ES2618406T3

ES2618406T3 - Aplicación diagnóstica y terapéutica de linfocitos CTL y NK seleccionados de forma funcional

Info

Publication number: ES2618406T3
Application number: ES07734273.1T
Authority: ES
Inventors: Roberto Gambari; Roberto Guerrieri
Original assignee: Menarini Silicon Biosystems SpA
Current assignee: Menarini Silicon Biosystems SpA
Priority date: 2006-04-12
Filing date: 2007-04-12
Publication date: 2017-06-21
Anticipated expiration: 2027-04-12
Also published as: JP5401307B2; EP2016407B8; CA2649244C; EP2016407A2; WO2007116309A2; CN101495864B; CA2880547C; CA2880547A1; US9528981B2; CN101495864A; CA2649244A1; EP2016407B1; WO2007116309A3; US20090325213A1; JP2009533043A; ITBO20060267A1

Abstract

Método para la selección de células del sistema inmunitario deseadas, que tengan propiedades efectoras/líticas de la diana entre una población de células del sistema inmunitario, que incluye las etapas de: a) permitir que las células del sistema inmunitario recogidas anteriormente de un ser humano interactúen con células, en particular células tumorales y microorganismos; b) comprobar el efecto de la interacción en la etapa a); c) seleccionar, entre las células del sistema inmunitario que han interactuado con las células diana, en particular células tumorales y microorganismos, solo las células del sistema inmunitario que hayan mostrado propiedades efectoras/líticas de la diana; caracterizado porque las etapas a), b) y c) se llevan a cabo desplazando células individuales por medio de un dispositivo miniaturizado que permite la manipulación en tiempo real de células efectoras individuales sin modificar la actividad citolítica de las mismas.

Description

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DESCRIPCION

Aplicacion diagnostica y terapeutica de linfocitos CTL y NK seleccionados de forma funcional Campo de la invencion

La invencion propone una metodologla terapeutica y diagnostica nueva a base del uso de celulas efectoras (por ejemplo linfocitos CTL y NK) seleccionadas por tener la capacidad de inducir la lisis en celulas diana. En particular, la invencion ensena como seleccionar cepas de celulas efectoras del sistema inmunitario a base de sus propiedades llticas. Tambien ensena como pueden mejorarse los procedimientos diagnosticos para comprobar la actividad de vacunas terapeuticas, considerando lo que se muestra. Para finalizar, muestra como pueden mejorarse las terapias celulares utilizadas actualmente mediante el uso de esta estrategia.

Debe indicarse que aqul y mas adelante, por las expresiones “celula(s) efectora(s)” o, de forma mas general, por los terminos “efectora/efectoras” se entiende una partlcula (una celula o un microorganismo generico) que tiene un efecto sobre una partlcula “diana”, a su vez definida como una celula o microorganismo generico en el cual se expresa la modification inducida por el efector.

Estado de la tecnica

Algunas propiedades de funcionamiento importantes del sistema inmunitario estan determinadas por la action de grupos celulares considerados como “raros”. En este contexto, por “raro” se entiende una subpoblacion de celulas que tiene una frecuencia de una parte por mil o menos dentro de una subpoblacion conocida. Se sabe, por ejemplo, que la evolution de enfermedades tales como las oncologicas puede confrontarse por un subgrupo de celulas del sistema inmunitario que tienen la propiedad de inducir la lisis en celulas diana que tengan las caracterlsticas oportunas. Es igualmente conocido que tales celulas efectoras son raras, por lo que esta accion no es muy eficaz si no se estimula mediante los medios terapeuticos oportunos.

En el campo terapeutico, los linfocitos CTL y NK se alslan ahora a traves de una prepurificacion, combinada con una selection clonal mediante dilution “al llmite” (10). Estas estrategias, aunque son validas y han sido exitosas en su aplicacion, son complejas, largas y caras. Ademas, la estrategia de la seleccion clonal no siempre puede activarse, dado que en muchos casos se desconocen o se conocen solo en parte las caracterlsticas de los receptores de las celulas diana (por ejemplo que pertenecen a un tumor) a atacar.

