CN101484571B - 细胞或组织的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞或组织等培养物的培养方法，该培养方法是含有细胞或组织的培养物(细胞构成体2)的培养方法，包括对该培养物施加弯曲运动。使弯曲力作用于细胞或组织等的培养物(细胞构成体2)，使培养物弯曲，由此可以使从其凹陷部分至突起部分的厚度方向上产生连续的压缩和伸长，培养物可负荷以往的加压、剪切、拉伸无法得到的物理性刺激或变形，可以获得适合伴随有弯曲的部位的组织修复的培养物。

Description

细胞或组织的培养方法

技术领域

本发明涉及在再生医疗领域、组织工程领域中的细胞或组织的培养，还涉及用于三维组织或器官再生的三维组织的培养方法，具体来说，涉及含有细胞、细胞载体、细胞产生的胞外基质的任意种类作为细胞构成体(Cellconstruct)，根据情况添加培养液或其它添加物、或生长因子或药品等进行的培养方法。

简而言之，本发明的培养方法与以往的静置培养不同，是涉及物理作用并用的三维培养的方法，该培养方法是：对细胞构成体的细胞施加主动刺激，对细胞构成体施加位移，促进增殖、细胞移动、物质移动，提高细胞的存活能力，同时通过诱导分化或抑止去分化来实现目标再生组织。

背景技术

细胞或组织的培养中，对于对要培养的细胞或组织给予压力或张力等物理刺激的方法进行了研究，提出了各种生物反应器等。二元培养(平面培养)是使用平底培养基材的培养方法，通常是在培养箱内的静置培养法。悬浮培养是使非贴壁细胞悬浮培养的方法，也是在培养箱内的静置培养方法。三维培养的常规方法是将接种了细胞的细胞载体在培养箱内静置，进行培养。三维培养(使用生物反应器)通常是使细胞粘附或包含在细胞载体上，进行培养液的搅拌等处理，但是细胞载体的三维培养中也有对细胞施加加压、压缩、张力、剪切等物理作用的培养方法。施加物理性作用的培养装置被称为“生物反应器”、“组织工程处理器”等，作为用于组织工程培养实验或再生医疗的体外细胞、组织的培养装置，有望得到实际应用。

关于所述细胞或组织的培养、该培养中所使用的具有施加物理性位移或应力、刺激的功能的生物反应器，采用压力、振动(超声波)的例子有专利文献1中公开的细胞或组织的培养方法及其装置；采用压力的例子有专利文献2中公开的生物体内、生物体外和试管内的软骨和胶原的修复和再生以及骨骼再形成的方法；采用剪切力的例子有专利文献3中公开的细胞、组织培养装置；采用拉伸力的例子有专利文献4中公开的细胞、组织培养装置；采用压缩力的例子有专利文献5中公开的细胞、组织培养装置；采用剪切力的例子有专利文献6中公开的细胞培养装置；采用拉伸力的例子有专利文献7中公开的使用硅胶带的培养细胞用伸缩刺激负荷装置；并用拉伸力和剪切力的例子有专利文献8中公开的对组织、合成或天然血管移植片进行灭菌、接种、培养、保存、运输以及检查的装置和方法。专利文献9中公开了通过膜体使保持膜体状的细胞产生变形的培养方法等。专利文献10和专利文献11中公开：培养中利用半透膜。人们对于各种物理性作用和刺激的施加或利用半透膜的细胞等的培养进行了尝试。

专利文献1：日本特开2001-238663号公报(摘要等)

专利文献2：日本特表2004-512031号公报(摘要等)

专利文献3：日本特开2002-315566号公报(摘要等)

专利文献4：日本特开2003-061642号公报(摘要等)

专利文献5：日本特开2003-180331号公报(摘要等)

专利文献6：日本特开平09-313166号公报(摘要等)

专利文献7：日本特开平10-155475号公报(摘要等)

专利文献8：日本特表平11-504216号公报(摘要等)

专利文献9：日本特开2005-143343号公报(摘要等)

专利文献10：WO2006-015304A2(摘要等)

专利文献11：日本特表2000-513214号公报(摘要等)

发明内容

发明所要解决的课题

但是，人体存在承受各种应力的部位，这些部位的修复中所使用的组织根据其部位不同而不同。例如，在椎间板、半月板、骨骼、纤维软骨、心脏瓣膜处，在体内承受弯曲力。该弯曲力与单纯的压力、压缩、拉伸、剪切等不同。对于所述承受弯曲力的部位，采用通过单纯的压力、压缩、拉伸、剪切等刺激因素培养的组织并不足够。

因此，本发明人等认识到，作为施加给要培养的细胞或组织的刺激或负荷，弯曲对于细胞或组织的增殖等极为有利。本发明是基于上述认识而完成的，关于所述弯曲，专利文献1～11中没有公开，也没有任何启示。

