CN101450115A - 治疗妇科疾病的中药组合物及其制备方法和质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗妇科疾病的中药组合物及其制备方法和质量控制方法。本发明中药组合物原料药组成为：桂枝、牡丹皮、赤芍、白术、甘草。制备方法I为：以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，制粒，压制成1000粒，包衣，即得。制备方法II为：以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，制粒，压制成1000粒，包衣，即得。在本发明中药组合物的质量控制方法中对桂枝、牡丹皮、赤芍进行了检测，使本发明药物组合物的活血、化瘀、消癥作用更加稳定可靠。

Description

治疗妇科疾病的中药组合物及其制备方法和质量控制方法

发明领域

本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法，特别涉及一种治疗妇科癥块或血瘀经闭的中药组合物及其制备方法和质量控制方法。

背景技术

女性因受寒邪，寒邪客于胞中，或情志抑郁，气机不畅，瘀血凝结，经脉阻滞.则经闭。证见少腹胀痛、胀甚于痛，或胸胁胀闷，噫气泛恶，脉沉弱。《金匮要略》说“妇人宿有癥病，经断未及三月，而得漏下不止，胎动在脐上者，为癥痼害。......所以血不止者，其癥不去故也，当下其癥。”妇人少腹宿有癥块，癥积不去，漏下不止，只有去癥，才能使新血得以生存，现代医学所说之妇科子宫肌瘤、盆腔炎、子宫糜烂等有淤血证者皆属此类疾病。西医多以手术、物理治疗或使用抗炎药物，但妇科病多迁延日久，很多无法彻底治愈，反复发作，给患者带来很多痛苦。应用中医药治疗妇科疾病已经取得了显著的成绩，所以依据中医药理论，提供一种治疗妇科癥块或血瘀经闭等疾病的药物是很有必要的。

发明内容

本发明目的在于提供一种治疗妇科癥块或血瘀经闭的的中药组合物；本发明的第二个目的在于提供该中药组合物的制备方法；本发明的第三个目的在于提供该中药组合物的质量控制方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现：

本发明中药组合物的原料药组成为：桂枝50-150重量份、牡丹皮50-150重量份、赤芍50-150重量份、白术50-150重量份、甘草50-150重量份。

本发明中药组合物的原料药组成还可以为：桂枝50-120重量份、牡丹皮50-120重量份、赤芍50-120重量份、茯苓50-120重量份、桃仁50-120重量份。

本发明中药组合物的原料药组成优选为：桂枝60重量份、牡丹皮60重量份、赤芍60重量份、茯苓60重量份、桃仁60重量份。

本发明中药组合物的原料药组成优选为：桂枝100重量份、牡丹皮100重量份、赤芍60重量份、茯苓60重量份、桃仁60重量份。

本发明中药组合物制备方法为：以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，再加入常规辅料，经常规方法，制成临床接受的制剂。

本发明中药组合物制备方法优选为：以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，再加入常规辅料，经常规方法，制成临床接受的口服固体制剂。

本发明中药组合物制备方法还可以为：以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以80-100％乙醇为溶剂，80-95℃水浴回流。第1煎加入6-10倍量溶剂，回流提取1-3h，过滤；滤渣加入4-8倍量溶剂，继续回流提取1-3h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，经常规方法，制成临床接受的制剂。

本发明中药组合物制备方法优选为：以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，药粉与微晶纤维素以2：1混匀，以3％PVP的90％乙醇溶液为粘合剂制备丸剂。再加入常规辅料，经常规方法，制成临床接受的口服固体制剂。

本发明中药组合物丸剂的制备方法为：

以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤；合并两次煎液，浓缩、干燥，药粉与微晶纤维素以2：1混匀，以3％PVP的90％乙醇溶液为粘合剂制备丸剂。

本发明中药组合物质量控制方法包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：

【鉴别】

(1)取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加乙醚40-60ml，超声处理1-3次，每次12-18分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(15-19：1-5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(7-9：1-3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇15-25ml，超声处理10-20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10-20ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取1-3次，每次15-25ml，合并正丁醇液，用水洗涤1-3次，每次5-15ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇(8-12：1-3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

【含量测定】

(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定。

色谱条件与系统适用性试验HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：110-120℃，载气流速：每分钟1.0-3.0mL；分流进样，分流比为30-50：1-3，进样量2μL。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于20000

内标溶液的制备取正十五烷适量，精密稳定，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，作为内标溶液。