A este respecto,

1. se sabe que en los casos en los cuales se conocen los peptidos especlficos de tumor, es posible la preselection de poblaciones de los CTL especlficos de tumor y ya se descritos en protocolos terapeuticos (11);

2. se sabe que en la mayorla de los casos, los CTL especlficos de celulas neoplasicas estan presentes en el paciente en el orden de 1/1000-10.000 (12);

3. es posible aislar, con tecnicas inmunologicas, poblaciones de CTL dentro de la cual pueden identificarse los CTL especlficos de tumor (13);

4. pueden expandirse in vitro los CTL individuales para dar lugar a poblaciones homogeneas que se pueden utilizar para el seguimiento de analisis bioqulmicos (14) y, si se expanden de manera suficiente, para la inmunoterapia de tumores, y deberlan mantenerse especlficas para las celulas malignas (15):

5. pueden aplicarse estrategias completamente similares a las de aislamiento de CTL a otras celulas efectoras que tengan la capacidad de inducir la lisis en celulas diana;

6. el uso de los CTL (y de las celulas efectoras analogas) en la inmunoterapia no se restringe al tratamiento de tumores sino que puede incumbir a otras patologlas, entre ellas patologlas vlricas (por ejemplo SIDA) y patologlas debidas a una infection bacteriana.

Las consideraciones llevadas a cabo para los CTL tambien se extienden a los linfocitos NK, sobre todo en cuando se logre el uso de los mismos, si son particularmente activos en inducir la lisis en las celulas tumorales (16).

Altomare L. et al. (2003) divulga un dispositivo de placa de circuito impreso que tiene la capacidad de generar jaulas a base de dielectroforesis controladas por programa informatico que permiten mover celulas tumorales “atrapadas” en las jaulas.

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Fuchs AB. et al. (2006) divulga un chip microelectronico que integra una serie de electrodos y detectores que permiten la manipulacion individual y paralela de celulas individuales de muestras de celulas mientras se mantiene la viabilidad y la proliferation.

Rickinson AB. (1995) divulga la recogida de las CTL de pacientes y la reinfusion en el paciente tras la reactivation in vitro.

Schoell WMJ. et al. (1999) divulga un metodo para la generation in vitro de linfocitos T citotoxicos (los CTL) especlficos para el peptido E7 del HPV-16 a partir de los CMSP de sujetos sanos para la futura inmunoterapia adoptiva del cancer de cuello uterino.

A la luz de estas consideraciones, es de gran importancia en el ambito terapeutico un metodo que permita seleccionar clones de CTL elevadamente llticos con respecto a las celulas diana en un tiempo razonable y de un modo eficaz.

Sumario de la invention

La presente invencion ensena un metodo para la selection funcional de celulas del sistema inmunitario por medio del control en tiempo real y la cuantificacion de la lisis de celulas diana (por ejemplo celulas tumorales) mediada por linfocitos T citotoxicos (CTL) (1) y de otras celulas que tengan la capacidad de inducir lisis en dianas celulares oportunas (normalmente linfocitos citolfticos naturales NK) (2). Tales metodos son a base del ensayo analltico innovador para la actividad de los CTL y otras celulas llticas con capacidades mas altas que los disponibles en la actualidad. Por lo tanto, la presente invencion tiene aplicaciones inmediatas en el sector diagnostico. Ademas, tal metodo se propone para una estrategia eficaz para el aislamiento de clones de celulas efectoras (normalmente los CTL o los NK) que tengan alta actividad. Por lo tanto, la presente invencion tiene importantes aplicaciones en el sector terapeutico.

En particular, la invencion se refiere a un metodo para la seleccion de celulas del sistema inmunitario recogidas anteriormente de un ser humano, utiles en particular para la obtencion de information importante para la comprobacion diagnostica/pronostica de la patologla de un paciente neoplasico, que incluyen las etapas de: a) permitir que las celulas del sistema inmunitario recogidas anteriormente interactuen con las partlculas diana respectivas, cuya modification, debido a dicha interaction, es un Indice de una propiedad deseada de las celulas del sistema inmunitario; b) comprobar el efecto de la interaccion sobre las partlculas diana y c) seleccionar, entre las celulas del sistema inmunitario que se han sometido a la interaccion con las partlculas diana, aquellas que hayan inducido la modificacion en las partlculas diana, que actuan, por lo tanto, contra las mismas, como celulas efectoras.