因此，本发明的目的在于涉及含有细胞和/或组织的培养物的培养方法，提供适合人等身体部位的细胞和/或组织的培养方法。

解决课题的方法

为实现上述目的，本发明涉及含有细胞和/或组织的培养物的培养方法，通过使弯曲力作用于含有细胞和/或组织的培养物，使培养物弯曲、具体来说，通过弯曲，在从其凹陷部分至凸起部分的厚度方向上产生连续的压缩和伸长，对培养物负荷以往的加压、剪切、拉伸中无法得到的物理性刺激或变形，由此可以获得适合于伴有弯曲的部位的组织修复的培养物。

因此，为实现上述目的，本发明的第一方面是含有细胞和/或组织的培养物的培养方法，该方法含有对上述培养物负荷弯曲运动的步骤。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述弯曲运动含有使上述培养物形成弯曲状态的处理。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选含有在可弯曲的培养床上设置上述培养物的步骤，上述弯曲运动以上述培养床作为媒介来进行。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述培养床是可移动地支撑其两端、通过对中央部负荷载荷来使其弯曲。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述培养物用半透膜密封。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述弯曲运动周期性或断续性地进行。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述培养物中含有细胞、细胞载体、上述细胞产生的胞外基质、培养液的任意种类。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述培养物是接种了细胞的三维培养载体。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述培养物是含有凝胶状物质。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述三维培养载体为生物体吸收性材料。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选上述凝胶物质是生物体吸收性材料。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选含有下述处理的任意形式：对上述培养物施加连续的张力的处理；对上述培养物施加断续的张力的处理；或者对上述培养物周期性地施加连续或断续的张力的处理。

为实现上述目的，上述培养方法中，优选含有将上述培养物加压的处理，该加压可以是连续或断续、或者周期性变化或不规则变化。

发明效果

根据本发明，可以得到以下效果。

(1)对正在培养的培养物施加弯曲等位移(应力)，因此可促进培养物的培养，例如可用于椎间板等体内承受弯曲力的组织的再生。

(2)有望防止干细胞分化、组织细胞去分化。

(3)组织结构等具有方向性时，可以使其排列方向一致，可获得与体内组织同等的培养物。

(4)排除压力等其它物理作用或使其最小化，通过弯曲作用可以培养所需的组织。

(5)有望使细胞移动变得容易。

(6)可使营养物、氧渗透至三维细胞构成体的内部。

(7)容易排出代谢废物。

(8)如果通过半透膜将细胞存在的部分和培养液的部分进行分离，则可以排除培养液的液流产生的剪切力，可以以限定为弯曲或压力的作用进行培养。

(9)如果用半透膜将存在细胞的部分和培养液的部分进行分离，则即使没有载体细胞也可以成为球体化，可实现三维组织化。

附图简述

图1是表示实施方式1的培养床的构成例的图。

图2是表示培养的处理顺序的流程图。

图3是表示进行培养处理的细胞构成体的形态的图。

图4A是表示将细胞构成体载放于培养床上的状态的图。

图4B是表示将细胞构成体载放于培养床上的状态的图。

图5A是表示对细胞构成体施加弯曲运动及其解除的图。

图5B是表示对细胞构成体施加弯曲运动及其解除的图。

图6A是涉及对弯曲状态下细胞构成体的受力和位移的相关分析的图。

图6B是涉及对弯曲状态下细胞构成体的受力和位移的相关分析的图。

图7A是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图7B是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图7C是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图8A是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图8B是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图8C是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图9A是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图9B是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图9C是涉及高度位置下的凝胶圆柱内部位移的分析图。

图10是表示实施方式2的细胞构成体的形态的图。

图11是表示将细胞构成体载放于培养床上的状态的图。

图12是表示实施方式3的细胞构成体的形态的图。

图13是表示实施方式4的细胞或组织培养系统的图。

图14是表示实验例的图。

图15是表示实验例的图。

图16是表示实验例的图。

图17是表示实验例的图。

图18是表示实验例的图。

符号说明

2细胞构成体

4培养床

6载放部

14、16支撑面

26、28把持部

32管

36培养小室(culturechamber)

38培养液

40支撑部件

实施发明的最佳方式

实施方式1

对本发明的实施方式1的细胞或组织的培养方法进行说明。

该细胞或组织的培养方法是使用细胞构成体2(图3)作为培养物的一个例子。该细胞构成体2含有细胞、细胞载体(scaffold)、上述细胞产生的胞外基质的任意种类，还可以根据需要添加培养液或其它添加物、生长因子或药品等。例如可以是使细胞悬浮的培养液、接种了细胞的三维载体和凝胶状物质或其它载体复合而成，还可以将它们封入半透膜制的袋或管中。三维载体和凝胶状物质例如由生物体吸收性材料等构成。

密封上述细胞构成体2的半透膜可根据可通过的分子的大小来制备。例如可从透过分子量为100[Da](道尔顿)～1000[kDa]的半透膜中选择使用。即，选择可透过培养液中的营养成分、必需的氧等气体或细胞产生的代谢废物等低分子物质等，但不能透过细胞或高分子的胞外基质的半透膜，只要可以锁住细胞，则可以防止细胞或胞外基质的流失，同时可以使营养成分和氧的供给成为可能，可实现高效率培养。

