CN101485661A - 一种青藤碱衍生物通过拮抗TNF-α信号通路治疗自身免疫病 - Google Patents
一种青藤碱衍生物通过拮抗TNF-α信号通路治疗自身免疫病 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101485661A CN101485661A CNA2008100327554A CN200810032755A CN101485661A CN 101485661 A CN101485661 A CN 101485661A CN A2008100327554 A CNA2008100327554 A CN A2008100327554A CN 200810032755 A CN200810032755 A CN 200810032755A CN 101485661 A CN101485661 A CN 101485661A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- autoimmune disease
- purposes
- formula
- sinomenine
- compositions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种青藤碱衍生物通过拮抗TNF-α信号通路治疗自身免疫病,即如式I的青藤碱衍生物的用途,它可用于制备预防或治疗自身免疫疾病的组合物。本发明还公开了式I化合物在制备肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路阻断剂组合物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域。更具体地涉及青藤碱衍生物的用途。
背景技术
自身免疫病以其发病率高、无有效治疗手段而成为直接威胁人类生命健康和影响生活质量的严重疾病。比如:类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)在我国普通人群中的发病率高达0.35—0.4%,而且有逐年上升的趋势。RA是一种器官特异性的自身免疫病,病变主要累及全身大小关节,最终导致关节强直,生活自理能力丧失。同样,强直性脊柱炎和系统性红班狼疮,由于没有有效治疗方法,而严重危害人类的健康。
基础研究和临床观察表明:Th1细胞介导的细胞免疫和Th2细胞介导的体液免疫,在自身免疫性疾病的发病机制中有重要的调节作用。而在疾病的致病过程中,炎症因子是促进免疫系统紊乱导致疾病的关键。因此,抑制炎症(anti-inflammatory)的介质或细胞因子,对治疗疾病是有益的。对于许多自身免疫病,包括RA,银屑病(psoriatic)和炎症性肠病(inflammatory boweldisease,IBD),TNF-α的产生和活性对于疾病的产生和严重程度起着至关重要的作用。
临床资料表明:采用抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的重组受体以及TNF-α的人源化单克隆抗体的生物治疗所得到的临床结果令人振奋,它可通过中和TNF-α生理活性而抑制炎症病变的形成。临床效果十分显著,如使用抗体治疗,次日关节痛减轻,一周后C-反应蛋白降低,肿胀关节数降低。但是抗体治疗仍有难以克服的缺陷,比如,用量大,且价格昂贵;反复给药易产生中和抗体,使疗效降低。
因此,本领域迫切需要开发一种对TNF-α的活性有抑制作用的小分子化合物,来取代注射生物大蛋白。
发明内容
本发明旨在提供青藤碱衍生物的新用途。
在本发明的第一方面,提供了一种如式I所示的青藤碱衍生物的用途,
它可用于制备预防或治疗自身免疫疾病的组合物。
在另一优选例中,所述的自身免疫疾病是巨噬细胞趋化引起的自身免疫疾病。
在另一优选例中,所述的自身免疫疾病组合物是由肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路传导引起的自身免疫疾病。
在另一优选例中,所述的自身免疫疾病选自类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis,RA),强直性脊柱炎,系统性红班狼疮,银屑病(psoriatic),炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)。
在本发明的第二方面,提供了一种如式I所示的青藤碱衍生物在制备肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路阻断剂组合物中的用途。
在另一优选例中,所述的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路阻断是由于抑制了Ikb-α的降解。
在另一优选例中,本发明所述的组合物含有(a)如式I所示的青藤碱衍生物,和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的组合物包括药物组合物或保健品组合物。
在另一优选例中,所述的组合物选自:粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。
据此,本发明提供了一种对TNF-α的活性有抑制作用的小分子化合物,即如式I所示的青藤碱衍生物,它可以通过拮抗TNF-α信号通路治疗自身免疫疾病。
附图说明
图1显示了式I化合物的半数抑制浓度;其中
