KR20130065657A - Ｔｒ1 세포의 새로운 분리방법 - Google Patents

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발레히 브훈
나탈리 벨몽트
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Abstract

본 발명은 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포를 분리하는 방법, 세포집단에서 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포를 농축 또는 고갈시키는 방법 및 만성 염증성 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 암 및 장기이식 병태를 치료하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

Ｔｒ1 세포의 새로운 분리방법{NEW METHODS FOR ISOLATING TR1 CELLS}
발명의 분야
본 발명은 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포를 동정 및/또는 분리하는 방법, Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포가 농축된 집단, Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포가 고갈된 집단 및 만성 염증 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 암 및 장기이식 병태의 진단 또는 치료를 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
면역계의 항상성은 침입한 병원균에 대한 면역반응과 자가 항원에 대한 면역 관용성 간의 균형에 의존한다. 중추 관용성과 말초 관용성은 두가지 모두 T 세포 관용성의 유도 및 유지를 위한 중요한 메카니즘이다. 최근 십년간, 말초 면역 관용성을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 하는 조절 T 세포 (Treg)에 지대한 관심이 쏟아져 왔다. 현재 Treg은 2가지 서로 다른 서브타입, 즉: 천연 Treg (nTreg) 및 유도형 Treg 집단, 예컨대 TGF-베타 유도형 Treg 세포, Tr1 세포 또는 Th3 세포로 구분할 수 있는 것으로 확인된 바 있다. 이들 Treg 집단은 말초 면역 관용에 있어 주요한 역할을 하기 때문에, 만성 염증성 질환, 자가면역성 질환 또는 알레르기성 질환과 같은 면역학적 병태의 진단, 평가 또는 치료를 용이하게 하기 위해서는 이들 서로 다른 Treg 서브세트들을 동정 분리, 또는 농축(enrich) 시킬 수 있는 능력이 중요하게 되었다.
예를 들어, 이들이 동정된 이래, nTreg은 CD25의 발현에 의해 동정되어 왔다. 그러나, CD25는 통상적인 T 세포 (convT)의 활성화 마커이므로 Treg 세포에만 국한되는 것은 아니다. 인간의 nTreg의 구별과 관련한 최근의 진보는 예컨대 Foxp3, CD127 (WO2007140472), CD45RA (WO2007/117602), CD134 (WO2009/036521) 및 CD49d (WO2009/047003)와 같은 세포내 마커 또는 세포 표면의 동정에 의하여 이루어진 것이다. Tr1 세포와 관련하여, 이들을 특이적으로 동정하는 것은 여전히 어려우며 주로 IL-10 분비의 측정에 기초하고 있다. 따라서 Tr1 세포를 보다 잘, 보다 더 정확하게 구별하는 수단이 필요한 실정이다.
이에 더해서, 크론씨 병을 앓는 환자들에게 Tr1 세포를 주사할 경우 그 증상이 호전된 것에 미루어, Tr1 세포는 세포 치료법에 유용한 것으로 입증되었다. 따라서, 세포 치료법에 이들을 사용하는 방안과 관련하여 보다 정확하게 Tr1 세포를 동정 및 분리하는 것이 요망되고 있다.
본 발명자들은 Tr1 세포가 CD127 및 CD62L 세포 표면 마커를 이용하여 특이적으로 동정될 수 있음을 발견하였다. 실제로, 이들 두가지 마커를 CD4 마커 및 임의로 CD25 마커에 더해서 사용함으로 해서, Tr1 세포를 통상적인 휴지(resting) 및 활성화(activated) T 세포 및 휴지 및 활성화 nTreg으로부터 구별해낼 수 있다.
발명의 개요
본 발명의 한가지 목적은 세포집단 상의 CD4, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지되, 여기서:
- CD4 및
- 저수준의 CD127 및
- 저수준의 CD62L
을 발현하는 세포가 Tr1 세포인 것인, Tr1 세포집단의 동정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포집단 상의 CD127 및 CD62L 마커 중 적어도 한가지 및 CD4, 및 CD25의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지되,여기서:
- CD4 및
- CD127 및 CD62L 중 적어도 한가지를 저수준으로
발현하고,
- CD25
는 발현하지 않는 세포가 휴지 Tr1 세포인 것인, 휴지 Tr1 세포집단의 동정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포집단 상의 CD4, CD25, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지되, 여기서:
- CD4 및
- 저수준의 CD127,
- 저수준의 CD62L
를 발현하고,
- CD25
는 발현하지 않는 세포가 휴지 Tr1 세포인 것인, 휴지 Tr1 세포집단의 동정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포집단 상의 CD4, CD25, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지되, 여기서:
- CD4,
- CD25,
- 저수준의 CD127 및
- 저수준의 CD62L,
를 발현하는 세포가 활성화 Tr1 세포인 것인, 활성화 Tr1 세포의 동정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같이 휴지 Tr1 세포집단 또는 활성화 Tr1 세포집단을 동정하는 것을 포함하여 이루어지는, 휴지 또는 활성화 Tr1 세포집단을 동정하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 의하여 수득되는 휴지 Tr1 세포의 세포집단 또는 활성화 Tr1 세포의 세포집단을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 의하여 수득도는 Tr1 세포의 분리된 집단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 방법에 의하여 수득되는 휴지 Tr1 세포의 분리된 집단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 방법에 의하여 수득되는 활성화 Tr1 세포의 분리된 집단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
- CD4, 저수준의 CD127 및 저수준의 CD62L를 발현하는 세포들을 동정하고,
- 상기 세포들을 선별함으로써
농축 전의 Tr1 세포의 백분율에 비해 Tr1 세포의 백분율이 적어도 2배인, Tr1 세포가 농축된 세포집단을 수득하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 Tr1 세포를 농축시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
- CD4를 발현하고 저수준의 CD127와 저수준의 CD62L 중 적어도 한가지를 발현하며 CD25는 발현하지 않는 세포들을 동정하고,
- 상기 세포들을 선별함으로써
농축 전의 휴지 Tr1 세포의 백분율에 비해 휴지 Tr1 세포의 백분율이 적어도 2배인, 휴지 Tr1 세포가 농축된 세포집단을 수득하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 휴지 Tr1 세포를 농축시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
- CD4, CD25를 발현하고 저수준의 CD127 및 저수준의 CD62L를 발현하는 세포를 동정하고,
- 상기 세포들을 선별함으로써
농축 전의 활성화 Tr1 세포의 백분율에 비해 활성화 Tr1 세포의 백분율이 적어도 2배인, 활성화 Tr1 세포가 농축된 세포집단을 수득하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 활성화 Tr1 세포를 농축시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같이 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포를 동정하고 상기 세포를 선별함으로써, 농축 전의 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포의 백분율에 비해 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포의 백분율이 적어도 2배인, 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포가 농축된 세포집단을 수득하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포를 농축시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법으로 얻어지는 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 농축 집단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
- 본 발명에 따라 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포를 동정하고,
- 상기 세포를 고갈시킴으로써
고갈 전의 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 백분율에 비해, Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 백분율이 0.5배 이하인, Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포가 고갈된 세포집단을 수득하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포를 고갈시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같이 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포를 동정하고, 상기 세포를 고갈시킴으로써, 고갈 전의 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포의 백분율에 비해, 휴지 및/또는 활성화 Tr1의 백분율이 0.75배 이하인, 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포가 고갈된 세포집단을 수득하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포를 고갈시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 따라 수득된 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포-고갈형 세포집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 따라 수득된, Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포-고갈형 세포집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD4, CD25, CD127 및 CD62L의 세포 표면 발현을 검출하기 위한 수단을 포함하여 이루어지는, Tr1 세포집단, 휴지 Tr1 세포집단 또는 활성화 Tr1 세포집단을 동정 또는 분리하기 위한 키트이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 분리된 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단 또는 전술한 바와 같은 농축형 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단 또는 전술한 바와 같은 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포-고갈형 세포집단을 포함하여 이루어지는 의약 조성물이다.
한가지 구체예에서, 전술한 바와 같은 분리된 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단 또는 전술한 바와 같은 농축형 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단을 포함하는 의약 조성물은 감염 또는 장기이식과 관련된 면역반응을 예방 또는 치료하거나 또는 염증성 병태 또는 자가면역 병태를 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 감염 또는 장기이식과 관련된 면역반응을 예방 또는 치료하거나 또는 염증성 병태 또는 자가면역 병태를 예방 또는 치료하기 위한 분리 및/또는 농축된 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역반응 증진을 필요로 하는 환자에 있어서 면역반응을 증진시키기 위한, 전술한 바와 같은 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포-고갈형 세포집단이다. 한가지 구체예에서, 상기 세포집단은 종양 항원 특이적인 T 세포집단이다.
한가지 구체예에서, 전술한 바와 같은 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포-고갈형 세포집단을 포함하는 의약 조성물은 암 치료를 필요로 하는 대상체에 있어서, 암을 치료하기 위한 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포집단은 종양 항원 특이적인 T 세포집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상체에 있어서 혈액으로부터 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포를 세포외(ex vivo) 고갈시키기 위한, 전술한 바와 같은 고갈 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 휴지 Tr1 세포와 활성화 Tr1 세포와의 혼합물을 포함하여 이루어지는 의약 조성물을 제공하는 것으로, 여기서 상기 혼합물은 전술한 방법에 따라 수득된, 분리된 휴지 Tr1 세포집단을 시험관내 증폭 (expanding in vitro)시킴으로써 수득되는 것이다.
한가지 구체예에서, 상기 의약 조성물은 감염 또는 장기이식 또는 알레르기성 질환과 관련된 면역 반응을 치료하거나 또는 염증성 병태 또는 자가면역 병태를 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 방법에 따른 치료 전 및 후에 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중에서 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포를 동정하는 것을 포함하여 이루어지는, 대상체에 있어서 치료 효과를 시험관내 모니터링하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 치료 후 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단의 증가는 치료에 대한 응답에 상응하는 것인 시험관내 모니터링 방법을 제공하는 것이다.
발명의 상세한 설명
Tr1 세포는 후술하는 바와 같이 특이적인 시토카인 분비 프로파일에 의해 특지어질 수 있는 독특한 세포집단이다. Tr1 세포는 항원과 조우한 나이브(naive) CD4+ T 세포로부터 분화한다. Tr1 세포는 따라서 생체내(in vivo)에서 2개의 스테이지, 즉: 활성화 및 휴지기 상태로 발견될 수 있다. 전술한 바와 같이, 표면 마커를 하용하여 Tr1 세포 및 특히 휴지 및 활성화 Tr1 세포를 구별하는 것은 현재 불가능한데, 이는 이들 세포집단에 대한 특이적인 표면 표현형을 구할 수 없기 때문이다.
본 발명자들은 놀랍게도 휴지 Tr1 세포들이 다음의 표현형, 즉 CD4+CD25-CD127lo/-CD62Llo/-를 나타내고 활성화 Tr1 세포는 다음의 표현형, 즉 CD4+CD25+CD127lo/-CD62Llo/-를 나타낸다는 것을 발견하였다. 이는 기술분야에서 휴지기의 T 세포가 전형적으로 CD62L을 고수준으로 발현한다는 것이 널리 알려진 점을 고려하면 특히 놀라운 발견이다.
본 발명은 인간의 Tr1 세포, 및 특히 인간의 휴지 Tr1 세포 및 인간의 활성화 Tr1 세포를 동정, 분리, 농축 및/또는 고갈시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 이렇게 하여 얻어진 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 및 활성화 Tr1 세포집단 또는 조성물 및 그의 사용 방법도 제공한다.
본 발명의 한가지 목적은 세포집단 상의 CD4, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지되, CD4, 저수준의 CD127 및 저수준의 CD62L를 발현하는 세포가 Tr1 세포인 것인, Tr1 세포집단의 동정 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포집단 상의 CD127 및 CD62L 마커 중 적어도 1종과 CD4, 및 CD25의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지되, 여기서 저수준의 CD127 및 CD62L 중 적어도 1종과 CD4는 발현하지만 CD25는 발현하지 않는 세포가 휴지 Tr1 세포인 것인, 휴지 Tr1 세포집단의 동정 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포집단 상의 CD4, CD25, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지되, 여기서 CD4, CD25, 저수준의 CD127 및 저수준의 CD62L를 발현하는 세포가 활성화 Tr1 세포인 것인, 활성화 Tr1 세포집단의 동정 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 통상적인 휴지 및 활성화 T 세포 및 천연 조절 휴지 및 활성화 T 세포 중에서 휴지 Tr1 세포집단 및/또는 활성화 Tr1 세포집단을 동정하는 방법으로서, 여기서 휴지 Tr1 세포는 CD4+CD25-CD127lo /-CD62Llo /- 이고 활성화 Tr1 세포는 CD4+CD25+CD127lo /-CD62Llo /-이다.
