(11)；
2.已知在大多数情形中，赘生性细胞-特异性CTL以1/1000-10,000的数量级存在于患者中(12)；
3.可能利用免疫学技术分离能够在其中识别肿瘤-特异性CTL的CTL群体(13)；
4.能够在体外扩增单CTL，从而产生可用于下列生物化学分析的同源群体(14)，并且如果为了肿瘤的免疫治疗，以高效方式扩增，则它们应该维持对恶性细胞的特异性(15)；
5.完全与CTL分离类似的策略可以应用于能够在靶细胞中诱导裂解作用的其它效应细胞；
6.CTL(和类似的效应细胞)在免疫疗法中的应用不限于肿瘤的治疗，而是能够涉及其它病理学，其中包括病毒病理学(例如AIDS)和由于细菌感染的病理学。
针对CTL进行的考虑也延伸到NK细胞，首先目前实现了NK细胞的应用，其条件是NK细胞在肿瘤细胞中特别活跃地诱导裂解作用(16)。
根据这些考虑，容许以合理的时间和有效方法选择对靶细胞是高度裂解性的CTL克隆的方法在治疗范围中是非常重要的。
发明概述
本发明教导用于通过实时监测和量化靶细胞(例如肿瘤细胞)的裂解而功能性选择免疫系统细胞的方法，所述靶细胞的裂解是由T-细胞毒性淋巴细胞(CTL)(1)和能够在恰当的细胞靶点中诱导裂解的其它细胞(典型地，天然杀伤细胞NK)(2)介导的。该方法基于创新的CTL活性分析测定和其它具有比当前可用的那些更高能力的溶胞细胞。因此，本发明在诊断部门具有直接应用。此外，认为该方法是用于分离具有高活性的效应细胞(典型地，CTL或NK)克隆的有效策略。因此，本发明在治疗部门具有重要应用。
具体地，本发明涉及用于选择预先从人类收集的、特别有效用于获得肿瘤患者疾病状态的诊断/预后检查的重要信息的免疫系统细胞的方法，所述方法包括下列步骤：a)允许预先收集的免疫系统细胞与各种靶粒子相互作用，由于所述相互作用引起的所述靶粒子的修饰是免疫系统细胞所需特性的指示；b)检查所述相互作用对所述靶粒子的作用；和c)在经历了与所述靶粒子相互作用的免疫系统细胞中，选择在靶粒子中诱导了所述修饰、因此作为效应细胞对其起作用的那些。
此外，按照本发明的方法还能够包括扩增在步骤c)结束时选择出的免疫系统细胞的步骤，从而创建上述选择的抗肿瘤效应器克隆，所述抗肿瘤效应器是通过裂解机制的特殊效力从单核细胞的异种群体(循环或“停留”在引流淋巴区域中)中选择的。
按照本发明的另一个方面，扩增步骤是通过连续的阶段进行的，在可能不稳定克隆群体的离体扩增过程中，在一个阶段和下一个阶段之间进行具有最佳特征的效应器的再选择，特别地对至少一个所述可能不稳定的克隆群体重复步骤a)、b)和c)。
本发明还涉及上述方法用于制备包括处于载体中的免疫系统细胞和/或它们的克隆的药物的应用，所述免疫系统细胞是经过步骤a)、b)和c)选择的，所述载体适合于以治疗为目的的体内再输注，所述体内再灌输可能发生在用树突细胞刺激后。
最后，本发明涉及小型化装置的应用，所述装置容许在不改变效应细胞和靶细胞的生物学活性的条件下，操作效应细胞和靶细胞，从而进行效应细胞的选择和用于制备上文指出的类型的药物，本发明还涉及选择的和扩增的裂解性效应细胞制备用于治疗病理的药物的应用，所述病理能够通过体内再输注所选择和扩增的裂解性效应细胞进行治疗，所述应用的特征在于所述药物仅包括预先选择的效应细胞和/或预先选择的效应细胞的克隆，所述预先选择的效应细胞和/或所述预先选择的效应细胞的克隆全部具有基本相似的裂解活性。
附图简述
图1.A：指向击中靶点肿瘤细胞(绿色箭头)的CTL替换(3CTL：红色箭头)。B：CTL和靶细胞复合体。
图2.CTL(黑色箭头)和一种靶细胞(绿色箭头)的相互作用：靶细胞处于晚期裂解状态。
图3.A：靶细胞的裂解动力学。B：非预-活化的CTL。