对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1mL含0.4mg的溶液，精密量取该溶液及内标溶液各2mL，置5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取样品内容物适量，精密称定，研细，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约400mL，用三氯甲烷振摇提取3-5次(每次30-60mL)，合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠使脱水，滤过，取滤液，用三氯甲烷液10mL分次洗涤无水硫酸钠及容器，滤过，合并三氯甲烷液，在60-80℃水浴上回收三氯甲烷至适量，转移至5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取2mL，置5mL量瓶中，加内标溶液2.0mL，用三氯甲烷至刻度，摇匀，做为样品溶液。

方法用HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：110-120℃，载气流速：每分钟1.0-3.0mL；分流进样，分流比为30-50：1-3，进样量2μL。

本发明中药组合物相当于原料药每0.3g含牡丹皮以丹皮酚(C9H10O3)计，不得少于2.0mg。

(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—0.1％磷酸溶液(30-50：50-80)为流动相；检测波长为285mn。理论板数按肉桂酸峰计算不低于2000。

对照品溶液的制备精密称取肉桂酸对照品1.68mg，置100ml棕色量瓶中，用45-55％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置5ml量瓶中，加45-55％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含肉桂酸7μg)。

供试品溶液的制备取本发明中药组合物，研细，取相当于原药材0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加40-60％甲醇10ml适量，超声提取20-40分钟，取出，放至室温，补足减失溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明中药组合物相当于原料药每0.03g含桂枝以肉桂酸(C9H8O2)计，不得少于40.0μg。

本发明中药组合物质量控制方法优选如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：

【鉴别】

(1)取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加乙醚50ml，超声处理2次，每次15分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

【含量测定】

(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定。

色谱条件与系统适用性试验HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20：1，进样量2μL。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于20000

内标溶液的制备取正十五烷适量，精密稳定，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，作为内标溶液。

对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1mL含0.4mg的溶液，精密量取该溶液及内标溶液各2mL，置5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取样品内容物适量，精密称定，研细，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约400mL，用三氯甲烷振摇提取4次(60mL，40mL，40mL，30mL)，合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠使脱水，滤过，取滤液，用三氯甲烷液10mL分次洗涤无水硫酸钠及容器，滤过，合并三氯甲烷液，在70℃水浴上回收三氯甲烷至适量，转移至5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取2mL，置5mL量瓶中，加内标溶液2.0mL，用三氯甲烷至刻度，摇匀，做为样品溶液。

方法用HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20∶1，进样量2μL。

本发明药物组相当于原料药每0.3g含牡丹皮以丹皮酚(C9H10O3)计，不得少于2.0mg。

(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—0.1％磷酸溶液(40：60)为流动相；检测波长为285mn。理论板数按肉桂酸峰计算不低于2000。

对照品溶液的制备精密称取肉桂酸对照品1.68mg，置100ml棕色量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置5ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含肉桂酸7μg)。

供试品溶液的制备取本发明药物组，研细，取相当于原药材0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇10ml适量，超声提取30分钟，取出，放至室温，补足减失溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明药物组相当于原料药每0.03g含桂枝以肉桂酸(C9H8O2)计，不得少于40.0μg。

本发明药物组合物活血，化淤，消癥，能从根本上治疗妇人宿有癥块或血瘀经闭，行经腹痛，产后恶露不尽。本发明药物组合物中桂枝辛甘温，入心、肺、膀胱经，能宣通心阳、温通膀胱、辛散瘀滞；茯苓甘淡，入心、脾、膀胱经，能健脾养心，祛痰行水；芍药味酸入肝，缓急止痛，柔养刚脏，兼顾化源，行血中之滞；丹皮、桃仁味辛苦寒，活血化瘀，消徵散结，兼清瘀热。五味药共建通阳行水，化瘀消徵之功，其特点是祛邪以固本，下瘀不伤正，行水不伤阴，阴阳兼顾，气血并调，多系统、多范围地调控人体功能，但又重在活血化瘀、缓消癥块。

本发明组合物相比现有制剂具备很好的药效，并且本发明所述的范围在可以实现本发明药效的同时，经过筛选，意外的发现，在组合物的某些范围内，具备更为突出的药效。

本发明所提供的中药组合物的质量控制方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴别专属性很好，而且方法经济适用、结果快速，并且对不同的薄层板都能应用。含量测定方法中通过对样品、供试品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得含量测定方法可以很有效的对产品进行质量控制，并且用该方法测定的产品相比其他方法测定的产品在药效上表现的更为稳定。

具体实施方式

以下实验例和实施例用于进一步说明本发明但不限于本发明。

实验例1.本发明片剂的制备

桂枝60g、茯苓60g、牡丹皮60g、赤芍60g、桃仁60g五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，再与细粉量2％的崩解剂混匀，制成颗粒，干燥，整粒，压片，包衣，即得。

