CN101455845A - 奥曲肽为靶向配基的聚乙二醇修饰磷脂衍生物及其制法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药用高分子辅料和药剂领域。具体涉及一类以奥曲肽为靶向配基的聚乙二醇修饰磷脂衍生物(I)，本发明中聚乙二醇长链发挥空间稳定作用，使被修饰的脂质体实现长循环，同时，奥曲肽连接在PEG亲水链的外侧，暴露在脂质体的外层，不受PEG链的影响，在脂质体渗透出肿瘤新生血管后保持了主动靶向肿瘤细胞、与细胞膜SSTR受体结合的作用，从而提高了肿瘤细胞对于脂质体所包载药物的摄取。

Description

奥曲肽为靶向配基的聚乙二醇修饰磷脂衍生物及其制法

技术领域

本发明涉及药用高分子辅料和药剂领域。具体涉及一类以奥曲肽为靶向配基的聚乙二醇修饰磷脂衍生物，还涉及这种新型材料在抗肿瘤药物制剂中的应用。

背景技术

1965年英国人Bangham发现了脂质体，经过40多年的发展，脂质体在很多领域得到了应用。脂质体具有高度的生物相融性，利用其递送药物具有缓释性和靶向性同时还能降低被包封药物的毒性和提高药物稳定性。应用传统脂质体递送药物除了以上优良的性质外也存在局限性。①脂质体是一种被动靶向给药系统，给药后在体内主要集中于肝、脾、肾等网状内皮细胞丰富的器官，如欲对其它组织器官进行治疗，则靶向性不明显。为了提高脂质体靶向其它组织器官的能力，人们将脂质体表面采用具有靶向性的分子(如单克隆抗体、半乳糖基、转铁蛋白、叶酸等)进行修饰，通过靶向性分子与靶细胞膜蛋白受体的特异结合，将脂质体包载的药物导向靶组织，赋予脂质体主动靶向性。这种脂质体又被称免疫脂质体。②脂质体体内稳定性差。传统脂质体进入体循环后半衰期短体内清除快。为了提高脂质体的体内稳定性人们将脂质体表面采用生物相容性的高分子(如PEG)进行修饰，这样可以使脂质体免受血液调理素破坏以及组织网状内皮系统(RES)摄取。这类脂质体被称为空间稳定脂质体或长循环脂质体。

目前研究的脂质体绝大多数都集中在肿瘤治疗领域。但是迄今为止，脂质体递药系统对于像胃癌、肝癌这类血管外实体肿瘤的疗效改善不够显著。要使脂质体聚集到血管外实体瘤，既需要脂质体具有高体内稳定性防止脂质体在渗透出血管前被调理素破坏及RES系统摄取，又需要脂质体对肿瘤细胞具有高度亲和性使得渗透出肿瘤新生血管的脂质体迅速被肿瘤细胞捕获。将免疫脂质体和长循环脂质体的优点结合集中到一个给药体系中，这样形成的脂质体被称之为空间稳定免疫脂质体。空间稳定免疫脂质体既具有相对较高的血液循环稳定时间(相对较低的RES系统摄取率)，以便脂质体在体循环中能更多的通过“增强渗透驻留效应”(EPR效应)渗漏出血管；同时又有高的靶向结合效率，使得渗漏出血管的脂质体能通过其修饰配体的靶向作用快速与靶细胞亲和，被靶细胞摄取发挥药效。迄今为止，研究表明将靶向配体通过PEG链偶联在脂质体上形成的空间稳定免疫脂质体具有高效的体内稳定性和靶向活性，更适合于脂质体的靶向给药。

靶向配体通过PEG链偶联在脂质体上制空间稳定免疫脂质体关键需要具有能与蛋白反应活性位点的PEG修饰磷脂。常用的此类磷脂有Mal-PEG-DSPE、PDP-PEG-DSPE、以及应用EDC/NHS做耦连剂的系统，这些方法有的需要被耦连分子具有特定位点(巯基)，有的需预先对耦连蛋白进行修饰，有的耦连后形成的化学键具有毒性，这些都限制了空间稳定免疫脂质体的开发。研究发现对硝基苯基碳酸酯基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(pNP-PEG-PE)是一种简便(靶向性分子与PEG修饰磷脂连接只需要一步反应)、温和(室温反应)、通用(适合蛋白、多肽、单抗等各种靶向分子连接)、安全(通过形成酰胺键连接)的制备空间稳定免疫脂质体的材料。