图4.A：通过在Cr51释放测定中的裂解％测量的钙荧光素对CTL裂解活性的影响。在黑色柱形图中，报告了存在(左侧)或不存在(右侧)钙荧光素的条件下，靶LCL(B35，负载了EBV肽)的特异性裂解；在白色柱形图中，报告了由没有负载肽的LCL代表的对照。B.甘露糖醇缓冲液对CTL裂解活性的影响(Cr51释放测定)。在黑色柱形图中，报告了在含有甘露糖醇的缓冲液(左侧)中或在标准缓冲液(RPMI；右侧)中靶LCL的特异性裂解；在白色柱形图中，显示了由没有负载肽的LCL代表的对照。
图5.在
Figure G2007800214954D0004145228QIETU
上，检测在DEP替换和负载钙荧光素后，在甘露糖醇缓冲液中负载了EBV肽的靶LCL的特异性溶胞。A-D图：检测了10’和20’后，由HPV-特异性CTL引起的HPV-阳性LCL的裂解；图E-H：相反，EBV-特异性CTL不裂解没有负载所述肽的LCL。
图6.报告的数据是三次试验的平均值，其中随着时间的推移检测到荧光信号(钙荧光素)的减少，其原因在于在标准缓冲液(RPMI)中共-培养15’(图B)或30’(图C)后，由特异性CTL引起的负载EBV肽的LCL-B35的裂解。平行对照检测(A中的白色柱形图；C中的空心符号)显示裂解是特异性的；事实上，如果LCL没有负载EBV肽，则不存在；在这种情形中，信号强度随着时间的减少是最小的。
详述
为了分析CTL活性，目前最普遍使用的方法基于来自裂解的细胞中的Cr51释放(3)。近期调整了基于非-放射活性铕(Eu3+)的释放(4)、荧光标记(例如钙荧光素)的释放(5)、酯酶活性分析、膜联蛋白V或β-半乳糖苷酶的应用的其他方法。基于阻抗电子分析的其他方法也由Acea生物科学(Acea Biosciences)实现了商业化，这容许了实时检查对由免疫系统细胞诱导的细胞聚集物的裂解作用(6，7)。
这些方法学遭受一些重要的缺点。在一些情形中，它们基于放射性分子的使用(3)，并且总是测定“平均”结果而非处于单细胞水平(4，5)。当能够使用FACS(荧光激活细胞分选仪)分析(8)时，需要相当大数量的细胞和复杂且昂贵的仪器。在所有这些分析中，实时评估不可能是有效的。
鉴于这些考虑，一种通过将所述在单细胞或高度裂解性克隆水平的分析扩展到靶细胞而容许以实时并以有效方法监测由效应细胞(例如CTL)介导的细胞裂解的方法确实在诊断和治疗范围中是非常重要的。
在这点上，
1.已知能够利用不同的超活染料对CTL靶细胞进行染色，如果所述靶细胞被裂解和/或受损，则所述超活染料中的一些能够被释放到细胞外(钙荧光素(5)属于这些超活染料)；
2.已知能够利用不同的超活染料对CTL靶细胞进行染色，所述超活染料识别复合体结构(线粒体、细胞核等)，并且即使所述细胞受损，所述超活染料也不能被释放到细胞外(9)；
3.适宜的数据处理程序和成像方案能够用于以自动化方式量化出现确定特征的细胞百分比的目的。
关于实时细胞操作，该工艺学近期提供了一些工艺。例如，镊子激光容许创建光学笼(optical cage)，所述光学笼能够容纳细胞，并且通过移动该笼使细胞彼此接触(17)。还已知基于介电电泳(DEP)的芯片上实验室(Lab-on-a-chip)装置能够非常有效地用于以程序性方式替换生物学项目(18-21)。特别地，由点阵-电极组成的装置能够操作单细胞或单细胞分组。
基于点阵-电极的芯片上实验室的实例显示在(21)中。基于本发明，存在操作CTL、NK和靶赘生性细胞的实时方法学的应用，并且其还能够替换单细胞，这是为了开发首先为了识别以及然后分离高度细胞毒性的CTL并且由此能够用于通过免疫治疗策略治疗赘生性病理学的有效方法的目的。
试验过程
在用埃巴病毒(EBV)毒株B95.8感染人B淋巴细胞后，获得了类淋巴母细胞细胞系(LCL)(26)。使用EBV-特异性肽HPVGEADYFEY(HPV)，其对应于EBNA1蛋白的aa 407-417进行刺激。以3.5x106细胞/孔的浓度，将来自HLA-B35供体的外周血(PBL)的淋巴细胞涂布到在培养基RPMI1640，10％FCS(Hyclone)中的24-孔平板中，并用HPV肽(10μM)进行刺激。7和14天后再次刺激培养物，并且对培养基增补10U/ml rIL-2(Chiron)。在第14和21天，利用合适的细胞毒性测定(51Cr-释放)，通过CTL活性分析T-细胞培养物(3)。