该细胞构成体2的培养使用培养床4。图1是表示该培养床的构成例的图。

该培养床4是支撑细胞构成体2、同时对细胞构成体2施加运动的装置，该培养床4构成功能部，即将位移动作传递至保持的细胞构成体2，通过培养床4所具有的弹性，使细胞构成体2恢复至位移动作前的状态。

培养床4具备可平行载放两个细胞构成体2的载放部6，该载放部6是：具有将两个细胞构成体2平行载放的面积和形状，且由用于对各细胞构成体2施加弯曲运动的弹性材料形成的板状部。弹性材料例如可使用弹簧用不锈钢钢板或其它弹性高的材料。此时，可以用弹性材料形成培养床4全体，也可以用弹性材料形成可弯曲运动的载放部6或其一部分。载放部6并不限定于平板状，也可以是网状。载放部6可以是载放单一的细胞构成体2的构成，也可以是可载放3个以上细胞构成体2的构成。

该载放部6为长方形状，在其长度方向的端部形成长方形状的竖直壁部8、10，各竖直壁部8、10与载放部6成直角，同时形成与各细胞构成体2对应的椭圆形的透孔部12。这些透孔部12固定细胞构成体2的两端。另外，各竖直壁部8、10可以根据各细胞构成体2的尺寸设定为规定高度h。

在各竖直壁部8、10的顶部，作为平行面，与载放部6平行地形成具有一定宽度的支撑面部14、16，各支撑面部14、16上，将一部分弯折，与各竖直壁部8、10平行地形成弯折部18，各弯折部18可以使各支撑面部14、16和各竖直壁部8、10得到补强。即，即使用与含有薄板状部的载放部6相同的板材形成各支撑面部14、16和各竖直壁部8、10，也可得到足够的强度，同时可实现培养床4的重量减轻。该实施方式的培养床4中，为了固定支撑面部14一侧，形成与未图示的定位销对应的U字形的缺陷部20。

载放部6的中间边缘部位形成支撑所载放的细胞构成体2的侧面部的支撑壁部22、24，各支撑壁部22、24的顶部形成覆盖细胞构成体2的上面部的把持部26、28。各支撑壁部22、24是与载放部6垂直相交的壁部，其高度与上述竖直壁部8、10同样。另外，各把持部26、28与载放部6构成平行面。细胞构成体2配置在载放部6和各把持部26、28的间隔内。各把持部26、28的终端部构成曲面部，两者之间设定用于装卸细胞构成体2的间隔30。

下面，参照图2、图3、图4A、图4B、图5A和图5B，对细胞构成体2的培养方法进行说明。图2是表示培养的处理顺序的流程图，图3是表示进行培养处理的细胞构成体的形态的图，图4A和图4B是表示将细胞构成体设置于培养床上的图，图5A和图5B是表示对细胞构成体施加弯曲运动及其解除的图。

如图2所示，细胞构成体2的培养处理含有前处理(步骤S1)、培养处理(步骤S2)和后处理(步骤S3)。前处理中含有细胞构成体2的形成、半透膜的封入处理等。培养处理含有弯曲运动处理，反复进行弯曲处理(步骤S21)、弯曲解除(步骤S22)、弯曲处理(步骤S23)......、弯曲解除(步骤S2N)。后处理含有将结束培养的细胞构成体2从培养床4中取出等。

(1)前处理(步骤S1)

在细胞构成体2的形成中，由体内取出组织或细胞，然后将取出的组织用酶等分解，进行必需的细胞筛选。另外，需要增加筛选的细胞数时，可在前处理阶段通过单层培养等进行细胞数的增加处理。对于所得细胞，将培养液、水凝胶、凝胶状载体组合，制备细胞构成体2。除此之外，作为不定形构成体，可以使细胞悬浮在培养液或水凝胶中，或使细胞与凝胶状载体混合。作为定形构成体，可以使细胞悬浮在培养液中，将其加入到胶原海绵、壳聚糖海绵等细胞载体中，使细胞附着，或者是以溶胶状态将细胞混入载体，将其加入到胶原海绵、壳聚糖海绵等细胞载体中，使细胞附着，同时实现凝胶化。还可以根据需要添加生长因子或药剂等。

如图3所示，将作为培养物的细胞构成体2密封到筒状的半透膜制的管32中进行培养。在半透膜制的管32的一端例如设置由半透膜制成的密封栓34，由另一端加入上述的细胞构成体2，同样用密封栓34密封，由此可密封细胞构成体2。封入了细胞构成体2的管32的大小可根据要培养的物质的目的、以及细胞构成体2的种类等而变化。