본 발명자들은 Tr1 세포가 CD4, CD127 및 CD62L 마커를 이용하여 특이적으로 동정될 수 있음을 입증하였다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 또한, CD4, CD25, CD127 및 CD62L 마커를 이용하여 휴지 Tr1 세포들을 활성화 Tr1 세포로부터 구별해낼 수 있음을 입증하였다. 본 발명에서, "마커"라는 용어는 세포집단을 구별하는데 이용될 수 있는, 세포 표면 상의 단백질, 탄수화물 또는 지질을 가리킨다.
본 발명에서, "발현"이라는 용어는 코딩된 폴리펩타이드 또는 단백질을 비롯한 유전자 또는 유전자 산물의 발현과 호환된다. 어떤 유전자 산물의 발현은 예컨대 해당 폴리펩타이드와 결합하는 1종 이상의 항체(들)을 이용하는 면역분석법에 의하여 검사할 수 있다. 별법으로, 유전자 발현은 예컨대 RT-PCR, qPCR에 의한 mRNA 수준의 측정에 의하여 검사할 수도 있다.
"나이브(naive)"라는 용어는 기술 분야에 잘 알려진 표현으로 어떤 특이적인 항원과 조우한 적이 없는 세포집단 또는 면역 세포를 지칭하는 것이다. 나이브 T 세포는 휴지 세포이다.
"휴지(resting)"라는 용어는 기술 분야에 잘 잘 알려진 용어로서 증식하지 않고, 시토카인을 생산하지 않으며, 그 표면에서 CD25와 같은 통상적인 면역 세포 활성화 분자를 발현하지 않는 면역 세포 또는 세포집단을 가리키는 것이다.
"활성화(activated)"라는 용어는 기술 분야에 잘 알려져 있으며 증식하고 및/또는 시토카인을 생산하며 그의 표면에서 CD25와 같은 통상적인 면역 세포 활성화 분자를 발현하는 면역 세포 또는 세포집단을 가리킨다.
특히 T 임파구의 경우, 휴지 상태로부터 활성화 상태로의 패시지는 T 세포와 그의 특이적 항원과의 조우에 의해 또는 활성화 시토카인 또는 미토겐에 의한 활성화에 의해 매개된다.
CD127lo /-, CD62Llo /- 또는 CD25Llo /-와 관련하여 사용되는 "낮은, 저(低)" 또는 "lo" 또는 "lo/-" 이라는 표현은 기술 분야에 잘 알려져 있으며 대상이 되는 세포 마커의 발현 수준과 관련하여, 그 세포 마커의 발현 수준이, 분석되는 세포들의 집단 내의 세포 마커의 전체적인 발현 수준과 비교할 때 그보다 낮은 것을 가리키는 것이다. 더욱 구체적으로, 용어 "lo"는 1종 이상의 다른 특수한(distinct) 세포집단보다 세포 마커를 더 낮은 수준으로 발현하는 특수한 세포집단을 가리킨다.
"높은, 고(高)" 또는 "hi" 또는 "밝게(bright)"라는 용어는 기술 분야에 잘 알려져 있으며 대상이 되는 세포 마커의 발현 수준과 관련하여, 그 세포 마커의 발현 수준이 분석되는 세포들의 집단 내의 세포 마커의 전체적인 발현 수준과 비교할 때 그보다 높은 것을 가리키는 것이다.
용어 "+" 및 "-"는 기술 분야에 잘 알려져 있으며 대상이 되는 세포 마커의 발현 수준을 가리키는 것으로, "+"에 대응하는 세포 마커의 발현 수준은 높은 것이고 "+/-"는 중간 정도를 나타내며, 대상이 되는 세포 마커의 발현 수준이 "-"인 것은 낮거나 아무 가치가 없는 (null) 것을 나타낸다. 일반적으로 염색 강도가 상위 2, 3, 4, 또는 5%인 세포들은 "hi"로 표시하고, 집단의 상위 절반에 해당하는 것들은 "+" 카테고리로 분류한다. 형광 강도가 50% 미만인 세포들은 "lo"세포로 표시하고 5% 미만인 세포들은 "-" 세포fhh 표시한다.
본 발명에서, "CD127"라 함은 Tr1 세포 표면에 존재하는 "인터류킨-7 수용체"를 가리킨다. IL-7 수용체 알파쇄는 문헌상에 설명되어 있다(예컨대, Goodwin et al. (1990) 세포 60:941-951). IL-7R은 또한 문헌에서 CD127로도 칭해진다. "CD127+"은 CD127에 지향된 표지된 항체로 처리될 경우 중간 또는 밝게 염색되는 세포들을 가리킨다. "CD127lo /-"는 표지된 CD127 항체와 접촉될 경우 약간/희미하게 염색되거나 또는 전혀 염색되지 않는 유형의 세포들을 가리킨다. 일반적으로, 당업자에게 알려진 바와 같이, 염색 강도의 용이하게 식별가능한 차이에 기초해서, 세포들은 그들의 CD127 발현 수준에 따라 구별된다. 몇가지 구체예에서, 어떤 세포를 CD127lo/- 세포라 지칭하기 위한 컷오프(cutt off)는 모든 세포에 대하여 관찰된 형광 강도 분포 측면에서 설정할 수 있는데, 즉 형광 강도가 50%, 40%, 30% 또는 20% 미만인 세포들을 CD127lo /- 세포로 표시한다. CD127- 세포는 형광 강도가 하위 10번째 백분위수 미만인 것들(that falls below the tenth bottom percentile)로 정의할 수 있다. 몇몇 구체예에서, CD127 염색의 빈도 분포를 모든 세포에 대하여 구하고 집단 커브를 고염색 집단과 저염색 집단에 피팅하여, 각각의 집단 분포의 통계적 분석 관점에서 통계학적으로 가장 잘 속할 것으로 여겨지는 집단에 세포를 배정한다. 몇몇 구체예에서, CD127lo /- 세포는 CD127+ 세포보다 2 내지 3배 더 낮은 강도로 염색된다.
본 발명에서, "CD62L"이라는 용어는 임파구 이동에 있어서 중요한 부착 분자인 L-셀릭틴을 가리킨다. "CD62L+"는 CD62L에 지향된 표지된 항체로 처리될 경우 중간 또는 밝게 염색되는 세포를 가리킨다. "CD62Llo /-"는 표지된 CD62L 항체와 접촉될 경우 약간/희미하게 염색되거나 또는 전혀 염색되지 않는 유형의 세포를 가리킨다. 일반적으로, 세포들은 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 염색 강도의 용이한 구별 가능성에 기초해서 그들의 CD62L 발현 수준에 따라 구별된다. 몇몇 구체예에서, 어떤 세포를 CD62Llo /- 세포라 지칭하기 위한 컷오프(cutt off)는 모든 세포에 대하여 관찰된 형광 강도 분포 측면에서 설정할 수 있는데, 즉 형광 강도가 50%, 40%, 30% 또는 20% 미만인 세포들을 CD62Llo /- 세포로 표시한다. CD62L- 세포는 형광 강도가 하위 10번째 백분위수 미만인 것들(that falls below the tenth bottom percentile)로 정의할 수 있다. 몇몇 구체예에서, CD62L 염색의 빈도 분포를 모든 세포에 대하여 구하고 집단 커브를 고염색 집단과 저염색 집단에 피팅하여, 각각의 집단 분포의 통계적 분석 관점에서 통계학적으로 가장 잘 속할 것으로 여겨지는 집단에 세포를 배정한다. 몇몇 구체예에서, CD62Llo /- 세포는 CD62L+ 세포보다 2 내지 3배 더 낮은 강도로 염색된다.
본 발명에서, "CD4"라는 용어는 단핵구 및 대식세포 뿐만 아니라 성숙한 헬퍼 T 세포 및 미성숙 흉선세포 상에서 일반적으로 발견되는 세포-표면 당단백질이다. T 세포 상에서, CD4는 T 세포 수용체 (TCR)에 대한 공수용체(co-receptor)이며 티로신 키나제 lck를 리크루트한다. 그의 D1-부분에 의해, CD4는 MHC 클래스 II 분자의 베타2-도메인에 부착할 수 있다. "CD4+"는 표지된 항-CD4 항체와 접촉할 경우 밝게 염색되는 세포를 가리키고, "CD4-"는 형광 표지된 CD4 항체와 접촉될 경우 최소로 밝게, 희미하게 염색되거나 전혀 염색되지 않는 유형의 세포를 가리킨다. CD4 염색은 명백히 이원형(bimodal)이기 때문에, 세포들은 염색 강도 측면에서 용이하게 인지가능한 구별성에 기초해서 그들의 CD4 발현 수준에 따라 구별된다. 몇가지 구체예에서, CD4 염색의 빈도 분포를 모든 세포에 대하여 구하고 집단 커브를 고염색 집단과 저염색 집단에 피팅하여, 각각의 집단 분포의 통계적 분석 관점에서 통계학적으로 가장 잘 속할 것으로 여겨지는 집단에 세포를 배정한다. 몇몇 구체예에서, CD4- 세포는 CD4+ 세포보다 2 내지 3배 더 낮은 강도로 염색된다.
본 발명에서, "CD25"라는 용어는 분자량이 55 kD인 단쇄 당단백질인 인터류킨-2 수용체의 알파 서브유닛을 가리킨다. 모노카인 인터류킨-1의 존재 하에 항원 또는 미토겐에 의한 T 세포 활성화에 이어서, 인터류킨 2 (IL-)는 급속히 합성 및 분비된다. 이에 응답해서, T 세포의 서브집단은 IL-2에 대한 고친화성 수용체들을 발현한다. 이들 세포들은 증식하여 헬퍼, 서프레서 및 세포독성 기능을 매개할 수 있는 T 세포집단을 증폭시킨다. IL-2 수용체는 T 세포 상에서만 독특하게 발견되는 것은 아니다. "CD25hi"는 표지된 항CD25 항체와 접촉될 경우 밝게 염색되는 세포들을 가리키고, "CD25+"는 표지된 항CD25 항체와 접촉될 경우 덜 밝게 염색되는 세포들을 가리키며, "CD25lo /-"는 표지된 CD25 항체와 접촉될 경우 최소한도의 밝기로 희미하게 염색되거나 아무 가치가 없는(null) 유형의 세포들을 가리킨다. 일반적으로, 세포들은 당업자에게 알려진 바와 같이 염색 강도에 차이에 기초하여 그들의 CD25 발현 수준에 따라 구별된다. 몇몇 구체예에서, 어떤 세포를 CD25 발현 카테고리 hi, +, lo, 또는 - 세포로서 표시하기 위한 컷오프는 그 모든 세포에 대하여 관찰된 형광 강도 분포 관점에서 설정될 수 있다. 일반적으로, 상위 2, 3, 4, 또는 5%의 염색 강도를 나타내는 세포들을 "hi"로 표시하고, 집단의 상위 절반에 해당하는 것들을 "+" 카테고리로 분류한다. 하위 50%의 형광 강도를 나타내는 세포들은 CD25lo 세포로 나타내고 5% 미만인 세포들을 CD25- 세포로 나타낸다.
본 발명에서 "Foxp3"이라는 용어는 전사 인자로 작용하는 것으로 믿어지는 핵 단백질 Foxp3이다 (Hori et al., 2003; Yasayko, J. E. et al., Nat. Genet. 27:68-73 (2001); Fontenot, J. D. et al., Nat. Immunol. 4:330-336 (2003); Khattri, R. et al., Nat. Immunol. 4:337-342 (2003)). 세포내에 위치하기 때문에, Foxp3 발현은 표지된 항Foxp3 항체 (eBioscience inc 또는 BD biosciences)를 이용한 세포내 유도성 분석기를 이용하여 분석할 수 있다.
본 발명에 따라, Tr1 세포들은 활성화될 경우 높은 수준의 IL-10 및 중간 수준의 TGF-베타를 분비할 수 있다. Tr1 세포는 부분적으로는 그들의 독특한 시토카인 프로파일에 의해 특징지어질 수 있다: 이들은 고수준의 IL-10, 중간 수준의 TGF-베타 및 중간 수준의 IFN-감마를 생산하지만, IL-4 또는 IL-2는 거의 또는 전혀 생산하지 않는다. 시토카인 생산은 일반적으로 항CD3 + 항CD28 항체 또는 인터류킨-2, PMA + 이오노마이신과 같은 T 임파구의 폴리클로날 활성화제에 의한 활성화 후 세포 배양체 내에서 측정된다. 별법으로, 시토카인 생산은 항원 제시 세포에 의해 제시되는 특이적인 T 세포 항원에 의한 활성화 후 세포 배양체 내에서 평가된다. 고수준의 IL-10은 적어도 약 500 pg/ml, 일반적으로 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20 x 103 pg/ml 이상에 대응한다. 중간 수준의 TGF-베타는 적어도 약 100 pg/ml, 일반적으로 약 200, 300, 400, 600, 800, 또는 1000 pg/ml 이상에 해당한다. 중간 수준의 IFN-감마는 0.1 pg/ml 내지 적어도 400 pg/ml, 일반적으로, 약 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000 pg/ml 이상에 해당한다. IL-4 또는 IL-2이 전혀 생산되지 않는다 함은 약 500 pg/ml 미만, 좋기로는 약 250, 100, 75, 또는 50 pg/ml 이하의 양으로 생산됨을 의미한다.