生长抑素(somatostatin，SST)是一种环状的多肽类激素，主要分布于胃肠道及中枢神经系统。SST的主要作用为抑制内外分泌腺的分泌，减少胃肠道对水、氨基酸的吸收。奥曲肽是将天然的SST缩短生物学活性中心并引入D型氨基酸改造后得到的8个氨基酸的SST类似物。与天然SST相比它具有生物半衰期长，作用持久单一的优点。SST及SST类似物通过作用于生长抑素受体(somatostatinreceptor，SSTR)发挥作用。SSTR属G蛋白偶联型受体，目前发现SSTR包括5个亚型(SSTR_1-5)。不同亚型的SSTR对SST类似物的亲和力不同，其中SSTR₂、SSTR₃、SSTR₅对奥曲肽有较强的亲和力。大量研究表明，除神经内分泌肿瘤外，消化道肿瘤组织(包括胃癌、肝癌、胰腺癌等)呈现SSTR的高表达，而且主要是SSTR₂和SSTR₅呈高表达，这种高表达为SSTR介导的肿瘤靶向治疗奠定了良好基础，而基于此原理的放射性核素标记的奥曲肽已经被FDA批准为临床肿瘤诊断试剂。此外，奥曲肽作为靶向配基，与目前常用的靶向配基如小分子半乳糖、疏水性的叶酸及大分子转铁蛋白及单克隆抗体等比较，更具有特异性、亲水性、分子量适中以及易于实施等优点。

发明内容

本发明公开了一类以奥曲肽为靶向配基的聚乙二醇修饰的磷脂衍生物。本发明以奥曲肽(Oct)为配基，并使之与对硝基苯基碳酸酯基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(pNP-PEG-PE)偶联形成制备空间稳定免疫脂质体的靶向型PEG修饰磷脂衍生物(以下简称Oct-PEG-PE)。材料中聚乙二醇(PEG)长链发挥空间稳定作用，使被修饰的脂质体实现长循环，同时，奥曲肽连接在PEG亲水链的外侧，暴露在脂质体的外层，不受PEG链的影响，在脂质体渗透出肿瘤新生血管后保持了主动靶向肿瘤细胞、与细胞膜SSTR受体结合的作用，从而提高了肿瘤细胞对于脂质体所包载药物的摄取。

本发明的靶向型PEG修饰磷脂衍生物的结构如下：

该化合物结构中磷脂酰乙醇胺(PE)部分分子量为400～850，即x或y＝6～22的整数，聚乙二醇(PEG)部分分子量为200～20000，即z-4～450的整数。

x优选＝16，y优选＝16，z优选＝90。

本发明的Oct-PEG-PE可用以下方法制备：使用4-硝基苯基氯甲酸酯将PEG两端进行活化，利用活化后的PEG上的对硝基苯基(pNP)基团在碱性条件下可与带有伯氨基的物质形成酰胺键的性质分两步与磷脂(PE)和Oct偶联得到Oct-PEG-PE。

反应式如下：

其优选的制备方法如下：

1、聚乙二醇双对硝基苯基碳酸酯((pNP)₂-PEG)的合成：将PEG与过量的4-硝基苯基氯甲酸酯，在三乙胺的催化下常温过夜反应，滤去生成的三乙胺盐酸沉淀，蒸干溶剂，所得产物经乙酸乙酯和乙醚两次重结晶，将重结晶产物用二氯甲烷溶解，并加入乙醚使得产品析出，反应式如下：