本发明制成片剂的崩解性不理想，故我们通过实验对加入的崩解剂进行了筛选，试验结果见表1。

表1 不同崩解剂制成片剂的实验结果

 

崩解剂	用量	崩解时间(min)	外观性状
				淀粉	2％	17	易吸湿，药物稳定性差
羧甲基淀粉钠	2％	9	硬度好，外观可压性及流动性良好
				二氧化硅	2％	24	可压性及流动性差
低取代羟丙基纤维	2％	16	硬度不符合要求

故本发明选择2％羧甲基淀粉钠为崩解剂。

实验例2.本发明软胶囊的制备

如以上实验例1中的五味原料药，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，粉碎，加入基质适量，搅匀，制成软胶囊。

为选择合适的基质及其优选的配比，我们对其进行了筛选试验，结果见表2。

表2 不同软胶囊基质优选的实验结果

 

辅料	药物:基质	制成后性状
			豆油	1：2	内容物易分层、装量不准确
豆油：吐温-80：乙基纤维素2：0.1：1.5	1：2	流动性好，易成型，且不易渗漏
			豆油：吐温-80：单硬脂酸铝2：0.1：1.5	1：2	稳定性好，但流动性差，不易成型
豆油：吐温-80：蜂蜡2：0.1：1.5	1：2	流动性好，但易于渗漏

根据以上结果，我们以豆油：吐温-80：乙基纤维素2：0.1：1.5作为该软胶囊的基质。

实验例3.本发明丸剂的制备

如以上实验例1中的五味原料药，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，粉碎，加入赋性剂混合，以3％PVP的90％乙醇溶液为粘合剂制成丸剂。

本发明制成丸剂时，我们对丸剂的辅料进行了筛选试验，试验结果见表3和表4。

表3 不同处方丸剂的外观质量

 

药物粉末	赋形剂	外观性状
			药物粉末2份	淀粉1份	球形、光滑、圆整
药物粉末2份	微晶纤维素1份	球形、光滑、圆整
			药物粉末2份	乙基纤维素1份	球形、不光滑、不圆整
药物粉末2份	淀粉：乙基纤维素(1：1)1份	球形、光滑、圆整
			药物粉末2份	淀粉：微晶纤维素(1：1)1份	球形、不光滑
药物粉末2份	硬脂酸：乙基纤维素(1：1)1份	块状

表4 溶散时间与吸湿百分率的测定结果

以上试验结果表明：药粉与微晶纤维素以2：1混合制备丸剂大小均匀、吸湿性小，稳定性好，可操作性和质量均符合规定，固本发明丸剂以微晶纤维素作为赋形剂。

实验例4桂枝鉴别试验筛选

(1)供试品溶液的制备

取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加提取溶剂50ml，提取处理2次，每次15分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去溶剂，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见表5和表6。

表5 桂枝供试品溶液的制备方法

 

提取溶剂提取方法	正己烷	乙醇	石油醚(60-90℃)
				超声	A	B	C
水浴回流	D	E	F

表6 供试品溶液的制备筛选结果

 

	斑点清晰度	前沿	拖尾	干扰
					A	斑点清晰	无	有	无
B	斑点清晰	无	无	无
					C	斑点不清晰	无	无	有
D	斑点不清晰	无	无	无
					E	斑点不清晰	无	无	有
F	无斑点	—	—	—

结果表明：样品提取溶剂选用乙醚，超声提取的效果最佳。

(2)展开剂配比的优选：

展开剂一：石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(15：5)

展开剂二：石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17：3)

展开剂三：石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(19：1)

取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加乙醚50ml，超声处理2次，每次15分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。按实验例1法制备不含桂枝的阴性样品，并依样品溶液制备方法制得阴性样品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液各10μl，对照品溶液5μl，分别点于三块同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以展开剂一、二、三为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见表7。

表7 桂枝鉴别展开剂的选择

 

	斑点清晰度	拖尾情况	干扰情况
				展开剂一	清晰	无	有
展开剂二	清晰	无	无
				展开剂三	清晰	有	无

从上表可以看出展开剂为石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17：3)时，在薄层板上展开效果好，主斑点清晰，无拖尾，与对照品的斑点位置及颜色相同，适合试验要求。

(3)样品溶液点样量的优选：

取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加乙醚50ml，超声处理2次，每次15分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液各3、5、10、15μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见表8

表8 样品溶液点样量优选实验结果表

 

点样量	斑点清晰度	拖尾情况	干扰情况
				3μl	不清晰	无	无
5μl	主斑点颜色很浅	无	无
				10μl	颜色清晰	无	无
15μl	颜色清晰	有	无