如图4A和图4B所示，将密封在管32中的细胞构成体2载放于培养床4的载放部6上。在培养床4上的载放处理是将封入了细胞构成体2的管32穿过在把持部26、28之间设置的间隔30，使管32的两端通过设置于各竖直壁部8、10的透孔部12，同时使管32的中间部位于载放部6和把持部26或28之间。在该实施方式中，是将两根管32并列载放，其根数并没有特别限定。该实施方式中，是将管32的两端插入透孔部12进行固定，但也可以根据管的大小，例如用专用夹子等支撑在培养床4上。

通过所述载放，后述的培养处理中，例如通过对培养床4的底部一侧施加的力使培养床4弯曲及其解除，与此相对，管32被各透孔部12和把持部26、28支撑，可与培养床4一起进行弯曲和恢复动作，可以实现弯曲运动。

(2)培养处理(步骤S2)

培养处理中，如图5A所示，将密封在管32中的细胞构成体2与培养床4一起转移至作为培养空间的培养小室36，将培养液38供给该培养小室36内。设置在培养小室36中之后，为了防止培养液38等流出或者由外部混入杂菌，例如可以通过外罩等使培养小室36处于密封状态。另外，设置在培养小室36中的培养床4，其支撑面14、16由支撑部件40支撑。由此，即使由后述的背面一侧施加力F，培养床4也不会发生上下挪移，可以使培养床4和管32弯曲。所述培养小室36可以具有保持密封状态，同时在培养处理中使培养液38循环供给的构成。这种情况下，培养液38可以是在培养小室36中连续地循环的构成，也可以是定期交换的构成。

由培养床4的背面一侧例如通过未图示的控制杆等负荷力F，则如图5B所示，培养床4的载放部6由于力F而向上方弯曲，通过该弯曲，载放部6上的管32也弯曲。即，细胞构成体2中产生弯曲。由该弯曲状态解除力F，则培养床4的载放部6由于弹性而恢复成原形状，变得平坦，因此载放部6上的细胞构成体2也转移为平坦状态，再次成为图5A所示状态。这种情况下，管32的上面部存在培养床4的把持部26、28，向上方突起变形的管32根据载放部6的复原而穿过管32两端的透孔部12和被把持部26、28把持，根据载放部6的原状复原而变得平坦。如上所述，通过透孔部12和把持部26、28，可以对密封到管32中的细胞构成体2施加与培养床4的弯曲和平坦化的位移量同等程度的位移量，因此通过控制所施加的力F带来的移动量，也可以控制施加给细胞构成体2的弯曲运动量。

这样，反复进行所述弯曲运动(步骤S21～步骤S2N)，经过必要的培养时间，细胞在管32内增殖，同时生产胞外基质等，可以再生不定形的或定形的新生组织。弯曲动作的周期或大小、动作程序、培养小室36内的温度设定等可在培养处理开始前预先设定最佳方式等，除此之外也可以根据细胞或组织的培养状态任意设定。还可以根据需要在培养小室36内施加压力进行培养的构成。

如上所述，培养中使用半透膜制的管32时，可以防止培养液与培养物之间产生的剪切力的发生、且防止细胞或胞外基质的流失，同时使营养成分和氧的供给成为可能，可实现高效率培养。但是，由于营养物的通过阻力，可能对营养物的供给产生障碍。但是如上所述，通过施加弯曲动作，内部位移主动升高，产生压力差，营养成分容易移动，同时对于细胞施加物理性刺激。由此，在没有血管的阶段的细胞构成体2或没有血管的组织中，弯曲动作可以代替血管或心脏的运动进行培养。

(3)后处理(步骤S3)

结束培养的细胞构成体2与培养床4一起从培养小室36(图5A)中取出。由培养床4中取出密封了细胞构成体2的管32，取出在其内部增殖的细胞或生产的胞外基质等新生组织。对取出的新生组织进行品质检查等，在用于人体等治疗之前进行保存。

培养的新生组织如果是定形组织，则可通过缝合等方法直接移植到人体中，如果为不定形组织，则可通过注入到缺损部，或者结合组织的形状进行涂布或成型并固定等处理，在体内与周围的组织融合，可以实现组织化。

接着，参照图6A和图6B，对细胞构成体2的培养方法中的弯曲运动和培养进行说明。图6A和图6B是用于在弯曲状态下对圆柱状细胞构成体所承受的力和位移进行分析的图。

如上所述，培养床4是在培养小室36内、在规定位置支撑，使上下等不偏移，细胞构成体2也被固定在培养床4上，因此如图5B所示，从培养床4的背面一侧附加力F，则培养床4的载放部6向上方弯曲，细胞构成体2也随着培养床4一起变形。