Tr1 세포는 세포 표면 마커에 의해 작동적으로 특징지어질 수 있다. 이들 세포 표면 마커는 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 시약에 의해 인식될 수 있다. 예컨대, Tr1 세포의 표면 상의 단백질, 탄수화물 또는 지질들은 그 특정 단백질이나 탄수화물에 특이적인 항체에 의해 면역학적으로 인식될 수 있다 (마커에 대한 항체의 용도에 관하여는 다음 문헌을 참조: Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999); 또한 실시예도 참조할 것). Tr1 세포의 표면에 존재하고 이들 세포의 표면에 부재하는 일련의 마커들은 Tr1 세포에 특이적이다. 따라서, Tr1 세포들은 세포 표면 마커를 이용한 포지티브 및 네가티브 선별에 의해 선별될 수 있다. Tr1 세포에 의해 발현되는 세포 표면 마커에 결합하는 시약, 즉 "포지티브 마커"는 Tr1 세포의 포지티브 선별에 이용될 수 있다 (즉, 세포 표면 마커를 발현하는 세포들을 유지). 반대로, 네가티브 선별은 어떤 세포 표면 마커들은 Tr1 세포에 의해 발현되지 않는다는 사실에 기초한다. 따라서, "네가티브 마커" (즉, Tr1 세포의 세포 표면에 존재하지 않는 마커)는 네가티브 마커에 특이적인 시약과 결합하는 세포를 제거함으로써 집단 중 Tr1 세포가 아닌 세포들을 제거하는데 이용될 수 있다.
한가지 구체예에서, 세포 표면 마커의 발현 검출에 기초한 세포들 간의 구별은 세포 표면 마커의 발현을 세포 대조군 집단에 의한 평균 발현과 비교함으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, Tr1 세포 상의 마커의 발현을 Tr1 세포와 동일한 샘플로부터 유래하는 다른 세포 상의 동일 마커의 평균 발현과 비교할 수 있다. 마커 발현에 의한 세포들간의 또 다른 구별법으로는 시약들의 조합을 이용한 세포 유동성 측정에 의하여 세포들을 게이팅시키는 것을 포함한다 (참조: Givan A, Flow Cytometry: First Principles, (Wiley-Liss, New York, 1992); Owens M A & Loken M R., Flow Cytometry: Principles for Clinical Laboratory Practice, (Wiley-Liss, New York, 1995)).
"시약의 조합"이라 함은 Tr1 세포 표면 상에 존재하거나 (포지티브 마커) 또는 존재하지 않는 (네가티브 마커) 세포 표면 마커들에 결합하거나 또는 포지티브 마커와 네가티브 마커와의 조합에 결합하는 적어도 2종의 시약들을 의미한다. 예를 들어, Tr1 세포 표면 마커에 특이적인 항체들의 조합을 사용함으로써 여러가지 다양한 샘플/조직으로부터 Tr1 세포를 분리 및/또는 농축시킬 수 있다.
샘플로부터 수득된 세포들을 표현형 특징에 의해 선별함으로써, 마커들의 종-특이적 다양성을 인식하는 항체들을 이용하여 Tr1 세포를 농축 및 선별한다. 세포들의 농축된 집단에서와 같은 "농축된, 농축형 (enriched)"이라는 표현은 분획화되지 않은 세포 세트들 중 마커를 갖는 세포의 수에 비해 분획화된 세포 세트 중의 특저어 마커를 갖는 세포 수가 증가된 경우로 정의한다. 특정 구체예에서, Tr1 세포들을 Tr1 세포에 특이적인 세포 표면 마커에 결합하는 시약들을 이용하여 세포집단으로부터 농축시키고 이들 세포들을 형광 활성화 세포 소팅 (FACS),고상 자성 비드 등과 같은 세포 소팅 분석법을 이용하여 분리한다. 몇몇 구체예에서, 세포들을 소팅하는 방법들을 조합적으로 사용할 수 있으며, 예컨대 마그네틱 선별 후 FACS를 이용할 수 있다. 농축을 증대시키기 위하여, 세포 표면 마커를 이용하여 Tr1 세포 분리를 위한 네가티브 선별법과 포지티브 선별법을 조합시킨다. 세포 표면 마커를 이용하는 Tr1 세포의 분리/농축은 어떠한 순서로 수행하여도 무방하다. 따라서, 포지티브 선별 단계가 네가티브 선별 단계 직전에 수행될 수도 있고 그 반대도 가능하다. 분리/농축은 포지티브 선별 및 네가티브 선별 단계를 그룹화시킴으로써 수행된다. 따라서, 분리/농축은 먼저 포지티브 선별 단계를 수행한 다음, 네가티브 선별법을 수행하거나 그 반대로 수행함으로써 실시할 수 있다.
본 발명에서 "항X 항체" 또는 "X 항체"라 함은 X에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 예를 들어, 항CD127 항체 또는 CD127 항체는 CD127에 결합할 수 있다. 본 발명에 사용가능한 항체들의 비제한적인 예로는 재조합 항체, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 모노클로날 항체, 인간화 또는 영장류화(primatized) 모노클로날 항체, 및 항체 단편을 들 수 있다. 다수의 임파구 바이오마커 특이적인 항체들이 시판되고 있다. 이들의 예로는 항CD127, 항CD4, 항CD62L 및 항CD25 항체를 들 수 있다. "항체"라 함은 항원에 특이적으로 결합하여 항원을 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이들의 단편으로부터의 골격 대역을 포함하는 폴리펩타이드를 가리킨다. 인식된 면역글로불린 유전자로는 캅파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 mu 불변부 유전자와 무수히 많은 면역글로불린 가변부 유전자를 들 수 있다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며 이들은 다시 각각 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의된다. 일반적으로, 항체의 항원-결합 대역은 결합 친화성 및 특이성에 있어 가장 중요한 부분이다. 면역글로불린 (항체) 구조 유닛의 예로 테트라머를 들 수 있다. 각각의 테트라머는 두 쌍의 동일한 폴리펩타이드 사슬을 갖는데, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kD) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kD)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식에 주요한 역할을 하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변부를 구성한다. 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)라 함은 각각 이들 경쇄와 중쇄를 칭하는 용어이다. 항체는 예컨대 온전한(intact) 면역글로불린으로서 또는 여러가지 펩티다제에 의한 절단에 의하여 생성된 수개의 잘 특징화된 단편으로서 존재한다. 따라서, 예컨대 펩신은 힌지 대역의 다이설파이드 결합 하에 항체를 절단하여 그 자체가 다이설파이드 결합에 의해 VH-CH11에 결합된 경쇄인 Fab의 다이머 F(ab)'2를 생성한다. F(ab)'2는 온화한 조건 하에 환원되어 힌지 대역의 다이설파이드 결합이 파괴됨으로 해서, F(ab)'2 다이머가 Fab' 모노머로 전환된다. Fab' 모노머는 기본적으로 힌지 대역의 일부분을 갖는 Fab이다 [참조: Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)]. 온전한 항체의 절단 관점에서 다양한 항체 단편들이 정의되는데, 당업자들은 이러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론에 의하여 드 노보 합성될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 본 발명에서 항체라 함은 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편 또는 재조합 DNA 방법론 (예컨대 단쇄 Fv)를 이용하여 드 노보 합성된 것 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 동정된 것들이 모두 포괄된다 [참조: 예컨대, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]. 몇몇 구체예에서, 항체 대신 표적의 고친화성 리간드가 사용될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드가 어떤 항체에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합한다"라는 표현 또는 "특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응성이다"라는 표현은 종종 단백질 및 다른 생물학의 이종 집단에서, 그 단백질의 존재를 결정적으로 나타내는 결합 반응을 칭한다. 이러한 조건 하에서 항체에 대한 특이적인 결합은 특정 단백질에 대한 그의 특이성 관점에서 선택된다. 예컨대, 폴리클로날 항체들은 선택된 항원과 특이적으로 면역반응하고 다른 단백질과는 반응하지 않는 폴리클로날 항체들만을 수득하기 위하여 선택될 수 있다. 이러한 선별은 다른 분자들과 교차 반응하는 항체들을 제외함으로써 달성될 수 있다. 좋기로는 "표지(label)" 또는 "검출가능한 부분(detectable moiery)"은 항체에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착되는 것이 바람직하다. 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 기타 물리저거 수단에 의해 검출가능한 것일 수 있다. 특히 유용한 표지들은 형광 염료이다. 항체에 표지를 부착하는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 특히 바람직한 표지는 쉽게 탈착 또는 분리되거나 생리적 조건 하에서 소정의 효소와의 접촉에 의하여 가수분해되기 쉬운 링커에 의해 항체에 결합되는 것들이다. 항체는 또한 상자성 마이크로비드 (Miltenyi Biotec, Germany)와 같은, 자성 입자와 컨쥬게이션될 수도 있다. 자성 표지된 항체에 결합된 활성화된 T 세포는 비제한적인 예로서, 자성 세포 소팅을 이용한 기술에 의하여 분리될 수 있다. CD127, CD62L, CD4 및 CD25 및 기타 다른 많은 분화 클러스터에 대한 적절히 표지된 항체들이 시판되고 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 항체는 샘플과의 접촉 전후에 또는 CD와의 접촉 전후에 표지될 수 있다. CD 항체는 CD-항체에 결합하는 표지된 항체와의 접촉에 의해 표지시킬 수 있다. 본 발명에서 "CD" 또는 "분화 클러스터"라는 표현 또는 "공통 결정인자"라는 표현은 항체에 의해 인식되는 세포 표면 분자들을 칭하는 것이다.
본 발명에 따라, Tr1 세포집단은 세포집단 상의 CD4, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출함으로써 동정할 수 있다: CD4를 발현하고 (즉 CD4+) 저수준의 CD127 및 CD62L를 발현하는 (즉 CD127lo /- 및 CD62Llo /-) 세포들이 Tr1 세포에 해당한다.
본 발명에 따라, 휴지 Tr1 세포집단은 세포집단 상의 CD127 및 CD62L 마커들 중 적어도 1종과 CD4 및 CD25의 세포 표면 발현을 검출함으로써 동정할 수 있다: CD4를 발현하고 (즉 CD4+) 및 CD127 및 CD62L 중 적어도 1종을 저수준으로 발현하며 (즉 CD127lo /- 및/또는 CD62Llo /-), 좋기로는 저수준의 CD127 및 저수준의 CD62L를 발현하며, CD25는 발현하지 않는 (즉 CD25-) 세포들이 휴지 Tr1 세포에 해당한다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 마커 Foxp3 역시도 분석되며 CD4를 발현하고 (즉 CD4+) 및 CD127 및 CD62L 중 적어도 1종을 저수준으로 발현하며 (즉 CD127lo /- 및/또는 CD62Llo /-), 좋기로는 저수준의 CD127 및 저수준의 CD62L를 발현하지만 CD25는 발현하지 않고 (즉 CD25-), 또한 Foxp3를 발현하지 않는 (즉 Foxp3-) 세포들은 휴지 Tr1 세포에 해당한다.
본 발명에 따라, 활성화 Tr1 세포집단은 세포집단 상의 CD4, CD25, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출함으로써 동정할 수 있다: CD4 및 CD25를 발현하고 (즉 CD4+CD25+) 및 저수준의 CD127 및 CD62L를 발현하는 (즉 CD127lo /- 및 CD62Llo /-) 세포들은 활성화 Tr1 세포이다.
한가지 구체예에서, 마커 Foxp3 역시도 평가되며 CD4 및 CD25를 발현하고 (즉 CD4+CD25+) 및 저수준의 CD127 및 CD62L를 발현하며 (즉 CD127lo /- 및/또는 CD62Llo /-), Foxp3를 발현하는 (즉 Foxp3+) 세포들은 활성화 Tr1 세포이다.
상기 Tr1 세포의 동정/선별을 위하여 상기 마커 (CD4, CD25, CD127, CD62L 및 Foxp3)에 결합하는 바람직한 시약들은 항체들이다. 또 다른 구체예에서, 항체들은 플루오로크롬 또는 자성 입자에 컨쥬게이트된다. 또 다른 구체예에서, 세포 선별은 유세포분석법, 형광 활성화 세포 소팅법, 마그네틱 선별법, 친화성 크로마토그래피 또는 패닝 또는 이들의 조합에 의하여 수행된다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 방법에 의하여 동정 및 분리되어 수득된 Tr1 세포의 분리된 집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 방법에 의하여 동정 및 분리되어 수득된 휴지 Tr1 세포의 분리된 집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 방법에 의하여 동정 및 분리되어 수득된 활성화 Tr1 세포집단의 분리된 집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 방법에 의하여 동정 및 분리되어 수득된 휴지 및 활성화 Tr1 세포의 분리된 집단이다.