从上表可以看出供试品点样量达到10μl时，在薄层板上显色斑点清晰可见，效果符合要求。

实验例5 牡丹皮鉴别试验筛选

(1)展开剂配比的优选：

展开剂一：环己烷—乙酸乙酯(7：3)

展开剂二：环己烷—乙酸乙酯(4：1)

展开剂三：环己烷—乙酸乙酯(9：1)

取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按实验例1法制备不含牡丹皮的阴性样品，并依样品溶液制备方法制得阴性样品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液、阴性样品溶液各10μl，分别点于三块同一硅胶G薄层板上，以展开剂一、二、三为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见表9。

表9 牡丹皮鉴别展开剂的选择

 

	斑点清晰度	拖尾情况	干扰情况
				展开剂一	清晰	无	无
展开剂二	清晰	无	有
				展开剂三	清晰	有	无

从上表可以看出展开剂为环己烷—乙酸乙酯(5：1)时，在薄层板上展开效果好，主斑点清晰，无拖尾，与对照品的斑点位置及颜色相同，适合试验要求。

(2)样品溶液点样量的优选：

取本发明药物制剂适量，取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液、阴性样品溶液各3、5、10、15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷乙酸乙酯(3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见表10。

表10 样品溶液点样量优选实验结果表

 

点样量	斑点清晰度	拖尾情况	干扰情况
				3μl	不清晰	无	无
5μl	主斑点颜色很浅	无	无
				10μl	颜色清晰	无	无
15μl	颜色清晰	无	无

从上表可以看出供试品点样量达到10μl时，在薄层板上显色斑点清晰可见，效果符合要求好。

实验例6赤芍鉴别试验筛选

(1)供试品溶液的制备

取[鉴别](1)项下的药渣，超声或回流处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。按实验例1法制备不含赤芍的阴性样品，并依样品溶液制备方法制得阴性样品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿甲醇(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点，结果见表11和表12。

表11 供试品溶液的制备方法

 

提取溶剂提取方法

四氢呋喃

正丁醇

醋酸乙酯

 

超声	A	B	C
				水浴回流	D	E	F

表12 供试品溶液的制备方法筛选结果

 

	斑点清晰度	前沿	拖尾	干扰
					A	斑点清晰	无	有	无
B	斑点清晰	无	无	无
					C	斑点不清晰	无	无	有
D	斑点不清晰	无	无	无
					E	斑点不清晰	无	无	有
F	无斑点	—	—	—

结果表明：样品提取溶剂选用乙醇，超声提取15min的效果最佳。

(2)展开剂配比的优选：

展开剂一：氯仿—甲醇(8：3)

展开剂二：氯仿—甲醇(5：1)

展开剂三：氯仿—甲醇(12：1)

取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点，结果见表13。

表13 赤芍鉴别展开剂的选择

 

	斑点清晰度	拖尾情况	干扰情况
				展开剂一	清晰	无	有
展开剂二	清晰	无	无
				展开剂三	清晰	有	无

从上表可以看出展开剂为氯仿—甲醇(5：1)时，在薄层板上展开效果好，主斑点清晰，无拖尾，与对照品的斑点位置及颜色相同，适合试验要求。

(3)样品溶液点样量的优选：

取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液3、5、10、15μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿一甲醇(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点，结果见表14。

表14 样品溶液点样量优选实验结果表

 

点样量	斑点清晰度	拖尾情况	干扰情况
				3μl	不清晰	无	无
5μl	主斑点颜色很浅	无	无
				10μl	颜色清晰	无	无
15μl	颜色清晰	无	无

从上表可以看出供试品点样量达到10μl时，在薄层板上显色斑点清晰可见，效果符合要求。

实验例7 牡丹皮的含量测定方法试验

采用毛细管气相色谱法测定本发明药物中的牡丹皮的含量，以完善本发明的质量检测方法。

含量测定方法的方法学考察

对本发明药物所采用的含量检测方法，从线性关系、专属性、精密度、重现性、回收率等方面进行了相关方法学考察，具体结果如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器 HP6890气相色谱仪

1.2 试药 对照品丹皮酚由中国药品生物制品检定所提供，试剂均为分析纯；本发明药物组、不含牡丹皮阴性试验样品由实验室自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20：1，进样量2μL。