A表示其抑制伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激引起的细胞增殖情况,B表示其抑制脂多糖(LPS)刺激引起的细胞增殖情况。
图2显示了式I化合物的半数细胞毒浓度。
图3显示了实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(Experimental autoimmuneuveoretinitis,EAU)模型发病前后的组织形态;其中
A左图显示了正常小鼠的眼球照片(眼底镜观察),A右图显示了视网膜的组织化学切片;B左图显示了EAU的眼球照片,B右图和视网膜的组织化学切片。
图4显示了式I化合物对EAU动物模型评分的影响;其中将建立的EAU动物模型作为对照。
图5显示了式I化合物对ThG引起的巨噬细胞趋化过程的影响。
图6显示了式I化合物对I-κBα降解的影响。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现如式I的化合物可用于治疗自身免疫疾病。进一步地发现,它可有效阻滞ThG引起的巨噬细胞的趋化过程,并且能特异性地阻断TNF-α信号通路,从而抑制炎症因子的合成。
本发明提供的式I化合物是青藤碱本体(代号1000)(如式II)的衍生物,它可,包括但不限于,由植物中提取或化学合成、半合成、生物转化的方式获得:
本发明提供的组合物中含有治疗有效量的式I化合物和药学上或食品学上可接受的载体。所述的药学上或食品学上可接受的载体指用于治疗剂或营养剂的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些载体:它们本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上或食品学上可接受的载体可包括液体,如水、盐水、甘油和乙醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如崩解剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质、调味剂等。来自于其它的具有预防或治疗自身免疫疾病,和/或具有阻断TNF-α信号通路作用的辅助性活性成分(例如其他辅助性药材、植物提取物或化合物等),也包括在药学上或食品学上可接受的载体的定义中。
所述的组合物可以是药物组合物或保健品组合物。
本发明提供了式I化合物在预防或治疗自身免疫疾病中的应用。所述的自身免疫疾病可以是本领域技术人员所熟知的,例如但不限于:RA,强直性脊柱炎,系统性红班狼疮,银屑病,IBD。本发明提供的式I化合物特别适用于预防或治疗巨噬细胞趋化引起的自身免疫疾病,由TNF-α信号通路传导引起的自身免疫疾病,和/或由免疫细胞增殖引起的自身免疫疾病。
本发明提供的式I化合物在预防或治疗自身免疫疾病中的有效剂量是每日500-1500mg/50kg体重。可以根据病患的具体情况,由医生或相关人员给予相应的使用剂量。
本发明提供了式I化合物在阻断TNF-α信号通路中的应用,尤其适用于抑制Ikb-α降解。
本发明提供的式I化合物在阻断TNF-α信号通路中的有效剂量是每日500-1500mg/50kg体重。可以根据病患的具体情况,由医生或相关人员给予相应的使用剂量。
本发明提供的式I化合物可以阻滞ThG引起的巨噬细胞趋化过程,可以抑制免疫细胞(如T细胞、B细胞)的增殖。
本发明提供的式I化合物可作为研究免疫信号传导规律的分子探针,所述的探针可以使用本领域熟知的方法获得,例如在式I化合物上共价或非共价连接分子信号。
本发明提供的式I化合物也可用于筛选对免疫信号传导具有相关作用的药物。可以使用本领域熟知的方法进行筛选,例如但不限于,针对某个靶点(如抑制I-κBα),通过检验待筛药物和式I化合物的拮抗作用或协同作用的大小,获知待筛药物的药效。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于:
1、首次发现式I化合物在治疗自身免疫性疾病方面具有较强的疗效(比青藤碱本体强数倍)以及较青藤碱更低的毒性;
2、首次发现式I化合物具有阻断TNF-α信号通路的作用;
3、首次发现式I化合物具有阻滞ThG引起的巨噬细胞趋化过程。
下面将结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
制备式I化合物
可以参见中国专利申请CN200510024478.9的方法得到式I化合物(代号1032,在以下的实施例中都将使用此代号)。
实施例2
青藤碱衍生物免疫抑制活性的测定
首先在小鼠脾脏细胞的培养体系中加入T细胞或B细胞的特异性丝裂原(ConA、LPS),刺激T或B细胞增殖,然后分别以不同浓度梯度(测定第一组化合物IC50时,选择曲线骤变区域附近的浓度作梯度,之后各组化合物测定时,根据第一组的浓度梯度做相应调整)加入青藤碱(如式II所示,代号1000,在以下的实施例中都将使用此代号)及其衍生物(其中包括实施例1获得的1032),在48小时后用3H掺入法测量淋巴细胞增殖情况,算得IC50值,以衡量其对免疫细胞的生物学活性作用。
结果见图1。
结果表明,本发明提供的式I化合物具有非常强效的抑制免疫细胞增殖的作用。
实施例3
青藤碱衍生物毒性的测定
在小鼠脾脏细胞的培养体系中以不同浓度梯度加入青藤碱(如式II所示)及其衍生物(其中包括实施例1获得的1032),在42小时加入MTT(噻唑兰),48小时后反应终止,用分光光度计测量OD值,由下面公式算出CC50值,以表征毒性大小。以青藤碱作为对照,观察各衍生物相对于青藤碱的水平。