"분리된(isolated)"라 함은 자연적인 환경 (예컨대 말초 혈액)으로부터 제거된 세포 또는 세포집단 및 분리 또는 격리된 세포 또는 세포집단을 가리키는 것으로서, 이들과 함께 자연적으로 존재하는 다른 세포들의 적어도 약 75%, 80%, 85% 및 좋기로는 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%가 제거된 것을 의미하는 것으로, 단 상기 세포 분리의 기초가 된 세포 표면 마커를 결여하는 것들이다.
세포집단의 분리법은 기술 분야에 잘 알려져 있으며 그의 비제한적인 예로는 유세포분석법, 마그네틱 선별법, 친화성 크로마토그래피, 패닝 또는 그의 조합을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포의 분리된 집단을 포함하거나 이들로 구성된 의약 조성물이다.
한가지 구체예에서, 상기 의약 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명에 유용한 약학적으로 허용가능한 담체들은 통상적인 것들이다. 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에는 본 발명의 조성물의 약학적 전달에 적합한 조성물과 포뮬레이션이 설명되어 있다. 일반적으로, 담체의 특성은 사용되는 투여 방식에 따라 달라진다. 예를 들어, 비경구용 포뮬레이션은 일반적으로 비히클로서 물, 생리적 식염수, 밸런스를 맞춘 염용액, 수성 덱스트로스, 참기름, 글리세롤, 에탄올, 이들의 조합 등과 같은 약학적 및 생리적으로 허용가능한 플루이드를 포함한다. 담체와 조성물은 멸균될 수 있고 포뮬레이션은 투여 방식에 맞게 조정될 수 있다. 생물학적 중성 담체에 더해, 투여될 의약 조성물은 습윤제, 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등, 예컨대 소듐 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트와 같은 비독성 보조 물질을 소량 함유할 수 있다. 조성물은 액상 용액, 현탁액, 에멀젼일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은:
- CD4 및 저수준의 CD127 및 CD62L를 발현하는 세포를 동정하고,,
- 상기 세포를 선별함으로서,
- Tr1 세포가 농축된 세포집단을 수득하는 것
을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 Tr1 세포를 농축시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
- CD4를 발현하고 CD127 및 CD62L 중 적어도 1종을 저수준으로 발현하며, 좋기로는 CD127 및 CD62L를 저수준으로 발현하고, CD25는 발현하지 않는 세포들을 동정하고,
- 상기 세포들을 선별함으로서,
- 휴지 Tr1 세포가 농축된 세포집단을 수득하는 것
을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 휴지 Tr1 세포를 농축시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
- CD4, CD25 및 저수준의 CD127 및 CD62L를 발현하는 세포들을 동정하고,
- 상기 세포들을 선별 및 분리함으로써,
- 활성화 Tr1 세포가 농축된 세포집단을 수득하는 것
을 포함하여 이루어지는, 세포집단에서 활성화 Tr1 세포를 농축시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법으로 수득되는 Tr1 세포의 농축된 집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 따라 수득된 휴지 Tr1 세포의 농축된 집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 따라 수득된 활성화 Tr1 세포의 농축된 집단이다.
상기 세포를 선별/농축하기 위한 상기 마커 (CD4, CD25, CD127 및 CD62L)에 결합하는 바람직한 시약들은 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체들은 플루오로크롬 또는 자성 입자들에 컨쥬게이션된다. 또 다른 구체예에서, 세포 선별은 유세포분석법, 형광 활성화 세포 소팅, 마그네틱 선별법, 친화성 크로마토그래피 또는 패닝 또는 이들의 조합에 의한다.
Tr1 세포가 농축된 조성물/집단은 Tr1 세포의 백분율이 본래 수득된 세포집단 중의 Tr1 세포의 백분율보다 높은 것이다. 가능하기는 하나, Tr1 세포가 농축된 집단은 Tr1 세포의 동종 집단을 함유할 필요가 없다. 특정 구체예에서, 조성물의 상기 세포의 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99%는 Tr1 세포이다. 또 다른 구체예에서, 농축 조성물/집단 중의 Tr1 세포의 백분율은 농축 전의 Tr1 세포의 백분율의 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배이다. 본 발명에서 "약"이라는 용어가 숫자 앞에 올 경우 그 숫자의 10%를 상회 또는 하회하는 값을 포괄하는 것이다.
T 세포를 함유하는 어떠한 세포 공급원이든 Tr1 세포를 분리/농축하는데 이용할 수 있다. 유용한 공급원의 비제한적인 예로는 말초 혈액, 활액, 비장, 흉선, 임파절, 골수, Peyer's 팻치 및 편도를 들 수 있다.
농축 방법은 농축 과정의 각 단계에 연관된 농축 수준에 따라 다양할 수 있다. Tr1 세포의 농축 수준 및 순도 백분율은 예컨대 도너, 세포/조직 공급원 및 도너의 질병 상태와 같은 여러 인자 (이에 한정되지 않음)에 의해 달라진다. 특정 구체예에서, Tr1 세포는 적어도 약 2-배, 약 5-배, 약 10-배, 약 15-배, 약 20-배, 약 25-배, 약 30-배, 약 35-배, 약 40-배, 약 50-배, 약 55-배, 약 60-배, 약 65-배, 약 70-배, 약 75-배, 약 80-배, 약 85-배, 약 90-배, 약 95-배, 약 100-배, 약 105-배, 약 110-배, 약 115-배, 약 120-배, 약 130-배, 약 140-배, 약 150-배, 또는 약 200-배 농축된다.
세포를 격리, 분리 또는 선별하는 방법의 비제한적인 예로는 항체-코팅된 자성 비드 (Schwartz, et al, U.S. Pat. No. 5,759,793)를 이용하는 자성 분리법 및 친화성 크로마토그래피법 또는 고체 매트릭스 (예컨대 플레이트)에 부착된 항체를 이용하는 "패닝(panning)법"을 들 수 있다. 정확한 분리를 가능케하는 또 다른 기술의 예로는 다중 색상 채널, 저각도 및 둔감한(obtuse) 광스캐터링 검출 채널 또는 임피던스 채널을 갖는 것과 같이, 정밀도를 다양하게 조절할 수 있는 형광-활성화 세포 소터(FACS)를 들 수 있다. 죽은 세포와 관련된 염료, 예컨대 (프로피듐 요오다이드, LDS)를 이용한 선별에 의해 죽은 세포들을 제거할 수 있다. 적혈구는 예컨대 일루트리에이션, 용혈, 또는 Ficoll-Paque 구배에 의해 제거할 수 있다. 선택된 세포의 생존능에 과도하게 유해하지 않은 한 어떤 기술이든 이용가능하다.
편의상, 여러가지 목적으로 항체를 표지와 컨쥬게이션시킬 수 있다: 예컨대, Tr1 세포의 용이한 분리를 가능케 하는 자성 비드; 아비딘이나 스트렙트아비딘에 높은 친화도로 결합하는 바이오틴; 형광 활성화 세포 소터와 함께 이용할 수 있는 플루오로크롬; 합텐 등을 들 수 있다. 다색 분석은 FACS과 함께 또는 면역자성 분리 및 유세포분석과의 조합과 함께 이용될 수 있다. 다색 분석은 복수개의 표면 항원:예컨대 non-CD4+ 면역 세포 마커 (CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR 감마/델타 및 글리코포린 A), CD4, CD25, CD127 및 CD62L에 기초한 세포 분리에 유용하다. 다색 분석에 사용되는 플루오로크롬의 비제한적인 예로는 피코빌리단백질, 예컨대 피코에리쓰린 및 알로피코시아닌; 플루오레신 및 텍사스 레드를 들 수 있다.
자성 분리는 자기장 구배 내의 원심분리 튜브 또는 컬럼과 같은 용기 내에서 자성 물질을 선택적으로 보유하는데 사용되는 프로세스이다. Tr1 세포는 면역-친화성 상호반응을 비롯한, 특이적 상호반응을 통해 세포 표면에 자성 입자들을 결합시킴으로써 자성에 의해 표지시킬 수 있다. 이어서, 적절한 용기 내에 Tr1 세포를 함유하는 현탁액을 현탁액 중의 다른 세포로부터 Tr1 세포를 분리하는데 충분한 강도의 자기장 구배에 노출시킨다. 이어서 용기를 적절한 플루이드로 세척하여 표지되지 않은 세포를 제거함으로써, Tr1 세포의 정제된 현탁액을 얻는다.
자성 표지 시스템의 대다수는 그의 표면에 공유 결합된 스트렙트아비딘 또는 모노클로날 항체와 함께 초상자성 입자들을 이용한다. 세포 분리 적용시, 이들 세포들을, 관심 대상인 세포들을 자성 표지 및 유지시키는 포지티브 선별 또는 목적하지 않은 세포들의 대다수를 자성 표지하여 유지시키는 네가티브 선별에 이용할 수 있다. 사용되는 입자의 직경은 MACS 입자 (Miltenyi Biotec) 및 StemSep(TM) 콜로이드 (StemCell Technologies)의 경우 약 50-100 nm, EasySep(R) (StemCell Technologies) 및 Imag 입자 (BD Biosciences)의 경우 150-450 nm, Dynabeads (Dynal Biotech)의 경우 4.2 ㎛이다. 사용된 입자 종류는 표지된 세포를 분리하는데 사용되는 마그넷 기술에 의해 영향을 받는다.
자성 분리 기술에는 2가지 중요한 부류가 있는데, 이들 두 종류 모두 편의성과 실무적인 관점에서, 전자석과 대비되는 영구자석을 사용한다. 첫번째 부류는 작고 약하게 자성을 띤 입자들을 이용하여 관심 대상인 표적을 표지시킨 다음 이들 표적을 자성을 띤 매트릭스가 충전된 컬럼 중에서 분리한다. 컬럼에 자기장이 인가되면 매트릭스 원소들의 표면 부근에서 매우 높은 구배가 발생한다. 이러한 높은 구배는 이들 상대적으로 약한 자성 입자들로 표지된 표적들을 분리하는데 필요하다. 두번째 부류는 관심대상인 표적을 보다 강한 자성 입자들로 표지시키는데 이용된다. 이들 관심 대상인 표적들을 튜브 외부의 자석에 의해 발생한 자기장 구배에 의해 원심분리형 튜브 내에서 분리한다. 이 방법은 구배를 발생시키기 위해 자기를 띨 수 있는 매트릭스에 의존하지 않아도 된다는 장점이 있으며; 그에 따라, 세척하기 불편하고 오염 제거 공정을 필요로 하는 값비싼 휴대용 컬럼이나 재사용가능한 컬럼을 필요로 하지 않는다.
일단 자석 내에 위치되면, 표지되지 않은 세포들은 탈락하는 반면, 표적화 세포들은 자기장 강도가 최고인 대역 또는 대역들을 향해 이동하며 그 자기장 내에 유지된다. 이어서 표적화 세포들을 수집하여 자기장으로부터 제거한 후에 사용할 수 있다. 네가티브 선별이 요구될 경우, 표지되지 않은 세포들을 유지시키고 이를 다양한 응용예에 이용할 수 있다.
FACS는 세포가 레이저 빔을 통과함에 따라 나타내는 그들의 광산란 특성에 기초하여 세포들의 서브집단을 분리할 수 있게 해준다. 전방 광산란기 (FALS)는 세포 크기와 연관이 있고, 측방 산란기 특징 (SSC)을 갖는 것으로도 알려진 광각 광 산란기는 세포 밀도, 세포 함량 및 핵-세포질 비율, 즉 세포 컴플렉시티와 연관이 있다. 세포들을 형광-컨쥬게이션된 항체로 표지할 수 있으므로, 이들을 항체(형광)강도에 의해 더욱 특징지을 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 Tr1 세포들을 면역-자성 크로마토그래피를 이용하여 분리한다. 예를 들어, 항CD4 항체를 자성 비드에 부착시킨다. 이 항체-표지된 자성 비드를 친화성 정제를 위한 기초로 사용한다. 항체-표지된 T 세포 분획을 자성 친화성 컬럼에 적용시킨다. 비부착성 세포들은 폐기되고 부착성 세포들은 자기장의 제거에 의해 자성 컬럼으로부터 용리된다. 또 다른 구체예에서는, 세포들을 항체 (예컨대, 항CD4)로 먼저 표지시킨 다음 자성 비드 또는 자성 스피어를 지니는 제2 항체로 표지시킨다.