2.2 内标溶液、对照品溶液及样品溶液的配制

取正十五烷适量，精密稳定，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，作为内标溶液；取丹皮酚对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1mL含0.4mg的溶液，精密量取该溶液及内标溶液各2mL，置5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取样品内容物适量，精密称定，研细，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约400mL，用三氯甲烷振摇提取4次(60mL，40mL，40mL，30mL)，合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠使脱水，滤过，取滤液，用三氯甲烷液10mL分次洗涤无水硫酸钠及容器，滤过，合并三氯甲烷液，在70℃水浴上回收三氯甲烷至适量，转移至5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取2mL，置5mL量瓶中，加内标溶液2.0mL，用三氯甲烷至刻度，摇匀，做为样品溶液。

2.3 专属性 取缺牡丹皮阴性试验样品，按上述方法测定，结果在与丹皮酚对照和内标物正十五烷相同位置无色谱峰出现，表明阴性对照无干扰。

2.4 线性关系考察 配制系列对照品溶液，上述条件下，以丹皮酚面积与内标峰面积的比值为纵坐标，丹皮酚浓度(mg·mL^-1)为横坐标，得回归方程：Y＝3.7308X+0.1976，r＝0.9994；丹皮酚浓度在0.0424mg～0.2544mg·mL^-1范围内有良好的线性关系。

2.5 精密度 取同一份对照品溶液，连续进样6次，测定内标与丹皮酚峰面积，计算丹皮酚峰面积之和与内标峰面积的比值，结果RSD为0.29％。

2.6 重复性 取一批号样品6份，按上述测定条件测定并计算丹皮酚含量，结果丹皮酚平均含量为2.04mg/片，RSD为0.78％(n＝6)。

2.7 回收率测定 分别精密取已知丹皮酚含量的样品适量(共6份)，并分别精密加入丹皮酚对照品溶液2.5mL(0.4240mg·mL^-1)，并按上述样品测定方法测定丹皮酚含量并计算，结果见表15。

表15 回收率试验结果

2.8 3批样品测定 3个批号样品050401、050402、050403含量测定结果分别为2.04、2.00、2.00(mg/片)。

实验例8 桂枝的含量测定方法试验

为了有效的控制制剂质量，对本发明药物所采用的含量检测方法，具有无杂质干扰，色谱峰保留时间及分析时间适当，色谱分离度好、对称性好，重现性好，适宜制剂中药材的含量测定，具体结果如下：

1、仪器   高效液相色谱系统

          Waters510型液相色谱泵系统；

          7725i型六通进样阀；

          岛津SPD—10A型紫外检测器；

          北京慧博精瑞GS2010型色谱工作站。

          美国丹法(Denver)十万分之一电子分析天平

          KQ-250DB数控型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司

试剂  乙腈       AR  批号030409    北京化工厂

      磷酸       AR  批号030522    北京化工厂

      甲醇       AR  批号030312    北京化工厂

      醋酸       AR  批号030520     北京化工厂

      异丙醇     AR  批号030510     北京化工厂

      水    二次重蒸水

试药  肉桂酸   批号110786—200303   中国药品生物制品检定所

      芍药苷   批号110736—200323   中国药品生物制品检定所

      丹皮酚   批号110708—9704     中国药品生物制品检定所

2 系统适应性试验

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Dikma DiamonsilTM C18(4.6×250cm，5μ)柱；

流动相：乙腈—0.1％磷酸(40：60)的混合溶液；

检测波长：285nm  流速：1.0ml/min；柱温：室温。

2.2 供试品溶液的制备  取本发明药物组，研成粉末，精密称取相当于原药材0.1g，置10ml量瓶中，加50％甲醇适量，超声提取30分钟，取出，放至室温，补足溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，即得。

2.3 空白对照溶液的制备  按照处方比例制成不含桂枝的制剂，不包衣，精密称取0.1g，置10ml量瓶中，加50％甲醇适量，超声提取30分钟，取出，放至室温，补足溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为空白对照溶液，即得。

2.4 对照品溶液的制备  精密称取肉桂酸对照品1.68mg，至100ml棕色量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置5ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含肉桂酸7μg)。

2.5 测定法  分别精密吸取供试品溶液、空白对照溶液及对照品溶液各10μl，在上述色谱条件下注入液相色谱仪，测定，即得。结果如说明书附图4，5，6。

结果  由上图可以看出样品在9分钟出峰，空白对照中在此处没有干扰。

3 精密度试验

精密吸取上述2.1.2项的供试品溶液10μl，在上述色谱条件及系统适用性试验条件下进样，连续进样5次，计算肉桂酸峰面积的RSD值，结果如表16。

表16 肉桂酸精密度试验数据表

结论：经计算，肉桂酸的RSD值为0.86％，符合试验要求，表明精密度良好。

4 稳定性试验

精密吸取上述2.1.2项的供试品溶液10μl，在上述色谱条件及系统适用性试验条件下进样，每1小时进样一次，连续进样8小时，选取其中的0、2、4、6、8小时的肉桂酸的峰面积计算RSD值，结果如表17。