2、对硝基苯基碳酸酯基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(pNP-PEG-PE)的制备：将PE加入到过量的(pNP)₂-PEG中，在三乙胺的催化下过夜反应，蒸干溶剂，将所得混合物溶于盐酸并超声形成pNP-PEG-PE胶束，所得胶束溶液经Sepharose4B琼脂糖凝胶柱分离去除过量(pNP)₂-PEG，冻干产品得pNP-PEG-PE，反应式如下：

3、pNP-PEG-PE与奥曲肽的连接：将奥曲肽溶于盐酸中，加入并分散pNP-PEG₄₀₀₀-PE形成脂膜，于上述混悬液中加入pH9.0缓冲液20ml，混匀，4℃反应过夜。以水为介质，分子质量为3kD的透析袋透析2天，冻干产品得Oct-PEG-PE。反应式如下：

本发明中所用的PEG优选PEG₂₀₀₀、PEG₄₀₀₀或PEG₆₀₀₀，最优选PEG₄₀₀₀。

本发明中所用的磷脂优选二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，最优选DSPE。

本发明还公开了一种脂质体制剂，它含药物、脂质体基质和结构式I的磷脂衍生物。

其中脂质体基质主要成分是磷脂，优选大豆磷脂酰胆碱，其中大豆磷脂酰胆碱和结构式I的磷脂衍生物的物质的重量比为20～99：1。

脂质体基质还优选含胆固醇和/或抗氧剂。

本发明的脂质体制剂的制备方法，先按常规方法制备含药普通脂质体，将制得的含药普通脂质体对靶向材料进行二次水合，具体做法是将Oct-PEG-PE用甲醇溶解，减压抽去甲醇后使之在瓶上形成脂膜，加入含药普通脂质体，孵育，优选孵育温度为37℃，使得靶向材料插入到脂质体的双分子层中。

本发明的Oct-PEG-PE修饰普通脂质体制备后可以组装成空间稳定免疫脂质体。将所制备的药物的普通脂质体二次水合Oct-PEG-PE形成脂质膜，使得Oct-PEG-PE通过其带有的磷脂疏水性结构嵌入到脂质体的磷脂双分子层中，从而组装成空间稳定免疫脂质体。药物的普通脂质体的制备方法可参考工具书或相关文献报道，这是本领域技术人员共知的技术。

上述所述的药物优选肿瘤用化疗药物，如紫杉醇、多西紫杉醇、藤黄酸、环孢素A、依托泊甙、长春酰胺、甲氨喋呤、藤黄酸、柔红霉素等均可按此方法制备成空间稳定免疫脂质体。更优选阿霉素、表阿霉素、藤黄酸或紫杉醇。

药理试验结果表明，用本发明的Oct-PEG-PE修饰的脂质体制剂，可以明显提高所包载药物进入SSTR受体高表达肿瘤细胞如人肝癌细胞系SMMC-7721的能力，并对肿瘤细胞的抑制能力较普通脂质体明显增强。下面是部分药理学试验.

一、细胞毒实验

以药物阿霉素为例，分别制备成阿霉素溶液、阿霉素普通脂质体组，本发明的阿霉素的空间稳定免疫脂质体组。将对数生长期的SMMC-7721细胞用胰酶消化后配制成浓度为5×10⁴个细胞/ml的细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔板，每孔加100μl，培养24小时后加入含不同浓度的药物溶液及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μl，给药组设6个剂量组并设一个溶剂对照组，每组设3个平行孔，于37℃继续培养24小时后，每孔加20μl浓度为5mg/ml的MTT(噻唑兰)。用微型振荡器振荡混匀后，用酶标仪在参考波长630nm，检测波长570nm条件下测定光密度值，以溶剂对照处理的肿瘤细胞作对照，计算药物对肿瘤细胞的抑制率，绘制抑制曲线，并按中效方程计算IC₅₀。结果显示阿霉素溶液组IC₅₀为1.39μg/ml，本发明的空间稳定免疫脂质体IC₅₀为1.88μg/ml，而普通脂质体IC₅₀为2.83μg/ml。见图1。本发明的脂质体对SMMC-7721细胞的抑制能力要强于普通脂质体。