또 다른 구체예에서는 Tr1 세포와 면역반응성인 제2 항체를 이용하여 Tr1 세포의 집단을 농축시킬 수 있다. 이러한 제2 항체의 사용은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 제2 항체는 제1 항체의 불변부와 면역반응성인 항체들이다. 바람직한 제2 항체로는 항토끼, 항마우스, 항래트, 항염소 및 항말 면역글로불린을 들 수 있으며 이들은 시판되고 있다. 시판되는 키트는 비제한적인 예로서 자성 입자 및 플루오로크롬과 같은 표지 시약(labeling agents)에 컨쥬게이트된 제2 항체를 제공한다.
본 발명의 한가지 구체예에서, Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포집단을 농축하는 방법은:
- non-CD4+ 세포의 마커에 결합하는 적어도 1종의 시약과 세포집단을 접촉시킴으로써, non-CD4+ 세포를 고갈시키는 단계,
- 전술한 바와 같이 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포를 동정한 다음 이들을 선별 및 분리하는 단계
를 포함할 수 있다.
non-CD4+ 세포에 결합하는 마커들의 비제한적인 예로는 CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, 및 글리코포린 A를 들 수 있다.
상기 마커에 결합하는 바람직한 시약은 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체들은 플루오로크롬 또는 자성 입자들과 컨쥬게이션된다. 또 다른 구체예에서, 세포 선별은 유세포분석법, 형광 활성화 세포 소팅법, 마그네틱 선별, 친화성 크로마토그래피 또는 패닝 또는 이들의 조합에 의하여 수행한다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 본 발명에 따라 분리된 Tr1 세포들은 WO2006/108882에 설명된 시험관내 방법에 의하여 더욱 증폭될 수 있다. 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 배양 배지 Mf에서 35℃ 미만의 온도 T1에서 곤충 피더 세포와 같은 피더 세포를 배양하는 단계. 여기서 상기 온도 T1은 피더 세포가 증식하도록 하는 온도이고 상기 피더 세포는 다음의 세포 표면 단백질과 상호반응하는 인자들을 발현한다:
- CD3/TCR 복합체,
- CD28 단백질
- IL-2 수용체,
- CD2 단백질,
- IL-4 수용체
b) 세척되거나 또는 Mf 배양 배지가 없도록 처리된, a) 단계에서 얻은 피더 세포를 배양 배지 Mp 중에 함유된 Tr1 세포집단과 접촉시키는 단계. 여기서 Tr1 세포집단, 피더 세포 및 배양 배지 Mp를 함유하는 혼합물을 얻기 위해, 상기 배양 배지 Mp는 a) 단계에서 언급된 인자들을 처음에는 함유하지 않는다;
c) 적어도 35℃인 온도 T2에서 상기 b) 단계에서 얻은 혼합물을 배양하는 단계, 상기 온도는 Tr1 세포집단은 증식하고 피더 세포는 증식하지 않도록 선택된 온도이다;
d) 이렇게 증폭된 Tr1 세포집단을 회수하는 단계.
전술한 세포 표면 단백질과 상호반응하는 인자들의 예로는 다음을 들 수 있다:
- CD3 중쇄의 항CD3 세포질내 도메인이 트랜스막 도메인에 의해 대체되어 있는 변형된 항CD3 항체 또는 항CD3 모노클로날 항체,
- CD80 또는 CD85 단백질
- 피더 세포에 의해 분비된 IL-2
- CD58 단백질
- IL-4 및 IL-13을 포함하는 군으로부터 선택된 인터류킨.
본 발명의 한가지 구체예에서, 이렇게 수득된 Tr1 세포들은 T 세포를 클로닝하는 통상적인 방법에 의해 클로닝될 수 있다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 이렇게 수득된 Tr1 세포 또는 Tr1 세포 클론은 보관을 위해 동결시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포집단에서 Tr1 세포를 고갈시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은:
- CD4 및 저수준의 CD127 및 CD62L을 발현하는 세포를 동정하고,
- 상기 세포를 고갈시킴으로써
- Tr1 세포가 고갈된 세포집단을 수득/분리하는 것을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포집단에서 휴지 Tr1 세포를 고갈시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은:
- CD4 및 저수준의 CD127과 저수준의 CD62L 중 적어도 1종, 좋기로는 저수준의 CD27 및 저수준의 CD62L를 발현시키되, 및 CD25는 발현시키지 않는 세포들을 동정하고,
- 상기 세포를 고갈시킴으로써,
- 휴지 Tr1 세포가 고갈된 세포집단을 수득/분리하는 것을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포집단에서 활성화 Tr1 세포를 고갈시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은:
- CD4, CD25 및 저수준의 CD127 및 CD62L를 발현하는 세포를 동정하고,
- 상기 세포를 고갈시킴으로써
- 활성화 Tr1 세포가 고갈된 세포집단을 수득/분리하는 것을 포함하여 이루어진다.
Tr1 세포-고갈형 조성물/집단은 Tr1 세포의 백분율이 본래 수득된 세포집단 중의 Tr1 세포의 백분율보다 낮은 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 따라 수득된 Tr1 세포-고갈형 세포집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 따라 수득된 휴지 Tr1 세포-고갈형 세포집단이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 따라 수득된 활성화 Tr1 세포-고갈형 세포이다.
전술한 바와 같이, 세포를 분리하는 방법의 비제한적인 예로는 항체-코팅된 자성 비드를 이용하는 마그네틱 분리법, 친화성 크로마토글개피법 또는 고체 매트릭스 (예컨대 플레이트)에 부착된 항체를 이용하는 "패닝법" 및 형광-활성화 세포 소터 (FACS)를 들 수 있다. 선택되는 대신, Tr1 세포들은 고갈된다.
한가지 구체예에서, 고갈형 조성물/집단 중의 Tr1세포의 백분율은 고갈 전의 Tr1 세포의 백분율의 0.75배 이하, 0.7배 이하, 0.6배 이하, 0.5배 이하, 0.4배 이하, 0.3배 이하, 0.25배 이하, 0.2배 이하, 0.15배 이하, 0.1배 이하이다.
본 발명의 또 다른 목적은 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포-고갈형 세포집단 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나 이들로 구성되는 의약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Tr1 세포집단, 휴지 Tr1 세포집단 또는 활성화 Tr1 세포집단을 동정 또는 분리하거나, 또는 세포집단에서 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포를 농축 또는 고갈시키기 위한 키트를 제공하는 것으로 여기서 상기 키트는 CD4, CD25, CD127 및 CD62L의 세포 표면 발현을 검출하기 위한 시약을 포함하는 것이다.
좋기로는 상기 시약은 항체이다. 또 다른 구체예에서, 이들 항체들은 플루오로크롬 또는 자성 입자들과 컨쥬게이션된다.
또 다른 구체예에서, 상기 키트는 또한 Foxp3 발현을 검출하기 위한 시약을 더 포함한다. 좋기로는, 상기 시약은 항체인 것이 바람직하다. 더욱 좋기로는, 상기 항체는 플루오로크롬에 컨쥬게이션된 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상체에게 본 발명에 따른 분리되거나 농축된 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 대상체에 있어서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 대상체에 있어서 면역 반응을 억제하는 방법으로서, 이 방법은:
- 전술한 방법에 따라 생물학적 샘플로부터 휴지 Tr1 세포를 분리하고,
- 상기 Tr1 세포를 증폭시키고,
- 대상체에게 상기 증폭된 Tr1 세포를 투여하는 것을 포함하여 이루어진다.
이에 따라 대상체에게 투여된 증폭된 Tr1 세포들은 그들의 억제 활성에 의해, 원치 않는 면역 반응을 억제함으로 해서, 원치 않는 면역 반응과 관련된 증상들을 치료할 수 있다.
세포 치료법의 관점에서 휴지 Tr1 세포를 분리하는 한가지 장점은 투여되는 세포집단이 순수하다는 것이다. 휴지 Tr1세포의 사용시 얻어지는 또 다른 장점은 이들의 효능이다. 사실상, 당업자에게는 이미 활성화된 T 세포집단의 활성화가 시험관내에서 세포 사멸성(mortality)를 유발하여, 생체내에서 덜 효과적이게 될 것이라는 것이 알려져 있다. 순수한 Tr1 세포집단을 사용하여 얻어지는 또 다른 장점은 시간 절약 및 비용 절감 측면이다. 사실상, 이 집단을 세포 치료에 충분한 숫자로 시험관내에서 증폭시키는데 걸리는 시간은 단지 약 2주일에 불과하다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 휴지 Tr1 세포는 예컨대 말초 혈액 또는 제대혈과 같은 혈액, 또는 임파절 생검물, 내장 또는 활액 생검물 또는 점막 조직 생검물과 같은 조직 생검물 또는 기관지페포세척액 또는 뇌척수액으로부터 얻을 수 있다.
또 다른 구체예에서, 휴지 Tr1 세포는 자가(autologous) 또는 동종이형(allogeneic)이다. 본 발명에서 "동종이형 세포"라 함은 한 대상체 (도너)로부터 분리된 다음 다른 사람 (수혜자 또는 호스트)에게 주입된 세포를 가리킨다. 본 발명에서 "자가 세포"라 함은 동일한 대상체로부터 분리되어 다시 그 동일한 대상체에게 주입되는 세포를 칭한다.
휴지 Tr1 세포집단을 증폭시키는 방법은 기술 분야에 공지이다.
본 발명의 한가지 구체에에서, 휴지 Tr1 세포는 WO2006/108882에 설명된 바와 같이 시험관내 증폭된다. 상기 방법은 다음을 포함하여 이루어진다:
a) 배양 배지 Mf에서 35℃ 미만의 온도 T1에서 곤충 피더 세포와 같은 피더 세포를 배양하는 단계. 여기서 상기 온도 T1은 피더 세포가 증식하도록 하는 온도이고 상기 피더 세포는 다음의 세포 표면 단백질과 상호반응하는 인자들을 발현한다:
- CD3/TCR 복합체,
- CD28 단백질
- IL-2 수용체,
- CD2 단백질,
- IL-4 수용체
b) 세척되거나 또는 Mf 배양 배지가 없도록 처리된, a) 단계에서 얻은 피더 세포를 배양 배지 Mp 중에 함유된 Tr1 세포집단과 접촉시키는 단계. 여기서 Tr1 세포집단, 피더 세포 및 배양 배지 Mp를 함유하는 혼합물을 얻기 위해, 상기 배양 배지 Mp는 a) 단계에서 언급된 인자들을 처음에는 함유하지 않는다;
c) 적어도 35℃인 온도 T2에서 상기 b) 단계에서 얻은 혼합물을 배양하는 단계, 상기 온도는 Tr1 세포집단은 증식하고 피더 세포는 증식하지 않도록 선택된 온도이다;
d) 이렇게 증폭된 Tr1 세포집단을 회수하는 단계.
전술한 세포 표면 단백질과 상호반응하는 인자들의 예로는 다음을 들 수 있다:
- CD3 중쇄의 항CD3 세포질내 도메인이 트랜스막 도메인에 의해 대체되어 있는 변형된 항CD3 항체 또는 항CD3 모노클로날 항체,
- CD80 또는 CD85 단백질
- 피더 세포에 의해 분비된 IL-2
- CD58 단백질
- IL-4 및 IL-13을 포함하는 군으로부터 선택된 인터류킨.
항CD3 모노클로날 항체는 TCR/CD3 복합체, 좋기로는 변형된 항CD3 항체를 통해 T 세포집단을 활성화시키는데 이용될 수 있는데, 여기서 항CD3 항체의 변형은 세포질내 도메인을 트랜스막 도메인으로 대체시켜, 상기 변형된 항CD3 항체가 피더 세포의 세포막에 앵커링하여 T 세포의 CD3/TCR 단백질 복합체와 상호반응하게 된다. 항원-특이적 Tr1 세포의 표면에 존재하는 CD28과 상호반응하며 피더 세포에 의해 발현되는 팩터는 CD28 분자와 가교할 수 있는 항CD28 모노클로날 항체 또는 그의 단편일 수 있다; 이 경우, 트랜스막 도메인이 피더 세포의 세포 표면에 앵커링하도록, 트랜스막 도메인을 첨가함으로써 항CD28 모노클로날 항체를 변형시킬 수 있다. 좋기로는, 항CD28 모노클로날 항체 대신, CD28에 대한 천연 리간드, 다시 말해서 예컨대 B7-1(CD80) 및 B7-2 (CD86) 단백질과 같은 B7 패밀리의 단백질 멤버를 사용하는 것이 바람직하다.