使物体弯曲时产生弯曲应力(Bendingstress)。物体弯曲，则产生弯曲应变(Bendingstrain)。弯曲的物体内部产生各种应变。即，如图6B所示，在弯曲的外周一侧(图6B的上侧)，拉伸力作用于其上，使其伸长，在内周一侧(图6B的下侧)，则相反是压缩力作用于其上，使其，压缩。考虑到物体内部的微小部分，则微小部分之间在相邻的位置上产生伸长或压缩的位移差异，因此产生剪应力(Shearingstress)，由此产生剪应变(Shearingstrain)。如图6A粗线所示，在物体的一部分上没有伸缩位移的(0)面是所谓的中立面，包括该中立面，在所有的位置均产生剪应变。剪应变在一定的方向上产生。

由于弯曲，使截面积发生变化，导致内部压力发生变化。通过变化截面形状，则在物体内部产生压力升高部分和降低部分。并且外周被拉伸、内周被压缩，因此内周部分压力高，外周附近压力降低。

即，弯曲是内部拉伸、压缩、剪切、压力等各种作用的结果。使弯曲运动作用于细胞构成体2，则通过拉伸、压缩、剪切、压力，细胞构成体2的内部微妙变形。这里，因压力而产生的液体的收缩率是可忽视的微量，因此弯曲运动产生的应变与反复对细胞构成体2施加压力的方法相比，可以产生非常大的应变。由此，弯曲作用可以进一步增大细胞或营养、氧、代谢废物等的移动、供给等的效果，同时，相对于弯曲方向以某一特定方向产生拉伸或压缩的剪切力，因此可以使所形成的组织排列一致。

因此，如果是适合弯曲运动的细胞，则可促进增殖，同时可以培养直至组织排列也可仿真生物体内的组织的组织。并且，与弯曲并行地使用压力时，可以扩大效果。

因此，可参照图6A和图6B，对使作为细胞构成体2的模型的凝胶圆柱弯曲时产生的伸长等进行分析。

如图6A中斜线所示，对表示弯曲之前的直径为d的凝胶圆柱长度方向的截面的图6B进行研究。变形前横向长度为L，相对于凝胶圆柱的中心线，弯曲至曲率半径为r。弯曲前的凝胶圆柱高度为d(＝直径)，将该d由弯曲的内侧向外侧分成m个区。以凝胶圆柱的中心线为0，朝向内侧为-n号，朝向外侧为+n号，设置断面(Section)。图6B中，一个例子是将凝胶圆柱分成10个断面，以分割该凝胶圆柱的各线与凝胶圆柱的侧面的切点作为位移的计算位置，由弯曲的内侧向外侧表示为1～11的位置断面。

沿长度方向的伸长为ΔLn，沿厚度方向的位移为ΔRn，总位移为Dn。对于弯曲产生的长度方向(圆周方向)的位移进行分析。长度L的凝胶在弯曲的内周收缩，在外周伸长。以弯曲前的圆柱中心线作为中立面，则压缩应力和拉伸应力相等。第n号的断面的曲率半径r_n为：

[数1]

$r_n=r+\frac{n}{m}d\·\·\·\left(1\right),$

第n号断面的弦长为：

[数2]

因此，长度方向的拉伸ΔLn为：

[数3]

将式(1)代入到式(3)中，则形成

[数4]

$\mathrm{\ΔLn}=L(\frac{r+\frac{n}{m}d}{r}-1)=L\·\frac{n\·d}{m\·r}\·\·\·\left(4\right).$

接着，对于厚度方向(曲率半径方向)的位移ΔRn进行分析。自弯曲时成为最内侧的部分起，有n个断面弯曲，则变形前为长方形的该部分保持该面积而形成扇形。使凝胶圆柱弯曲，则如上所述，长度方向发生变化，因此只有这部分的厚度变化。由该考虑方法可以计算厚度方向的位移。弯曲时，由中心至成为最内侧的面的距离r₀为：

[数5]

$r_o=r-\frac{1}{2}d\·\·\·\left(5\right).$

由最内侧至第n号断面的长方形面积Sns为：

[数6]

$S_{\mathrm{ns}}=\frac{n+\frac{m}{2}}{m}d\·L\·\·\·\left(6\right),$

由最内侧至第n号断面的扇形面积Sn为：

[数7]

$S_n=\frac{L}{2\mathrm{\πr}}(\mathrm{\π}{R_n}^2-{{\mathrm{\πr}}_0}^2)\·\·\·\left(7\right).$

Sns和Sn保持相同面积(Sns＝Sn)，则由式(6)、式(7)得到：

[数8]

$\left(\frac{n+\frac{m}{2}}{m}\right)\·d\·L=\frac{L}{2\mathrm{\πr}}(\mathrm{\π}{\mathrm{Rn}}^2-{{\mathrm{\πr}}_0}^2)$

${\mathrm{\πRn}}^2-{{\mathrm{\πr}}_0}^2=\frac{2\mathrm{\πr}\·d\·L(n+\frac{m}{2})}{\mathrm{Lm}}$

$\mathrm{\π}{\mathrm{Rn}}^2=\frac{2\mathrm{\πr}\·d\·L(n+\frac{m}{2})}{\mathrm{Lm}}+{{\mathrm{\πr}}_0}^2$