表17 稳定性试验数据表

结论：经计算，肉桂酸RSD值为0.96％，符合试验要求，表明8小时内样品是稳定性的。

5 加样回收率试验

采用加样回收法，取已知含量的本品，分别添加适量的肉桂酸对照品，如2.1.2项下供试品溶液制备方法制备，在2.1.1的色谱条件下测定，按下式计算回收率，结果如表18

表18 肉桂酸加样回收率数据表

结论加样回收率范围在95.05％～98.86％之间，平均回收率为96.91％，其RSD值为1.46％，符合试验要求，故收入正文。

6 重现性试验

6.1 供试品溶液制备 取本品5份，每份约0.1g，精密称定，分别置10ml量瓶中，如2.1.2项下供试品溶液制备方法制备，作为供试品溶液。

6.2 测定法 分别精密吸取上述供试品溶液10μl，在2.1.1的色谱条件下测定，每份样品进样3次，由肉桂酸峰面积的平均值计算5份样品中肉桂酸的含量。结果见表19

表19 肉桂酸重现性试验数据表

结论5份样品中肉桂酸含量(μg/丸)平均值的RSD值为1.48％，符合试验要求，故收入正文。

7 样品含量限度试验

7.1 供试品溶液的制备 取本品10批，每批约0.1g，精密称定，分别置10ml量瓶中，如2.1.2项下供试品溶液制备方法制备，作为供试品溶液，即得。

7.2 测定法 分别精密吸取上述供试品溶液10μl，在2.1.1的色谱条件下测定，每份样品进样3次，由肉桂酸峰面积的平均值计算10批样品中肉桂酸的含量。结果见表20

表20 肉桂酸含量限度数据表

结论：由以上10批样品的测定结果可知，桂枝茯苓丸中桂枝的含量以肉桂酸计含量范围为41.7μg/丸～70.0μg/丸，故暂定其含量不得低于40.0μg/丸。

实验例12 药物对大鼠佐剂性关节炎的影响

1 实验材料

1.1 受试药物  本发明药物组I根据实施例4，本发明药物组II根据实施例6，相当于1.0g生药/g，根据给药剂量和给药体积的要求，用蒸馏水配制成需要的浓度。阿斯匹林片，规格0.3g/片，以0.5％CMC-Na配成0.005g/ml混悬液备用。地塞米松注射液；规格：1ml∶5mg，以蒸馏水配成0.0125％溶液备用。氧氟沙星片。甲哨唑注射液。己烯雌酚液(1mg/ml)；催产素注射液(10U/ml)；苯甲酸雌二醇注射液(20mg/ml)；黄体酮注射液(20mg/ml)；大黄蛰虫丸(3g/袋)。

1.2 实验动物  Wistar大鼠，雌雄各半；昆明种小鼠，雌雄各半；家兔，雌性；豚鼠，雌性。

1.3 菌种：大肠杆菌〔CMCC(B)44102〕绿脓杆菌〔CMCC(B)10104〕藤黄微球菌〔CMCC(B)28001〕金葡菌〔CMCC(B)26003〕链球菌及厌氧菌产黑色素杆菌。

1.4 仪器 TYXN-91型智能血液凝集仪；MVIS-2000型全自动血液流变分析系统。WX2微循环观察仪；生物机能实验系统BL410；红外多切变粘度测定仪HDNA型；紫外分光光度计753BI。

2 数据处理  以下试验均用t检验比较各给药组与对照组差异显著性。

3 实验方法与结果

3.1 改善血液流变学指标

3.1.1 对大鼠试验性血栓形成的影响

体重200-250g大鼠雄性40只，随机分为4组，每组10只。各组动物ig给药，连续5d。伪结扎组和模型对照组ig等量生理盐水。实验前动物禁食16h。末次药后1h。ip40mg/kg戊巴妥钠麻醉大鼠，剥离颈外静脉和颈总动脉。以三段聚氯乙烯塑料管合成一插管，中间管内径为2mm，长10cm.塑料管事先经硅化处理。先在管中注满浓度为50μg/ml的肝素生理盐水溶液。待管一端插入颈外颈脉后，再经塑料管注入肝素50μg/kg。之后，再将管另一端插入颈总动脉，放开动脉夹，形成右总动脉和左外静脉循环。开放流血15min后，动脉夹夹断血流，迅速取出丝线称重。总重量减去丝线干重即为血栓湿重。结果见表25：

表25 对大鼠试验性血栓形成的影响(x±s，n＝10)