CD2와 상호반응하는 피더 세포에 의해 발현되는 팩터는 CD2 분자와 가교될 수 있는 항CD2 모노클로날 항체 또는 그의 단편일 수 있다; 항CD2 모노클로날 항체의 변형을 위해 피더 세포의 세포 표며에 대한 앵커링을 위해 트랜스막 도메인을 첨가하는 방법을 상정할 수 있다. 좋기로는, 항CD2 모노클로날 항체 대신 CD2에 대한 천연 리간드, 즉 CD58 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.
피더 세포의 세포막에 앵커링되는 팩터들에 더해, 인터류킨과 같이, 분비되는 팩터은 항원-특이적인 Tr1 세포집단의 증폭에도 필요하다. 이들 인터류킨들로는 항원-특이적인 Tr1 세포의 표면에 존재하는 IL-2 수용체와 반응하는 IL-2, 항원-r이적인 Tr1 세포의 IL-4 수용체ㅘ 상호반응하는 IL-4 또는 IL-13을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 휴지 Tr1 세포는 IL-2, IL-4, IL-13 및/또는 IL-15와 같은 시토카인의 존재 하에 Tr1 세포를 항CD3/28 비드와 배양시킴으로써 증폭된다. 휴지 Tr1 세포를 증폭시키기 위한 상기 키트의 한가지 예는 Invitrogen (Cat No. 11-41D)사가 시판하는 Dynabeads
Figure pct00001
키트이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 휴지 Tr1 세포는 항원 존재 하에, Tr1 세포를 자가 PBL, 백혈구, PBMC, L 세포와 같은 MHC 클래스 II를 발현하는 인공 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포와 함께 배양함으로서 증폭된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 휴지 Tr1 세포는 Tr1 세포를 IL-2와 같은 시토카인의 존재 하에 PHA와 같은 미토겐과 함께 배양함으로써 증폭된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이렇게 증폭된 Tr1 세포는 T 세포를 클로닝하는 통상적인 방법에 의해 클로닝될 수 있다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 이렇게 증폭된 Tr1 세포 또는 Tr1 세포 클론은 보관을 위하여 동결시킬 수 있다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 증폭된 Tr1 세포는 하나의 항원에 특이적이거나 또는 복수개의 항원에 특이적이다.
증폭된 Tr1 세포가 특이성을 나타내는 항원의 비제한적인 예로는 자가항원; 일반적인 인간의 식습관으로부터 유래하는 식품 항원; 다발경화증 항원 또는 관절 관련 항원과 같은 염증성 항원; 및 알레르겐을 들 수 있다.
"일반적인 식습관으로부터 유래하는 식품 항원"이라는 용어는 인간이 일반적으로 섭취하는 식품으로부터 유래되는 면역원성 펩타이드를 가리키는 것으로, 예를 들면 다음의 비제한적인 리스트의 식품 항원을 들 수 있다: 소의 항원 예컨대 리포칼린, Ca-결합 S100, 알파-락트알부민, 락토글로불린, 예컨대 베타-락토글로불린, 소혈청 알부민, 카제인. 식품-항원은 또한 파르브알부민과 같은 대서양 연어 항원, 닭 항원 예컨대 오보뮤코이드, 오브알부민, Ag22, 콘알부민, 리소자임 또는 닭 혈청 알부민, 땅콩, 새우 항원, 예컨대 트로포미오신, 밀 항원 예컨대 아글루티닌 또는 글리아딘, 셀러리 항원 예컨대 셀러리 프로필린, 당근 항원 예컨대 당근 프로필린, 사과 항원 예컨대 타우마틴, 사과 지질 전달 단백질, 사과 프로필린, 배 항원 예컨대 배 프로필린, 이소플라본 환원효소, 아보카도 항원 예컨대 엔도키티나제, 살구 항원 예컨대 살구 지질 전달 단백질, 복숭아 항원 예컨대 복숭아 지질 전달 단백질 또는 복숭아 프로필린, 대두 항원 예컨대 HPS, 대두 프로필린 또는 (SAM 22) PR-I0 prot일 수도 있다.
"자가 항원 (auto-anrigen)"이라는 용어는 상기 개체의 단백질로부터 유래된 면역원성 펩타이드를 칭한다. 자가 항원의 비제한적인 예로서 다음을 들 수 있다: 아세틸콜린 수용체, 액틴, 아데닌 뉴클레오타이드 트랜스로케이터, β-아드레노수용체, 방향성 L-아미노산 데카르복실라제, 아시오알로당단백질 수용체, 살균/투여성 증진 단백질 (BPi), 칼슘 인식 수용체, 콜레스테롤 측쇄 절단 효소, 콜라겐형 IV Oy-사슬, 시토크롬 P450 2D6, 데스민, 데스모글레인-1, 데스모글레인-3, F-액틴, GM-강글리오사이드, 글루타메이트 데카르복실라제, 글루타메이트 수용체, H/K ATPase, 17-알파-히드록실라제, 21-히드록실라제, IA-2 (ICAS 12), 인슐린, 인슐린 수용체, 고유 인자 타잎 1, 백셜구 기능 항원 1, 미엘린 관련 당단백질, 미엘린 염기성 단백질, 미엘린 희소돌기아교세포 단백질, 미오신, p-80 콜린, 피루베이트 데스히드로게나제 복합체 E2 (PDC-E2), 요오드화나트륨 심포터, SOX-10, 갑상선 및 안근육 공유 단백질, 타이로글루불린, 갑상선 퍼옥시다제, 타이로트로핀 수용체, 조직 ㅌ트랜스글루타미나제, 전사 공활성화제 p75, 트립토판 히드록실라제, 티로시나제, 티로신 히드록실라제, ACTH, 아미노아실-tRNA-히스티딜 신테타제, 카르지올리핀, 카보닐 안하이드라제 II, 세브트로미어 관련 단백질, DNA-의존성 뉴클레오좀-자극형 ATPase, 피브릴라린, 피브로넥틴, 글루코스 6 포스페이트 이소메라제, ㅂβ 2-당단백질 I, 골긴 (95, 97, 160, 180), 열충격 단백질, 헤미데스모소말 ㄷ단백질 180, 히스톤 H2A, H2B, 케라틴, IgE 수용체, Ku-DNA 단백질 키나제, Ku-핵단백질, La 인단백질, 미엘로퍼옥시다제, 프로테이나제 3, RNA 폴리머라제 I-III, 신호 인식 단백질, 토포이소머라제 I, 튜불린, 비멘신, 미엘린 관련 희소돌기아교세포 염기성 단백질 (MOBP), 단백지질 단백질, 희소돌기아교세포 특이 단백질(OSP/클라우딘 11), 사이클릭 뉴클레오타이드 3' 포스포디에스테라제 (CNPase), BP 항원 1 (BPAGl-e), 트랜스알돌라제 (TAL), 인간 미토콘드리아 자가항원 PDC-E2 (Novo 1 및 2), OGDC-E2 (Novo 3), 및 BCOADC-E2 (Novo 4), 수포성 유천포창 (BP)180, 라미닌 5 (LN5), DEAD-박스 단백질 48 (DDX48) 또는 인슐리노마 관련 항원-2.
"다발경화증-관련 항원"이라는 용어는 미엘린 염기성 단백질 (MBP). 미엘린 관련 당단백질 (MAG), 미엘린 올리고가지세포 단백질 (MOG), 단백지질 단백(PLP), 올리고가지세포 미엘린 올리고단백질 (OMGP), 미엘린 관련 올리고가지세포 염기성 단백질 (MOBP), 올리고가지세포 특이적인 단백질 (OSP/Claudinl 1), 열충격 단백질, 올리고가지세포 특이적인 단백질 (OSP), NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22 (PMP22), 2',3'-시클릭 뉴클레오타이드 3"-포스포디에스테라제 (CNPase), 그의 단편, 변이체 및 혼합물을 칭한다.
"관절-관련 항원"이라는 용어는 시트룰린-치환된 시클릭 및 선형 필라그린 펩타이드, 콜라겐 II형 펩타이드, 인간 연골 당단백질 39 (HCgp39) 펩타이드, HSP, 이종 핵 리보핵단백질 (hnRNP) A2 펩타이드, hnRNP Bl, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, 65, 70 및 90, BiP, 케라틴, 비멘틴, 피브리노겐, 콜라겐 I, III, IV 및 V 펩타이드, 아넥신 V, 글루코스 6 포스페이트 이소머라제 (GPI), 아세틸-칼파스타틴, 피부레이트 데스히드로게나제 (PDH), 알돌라제, 토포이소머라제 I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-100, 인지질 항원, 예컨대 음이온성 카르디올리핀 및 포스파티딜세린, 중성 하전된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 피브릴린, 아그레칸을 가리킨다.
"알레르겐"이라는 용어는 흡입형 알레르겐, 섭취형 알레르겐 또는 접촉성 알레르겐을 칭한다. 알레르겐의 비제한적인 예로는 화분(Cup, Jun), 집먼지 진드기 (Der, Gly, Tyr, Lep), 개, 고양이 및 설치류 (Can, Fel, Mus, Rat)로부터 유래한 흡입형 알레르겐을 들 수 있다. 접촉성 알레르겐의 비제한적인 예로는 중금속 (예컨대 니켈, 크롬, 금), 라텍스, 합텐, 예컨대 할로쎄인, 히드랄라진을 들 수 있다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 증폭된 Tr1 세포는 비경구, 근육내, 조직내, 정맥내, 복강내 주사, 비내 흡입, 폐 흡입, 피내 또는 동맥내 주사에 알맞게 조서오딜 수 있다.
좋기로는, 증폭된 Tr1 세포는 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사되거나 또는 환자의 임파절 내로 직접 주사되거나, 더욱 좋기로는 정맥 주사에 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적은 휴지 Tr1 세포와 활성화 Tr1 세포와의 혼합물인 증폭된 Tr1 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나 이들로 구성된 의약 조성물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 휴지 Tr1 세포와 활성화 Tr1 세포와의 혼합물을 포함하는 의약 조성물로서, 여기서 상기 혼합물은 전술한 방법에 의해 수득된 분리된 휴지 Tr1 세포집단을 시험관내 증폭시킴으로써 수득되는 것이다.
따라서, 본 발명의 의약 조성물은 다음의 표현형 CD4+CD25-CD127lo /-CD62Llo /- 을 갖는 휴지 Tr1 세포 및 다음의 표현형 CD4+CD25+CD127lo /-CD62Llo /-을 갖는 활성화 Tr1tpvhfmf 포함하여 이루어진다.
대상체에게 투여하고자 하는 증폭된 Tr1 세포의 표현형은 유세포분석법에 의해 분석할 수 있다.
증폭 단계 말기에, 증폭된 Tr1 세포는 2가지 단계, 즉: 휴지기 단계와 활성화 단계가 그것이다. 활성화된 Tr1 세포는 투여 직후 염증을 억제할 수 있는 반면, 휴지 Tr1 세포는 생체내에서 증폭되기 위해 인 시투(in situ) 활성화될 필요가 있고 그들의 억제 활성을 장기간 발휘할 수 있으므로, 이러한 점을 고려할 때 본 발명자들은 휴지 Tr1 세포와 활성화 Tr1 세포와의 혼합물을 포함하는 조성물이 유리할 것으로 생각하나, 특정 이론에 구애되는 것은 아니다.
한가지 구체예에서, 대상체는 골수이식이나 장기 이식과 같은 이식을 받거나 이식을 받은 대상체가다.
또 다른 구체예에서, 대상체는 미생물 감염, RSV 감염, 알레르기와 같은 감염에 걸린 대상체가다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 분리 또는 농축된 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 대상체에 있어서 염증성 병태를 예방 또는 치료하기 위한 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 분리 또는 농축된 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 대상체에 있어서 자가면역 병태를 예방 또는 치료하기 위한 방법이다.
한 가지 구체예에서, 상기 대상체는 골수 이식 또는 기관 이식과 같은 장기 이식을 겪었거나 겪고 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 대상체는 감염, 예컨대 미생물 감염, RSV 감염, 알레르기를 겪는다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 단리된 또는 강화된 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체의 염증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 단리된 또는 강화된 Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체의 자가 면역 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, Tr1 세포-강화 조성물이 도입되는 대상체로부터 세포집단을 얻을 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 상기 대상체는 면역 반응의 억제가 요구되는 대상체일 수 있다.