结果见图2。
结果显示,有数种衍生物的毒性要比青藤碱(代号1000)明显低,安全性更好。
综合实施例1、2中的数据,从诸多衍生物中选取活性很高且毒性很低的1032化合物进行以下疗效及机制研究。
实施例4
1032对自身免疫病的疗效验证
将实施例1获得的1032化合物,在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)动物模型(对照)中检验其疗效。
用光间受体视黄素物质结合蛋白(IRBP)(其纯化方法如下)加完全弗氏佐剂(CFA,加入了灭活的结核杆菌)诱导小鼠产生EAU(对照)。其间在皮下打入10-30mg/kg剂量1032化合物,21天后取眼球切片打分,以衡量1032化合物在EAU这种Th1介导的自身免疫病模型(对照)中的治疗作用。
结果见图3和4。
结果表明,1032对于EAU具有很好的治疗效果。
IRBP的纯化方法:
第一天
1、冰浴下碾磨牛眼视网膜(200只),浸泡于160ml PBS中,加入0.9ml苯甲基磺酰氟(即PMSF),4℃慢速搅拌3小时得一混合液;
2、将步骤1得到的混合液离心,4℃,10000rpm,1小时;
3、取上清,加入伴刀豆球蛋白A琼脂糖4B(ConA Sepharose 4b),得一混合液〔伴刀豆球蛋白A琼脂糖4B预处理:10ml伴刀豆球蛋白A琼脂糖4B用结合缓冲液洗过5—6次,平衡于150ml结合缓冲液中〕;
4、将步骤3得到的混合液慢速搅动2小时,4℃放置过夜;
第二天
5、早上不时搅动1小时;
6、将混合液加到ConA-Sepharose 4B亲和层析柱中,流干,液体弃之不用;
7、柱子用100ml结合缓冲液(50mM Tris,140mM NaCl,pH7.6)洗,加入10ml洗脱缓冲液(结合缓冲液中含0.5M甲基a-D-吡喃甘露糖苷(sigma)),搅拌使悬浮得一混合液;
8、将步骤7得到的混合液放置2小时(期间每0.5小时搅拌一次),收集上清;
9、再向除去上清后的混合液中加入10ml洗脱缓冲液,搅拌使悬浮,放置4小时(期间每0.5小时搅拌一次),收集上清;
10、再向除去上清后的混合液中加入10ml洗脱缓冲液,搅拌使悬浮,放置4小时(期间每0.5小时搅拌一次),收集上清;
11、合并三次洗脱液(即三次上清),在PBS中透析过夜,期间换2次PBS。
透析后的即为IRBP。
实施例5
1032对ThG引起的巨噬细胞趋化过程的阻滞效果验证
在0小时和24小时分别在C57BL/6小鼠腹腔注射ThG,它可以趋化体内的巨噬细胞,同时这些巨噬细胞能够释放炎性因子比如TNF-α。
同时打入10-30mg/kg1032化合物或者不打入,48小时后对腹腔冲洗出的细胞计数,并且对其细胞亚型用流式细胞仪进行检测,以说明1032对巨噬细胞迁移和其释放炎症性细胞因子的改变。
结果见图5。
结果表明,1032对ThG引起的巨噬细胞趋化过程有很明显的阻滞效果。
实施例6
1032治疗自身免疫病的机制探讨
首先用加入10%胎牛血清的DMEM培养基体外培养HeLa细胞,这种细胞对TNF-α的信号敏感,取对数生长期细胞,加入重组纯化的TNF-α(购自Peprotech),使TNF-α终浓度为0.4ng/ml,同时以一定浓度梯度(0.14μmol/ml,0.28μmol/ml,0.56μmol/ml,1.12μmol/ml)加入实施例1获得的1032化合物,20—30分钟后裂解细胞,用Western Blot的方法检测TNF-α信号通路中信号转导分子I-κBα的降解程度,从而表明小分子对TNF-α所开启的信号通路的直接影响。
结果见图6。
结果表明,1032能够拮抗TNF-α信号通路,这也很可能是1032治疗自身免疫病的分子机制。
TNF-α所导致炎症反应主要是通过激活NF-κB所产生,在非诱导的稳态,细胞的I-κBα蛋白与NF-κB二聚体结合,使得NF-κB被限制在胞浆中。TNF-α和其他能诱导激活NF-κB的细胞因子一样,能够诱导一系列信号转导蛋白的相互作用,传递给一个IKK复合物,由IKKα,IKKβ,IKKγ所组成。对IKK复合物的激活可以磷酸化I—κBα蛋白的调节结构域,使I-κB被SKP1-Cullin-Fboxtype E3泛素化酶所识别,并被蛋白酶体降解,从而释放NF-κB入核表达生成炎症因子。
通过检测I—κBα蛋白的降解程度,可以间接表征NF-κB介导的炎症因子表达水平:I—κBα蛋白降解量越多,被释放入核的NF-κB量越多,炎症因子表达水平越高;1032能抑制I—κBα蛋白降解,也就说明1032能抑制炎症因子的表达。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用以限定本发明的实质技术内容范围,本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中,任何他人完成的技术实体或方法,若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同,也或是一种等效的变更,均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (9)
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的自身免疫疾病是巨噬细胞趋化引起的自身免疫疾病。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的自身免疫疾病组合物是由肿瘤坏死因子-α信号通路传导引起的自身免疫疾病。