二、SMMC-7721细胞对所药物的摄取实验

SMMC-7721细胞按5×10⁴接种于盖玻片，爬片48小时，分三组分别采用阿霉素普通脂质体、本发明的阿霉素空间稳定免疫脂质体、阿霉素溶液(浓度均为10ug/ml)进行4小时孵育，取出玻片用冷PBS润洗3次，荧光显微镜下观测，荧光的强弱反应了细胞内阿霉素的多少。结果见图2所示，从图可见含有Oct-PEG-PE修饰的阿霉素空间稳定免疫脂质体其细胞内荧光强度明显高于阿霉素普通脂质体，接近于阿霉素溶液组的水平。

三、SMMC-7721细胞内阿霉素浓度的测定

SMMC-7721细胞按1×10⁵接种于3个同样大小细胞培养瓶，培养48小时贴壁后分三组分别采用阿霉素普通脂质体、本发明的阿霉素空间稳定免疫脂质体、阿霉素溶液(浓度均为5ug/ml)进行4小时孵育，取出培养瓶用冷PBS润洗3次，每瓶细胞加入500ulPBS后用细胞刮将细胞悬浮，取出细胞悬液，加入0.3mol/L的50％乙醇溶液2ml，震荡3分钟混匀，于37℃消化18小时，于10000转/分离心10分钟后取上清用高效液相色谱法测定样品中阿霉素浓度，结果显示含有Oct-PEG-PE修饰的阿霉素空间稳定免疫脂质体摄取后其细胞内阿霉素的浓度为42.63ng/10⁶个细胞，而普通脂质体摄取后其细胞内阿霉素的浓度为24.36ng/10⁶个细胞，阿霉素溶液组摄取后其细胞内阿霉素的浓度为43.96ng/10⁶个细胞。

附图说明

图1三组对SMMC-7721细胞的抑制曲线。

图2SMMC-7721细胞对阿霉素普通脂质体、本发明的阿霉素空间稳定免疫脂质体和阿霉素溶液摄取后的荧光照片。

具体实施方式

实施例1

聚乙二醇双对硝基苯基碳酸酯((pNP)₂-PEG)的合成

称取4-硝基苯基氯甲酸酯2g，PEG₄₀₀₀ 20g。将以上两种物质分别溶于无水二氯甲烷4ml和36ml中，并在PEG的无水二氯甲烷溶液中加入三乙胺(TEA)1.5ml。将含有三乙胺的PEG无水二氯甲烷溶液缓慢加入到搅拌状态下的4-硝基苯基氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液中，常温搅拌反应过夜。

滤去反应液中生成的三乙胺盐酸盐沉淀，减压蒸干溶剂。所得粗品用无水乙醚沉淀，沉淀分别用乙酸乙酯和乙醚重结晶两次。两次重结晶后产物用二氯甲烷溶解，再加入5倍体积的乙醚于4℃沉淀，抽滤除去乙醚，所得产品置真空干燥器干燥，得白色粉末14g。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ 3.60-3.73(O-CH₂CH₂-O)，δ 3.80-3.86(4H，OCH₂CH₂OCO)，δ4.40-4.50(4H，OCH₂CH₂OCO)，δ 7.38(d，4H，-OC(O)OC₆H₄NO₂)，δ 8.28(d，4H，-OC(O)OC₆H₄NO₂)。

实施例2

对硝基苯基碳酸酯基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(pNP-PEG-PE)的制备

称取50mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)溶于2.5ml氯仿，加入TEA 0.2ml，将上述混合液加到(pNP)₂-PEG₄₀₀₀的氯仿溶液(200mg/ml)7ml中，室温搅拌反应过夜。减压蒸干氯仿，加入0.01M盐酸溶液10ml，超声形成透明胶束溶液。