Ademas, el metodo de acuerdo con la invencion tambien puede incluir la etapa de expansion de celulas del sistema inmunitario que se han seleccionado al final de la etapa c) para crear clones de efectores antitumorales seleccionados aguas arriba por una eficacia particular del mecanismo lltico, a partir de poblaciones heterogeneas (circulantes o “fijas” en las areas linfaticas de drenaje) de celulas mononucleares.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invencion, la etapa de expansion se realiza mediante fases sucesivas, llevando a cabo entre una fase y la siguiente una reseleccion de efectores con caracterlsticas optimas durante la amplification ex vivo de poblaciones clonales posiblemente inestables, en particular repitiendo las etapas a), b) y c) sobre al menos una de dichas poblaciones clonales posiblemente inestables.

La invencion se refiere adicionalmente al uso del metodo anterior para la preparation de un farmaco que incluye celulas del sistema inmunitario que se han seleccionado a traves de las etapas a), b) y c), y/o sus clones, en un vehlculo adecuado para una reinfusion in vivo con fines terapeuticos, posiblemente tras la estimulacion con celulas dendrlticas.

Para finalizar, la invencion se refiere al uso de un dispositivo miniaturizado que permite la manipulacion de celulas efectoras y de celulas diana sin modificar la actividad biologica de las mismas, para llevar a cabo la seleccion de celulas efectoras y para la preparacion de un farmaco del tipo indicado anteriormente, as! como al uso de celulas efectoras llticas seleccionadas y expandidas para la preparacion de un farmaco para el tratamiento de patologlas que pueden tratarse mediante una reinfusion in vivo de las celulas efectoras llticas seleccionadas y expandidas, caracterizado porque el farmaco solo incluye celulas efectoras seleccionadas anteriormente y/o clones de celulas efectoras seleccionados anteriormente, que tienen todos una actividad lltica sustancialmente comparable.

Breve description de las figuras

Figura 1.A: desplazamiento de los CTL (3 CTL: CTL1, CTL2, CTL3, indicados por flechas) dirigido a afectar a celulas tumorales diana (indicadas mediante una flecha a la izquierda).

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B: complejo de los CTL y la celula diana.

Figura 2. Interaccion de los CTL (flechas negras) y de una celula diana (flecha blanca): la celula diana esta en un estado de lisis avanzado.

Figura 3.A: cinetica de lisis de las celulas diana. B: CTL no preactivados.

Figura 4.A: efecto de la calcelna sobre la actividad lltica de los CTL, medida a traves del % de lisis en un ensayo de liberacion de Cr51. En los graficos de barras negras se informa la lisis especlfica de las LCL diana (B35, cargadas con peptido de EBV), en presencia (a la izquierda) o en ausencia (a la derecha) de calcelna; en los graficos de barras blancas se informa sobre el control representado por las LCL no cargadas con el peptido.

B. efecto del tampon de manitol sobre la actividad lltica de los CTL (ensayo de liberacion de Cr51). En los graficos de barras negras se informa sobre la lisis especlfica de las LCL diana, en un tampon que contiene manitol (a la izquierda) o en un tampon convencional (RPMI; a la derecha); en los graficos de barras blancas se muestra el control representado por las LCL no cargadas con peptido.

Figura 5. Detection de la lisis especlfica de las LCL diana cargadas con el peptido de EBV en un tampon de manitol, tras el desplazamiento de DEP (dielectroforesis) y la carga con calcelna, en SmartSlide®. Paneles A-D: la lisis de las LCL positivas para HPV por los CTL especlficos para HPV se ha detectado tras 10' y 20'; paneles E-H: por el contrario, los CTL especlficos para EBV no lisan las LCL no cargadas con el peptido.