4.如权利要求1—3任一所述的用途,其特征在于,所述的自身免疫疾病选自类风湿性关节炎,强直性脊柱炎,系统性红班狼疮,银屑病,炎症性肠病。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述的肿瘤坏死因子-α信号通路阻断是由于抑制了Ikb-α的降解。
7.如权利要求1或5任一所述的用途,其特征在于,所述的组合物含有(a)如式I所示的青藤碱衍生物,和(b)药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述的组合物包括药物组合物或保健品组合物。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述的组合物选自:粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2008100327554A CN101485661A (zh) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | 一种青藤碱衍生物通过拮抗TNF-α信号通路治疗自身免疫病 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2008100327554A CN101485661A (zh) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | 一种青藤碱衍生物通过拮抗TNF-α信号通路治疗自身免疫病 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101485661A true CN101485661A (zh) | 2009-07-22 |
Family
ID=40888824
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2008100327554A Pending CN101485661A (zh) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | 一种青藤碱衍生物通过拮抗TNF-α信号通路治疗自身免疫病 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101485661A (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102210680A (zh) * | 2010-04-01 | 2011-10-12 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种青藤碱衍生物通过阻断巨噬细胞p38 MAPK信号通路治疗炎症疾病 |
CN107325097A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-07 | 北京师范大学 | 青藤碱衍生物及其制备方法与应用 |
CN107337672A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-10 | 北京师范大学 | 一类青藤碱衍生物及其制备方法与应用 |
CN112450330A (zh) * | 2019-09-06 | 2021-03-09 | 中国科学院水生生物研究所 | 青藤碱在防治豆粕饲料引起的鱼类肠肝炎症中的应用 |
CN114699411A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-07-05 | 武汉儿童医院 | 中药化合物青藤碱作为topk激酶抑制剂在制备治疗银屑病产品中的应用 |
CN114903875A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-08-16 | 南方医科大学顺德医院(佛山市顺德区第一人民医院) | 一种含有青藤碱的雾化药剂及其应用 |
-
2008
- 2008-01-17 CN CNA2008100327554A patent/CN101485661A/zh active Pending
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102210680A (zh) * | 2010-04-01 | 2011-10-12 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种青藤碱衍生物通过阻断巨噬细胞p38 MAPK信号通路治疗炎症疾病 |
CN107325097A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-07 | 北京师范大学 | 青藤碱衍生物及其制备方法与应用 |
CN107337672A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-10 | 北京师范大学 | 一类青藤碱衍生物及其制备方法与应用 |
CN107325097B (zh) * | 2017-08-04 | 2019-05-28 | 北京师范大学 | 青藤碱衍生物及其制备方法与应用 |
CN112450330A (zh) * | 2019-09-06 | 2021-03-09 | 中国科学院水生生物研究所 | 青藤碱在防治豆粕饲料引起的鱼类肠肝炎症中的应用 |