注：^*P<0.05；^**P<0.01；△^*P<0.05；

结果表明：本发明药物组I、II和阳性对照组与空白对照组比较均有显著差异；本发明药物组II优于本发明药物组I。

3.1.2 对大鼠血小板聚集的影响

取体重250g±25g大鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各5只。各组动物ig给药，空白对照组ig等量生理盐水，连续给药7d。给药第6日，除空白对照组外，其余各组sc盐酸肾上腺素10μg/kg，共给药2次，间隔4h。两次注射盐酸肾上腺素之间，前后各间隔2h，将大鼠侵入水温为6℃的冰水中5min，造成血瘀模型。处置后停食。第7日末次给药后1h，腹主动脉采血，放入硅化试管中，3.8％枸橼酸钠抗凝，离心取血浆，以TYXN-91型智能血液凝集仪测定血小板聚集率。测定时加入ADP2mmol/L，描记1、5min，最大聚集率和解聚率。结果见表26。

表26 对ADP诱导的大鼠血小板聚集率的影响(x±s，n＝10)

注：^*P<0.05；^**P<0.01；ΔP<0.05；

结果表明：本发明药物组I、II和阳性对照组与空白对照组比较均有显著差异；本发明药物组II优于本发明药物组I。

3.1.3 对大鼠血液流变性的影响

取体重250g±25g大鼠60只，给药，分组及造模方法同血小板聚集试验，末次给药后1h，腹主动脉采血，肝素1％抗凝，以MVIS-2000全自动血液流变分析系统检测大鼠血液流变性。结果见表27。

表27 对血瘀模型大鼠血液流变性的影响(x±s，n＝10)

注：^*P<0.05；^**P<0.01；

结果表明：本发明药物组I、II和阳性对照组与空白对照组比较均有显著差异；本发明药物组II优于本发明药物组I。

3.1.4 对小鼠凝血时间的影响

体重18-22g小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。各组动物ig给药，连续5d。空白对照组ig等量生理盐水。采血前动物禁食16h。末次给药后1h，小鼠眼眶采血，玻片法测定凝血时间。结果见表28。

表28 对小鼠凝血时间的影响(x±s，n＝10)

注：与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.05；

结果表明：本发明药物组I、II和阳性对照组与空白对照组比较均有显著差异；本发明药物组II优于本发明药物组I。

3.2 抑菌、杀菌作用

3.2.1 对小鼠耳廓肿胀的抑制作用：取体重20～25g小鼠40只，雌雄各半，随机分成阳性对照组，空白对照组，本发明药物组I和本发明药物组II，每组10只，分别ig给予阿斯匹林0.2g/kg小鼠，40ml蒸馏水/kg小鼠，相当于1.0g生药/kg小鼠，给药1次，30min后用二甲苯0.04ml/只，涂抹左耳正反面，于30min后再ig给药1次，于给药后4h脱椎处死，用直径8mm打孔器打下左右耳片，左右耳片的重差为肿胀度，计算抑制率，并进行t检验，结果见表29。

表29 对小鼠耳廓肿胀的抑制作用(n＝10，X±S)

结果表明，本发明药物组能显著地抑制小鼠耳廓的肿胀，本发明药物组II的效果与阿斯匹林组近似，并且其抑制作用呈量效关系。

3.2.2 对大鼠肉芽肿模型的抗炎作用：取体重160～200g大鼠40只，随机分成空白对照组，阳性对照组，本发明药物组I、本发明药物组II，每组10只，于实验第1天将背部去毛，于乙醚浅麻醉下，灭菌操作，在大鼠背中去毛区皮下注射2％灭菌琼脂溶液2ml/只致炎，从致炎当日起，按不同组灌胃给予相应受试物，空白对照组给予蒸馏水，本发明药物组I、II给予相当于生药1.0g/kg大鼠，阳性对照组给予0.0125％地塞米松磷酸钠溶液，日剂量2.5mg/kg大鼠，每天给予1次，连续给药14天；给药容量为2ml/100g大鼠，第15天处死大鼠，剥离肉芽肿琼脂块，称湿重与溶剂对照组比较，计算抑制率，作t检验，结果见表30。

表30 对大鼠琼脂肉芽肿的抗炎作用(n＝10，X±S)