对获得的结果的评论
该研究的结果显示在图1-6中报告的实施例中。提供实施例是为了例证的目的，而非意欲以任何方式限制本发明的范围。在图1中，报告了三种CTL(红色箭头)的替换，所述三种CTL通过产生在该图右侧显示的复合体，而指向击中单一的靶点肿瘤细胞，其中CTL以红色显示，且靶细胞以绿色显示。
我们惊讶地发现在含有点阵电极的芯片上实验室上替换的CTL能够与赘生性靶细胞接触，并且能够以非常快速的时间(8-20分钟不同)裂解它们。如果用钙荧光素标记细胞，那么它们如果是完整的则是荧光的，如果被CTL损伤则失去荧光性(图2和图3)。通过利用针对线粒体或DNA的染料进行双染色，被CTL损伤的细胞失去它们的钙荧光素的荧光性，而维持针对线粒体或DNA的特异性染料中的一种。因此，通过荧光显微镜分析(可能利用成像程序)，有可能区别活性的CTL和非活性的CTL。非-选择的CTL没有显示出对非预-负载肽的LCL的裂解活性。
从另一方面，如近期所述(22-25)，由DEP操作的细胞维持它们的表型和它们的分化的特征。按照本发明，注意到这种类型的操作也不改变细胞裂解活性和光学信号(荧光性)的检测。因此，这种方法适合于直接识别以及随后分离和扩增活性CTL克隆、以及对确定的细胞靶标显示出细胞裂解活性的其他细胞群体。
除了在该示范中使用的光学成像技术，已知阻抗测量技术(6)容许以高水平的精确性检查单细胞的状态。因此，该实施方案中描述的光学技术意欲仅作为更普通方法的范例。
图2显示与CTL相互作用后，处于晚期裂解状态中的细胞的详细信息。具体地，在图的右部中，能够观察到由三种CTL(黑色箭头)引起的裂解的靶细胞(绿色箭头)。图3(图A)显示CTL/靶细胞聚集体的裂解动力学。在B中，指出了非-预选择的CTL不是裂解性的。如能够看到地，该策略容许分析与CTL接触后的裂解动力学并识别具有高细胞裂解活性的CTL模式。
图4A显示用钙荧光素标记不改变CTL的裂解机制或对负载了EBV肽的(LCL)HLA-B35淋巴细胞的特异性识别。在图4B中，还显示出介电电泳或含有甘露糖醇的缓冲液对该机制均不具有任何作用，即是与其他人对基因表达模式(37)和K562生长能力(35，36)的检查结果相校准的结果，所述对基因表达模式和K562生长能力的检查结果不被介电电泳引起改变。
在图5和6中显示的试验中进一步检查了在所用的试验条件(甘露糖醇缓冲液和通过介电电泳替换)下对识别反应和裂解的特异性的维持。在图6中，还显示了在CTL对LCL的特异性裂解后的荧光性强度变化动力学，在从DEP处理开始的最初8-10分钟中已经能够将其指出，并且从有限数量的细胞(数量＝25，30，20，27)开始。总之，令人惊讶地发现了免疫反应的特异性在该试验情形中得到保持。事实上，免疫反应也在极端减少的细胞数量的存在下引起选择性行为绝对不是显然的。具体地，发生这种类型操作的环境防止细胞中的聚集现象，相反地，这发生在所有其他方法学中。尽管如此，免疫反应的选择性和特异性的发现开启了通向本专利重要的教导系列的大门。
能够实时地先体外再体内地计数细胞毒性效应器(在报告的实施例中的CTL，还有NK细胞和其他)，并且该分析不是基于“替代终点(surrogateendopoints)”(例如，效应器的表面特异性标记的表达，淋巴因子的释放，分化抗原的表达，等)而是基于以单细胞水平在线和实时定量读取裂解效力，上述事实是创新的并具有巨大的重要性。事实上，已知并不是所有识别给定抗原的T-淋巴细胞同等地裂解(2，28)，并且成熟表型-淋巴细胞的百分比在接种疫苗的过程中增加(29)。预测与使用替代终点相比，使用直接的细胞毒性作为终点与临床预后非常相关，并且容许更精确地监测疫苗制剂在诱导特异性免疫中的效力。此外，在近期没有接种疫苗的患者中还经常观察到抗肿瘤T-淋巴细胞的存在，伴随着疾病的复发和重现(30)。