한 가지 구체예에서, 상기 대상체는 염증성 질환 또는 질병/장애로 영향받은 인간이며, 상기 염증성 질환 또는 질병/장애는, 예컨대 비 면역 염증성 장 질환, 수술 후 협착, 관상 동맥 질환, 간 섬유증, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 염증성 췌장염, 역행성 췌담관 조영 유발성 췌장염, 화상, 관상 동맥, 뇌 및 말초 동맥의 죽종 형성, 맹장염, 담낭염, 게실염, 내장 섬유성 장애, 상처 치유, 피부 흉터 장애 (켈로이드, 화농성 한선염), 육아종성 장애 (유육종증, 원발성 담즙성 간경변), 천식, 괴저성 농피증 (pyoderma gandrenosum), 스위트 증후군, 베체트 병, 원발경화성담관염 및 농양 등을 포함하는 임의의 질병/장애이나 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 구체예에서, 상기 대상체는 자가 면역 질환 또는 질병/장애로 영향받은 인간이며, 상기 염증성 질환 또는 질병/장애는, 예컨대 홍반 루푸스, 심상성 천포창, 갑상샘염, 혈소판 감소성 자반병, 그레이브스 병, 당뇨병, 청소년 당뇨병, 자연 면역 당뇨병, 중증 근무력증, 애디슨 병, 류마티스 관절염 등의 관절염, 강직성 척추염, 청소년 특발성 관절염, 건선성 관절염; 다발성 경화증, 건선, 포도막염, 자가 면역 용혈성 빈혈, 강피증, 자가 면역 염증성 장 질환 등의 장 염증 질환, 크론 병, 대장염, 식품 알레르기 관련 장 감염; 스요르겐 병 (Sjorgen's disease), 하시모토 병, 중증 근무력증, 자가 면역 다내분비성 증후군, 제1형 진성 당뇨병 (TIDM), 자가 면역성 위염, 자가 면역성 포도막염 (autoimmune uveoretinitis), 다발 근육염, 및 갑상샘염 등을 포함하는 임의의 질병/장애이나 이에 국한되는 것은 아닐 뿐 아니라 인간 루푸스에 의하여 유형화된 일반적인 자가 면역 질환에 있어서도 그러하다. 본 발명에서 사용되는 "자가 항원 (Autoantigen)" 또는 "셀프-항원 (self-antigen)"이라는 용어는 포유 동물에 내재하는 항원 또는 에피토프를 말하는 것이며, 상기 포유 동물의 질병에 있어서 면역성이다.
본 발명의 세포들은 장기 이식 반응, 예컨대 이식편 대 숙주 병 (GVHD), 조혈 줄기 세포 이식 및 이식 거부를 예방하거나 치료하는 데 사용될 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 대상체는 알레르기 또는 천식 질환에 의하여 영향받는다. 알레츠기 또는 천식 질환의 예로는 천식, 아토피성 피부염, 알레르기 비염, 결막염, 습진, 접촉성 알레르기, 흡입성 알레르기, 섭취성 알레르기 및 과민증을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
환자에의 Tr1 세포의 도입은 이 기술 분야에서 잘 알려진 방법, 예컨대 양자 세포 전달법 (adoptive cell transfer) 등을 사용하여 이루어진다. 간략히, 표적 공여자로부터 혼합 상태의 세포집단이 추출된다. 본 발명에 따라, 세포들은 질병의 완화기 또는 질병의 활성화기 중에 추출될 수 있다. 일반적으로, 이것은 전혈을 추출하고 성분 채집을 통하여 과립구를 수집함으로써 이루어진다. 예컨대, 대부피 성분 채집 (large volume leukapherisis, LVL)이 백혈구 수득률을 최대화하는 것으로 나타났다. 수집된 백혈구들은 본 발명에서 설명하고 있는 것과 같은 Tr1-특이성 세포 마커들에 기반한 세포 단리 기술을 사용하여 단리될 수 있고, 그 후 양자 면역 억제 (adoptive immune suppression)를 위하여 환자, 통상적으로 세포 공여자 (공여자와 수용자가 상이한 GVHD의 경우는 제외된다)에게 융합될 수 있다.
대략 103 내지 1011, 좋기로는 104 내지 1010, 좋기로는 105 내지 109, 좋기로는 106 내지 109, 더 좋기로는 106 내지 108 의 Tr1 세포들이 환자에게 주입된다.
본 발명에서 사용되는 "유효량"이라는 용어는 질병의 중증도 및/또는 지속 기간 또는 한 가지 이상의 증상들을 저감 (임의의 수준으로) 또는 개선, 질병의 진행을 예방, 질병의 퇴치를 야기, 재발, 병증 진행, 질병과 관련된 한 가지 이상의 증상들의 개시 또는 진전을 방지, 질병을 탐지 또는 다른 치료법 (예컨대, 예방제 또는 치료제)의 예방 또는 치료 효과를 증강 또는 개선시키기에 충분한 치료 물질 또는 조성물의 양을 의미한다. 유효량은 대상체의 연령, 성별, 인종, 종, 일반적인 조건 등, 치료 대상 질환의 중증도, 투여되는 특정 제제, 치료 기간, 임의의 병행 치료의 성질, 사용되는 제약학적 허용 담체 및 이 기술 분야의 숙련자의 지식과 전문성 범위 내의 유사 요인들에 따라 달라질 것이다. 적절하게는, 임의의 각 개체의 경우에 "유효량"은 적절한 텍스트 및 문헌 및/또는 일반적인 실험을 이용하여 (예컨대, Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore MD; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway NJ 참고) 이 기술 분야의 통상의 기술자에 의하여 결정될 수 있다.
"예방하다 (prevent)", "예방하는 (preventing)" 및 "예방 (prevention)"이라는 용어들은 본 발명에서 치료법 (예컨대, 예방제 또는 치료제)의 적용, 또는 병용 치료법 (예컨대, 예방제 또는 치료제의 병용)의 적용 결과 대상체에서 나타나는 질병 진행 또는 개시의 억제 또는 질병의 한 가지 이상의 증상들의 재발, 개시 또는 진행의 방지를 말한다. "치료 (treatment)" 또는 "치료하는 (treating)"이라는 용어는 최소한 숙주 내에서 상기 질병과 관련된 증상들의 개선이 이루어짐을 의미하고, 여기서 개선은 최소한 파라미터, 예컨대 치료 대상 질환과 관련된 증상 수치의 감소를 일컫는 광범위한 개념으로 사용된다. 이렇게, 치료는 병리적 질환 또는 적어로 그와 관련된 증상들이 온전히 억제, 예컨대 발생 방지 또는 정지, 예컨대 종결되는 상황도 포함하며, 그로써 숙주가 더 이상 상기 질병으로 고통받지 않거나 적어도 그 질병의 특징인 증상들로 고통받지 않는 상황도 역시 포함한다.
본 발명에서, "대상체"라는 용어는 동물, 좋기로는 포유 동물이고, 가장 좋기로는 인간을 말한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 본 발명에서 설명한 바와 같은 저감된 Tr1 세포집단, 휴지 Tr1 세포집단 또는 활성화 Tr1 세포집단의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체의 이식된 세포집단의 면역 반응을 증가시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 본 발명에서 설명한 바와 같은 저감된 휴지 Tr1 세포집단 또는 활성화 Tr1 세포집단의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체의 이식된 세포집단의 면역 반응을 증가시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 이식된 세포집단 중 Tr1 세포의 부재는 어떠한 Tr1 세포도 그 억제 활성을 나타내지 못하기 때문에 원하는 면역 반응의 증가를 가능하게 한다.
한 가지 구체예에서, 상기 방법은 암 치료 중인 대상체를 치료하기 위한 방법이다.
한 가지 구체예에서, 상기 이식된 세포집단은 항원-특이적 효과자 (effector) T 세포집단이다. 좋기로는 상기 T 세포집단은 종양 항원, 예컨대 흑색종의 MART-1 (Melan A) 또는 흑색종의 MAGE 1, 2, 3, 갑상선수질암 (thyroid medullary), 소세포 폐암, 대장 및 / 또는 기관지 편평 세포 암 등에 대하여 특이적이다.
상기 구체예에서, 이식되는 세포집단은 치료 대상 환자에게 투여되기 전 시험관 내에서 (in vitro) 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포 중에서 저감된다.
조절 T 세포의 저감은 암 환자들에게서 백신-매개 면역의 증강을 보여주었다 (Dannull et al., 2005, 115(12):3623-3633). 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서, Tr1 세포, 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포의 저감은, 치료시 상기 Tr1 세포가 유해하거나 해가 될 수 있는 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 세포 치료법에서 이용될 수 있다. 예컨대, 암 치료에 있어서, 일시적인 Tr1 세포의 저감은 백신처리/면역요법 프로토콜 전에 흥미로운 것일 수 있고, 상기 일시적인 저감은 본 발명의 저감법에 따른 장치를 이용하여 생체 외에서 (ex vivo) 환자의 혈액을 방혈하고 즉시 상기 환자에게 재주입함으로써 얻을 수 있다. 그러므로, 상기 구체예에서, 환자 혈액 중의 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포의 저감은 장치를 통하여 생체 외에서 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 치료 전 및 치료 후에 생물학적 시료 중의 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단을 동정하는 단계를 포함하는 대상체에 대한 치료 효과를 시험관 내에서 모니터링하기 위한 방법을 제공하는 것이고, 여기서 치료 후의 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단의 증가는 치료법에 대한 반응에 해당한다.
자가 면역 또는 염증성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 천식, 편평 태선 및 류마티스 관절염을 앓고 있는 대상체들에서 Tr1 세포가 손상되어 있다는 것은 이 기술 분야에 잘 알려져 있다. 그러므로, 치료 후 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단의 증가가 관찰될 수 있는 대상체가 치료법에 반응하는 대상체이다.
본 발명에 따르면, 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단의 동정은 상기 본 발명에 설명한 바와 같이 이루어진다.
한 가지 구체예에서, 생물학적 시료들은 치료 전과 치료 후 여러 시점, 예컨대 치료 중 매주 또는 매달 대상체로부터 얻을 수 있다.
도 1: 인간 nTreg 및 Tr1 세포 상에서 CD25 및 CD127의 표면 발현 및 Foxp3의 세포 내 발현. 결과를 CD3 및 CD28 분자의 리게이션을 통하여 자극된 (Act) 또는 휴지 상태에서 배양된 (Res) 4 가지 상이한 Tr1 및 nTreg 세포집단 상에서 발현하는 세포의 평균 %로 표현하였다.
도 2: 인간 nTreg 및 Tr1 세포 상에서 CD62L의 표면 발현. 결과를 CD3 및 CD28 분자의 리게이션을 통하여 자극된 (Act) 또는 휴지 상태에서 배양된 (Res) 4 가지 상이한 Tr1 및 nTreg 세포집단 상에서 발현하는 세포의 평균 %로 표현하였다.
도 3: (A) 인간 nTreg 및 Tr1 세포 상에서 CD62L, CD25 및 CD127의 표면 발현. 결과를 CD3 및 CD28 분자의 리게이션을 통하여 자극된 (Act) 또는 휴지 상태에서 배양된 (Res) Tr1 및 nTreg 세포집단의 평균 형광 세기 (MFI)로 표현하였다. (B)는 인간 nTreg 및 Tr1 세포 상에서 CD62L, CD25 및 CD127의 유동 세포 분석 염색의 대표적 히스토그램을 보여준다.
도 4: 활성화 nTreg 및 Tr1 마우스 세포 상에서 CD62L의 표면 발현. 결과를 발현하는 세포의 평균 %로 표현하였다.
도 5: (A) CD4+CD25-CD127lo 세포 상에서 CD62L의 표면 발현. (B) 결과를 CD4+CD25-CD127lo 군 중의 CD62L 발현 세포의 백분율로 표현하였다.
실시예
실험 과정
Tr1 세포 분리
Tr1 세포를 Brun 등의 문헌 (International Immunopharmacology, 2009)에 설명된 바와 같이 분리하였다. 간단히 설명하면, 말초 혈액 세포를 Ficoll 밀도 원심분리에 의해 분리하고, 식품 항원에 특이적인 Tr1 세포를 증폭시킬 수 있도록, 상기 혈액 세포를 식품 항원의 존재 하에 1 ml 당 2x106 세포로 배양하였다. 배양 13일 후, 세포들을 3주일 동안 제한 희석법에 의해 클로닝시켰다. 이어서 성장 클론들을 CD3/CD28 자극제(stimulatory agents)와 시토카인 (IL-2 및 IL-4)을 이용하여 증폭시켰다. 클론들의 Tr1 세포 아이덴티티를 높은 IL-10 생산성, IFN-감마의 중간 생산성 및 낮은 IL-4 생산성을 나타내는 세포들의 시토카인 생산 프로파일에 의해 평가하였다 (문헌 참조: Brun et al, International Immunopharmacology, 2009). 마우스 Tr1 세포의 생산을 위해, 비장세포들을 IL-10, 항IL-12 및 항IL-4의 존재 하에 7일간 항CD3 및 항CD28 모노클로날 항체를 이용하여 활성화시켰다. 얻어진 세포집단을 조사된 유전적 동계의(syngeneic) 비장세포 및 항CD3 항체에 대해 3주일에 걸쳐 클로닝시켰다. 성장 클론들을 그들의 시토카인 분비 프로파일에 대하여 평가하였다. 높은 IL-10 생산성, 중간 정도의 IFN-감마의 생산성 및 낮은 IL-4 생산성을 나타내는 클론들을 Tr1 세포인 것으로 동정하였다.