${R_n}^2=\frac{2r\·d(n+\frac{m}{2})}{m}+{r_0}^2\·\·\·\left(8\right).$

这里，将式(5)代入式(8)，则得到：

[数9]

${R_n}^2=\frac{2r\·d(n+\frac{m}{2})}{m}+r^2-\mathrm{rd}+\frac{d^2}{4}=\frac{2\mathrm{rd}\·n}{m}+r^2+\frac{d^2}{4}$

$R_n=\sqrt{\frac{2\mathrm{rd}-n}{m}+r^2+\frac{d^2}{4}}\·\·\·\left(9\right).$

对于弯曲前的第n号断面，由曲率中心至此的距离r_n为：

[数10]

$r_n=r+\frac{n}{m}d\·\·\·\left(10\right),$

由此弯曲时的位移ΔRn为：

[数11]

ΔRn＝R_n-r_n

$\mathrm{\ΔRn}=\sqrt{\frac{2r\·d\·n}{m}+r^2+\frac{d^2}{4}}-(r+\frac{n}{m}d)\·\·\·\left(11\right).$

因此，综合位移Dn可由以下求出

[数12]

$D_n=\sqrt{\mathrm{\Δ}{\mathrm{Ln}}^2+\mathrm{\Δ}{\mathrm{Rn}}^2}\·\·\·\left(12\right).$

利用以上分析，图7A、图7B、图7C、图8A、图8B、图8C、图9A、图9B和图9C分别表示凝胶圆柱内部的位移。图7A、图7B和图7C是涉及高度为10(＝直径d，断面数＝10)的位置中央部的凝胶圆柱内部位移的分析图，图8A、图8B和图8C是涉及高度为8(断面数＝8)的位置(偏离中央的位置)的凝胶圆柱内部位移的分析图。图9A、图9B和图9C是涉及高度为4(断面数＝4)的位置(更加偏离中央的位置)的凝胶圆柱内部位移的分析图。

具体来说，对于将直径10(d＝10)的凝胶圆柱以曲率半径50(r＝50)弯曲时的变化进行分析，将圆柱以纵、横为10的断面区分，长度的位移是相对于10(L＝10)的值。由圆柱的圆形面一侧观察位移，对高度为10(对圆中心进行区分的断面，图7A)时、高度为8(图8A)时和高度为4(图9A)时的位移分别制图。各图均是横轴为表示位移理论位置的断面位置，纵轴为总位移(Dn)、厚度方向上的位移(ΔRn)、长度方向上的伸长(ΔLn)，高度为位移量。

由上述分析结果显示，将圆柱弯曲，则该圆形截面上的某一点与相邻的点之间一定会产生位移的大小和方向上的差异。由于该差异，在圆柱的所有部分产生剪切力。不过在某一点的长度方向的线上产生同等位移和应力。

实施方式2

接着，参照图10和图11对本发明的实施方式2的细胞或组织的培养方法进行说明。图10是表示实施方式2的细胞构成体的形态的图，图11是表示将细胞构成体2载放于培养床4上的状态的图。图10、图11中，与实施方式1相同部分和相同构成采用相同符号。

该实施方式中，在实施方式1的培养方法中，将不定形的细胞构成体2密封入半透膜制的管42中进行培养。例如，对于细胞悬浮于培养液或水凝胶中、或者将细胞混合到凝胶状载体中所得的不定形的细胞构成体2，半透膜制的管42不会成为模框(frame)，因此培养后也形成不定形组织，可以培养适合注入到生物体组织间等用途的组织。上述凝胶状物质例如由生物体吸收性材料构成。

所述细胞构成体2(图10)中，可以使用上述的培养方法(图2)，同样地进行培养，但是，此时，前处理是使用柔软性高的管42，因此其开口截面形状为不定形，管42的两端开口的密封是利用管42所具有的柔软性，同时用专用的夹子44密封，以此代替密封栓34(图3)。即，为防止细胞构成体2从管42中流出，实施将管42的两端弯折、将重叠部分用夹子44密封等处理。另外，为防止弯曲运动导致的管42的破裂、或使管42内的细胞构成体2产生移动空间等，细胞构成体2在管42中的密封必须密封适量，以不至于形成满载状态。根据培养的目标量而不同，例如可以密封成半透膜制的管42的截面为椭圆形状。

如上所述，密封到管42中的细胞构成体2如图11所示，安装于培养床4上。培养床4上的载放处理与实施方式1相同，将密封了细胞构成体2的管42穿过设于把持部26、28之间的间隔30，使管42的两端穿过设于各竖直壁部8、10的透孔部12中，同时管42的中间部配置成位于载放部6和把持部26、28之间的位置。通过所述载放，通过上述培养处理中的弯曲运动，根据培养床4载放部6的弯曲及其解除，可以使细胞构成体2产生弯曲运动。