CN112450330B (zh) * | 2019-09-06 | 2023-09-15 | 中国科学院水生生物研究所 | 青藤碱在防治豆粕饲料引起的鱼类肠肝炎症中的应用 |
CN114903875A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-08-16 | 南方医科大学顺德医院(佛山市顺德区第一人民医院) | 一种含有青藤碱的雾化药剂及其应用 |
CN114903875B (zh) * | 2022-03-15 | 2023-11-21 | 南方医科大学顺德医院(佛山市顺德区第一人民医院) | 一种含有青藤碱的雾化药剂及其应用 |
CN114699411A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-07-05 | 武汉儿童医院 | 中药化合物青藤碱作为topk激酶抑制剂在制备治疗银屑病产品中的应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9403874B2 (en) | Peptides and use thereof | |
Cheng et al. | Disabling of receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) receptor complex by novel osteoprotegerin-like peptidomimetics restores bone loss in vivo | |
CN100528222C (zh) | 共聚物-1在制备治疗多发性硬化症的口服固体药物中的用途 | |
HRP950052A2 (en) | Use of anti-tnf antibodies as drugs in treating diseases involving elevated interleukin-6 serum levels | |
CN101485661A (zh) | 一种青藤碱衍生物通过拮抗TNF-α信号通路治疗自身免疫病 | |
CN108289881A (zh) | 用于治疗纤维化的赛尼克韦罗联合疗法 | |
CN109071645A (zh) | 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法 | |
MX2013000542A (es) | Composicion farmaceutica combinada y metodos para el tratamiento de las enfermedades o condiciones funcionales del tracto gastrointestinal. | |
CN101262876A (zh) | 用taci-ig融合分子治疗b细胞恶性肿瘤的方法 | |
CN114364681A (zh) | 治疗mk2介导的病症的方法 | |
CN101700249B (zh) | 一种防治类风湿关节炎的药物组合物 | |
JP2018519362A (ja) | 炎症性疾患の予防または治療用ペプチド及びこの用途 | |
EP1550460A1 (en) | Method for correcting immune responses and medicinal agent | |
CN110139672A (zh) | 运动调节功能提高剂 | |
WO2005089736A2 (en) | Methods for treating inflammatory and autoimmune diseases | |
CN110314233A (zh) | 包含柠檬苦素类化合物和dpp-4抑制剂的组合产品 | |
CN102048825B (zh) | 一种治疗重症肌无力的马钱子胶囊剂及其制备工艺 | |
EP3381934B1 (en) | Protein for neutralizing programmed necrocytosis promotion antibody, and application of protein | |
Jedrzejewski et al. | Polysaccharide peptide induces a tumor necrosis factor-α-dependent drop of body temperature in rats | |
Juel-Jensen | Sensitivity to phenindione | |
TWI671284B (zh) | 治療大腸直腸癌的化合物 | |
CN101747414B (zh) | TNF-α结合肽和TNFR1封闭肽及其在治疗TNF相关疾病中的应用 | |
KR101313894B1 (ko) | 신규한 탈황산화된 헤파린-담즙산 유도체를 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 | |
Aronstam et al. | A double‐blind controlled trial of two dose levels of factor VIII in the treatment of high risk haemarthroses in haemophilia A | |
CN108404016A (zh) | 一种蒙兽药及其在抗动物冷应激中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20090722 |