Figura 6. Los datos informados son la media de tres experimentos en los que se detecta la disminucion de la senal de fluorescencia (calcelna) a lo largo del tiempo, debido a la lisis de LCL-B35 cargadas con peptido de EBV por los CTL especlficos, tras la coincubacion en un tampon convencional (RPMI) durante 15' (panel B) o 30' (panel C). Una deteccion de control paralela (graficos de barras blancas en A; slmbolos vaclos en C) muestra que la lisis es especlfica; de hecho, esta ausente si las LCL no estan cargadas con el peptido de EBV; la disminucion de la intensidad de la senal a lo largo del tiempo es, en este caso, minima.

Description detallada

Para el analisis de la actividad de los CTL, el metodo mas utilizado actualmente es a base de la liberacion de Cr51 a partir de celulas lisadas (3). Se han ajustado recientemente otros metodos, a base de la liberacion de europio no radioactivo (Eu3+) (4), la liberacion de marcadores fluorescentes (por ejemplo calceina) (5), el analisis de la actividad esterasica, el uso de anexina V o de beta-galactosidasa. Ademas, Acea Biosciences comercializa otros metodos a base de analisis electronico de la impedancia, el cual permite una comprobacion en tiempo real de los efectos liticos inducidos sobre agregados celulares.

Estas metodologias tienen algunas desventajas importantes. En algunos casos, son a base del uso de moleculas radiactivas (3) y siempre determinan resultados “promedio” y no a nivel de celulas individuales (4, 5). Cuando se puede utilizar analisis de FACS (separation de celulas activadas por fluorescencia) (8), este requiere una cantidad significativo de celulas e instrumentos complejos y caros. En ninguno de estos analisis puede ser eficaz una evaluation en tiempo real.

A la vista de estas consideraciones, un metodo que permita controlar en tiempo real y de un modo eficaz la citolisis mediada por celulas efectoras (por ejemplo los CTL), extendiendo tal analisis a un nivel de celula individual o de clones elevadamente liticos contra celulas diana, es ciertamente de gran importancia en el ambito diagnostico y terapeutico.

A este respecto,

1. Se sabe que los CTL se dirigen a celulas que pueden someterse a tincion utilizando distintos colorantes supravitales, algunos de los cuales pueden liberarse fuera de las celulas si estas se lisan y/o estan danadas (la calceina (5) pertenece a estos colorantes supravitales);

2. Se sabe que los CTL se dirigen a celulas que pueden someterse a tincion utilizando distintos colorantes supravitales que identifican estructuras complejas (mitocondria, nucleo, etc.) y que no pueden liberarse fuera de las celulas, incluso si estan danadas (9) ;

3. Pueden utilizarse programas de procesamiento de datos y protocolos de formation de imagenes oportunos con el fin de cuantificar de un modo automatizado el porcentaje de celulas que manifiestan determinadas caracteristicas.

Con respecto a la manipulation de celulas en tiempo real, la tecnologia ha proporcionado recientemente algunas

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tecnologlas. Por ejemplo, las pinzas laser permiten crear jaulas opticas que pueden contener celulas y, moviendo las jaulas, poner en contacto las celulas entre si (17). Ademas, se sabe que los dispositivos del tipo “laboratorio en un chip” a base de dielectroforesis (DEP) pueden ser muy utiles para el desplazamiento de artlculos biologicos de un modo programado (18-21). En particular, los dispositivos que consisten en una matriz de electrodos pueden tener la capacidad de manipular celulas individuales o agrupaciones de celulas individuales.

Un ejemplo de “laboratorio en un chip” a base de una matriz de electrodos se muestra en (21). En la base de la presente invencion esta el uso de metodologlas en tiempo real para la manipulacion de los CTL, NK y celulas neoplasicas diana, y que tambien tienen la capacidad de desplazar celulas individuales, con el fin de desarrollar un metodo eficaz en primer lugar para la identification y despues para el aislamiento de los CTL elevadamente citotoxicos y, por lo tanto, que se puedan utilizar en el tratamiento de patologlas neoplasicas a traves de estrategias inmunoterapeuticas.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Se obtuvieron llneas celulares linfoblastoides (LCL) tras la infection de linfocitos B humanos con la cepa B95.8 del virus Epstein-Barr (EBV) (26). Se utilizo para la estimulacion el peptido especlfico de EBV HPVGEADYFEY (HPV), que corresponde con los aa 407-417 de la protelna EBNA1. Se sembraron en placa linfocitos procedentes de sangre periferica (PBL) procedentes de un donante con HLA-B35, a una concentration de 3,5 x 106 celulas por pocillo en placas de 24 pocillos en medio de cultivo RPMI 1640, SFT al 10% (Hyclone), y se estimularon con el peptido HPV (10 pM). Tras 7 y 14 dlas los cultivos se estimularon nuevamente y el medio se complemento con rIL-2 10 U/ml (Chiron). En los dlas 14 y 21 se analizo la actividad CTL de los cultivos de linfocitos T utilizando los ensayos de citotoxicidad apropiados (liberation de 51Cr) (3).