作为在操作已知技术后的细胞回收技术(33)，该过程具有治疗所涉及的情况。分离和回收具有高裂解活性的效应细胞容许“体外”培育高度选择的细胞，目的是进行生物化学研究和扩增所选择的群体。这两种策略均具有对肿瘤免疫疗法的深刻暗示。
事实上，从单核细胞异源群体(循环或“停留”在引流淋巴区域中)中分离高选择性的细胞毒性效应器容许：(a)为了特别的裂解机制效力，克隆扩增上述选择的抗肿瘤效应器；(b)在可能不稳定的克隆群体的离体扩增过程中对效应器进行再选择。用于可能在用树突细胞刺激后为了治疗目的的体内再输注的技术是可用的(31)。这些效应器局部和/或系统再输注的效力，和自体输注的摄取还能够随着时间受到监测，并且与免疫状态和疾病的过程相关(31)。
体外扩增高度裂解性细胞，如果需要改变表型并将它们再输注到患有瘤形成的患者中(过继性(adoptive)-细胞-转移治疗)的可能性已经成为多个研究的主题(28-30，32)。在该试验策略中，快速识别具有高度裂解活性和产生具有治疗重要性的细胞负载的能力然而维持基因稳定性的效应器仍然是限制因素。
本专利的策略主题与减少时间和改进对具有高度裂解活性的细胞的选择程序相一致，其一方面促进靶点肿瘤抗原的识别，另一方面促进可用于免疫治疗的细胞的扩增。如果，通过实施例的方式，考虑将(32)中提示的方法用于获得对在靶细胞中潜在地具有诱导裂解活性的有用的细胞株的功能性选择，则通过本方法获得的选择质量的改进将得到更好的理解。(32)中的技术源自这样的观察，即存在能够在肿瘤组织中渗透并对致癌细胞发挥裂解活性的细胞株，即TIL或肿瘤渗透淋巴细胞。也是在这种情形中，在患者中发现的TIL的数量低于为了获得疾病好转所需要的数量。然后能够将该方案总结为下列步骤：1)从患者获得活组织切片，2)处理该组织，从而容许对理想的细胞体外输注合适的营养和生长因子，3)在生长步骤结束后，纯化TIL的细胞株，并去除肿瘤细胞，4)将由此获得的细胞再输注到患者中。已知仅有一部分以该方法获得的TIL显示出裂解活性，并且因此，由于不能超越为了限制不希望的副作用向患者中再输注的细胞数量，所以该治疗法具有有限的效力。本专利中提出的方法以显著的方式降低了本文中所讨论的方法的限制，因为1)效应细胞的选择能够扩展到也在外周血中存在的细胞系，并且不限于TIL；2)功能性选择产生这样一组株系，即它们的裂解活性是已知的；3)容许改进这些细胞系的扩增程序，这归因于在不同扩增步骤中监测所关心的细胞系稳定性的可能性；4)减少了治疗所需要的细胞负载，并且因此，对向患者中再输注的相同物质提供了更有目的的作用。第3)点以显著的方式改进了与CTL型细胞系扩增相关的技术状态，已知所述CTL型细胞系在一定数量的扩增后改变裂解表型。在这样的极端情形中，其中具有理想裂解特征的单细胞在选择程序之后可用，并且需要达到数百万细胞数量的治疗效价的细胞负载，需要大约25或30次扩增循环。
该循环数量不保持所涉及的细胞的基因稳定性，以致产生具有不同裂解表型的亚群。本发明教导如果解决这一问题。事实上，能够在生长程序的不同阶段重复细胞的功能性选择，并且例如当在10或12个生长周期后，能够获得数千个细胞。能够通过以上公开的功能性选择的扩展应用恢复细胞系的纯化。事实上可能维持通过活组织切片获得的靶细胞系，并重复所提出的方法，以消除具有不希望的表型的裂解性细胞。以该扩增水平消除裂解性细胞与基于电子技术的选择技术相一致，并且因此再次获得纯的品系。进一步扩增等于10或12次的循环数量产生对于治疗应用具有足够数量的裂解性细胞。即使在这一点，细胞数量用于防止以单细胞水平检验裂解表型的稳定性，极大地减少了在不控制表型条件下的生长周期次数，并且因此能够将细胞视为是原始细胞的适当繁殖。
本发明进一步预期了适合于细胞操作的任何装置的应用，所述细胞操作不改变效应细胞(在该情形中，CTL)的生物学活性。
从另一方面，本发明涉及能够裂解靶细胞的各种类型细胞(包括NK细胞)的分离。