CD4 + T 임파구 및 Treg 세포 분리
Ficoll-Plaque PLUS 구배 (GE healthcare) 상에서 밀도 침강에 의해, 건강한 지원자의 전혈로부터 유래된 백혈구연층 조제물로부터 PBMC를 분리하였다. 구배 게면으로부터 회수된 세포들을 RPMI 1640 배지로 2회 세척하고 계수한 다음 MACS 및 염색에 곧바로 사용하였다. 간단히 설명하면, CD4+ T 세포를 CD4 분리 키트 (Dynal)을 이용하여 총PBMC로부터 네가티브 선별하여, 순도가 92-98%인 CD4+ 세포집단을 생성하였다. 정제된 CD4+ Treg 세포를 Battaglia 등의 설명(The journal of Immunology, 2006)에 따라 시험관내 증폭시켰다. 간단히 설명하면, 분리된 CD4+ T 세포를 항CD3/항CD28 Ab-코팅된 자성 비드(Dynabeads CD3 / CD28 T 세포 증폭기, Dynal Invitrogen)를 이용하여 활성화시켰다. 100 nM 라파마이신 존재 하에, 5% 풀드 AB 인간 혈청 (Sigma), 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보강된 X-vivo 15 배지 존재 하에 배양하였다. 매 라운드 7일간의 자극을 3회 실시하고 IL-2 (100U/ml)를 2회차 라운드의 자극부터 첨가하였다.
유세포분석 연구
인간 세포에 대한 유세포분석을 위해 다음의 항체들을 이용하였다: PE-컨쥬게이션된 항CD127 (Beckman Coulter로부터의 클론 R34.34), Becton Dickinson 사의 TC-표지된 항CD4 Ab (클론 #RP4-T4), PeCy5-표지된 항CD62L (Becton Dickinson사의 클론 Dreg56) 및 알로피코시아닌-컨쥬게이션된 항CD25 (Becton Dickinson사의 클론 M-A251). 제조자 지침에 따라 세포질내 염색 키트 (BD사) 및 PE-컨쥬게이션된 항Foxp3 Ab (BD사의 클론 259 D/C7)를 이용하여 인간 Foxp3에 대한 세포질내 염색을 실시하였다. 마우스 세포에 대하여 유세포분석 연구를 수행하기 위해, 사용된 항체는 PECy7-컨쥬게이션된 항CD4 (클론 RM4-15), APC-컨쥬게이션된 항CD25 (클론 PC61), PE-컨쥬게이션된 FoxP3 (클론 MF23) 및 PE-컨쥬게이션된 항CD62L (클론 Mel14)이었다. 모든 항마우스 항체들은 Becton Dickinson사로부터 구입하였다.
유전자 발현 연구
Dayem 등의 문헌 (Comp Funct Genom, 2003)에 설명된 바와 같이 DNA 마이크로어레이 분석을 이용하여 유전자 발현 연구를 수행하였다. 이 목적을 위해, 세포 샘플을 용해시키고 RNA를 Trizol 시약 (Invitrogen)으로 안정화시켰다. RNA를 Quiagen사의 RNeasy 미니키트를 이용하여 정제하고 남아있는 DNA 잔량을 Ambion (DNA-무함유)로부터의 DNA를 이용하여 제거하였다. 분리된 RNA의 농도 및 양을 NanoDrop (Thermo) 및 Agilent Bioanalyzer 2100을 이용하여 측정하였다. RNA를 인간 아피메트릭스 마이크로어레이 상에서 혼성화시켰다 (Affymetrix-HuGene-1_0-st-v1).
결과
CD25 분자의 구조적 발현에 의하여 천연 CD4+ 조절 세포 (nTreg 세포)가 먼저 설명되었다. 또한, CD25는 모든 종류의 T-세포에 대한 활성 마커이므로 nTreg 세포와 활성화된 통상적인 T 세포 (ConvT세포)를 구별하는 것은 불가능하였다. 이규칙은, 그 발현이 nTreg 세포에 대해 구조적이고 활성화 convT 세포 상에서 상향조절되는, 마스터 조절 유전자 Foxp3의 발현의 경우에도 동일하게 적용되었다.
Foxp3 및 CD25가 Treg 세포에 대한 구조적인 마커(constitutive markers)인 것으로 밝혀진지 수년 후, 분자 CD127은 Treg 세포의 표면 상에서는 구조적으로 적게 발현되나 통상적인 모든 T 세포의 표면에서는 구조적으로 고도로 발현되는 것으로 나타났으며 이로부터 활성화될 경우 이들 2 집단들을 서로 구별하는 방법이 제공되었다.
o CD3+CD4+Foxp3+CD25+CD127lo = nTreg 세포 (휴지 및 활성화)
o CD3+CD4+Foxp3+CD25+CD127hi = 활성화된 통상적인 T 세포
o CD3+CD4+Foxp3-CD25-CD127hi = 휴지기의 통상적인T세포
nTreg 세포에 더해, 연구가 잘 이루어진 다른 조절 세포집단 역시도 면역 관용성과 관련하여 제안된다. Tr1 임파구라 칭해지는 이 집단 역시도 상기 분자의 발현에 의해 표현형을 구하였다. 그 결과는 다음과 같다:
o CD3+CD4+Foxp3+CD25+CD127lo = 활성화 Tr1 세포
o CD3+CD4+Foxp3-CD25-CD127lo = 휴지 Tr1 세포
상기 결과는 CD25 및 CD127의 발현에 의하거나, 또는 Foxp3, CD25 및 CD127의 발현에 의해, 휴지 Tr1 세포가 nTreg 세포로부터 구별될 수 있음을 보여준다. 그러나, 활성화된 Tr1 세포는 nTreg 세포와 동일한 표현형을 갖는 것으로 입증되었다 (도 1).
또 다른 표면 분자가 이들 두가지 집단들 간의 구별을 가능케 해줄 수 있는지 검사하기 위해, 본 발명자들은 두가지 모두 인간의 세포인 nTreg 및 Tr1 세포의 표면 상의 CD62L을 발현하는 수개의 세포들을 테스트하였다. 다수의 휴지 Treg 세포와 활성화 Treg 세포 두가지 모두 CD62L을 발현하는 반면, 휴지 또는 활성화된 Tr1 세포는 적은 수만이 CD62L을 발현하였다 (도 2). 중요한 것은 CD62L, CD127 및 CD25 염색의 평균 형광강도 (MFI)가 이전에 보고된 바와 같이 나타났고, nTreg이 연속적으로 CD62L을 발현한다는 것이다. 이와 대조적으로, CD62L은 Tr1 세포에 구조적으로 부재한다 (도 3). 따라서, CD62L 표현형결정(phenotyping)은 상기 마커 패널 중에 포함될 경우 활성화 Tr1 세포와 nTreg 세포를 구별할 수 있게 해준다. 2가지 세포집단 모두에 있어서 CD25 염색의 MFI는 낮다. CD25 염색의 MFI는 nTreg 세포에 대해 높고, 활성화 Tr1 세포에 대해 높으며 휴지 Tr1 세포에 대해서는 하향조절되어 낮은 MFI를 나타낸다. 이러한 관찰 결과는 RT-PCR 실험에 의하여도 확인되었다 (도 4).
o CD3+CD4+Foxp3-CD25-CD127loCD62Llo = 휴지 Tr1 세포
o CD3+CD4+Foxp3+CD25+CD127loCD62Llo = 활성화 Tr1 세포
o CD3+CD4+Foxp3+CD25+CD127loCD62Lhi = nTreg 세포
도 4는 활성화 Tr1 세포와 nTreg 세포 간의 표면 CD62L의 차별적인 역할이 마우스로부터 유래하는 세포집단에 대하여도 옳다는 것을 보여준다.
2명의 건강한 인간 지원자로부터의 말초혈액 백혈구를 형광 표지된 CD4, CD25, CD127 및 CD62L 특이적인 항체를 이용하여 염색하였다. CD62L를 발현하는 세포의 백분율을 CD4+CD25-CD127lo 표현형에 의해 특징지어지는 세포 서브세트들에 대하여 구하였다.
도 5A 및 도 5B는 CD4+CD25-CD127lo 집단에 있어서, 마커 CD62L이 CD62Llo 집단과 CD62Lhi 집단 간의 식별을 가능케 해준다는 것을 보여준다. 따라서, 마커 CD4, CD25 및 CD127은 세포집단에서 휴지 Tr1 세포를 구별하는데 충분치 않다.
결론적으로, 표 1은 사용된 마커에 따라 각 집단을 어떻게 구별하는지를 보여준다.
Figure pct00002
Foxp 3 역시도 세포집단들을 구별하는데 임의로 사용될 수 있다:
Figure pct00003

Claims (16)

  1. 세포집단에 있어서 CD4, CD25, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지는 휴지 Tr1 세포집단의 동정 방법으로서, 여기서:
    - CD4 및
    - 저수준의 CD127,
    - 저수준의 CD62L를 발현하되
    - CD25는 발현하지 않는
    세포가 휴지 Tr1 세포인 것인, 휴지 Tr1 세포집단의 동정 방법.
  2. 세포집단에 있어서 CD4, CD25, CD127 및 CD62L 마커의 세포 표면 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지는 활성화 Tr1 세포집단의 동정 방법으로서, 여기서:
    - CD4,
    - CD25,
    - 저수준의 CD127 및
    - 저수준의 CD62L
    를 발현하는 세포가 활성화 Tr1 세포인 것인, 활성화 Tr1 세포집단의 동정 방법.
  3. - 제1항 또는 제2항에 따라 휴지 Tr1 세포집단 또는 활성화 Tr1 세포집단을 동정하고
    - 상기 집단을 분리하는 것
    을 포함하여 이루어지는, 휴지 또는 활성화 Tr1세포집단의 동정 방법.
  4. 제3항의 방법에 의하여 수득된 휴지 Tr1 세포 또는 활성화 Tr1 세포의 분리된 집단.
  5. - 제1항 또는 항에 따라 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포를 동정하고,
    - 상기 세포를 선별함으로써,
    휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포가 농축된 세포집단을 수득하는 방법으로서, 여기서 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포의 백분율은 농축 전의 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포의 백분율의 적어도 2배인 것인, 세포집단에서 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포를 농축시키는 방법.
  6. 제5항에 따라 수득되는 휴지 Tr1 세포가 농축된 세포집단.
  7. - 제1항에 따라 휴지 Tr1 세포를 동정하고 및/또는 제2항에 따라 활성화된 Tr1 세포를 동정하고,
    -상기 세포들을 고갈시킴으로써
    휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포가 고갈된 세포집단을 수득하는 방법으로서, 여기서 휴지 및/또는 활성화 Tr1의 백분율은 고갈 전의 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포의 백분율의 0.75배 이하인 것인, 세포집단에서 휴지 Tr1 세포 및/또는 활성화 Tr1 세포를 고갈시키는 방법.
  8. 제6항에 따라 수득되는 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포가 고갈된 세포집단.
  9. CD4, CD25, CD127 및 CD62L의 세포 표면 발현을 검출하기 위한 수단을 포함하는, 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단을 동정 또는 분리하기 위한 키트.
  10. 제4항에 따른 분리된 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단 또는 제6항에 따른 농축된 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포집단 또는 제13항에 따른 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포가 고갈된 세포집단을 포함하는 의약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포를 포함하며 감염 또는 장기이식 또는 알레르기성 질환과 관련된 면역반응의 예방 또는 치료 또는 염증성 병태 또는 자가면역 병태를 예방 또는 치료하기 위한 것인 의약 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포 Tr1 세포가 고갈된 세포집단을 포함하며 대상체에 있어서 암을 치료하기 위한 것인 의약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포집단은 종양 항원에 특이적인 T 세포집단인 것인 의약 조성물.
  14. 휴지 Tr1 세포와 활성화 Tr1 세포와의 혼합물을 포함하는 의약 조성물로서, 여기서 상기 혼합물은 제3항에 따라 수득된 분리된 휴지 Tr1 세포집단을 시험관내 증폭시킴으로써 수득되는 것인 의약 조성물.
  15. 제14항에 있어서,감염 또는 장기이식 또는 알레르기성 질환과 연관된 면역반응을 치료하거나 또는 염증성 병태 또는 자가면역 병태를 예방 또는 치료하기 위한 것인 의약 조성물.
  16. 제1항의 방법에 따라 치료전후에 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중에서 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포 집단을 동정하는 것을 포함하여 이루어지는, 대상체에 있어서 치료 효과를 시험관내 모니터링하는 방법으로서, 여기서 치료 후의 휴지 및/또는 활성화 Tr1 세포 집단의 증가는 그 치료에 대한 반응에 해당하는 것인 대상체에 있어서 치료 효과를 시험관내 모니터링하는 방법.
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