OBSERVACIONES SOBRE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Los resultados de tal estudio se muestran en los ejemplos informados en las Fig. 1-6. Los ejemplos se proporcionan a fines de ilustracion y no se pretende que limiten el ambito de la invencion de ningun modo. En la Fig. 1 se informa el desplazamiento de tres CTL (CTL1, CTL2, CTL3, indicado por flechas), dirigidos a afectar una unica celula tumoral diana, generando los complejos mostrados en el lado derecho de la figura, en los que los CTL aparecen indicados mediante CTL1, CTL2, CTL3 y flechas, y las celulas diana se indica a la izquierda mediante una flecha.

Los inventores han encontrado, de forma sorprendente, que los CTL desplazados en un “laboratorio sobre un chip” que contiene una matriz de electrodos, se pueden poner en contacto con celulas diana neoplasicas y tienen la capacidad de lisarlas en un tiempo muy rapido (que varla de 8 a 20 minutos). Si las celulas se marcan con calcelna, son fluorescentes si estan intactas, perdiendo la fluorescencia si se danan mediante los CTL (Fig. 2 y Fig. 3). Llevando a cabo tinciones dobles utilizando colorantes para mitocondrias o ADN, las celulas danadas mediante los CTL pierden su fluorescencia de calcelna manteniendo la de los colorantes especlficos para mitocondria o ADN. Por lo tanto, a traves de un analisis por microscopio fluorescencia (utilizando posiblemente programas de formation de imagenes), es posible discriminar los CTL activos de los CTL inactivos. Los CTL no seleccionados no muestran actividad lltica sobre las LCL no precargadas con peptido.

Por otro lado, como se ha descrito recientemente (22-25), las celulas manipuladas mediante DEP (dielectroforesis) mantienen su fenotipo y sus caracterlsticas diferenciadas. De acuerdo con la presente invencion, se ha informado que este tipo de manipulacion tampoco altera la actividad citolltica y la detection de la senal optica (fluorescencia). Esta estrategia, por lo tanto, es adecuada para la identificacion inmediata y el siguiente aislamiento y expansion de los clones de cTl activos, as! como de otras poblaciones celulares que muestren una actividad citolltica frente a determinadas dianas celulares.

Ademas de las tecnicas de formacion de imagenes opticas utilizadas en la presente demostracion, se sabe que las tecnicas de medicion de la impedancia (6) permiten comprobar el estado de celulas individuales con un alto nivel de precision. La tecnica optica presentada en la presente realization se pretende, por lo tanto, que sea solo un ejemplo de un metodo mas general.

La Fig. 2 muestra detalles de celulas en un estado avanzado de lisis tras la interaction con los CTL. En particular, en la parte derecha de la figura se puede observar (flecha blanca) una celula diana lisada por tres CTL (flechas negras). La Fig. 3 (panel A) muestra las cineticas de lisis en los agregados de los CTL/celulas diana. En B se senala que los CTL no preseleccionados no son llticos. Como puede observarse, la estrategia permite analizar la cinetica de la lisis tras un contacto con los CTL e identificar los patrones de CTL con una elevada actividad citolltica.

La Fig. 4A muestra que un marcaje con calcelna no modifica el mecanismo de lisis o el reconocimiento especlfico de los linfocitos con HLA-B35 (LCL) cargados con peptido de EBV de los CTL. En la Fig. 4B tambien se muestra que ni la dielectroforesis ni el tampon que contiene manitol tienen ningun efecto sobre estos mecanismos, un resultado que esta alineado con lo que se han comprobado otros para el perfil de expresion genica (37) y la capacidad de

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crecimiento de K562 (35, 36), que no resultan estar modificados por la dielectroforesis.