所述构成中，通过与实施方式1同样地实施培养处理，如上所述，可培养不定形的细胞构成体2。

关于细胞构成体2与培养床4的固定，除上述之外，例如可以是用夹子44将管42与培养床4一起夹持的构成；或者是将培养床4的固定用夹与夹子44一起使用的构成。

实施方式3

接着，参照图12对本发明的实施方式3的细胞或组织的培养方法进行说明。图12是表示实施方式3的细胞构成体2的形态的图。图12中，与实施方式1相同部分或相同构成采用相同符号。

该实施方式中，相对于实施方式1的培养方法，是将细胞接种于定形的细胞载体(三维载体)48中、制备定形的细胞构成体2、封入半透膜制的管32中进行培养的构成。具体来说，可以将细胞悬浮在培养液或水凝胶中，或者将细胞混入凝胶状载体中。定形构建体是使细胞悬浮在培养液中，将其加入到胶原海绵、壳聚糖海绵等细胞载体中，使细胞附着，或者在溶胶状态下将细胞混入载体，或将其加入到胶原海绵、壳聚糖海绵等细胞载体中，使细胞附着，同时进行凝胶化。三维载体和凝胶状物质例如由生物体吸收材料等构成。培养方法可以与上述实施方式1相同，因此省略其说明。

通过上述构成，通过使用预先定形的细胞构成体2，可以培养所需形状或大小的新生组织。

实施方式4

以下，参照图13对本发明的实施方式4的细胞或组织的培养系统进行说明。图13是表示细胞或组织的培养系统的图。图13中，与实施方式1相同部分或相同构成采用相同符号，省略其说明。

该实施方式中，在实施方式1至实施方式3的细胞或组织的培养方法中，构成了在进行培养液的循环或随时供给新鲜的培养液的同时，控制培养室的温度或压力、所供给的混合气体G的浓度等进行培养的培养系统50。

培养系统50可使用作为培养装置的培养箱52。该培养箱52的培养室53中设置有培养单元54、培养回路56、调节器58、温度调节器60、气体浓度调节器62、加压装置64，它们通过在培养箱52的外部的控制装置66来控制。

培养单元54是对细胞构成体2施加压力或上述力F等进行培养的培养装置，在其内部形成作为上述培养空间的培养小室36。加压装置通过控制装置66进行控制，压力P作用于培养小室36内的培养床4的下面一侧。

培养回路56是对培养装置进行培养液38等的供给和循环的装置，培养回路56由储存培养液38的培养液储存器70、向培养液38或培养室53供给混合气体G(氮、氧、二氧化碳等)的气体交换部72、泵74、逆止阀76和将培养单元54与调节培养室53或培养小室36内的压力的压力调节器78连接的循环管80构成。

泵74可使用活塞式泵、汽缸式泵、蠕动泵。泵74的驱动、压力调节阀78的开闭、其开合程度等可通过控制装置66调节。调节器58是培养单元54用于对细胞构成体2施加力F的驱动源。温度调节器60调节培养室53和培养小室36内的温度。气体浓度调节器62进行供给培养液存储器70或培养液38的混合气体G(氮、氧、二氧化碳等)的浓度调节。控制装置66进行上述各功能部的控制，具体来说，将温度调节或气体浓度的调节等汇总控制，除此之外还进行培养液存储器70的循环或泵74的动作、调节器58的动作等的控制。

通过所述培养系统50进行上述培养处理，则可以进行负荷弯曲运动的培养处理，同时，可以通过培养回路56向培养小室36内供给培养液38以及代谢废物等的排除。通过加压装置64，可以连续地、断续地或周期性地等控制对培养单元54的加压，可以使温度或压力保持所需状态进行培养。结果可以进行高效率且可靠性高的培养。

该培养系统50中，在培养箱52的内部设置培养液存储器70、调节器58、泵74，但并不限于此，可以使它们的全部或部分处于培养箱52的外部。另外，调节器58的动作可以与通过加压装置64对培养小室36的加压、供给培养液38的泵74等动作连动，另外，如果在培养处理的中途中断，周期性地或断续地施加弯曲运动，则可以对细胞施加有效的刺激。

其它实施方式

上述实施方式中，对于作为培养物的细胞构成体2，由培养床4的背面一侧施加力F，使培养床4向上方弯曲，由此使细胞构成体2弯曲，也可以对培养床4或细胞构成体2本身施加规定的弯曲位移。该处理中，可以连续地或断续地施加，或者可以周期性地施加连续或断续的张力。所述构成也可以对细胞构成体2实施规定的弯曲。

实验结果

下面，参照图14～图18，对使用本发明的培养方法的实验结果进行说明。

图14表示细胞构成体。该细胞构成体是将悬浮在培养液中的细胞加入到半透膜的管中而构成，如图15所示，细胞构成体固定在培养床上，收纳于培养小室内。此时，驱动部可与培养小室分离。