最后，本发明适用于所有的病理学，如上所观察地，对于所述病理学，能够再将效应细胞(NK或CTL)的细胞裂解活性主要指引到急性和慢性类型的赘生性病理学、传染性病理学、自体免疫病理学和炎症病理学。
以下，最后提供了关于迄今为止我们所引用的公布文件的书目列表，以它们的参考文献编号显示它们，意欲通过参考，将它们的内容引入本说明书中需要的部分。
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Claims (15)

1.用于从预先从人类收集的免疫系统细胞群体中选择至少一个单个免疫系统细胞的方法，所述方法包括下列步骤：a）使预先收集的单个免疫系统细胞与各种靶粒子相互作用，由于所述相互作用引起的所述靶粒子的修饰是所述免疫系统细胞所需特性的指示；b）检查所述相互作用对所述靶粒子的影响；其特征在于所述方法进一步包括以下步骤：c）在经历了与所述靶粒子相互作用的免疫系统细胞中，仅选择在所述靶粒子中诱导了所述修饰、因此作为效应细胞对其起作用的那些单个免疫系统细胞，其中所述细胞是基于它们所显示的效应器/靶点裂解特性而被选择的；所需的免疫系统细胞的所述所需特性仅是裂解选自由细胞和微生物组成的组的靶粒子的特性，其中所述方法使用介电电泳装置或激光镊子进行。
2.按照权利要求1的方法，其中裂解细胞靶粒子的特性是裂解肿瘤细胞靶粒子的特性。
3.按照权利要求1的方法，其特征在于所述能够在所述靶粒子中获得的修饰是预先已知的。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于：进行了所述相互作用和选择步骤，以容许量化在外周血、炎性赘生性渗入物、引流区域性淋巴结中和在任何其他位置中或可到达的生物流体中的细胞毒性效应器的存在。
5.按照权利要求4的方法，其中所述细胞毒性效应器是T和NK细胞。
6.按照权利要求3或4的方法，其特征在于：进行了所述相互作用和选择步骤，以容许确定剩余最小疾病，同时提供对在危险患者中的抗肿瘤T和NK效应器的细胞裂解活性的直接和实时的测量。
7.按照前述权利要求3或4中任一项的方法，其中所述靶点裂解特性通过预先标记至少所述靶粒子通过光学成像技术或通过阻抗测量技术来测量。
8.按照权利要求1的方法，其特征在于：所述方法进一步包括扩增在步骤c）结束时选择出的所述单个免疫系统细胞的步骤，从而创建上述选择的抗肿瘤效应器的克隆，所述抗肿瘤效应器是关于裂解机制的特殊效力从单核细胞的异源群体中选择的。
9.按照权利要求8的方法，其中所述单核细胞的异源群体循环或“停留”在引流淋巴区域中。
10.按照权利要求8的方法，其特征在于：所述扩增步骤是通过下列阶段进行的，在离体扩增可能不稳定的克隆群体过程中，在一个阶段和下一个阶段之间进行对具有最佳特性的效应器的再选择。
11.按照权利要求10的方法，其中所述效应器的再选择通过对至少一种所述可能不稳定的克隆群体重复步骤a）、b）和c）进行。
12.按照权利要求1-11中任一项的方法用于制备包括在载体中的免疫系统细胞和/或它们的克隆的药物的应用，所述免疫系统细胞是经过所述步骤a）、b）和c）选择的，所述载体适合于以治疗为目的的体内再输注，所述体内再输注可能发生在用树突细胞刺激后。
13.按照权利要求12的应用，其特征在于：所述药物是使用各种细胞类型获得的，所述各种细胞类型的目的活性是裂解靶细胞的活性。
14.按照权利要求12或13的应用，用于制备治疗各种类型病理的药物，所述病理能够用输注所选择的和扩增的裂解性效应细胞而进行治疗。
15.根据权利要求1-11中任一项的方法选择的和扩增的裂解性效应细胞用于制备治疗病理的药物的应用，所述病理可以通过体内再输注所选择的和扩增的裂解性效应细胞的方法进行治疗，所述应用的特征在于：所述药物仅包括预先选择的效应细胞和/或预先选择的效应细胞的克隆，所述预先选择的效应细胞和/或所述预先选择的效应细胞的克隆都具有基本相似的裂解活性。
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