El mantenimiento de la especificidad de las reacciones de reconocimiento y de lisis en las condiciones experimentales utilizadas (tampon de manitol y desplazamiento a traves de dielectroforesis) se ha comprobado adicionalmente en los experimentos mostrados en las figuras 5 y 6. En la figura 6 tambien se muestran cineticas de la variacion de intensidad de fluorescencia despues de la lisis especlfica de las LCL procedentes de los CTL, que puede ya senalarse dentro de los primeros 8-10 minutos desde el tratamiento DEP (dielectroforesis), comenzando tambien a partir de un numero limitado de celulas (n.° = 25, 30, 20, 27). En conclusion, se ha encontrado de forma sorprendente que la especificidad de la reaccion inmunitaria permanece preservada en este contexto experimental. De hecho, no es absolutamente obvio que la reaccion inmunitaria de lugar a un comportamiento selectivo tambien en presencia de un numero extremadamente reducido de celulas. En particular, el entorno en el que este tipo de manipulacion tiene lugar impide entre las celulas que, por el contrario, se produce en todas las otras metodologlas. A pesar de esto, el hallazgo de la selectividad y especificidad de la reaccion inmunitaria abre la puerta a una importante serie de ensenanzas de esta patente.

El hecho de que los efectores citotoxicos (los CTL en el ejemplo informado, pero tambien los linfocitos NK y otros) puedan enumerarse ex vivo en tiempo real y que este analisis no sea a base de “criterios indirectos de valoracion” (por ejemplo, la expresion de un marcador de superficie especlfico del efector, la liberacion de una linfocina, la expresion de antlgenos de diferenciacion, etc.) sino mas bien de la lectura cuantitativa en llnea y en tiempo real de la eficacia lltica a un nivel de celula individual, es innovador y de una gran importancia. Se sabe, de hecho, que no todos los linfocitos T que reconocen un dado antlgeno son llticos por igual (2, 28) y que el porcentaje de linfocitos de fenotipo maduro aumenta durante las vacunaciones (29). Se espera que el uso de la citotoxicidad directa como criterio de valoracion correlacione en gran medida con el pronostico cllnico con respecto al uso de criterios indirectos de valoracion y permita un control mas preciso de la eficacia de las preparaciones de vacuna en la induccion de una inmunidad especlfica. Ademas, a menudo se observa la presencia de linfocitos T antitumorales en concomitancia con una recalda y el retorno de la enfermedad tambien en pacientes no vacunados de forma reciente (30).

Siendo la tecnica de recuperacion de celulas tras la manipulacion (33) una tecnica conocida, este procedimiento tiene implicaciones terapeuticas. El aislamiento y la recuperacion de celulas efectoras con una elevada actividad lltica permite el cultivo “in vitro" de celulas altamente seleccionadas, con el objetivo de llevar a cabo estudios bioqulmicos y de expandir las poblaciones seleccionadas. Ambas estrategias tienen profundas implicaciones en la inmunoterapia de tumores.

De hecho, el aislamiento de efectores citotoxicos de alta selectividad a partir de poblaciones heterogeneas (circulantes o “fijos” en las areas linfaticas de drenaje) de celulas mononucleares permite (a) la expansion clonal de efectores antitumorales seleccionados aguas arriba, por la eficacia particular del mecanismo lltico; (b) la reseleccion de efectores durante la amplification ex vivo de poblaciones clonales posiblemente inestables. Estan disponibles las tecnologlas de reinfusion in vivo con fines terapeuticos, posiblemente tras la estimulacion con celulas dendrlticas (31). La eficacia de la reinfusion local y/o sistemica de estos efectores, y la toma de la infusion autologa tambien pueden controlarse a lo largo del tiempo y correlacionarse con el estado inmunitario y el curso de la enfermedad (31).