所得胶束溶液用10000r/min离心5分钟，取上清用进行分子筛层析，Sepharose4B柱(2×60cm)，以0.01M盐酸为洗脱液(流速为0.35ml/min)洗脱，用分部收集器收集洗脱液，于270nm处测定各部分紫外吸收。绘制洗脱图谱。经TCL检测具有钼蓝显色反应的为pNP-PEG-PE所在位置，合并含有产品部分，冻干产品。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ 0.85-0.89(CH₃-)，δ 1.25(-CH₂-)，δ 2.28-2.40(-OCH ₂CH ₂NH-)，δ 3.60-3.73(O-CH₂CH₂-O)，δ 7.38(-OC(O)OC₆H₄NO₂)，δ 8.28(-OC(O)OC₆H₄NO₂)。

实施例3

pNP-PEG-PE与奥曲肽的连接

取pNP-PEG₄₀₀₀-PE 50mg溶于氯仿，减压除去氯仿，形成脂膜，将奥曲肽10mg溶于0.01mol/l HCl 4ml中，加入脂膜中，轻摇使脂膜充分分散。于上述混悬液中加10mmol/l(pH9.0)Tris缓冲液20ml，混匀，4℃反应过夜。以水为介质，分子质量为3kD的透析袋透析2天，冻干产品。

¹H-NMR(300MHz，D₂O)：δ 0.85-0.89(CH₃-)，δ 1.25(-CH₂-)，δ 2.28-2.40(-OCH ₂CH ₂NH-)，δ 3.60-3.73(O-CH₂CH₂-O)，δ 7.10-7.35(-NHCO-)。

实施例4

空间稳定免疫脂质体的制备

称取大豆磷脂酰胆碱200mg，胆固醇20.4mg，加入溶剂(CHCl₃:CH₃OH＝2:1)7.5ml于茄形瓶中，超声使其全部溶解。30℃旋转成膜3h，加入175mmol/l硫酸铵7.5ml，涡旋，37℃水和2h。然后用0.9％的生理盐水透析5次，每次1小时，100w探头超声700次，过0.22μm滤膜，得到空白脂质体。

取上述脂质体溶液3ml，加入4mg/ml阿霉素溶液1ml，60℃载药0.5h，所得溶液即为阿霉素普通脂质体，药物浓度1mg/ml。所制备的阿霉素脂质体粒径在110nm，呈正态分布，包封率在95％以上。

将9mgOct-PEG₄₀₀₀-PE用甲醇溶解，减压抽去甲醇后使之在茄形瓶上形成脂膜，加入阿霉素普通脂质体5ml，37℃孵育2小时，使得Oct-PEG₄₀₀₀-PE定向插入到脂质体外层磷脂膜中，分子筛过滤除去未插入的Oct-PEG₄₀₀₀-PE，所得溶液为阿霉素的空间稳定免疫脂质体溶液，其中Oct-PEG₄₀₀₀-PE含量为总磷脂的1％。

Claims (10)

1、一种通式I的奥曲肽为靶向配基的聚乙二醇修饰磷脂衍生物：

其中x或y＝6～22的整数，z＝4～450的整数。

2、权利要求1的聚乙二醇修饰磷脂衍生物，其中化合物结构中磷脂酰乙醇胺部分分子量为400～850；聚乙二醇部分分子量为200～20000。

3、权利要求1或2的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的制备方法，包括下列反应步骤：

4、一种脂质体制剂，含药物、脂质体基质和权利要求1或2的聚乙二醇修饰磷脂衍生物。

5、权利要求4的脂质体制剂，其中脂质体基质是磷脂。

6、权利要求5的脂质体制剂，其中脂质体基质还含胆固醇和/或抗氧剂。

7、权利要求4的脂质体制剂的制备方法，包括：先按常规方法制备含药普通脂质体，将权利要求1或2的聚乙二醇修饰磷脂衍生物用甲醇溶解，减压抽去甲醇后使之在瓶上形成脂膜，再加入含药普通脂质体，孵育，即得。

8、权利要求4的脂质体制剂，其中药物是肿瘤化疗药物。

9、权利要求8的脂质体制剂，其中肿瘤化疗药物是阿霉素、表阿霉素、藤黄酸或紫杉醇。

10、权利要求1或2的聚乙二醇修饰磷脂衍生物用作脂质体修饰剂的用途。

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