来自调节器的加压作用于培养单元，使弯曲动作施加于细胞构成体。调节器放置在培养室之外，电缆贯穿培养室的门，与驱动部连接。调节器的动作状态可通过显示装置确认。

调节器可以通过曲柄将马达的旋转运动变换为直线运动，通过选择曲柄臂的长度，可以调节线杆的进退幅度，由此可以调节对细胞构成体施加的弯曲的大小。

该实验中，加压动作是只限定于弯曲动作，保持大气压，进行培养液循环。压力和调节器产生的弯曲动作可以分别无关系地单独施加。该实验中，例如可以施加0.5[MPa]以上的加压。

图16～图18表示脊椎器官的培养实验(出生2天的小鼠的脊椎器官培养(Vertebraeorgancultureof2daysoldmouse))。实验是将从出生后两天的小鼠中取出的脊椎设置在培养床上(图16)，以0.1[Hz]的频率施加弯曲动作，实施10天的培养。该实验中未进行加压。

比较例是进行静置培养。图17和图18表示10天的静置培养。10天后，将器官的截面用甲苯胺蓝染色，观测细胞的存活状况。图中，着色部分未能明确标识，但是亮度降低的部分(染色部分)表示存在存活的细胞。静置培养中，椎间板内部的细胞密度没有提高，可见基质的变性(图17a)。

与此相对，施加了弯曲动作、位移的脊椎中，可见椎间板内部细胞的增生以及新生基质的蓄积(图18b)。

由该实验结果可知，施加弯曲动作的培养与静置培养比较，可见细胞的增生和新生基质的堆积，由此可以推断：该弯曲动作可以对细胞构成体产生刺激，同时促进物质移动。

如上所述，对本发明的最优选的实施方式进行了说明，但本发明并不限定于上述记载。根据权利要求中请求保护的范围或说明书所公开的发明内容，本领域技术人员可以进行各种变形或变更，所述变形或变更当然也包含在本发明的范围内。

产业实用性

本发明涉及细胞或组织的培养方法，通过将弯曲运动的刺激施加给细胞构成体，促进没有血管的新生组织内的物质移动，由此促进细胞的增殖，除此之外可以模仿生物体内组织状态进行培养，因此本发明是有用的。

Claims (12)

1.含有细胞和/或组织的培养物的培养方法，其特征在于，该培养方法包括：

在前处理的过程中，

在培养床的间隔中穿过所述培养物，并在载放部上载放所述培养物、同时将所述培养物的中间部配置于所述载放部和把持部之间，用透孔部固定所述培养物的两端的步骤，

所述培养床具备

用弹簧用不锈钢钢板形成的长方形状的所述载放部；

与该载放部为相同的板材、在所述载放部的长度方向的两端形成且与所述载放部成直角的竖直壁部；

形成于该竖直壁部的所述透孔部；

与所述载放部为相同的板材、形成于所述竖直壁部的顶部的支撑面部；

与所述竖直壁部具有同样的高度、支撑所载放的所述培养物的侧面部的2个支撑壁部，其是在所述载放部的中间边缘部位形成且与所述载放部垂直相交的壁部；以及

形成于该支撑壁部的顶部、与所述载放部构成平行面，覆盖所述培养物的上面部的所述2个把持部，

在所述2个把持部之间设定用于装卸所述培养物的所述间隔，

在培养处理的过程中，

将载持有所述培养物的所述培养床设置于培养小室，对上述培养物施加弯曲运动的步骤，

其中，利用形成于所述竖直壁部的顶部且与所述载放部平行的支撑面部、和形成于该支撑面部的弯折部，可移动地支撑所述载放部，

在对所述培养物施加弯曲运动时，在培养液循环的所述培养小室内，对所述载放部的中央部的背面侧施加荷重，使所述载放部弯曲，

解除所述荷重后利用弹性使所述载放部恢复成原形状，

利用通过所述荷重的施加及其解除而弯曲的所述载放部，在所述培养液内对所述培养物赋予所述弯曲运动。

2.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：上述弯曲运动含有利用所述载放部的弯曲使上述培养物形成弯曲状态的处理。

3.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：上述弯曲运动以上述载放部作为媒介来进行。

4.权利要求1、2或3所述的培养方法，其特征在于：上述培养物用半透膜密封。

5.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：上述弯曲运动周期性或断续性地进行。

6.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：上述培养物中含有细胞、细胞载体、上述细胞产生的胞外基质、培养液的任意种类。

7.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：上述培养物是接种了细胞的三维培养载体。

8.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：上述培养物含有凝胶状物质。

9.权利要求7所述的培养方法，其特征在于：上述三维培养载体为生物体吸收性材料。

10.权利要求8所述的培养方法，其特征在于：上述凝胶状物质为生物体吸收性材料。

11.权利要求1所述的培养方法，其特征在于，该培养方法含有下述任意形式的处理：对上述培养物施加连续的张力的处理；对上述培养物施加断续的张力的处理；或者对上述培养物周期性地施加连续或断续的张力的处理。

12.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：该培养方法含有将上述培养物加压的处理，该加压可以是连续或断续、或者周期性变化或不规则变化。