La posibilidad de la expansion in vitro de celulas altamente llticas cambiando, si es necesario, el fenotipo y la reinfusion de las mismas en pacientes que padecen neoplasia (terapia de transferencia de celulas adoptivas) ha sido sujeto de multiples estudios (28-30, 32). En esta estrategia experimental, la identification rapida de celulas efectoras con una elevada actividad lltica y la capacidad de generation de cargas celulares que tengan una importancia terapeutica manteniendo, no obstante, la estabilidad genica es aun un factor limitante.

La estrategia objeto de la presente patente es compatible con una reduction de los tiempos y una mejora del procedimiento de selection de celulas con elevada actividad lltica, lo que facilita, por un lado, la identificacion de antlgenos tumorales diana, por el otro la expansion de celulas que pueden utilizarse en inmunoterapia. Si, a modo de ejemplo, el metodo sugerido en (32) se considera para obtener una seleccion funcional de cepas utiles de celulas que tienen potencialmente una actividad de induccion de lisis en celulas diana, la mejora en la calidad de seleccion obtenida mediante la presente metodologla se aprecia mejor. La tecnica en (32) comienza a partir de la observation de que hay cepas de celulas, los TIL o linfocitos infiltrantes de tumor, que tienen la capacidad de infiltrarse en el tejido tumoral y de ejercer una actividad lltica frente a celulas carcinogenicas. Tambien en este caso, la cantidad de TIL encontrados en los pacientes es menor que la necesaria para obtener una remision de la enfermedad. El protocolo puede entonces resumirse en las siguientes etapas: 1) la obtencion de una biopsia del paciente; 2) el tratamiento del tejido a fin de permitir la infusion in vitro de factores nutritivos y de crecimiento oportunos para las celulas deseadas, 3) despues de que la etapa de cultivo ha terminado, la purification de las cepas celulares de los TIL y de la elimination de las celulas tumorales, 4) la reinfusion de las celulas as! obtenidas en los pacientes. Se sabe que solo una fraction de los TIL obtenidos de este modo muestra actividades llticas y, por lo tanto, dado que para limitar los efectos secundarios no deseados la cantidad de celulas reinfundidas en el paciente no puede excederse, la terapia tiene una eficacia restringida. La metodologla propuesta en la presente patente reduce de un modo significativo las limitaciones de la discutida en el presente documento, como 1) que la seleccion de celulas

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efectoras puede extenderse a ilneas celulares que existen tambien en la sangre periferica y no se limita a los TIL; 2) la selection funcional produce un conjunto de cepas cuya capacidad lltica es conocida; 3) permite mejorar el procedimiento de expansion de estas llneas celulares debido a la posibilidad de controlar en distintas etapas de expansion la estabilidad de las llneas celulares de interes; 4) reduce la carga de celulas necesaria para la terapia y, por lo tanto, del mismo material reinfundido en el paciente; proporciona una action mas dirigida. El punto 3) mejora de un modo significativo el estado de la tecnica en referencia a la expansion de llneas celulares de tipo CTL las cuales se sabe que cambian el fenotipo lltico tras un determinado numero de expansiones. En el caso extremo en el que la disponibilidad de una celula individual que tenga las caracterlsticas llticas deseadas este aguas abajo de los procedimientos de seleccion y sea necesario conseguir cargas celulares que tengan valencias terapeuticas en el orden de algunos millones de celulas, se necesarios aproximadamente 25 o 30 ciclos de expansion.

Este numero de ciclos es tal que no mantiene la estabilidad genica de las celulas implicadas, de forma que se generan subpoblaciones que tienen un fenotipo lltico distinto. La invention presentada ensena como resolver este problema. De hecho, la seleccion funcional de celulas puede repetirse en distintas fases del procedimiento de cultivo y, por ejemplo, cuando tras de 10 o 12 ciclos de cultivo esten disponibles algunos miles de celulas. La purification de la llnea celular puede reestablecerse a traves de una aplicacion extendida de la seleccion funcional divulgada anteriormente. De hecho, es posible mantener llneas celulares diana obtenidas mediante biopsia y repetir el metodo sugerido para eliminar celulas llticas que tengan un fenotipo no deseado. La elimination de celulas llticas en este nivel de expansion es consistente con las tecnologlas de seleccion a base de tecnicas electronicas y, por lo tanto, se obtienen otra vez llneas puras. Una expansion adicional durante una cantidad de ciclos equivalente a 10 o 12 produce una cantidad de celulas llticas que tienen cantidades adecuadas para aplicaciones terapeuticas. Incluso si en este punto el numero de celulas es tal que impide un examen de la estabilidad del fenotipo lltico a un nivel de celula individual, la cantidad de ciclos de cultivo sin control del fenotipo es ahora muy reducida y, por lo tanto, las celulas pueden considerarse como reproducciones apropiadas de las originales.

La invencion contempla adicionalmente el uso de cualquier dispositivo adecuado para manipulaciones de celulas que no modifican la actividad biologica de las celulas efectoras (en este caso los CTL).

Por otro lado, la invencion se refiere al aislamiento de cada tipo de celulas (incluyendo linfocitos NK) que tenga la capacidad de lisar celulas diana.

Para finalizar, la invencion se aplica a todas las patologlas para las que la actividad citolltica de las celulas efectoras (los NK o los CTL) puede entonces dirigirse, como se observo anteriormente, principalmente a patologlas neoplasicas, patologlas infecciosas, patologlas autoinmunitarias y patologlas inflamatorias de tipo agudo y cronico.

Referencias

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Metodo para la seleccion de celulas del sistema inmunitario deseadas, que tengan propiedades efectoras/llticas de la diana entre una poblacion de celulas del sistema inmunitario, que incluye las etapas de:

a) permitir que las celulas del sistema inmunitario recogidas anteriormente de un ser humano interaction con celulas, en particular celulas tumorales y microorganismos;

b) comprobar el efecto de la interaccion en la etapa a);

c) seleccionar, entre las celulas del sistema inmunitario que han interactuado con las celulas diana, en particular celulas tumorales y microorganismos, solo las celulas del sistema inmunitario que hayan mostrado propiedades efectoras/llticas de la diana;

caracterizado porque las etapas a), b) y c) se llevan a cabo desplazando celulas individuales por medio de un dispositivo miniaturizado que permite la manipulation en tiempo real de celulas efectoras individuales sin modificar la actividad citolltica de las mismas.
2. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las etapas a), b) y c) se llevan a cabo de forma que se permita cuantificar la presencia de efectores citotoxicos, es decir como linfocitos T y NK, y otros, en sangre periferica, infiltrados neoplasicos inflamatorios, ganglios linfaticos regionales de drenaje y en cualquier otro sitio o fluido biologico accesible del ser humano del que se recogieron anteriormente las celulas del sistema inmunitario.
3. Metodo para determinar una enfermedad residual minima en pacientes de riesgo midiendo la actividad citolltica de linfocitos efectores T y NK antitumorales, de acuerdo con el metodo de las reivindicaciones 1 y 2.
4. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la actividad citolltica se mide ya sea mediante tecnicas opticas de formation de imagenes hechas posible por marcar anteriormente al menos dichas celulas diana, en particular celulas tumorales y microorganismos, o mediante tecnicas de medicion de la impedancia.
5. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que incluye adicionalmente una etapa de recoger y expandir celulas del sistema inmunitario que se han seleccionado al final de la etapa c), para crear clones de efectores antitumorales seleccionados aguas arriba por la eficacia particular del mecanismo litico.
6. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que dicha etapa de expansion se lleva a cabo mediante la amplification ex vivo y la reseleccion de efectores con caracteristicas optimas, de forma que se eliminan poblaciones clonales inestables, repitiendo las etapas a), b) y c) sobre las celulas del sistema inmunitario expandidas que se han seleccionado al final de la etapa c).
7. Uso del metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparation de un farmaco que incluye celulas del sistema inmunitario que se han seleccionado a traves de dichas etapas a), b) y c) y/o de sus clones en un vehiculo adecuado para una reinfusion in vivo para fines terapeuticos, posiblemente despues de una estimulacion con celulas dendriticas.
8. Uso de acuerdo con la reivindicacion 7, para la preparacion de un farmaco para el tratamiento de una patologia que puede tratarse con la infusion de las celulas efectoras liticas seleccionadas y expandidas.