结果表明：本发明药物组I、II能明显地抑制大鼠琼脂肉芽组织增生，其抗炎作用呈量效关系。

3.2.3 常见致病菌敏感实验：取13×100mm灭菌具棉塞试管7支，编号排列于试管架上，于每管中先加入无菌葡萄糖酚红肉汤培养基2.0ml，然后于第1管中加入本发明药物组II约相当于100mg生药/ml受试液2.0ml，混匀后取出2.0ml放入第2试管中依次类推，直到第5管取出2.0ml弃去便成1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1：32第各浓度，第6管不加药物作对照，以便观察培养基是否适合细菌生长，第7管中加受试液2.0ml，混匀后取出2.0ml，弃去，不加细菌，以观察受试物是否有污染，每种细菌，以氧氟沙星(配制25ug/ml试液，灭菌供用)作为阳性对照，培养24小时，结果见表31。

表31 对下列细菌的最低抑菌浓度(MIC)

3.2.4 厌氧菌：产黑色杆菌与上述操作一样，菌种及试管在DY-2型厌菌培养箱中培养48小时，阳性对照药甲硝唑(配成25ug/ml试液，灭菌供用)，结果见表32。

表32 对产黑色素杆菌的最低仰菌浓度(MIC)

结果表明：本发明药物组II对大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、藤黄微球菌、金葡菌及厌氧菌产黑色素杆菌有抑菌作用，一般最低抑菌浓度(MIC)6.25～3.12mg/ml。(相当于原生药)

3.3 本发明药物组对子宫平滑肌调节作用的实验研究

本发明药物组溶液：取研细后过80目筛的本发明药物组细粉，加蒸馏水制成50、100、200mg/ml(用于离体试验)和10、20、40、60、80、100、120、140g/100ml(用于在体试验)及注射剂备用。阳性对照组(大黄蛰虫丸)溶液：取本品，剥去外壳，研细，过80目筛，加蒸馏水制成100mg/ml的溶液备用。催产素溶液：取催产素注射液，加生理盐水制成1U/ml的溶液备用。

3.3.1 子宫肌瘤模型的复制

参照Fujii法，取体重(235.8±23.6)g的健康、成熟、雌性、未孕豚鼠20只，每周一、三、五肌肉注射苯甲酸雌二醇600μg/只，连续3个月，第4个月开始除每周3次肌内注射苯甲酸雌二醇外，每周二次肌内注射黄体酮1mg/只，连续1个月。造模周期满4个月时处死豚鼠，剖腹观察子宫的形态变化，并与10只正常豚鼠子宫对比其子宫形态变化情况，结果：肌瘤子宫肥大，内壁明显增厚，暗红色，有的瓜子样大瘤，有的粘连大肠或膀胱部分子宫畸形，细长，具四角，除子宫二角显肥大外，子宫颈及阴道都有肿瘤。平均重量为2.83g(子宫粘连瘤除外)。镜下所见：子宫肌层中肌纤维是明显增生肥大，部分区域肌纤维排列紊乱，出现穿插现象，内膜腺体呈单层或复层柱状，有较明显嗜酸性细胞浸润，似子宫肌瘤形态改变。正常子宫，子宫正常，鲜红色，丫字形，细小。

结果表明，模型动物有明显的子宫肌瘤形成，其子宫与正常动物的子宫差异显著，大鼠的造模情况与此基本类同。

3.3.2 对模型动物在体子宫平滑肌活动的影响

选用子宫肌瘤模型豚鼠60只，随机分为生理盐水对照组，本发明药物组I、II，阳性对照组，催产素，催产素加中剂量本发明药物组等6个组，用戊巴比妥钠20mg/kg静脉注射麻醉。仰位固定于手术台上，下腹部剪毛，正中切口，打开腹腔，找出子宫，见子宫明显肥大，内壁明显增厚，呈暗红色，有瓜子样大的瘤，呈明显子宫肌瘤状，模型成立；参照方法，在丫字形子宫的其中一侧选取长约1.5cm的一段，中点缝一线与肌力换能器相连，阴道端和卵巢端分别缝合固定在特制的玻璃筒底两侧支点上。将腹壁围绕玻璃筒四周缝合固定，玻璃筒内放置(38±0.5)℃的低钙乐氏液(1/4正常钙量)，将子宫浸泡于此乐氏液中，玻璃筒下端紧贴腹壁，以免筒内乐氏液漏出，外接超级恒温水浴，并用手术灯照射保温，子宫静止负荷1g，稳定30分钟，待所描记的子宫活动恒定时，描记一段正常收缩曲线后开始实验。采用局部给药法，即先将玻璃筒内的液体吸出，再分别加入用低钙乐氏液配制的1.0mg/ml本发明药物组I、II、1.0mg/ml阳性对照组溶液及10mU/ml催产素溶液，观察记录30分钟。每次给药后换液冲洗3次，再进行下次给药。观察给药前后子宫平滑肌的收缩幅度、频率及活动力(幅度×频率)的变化情况，并作自身给药前后及组间比较，结果见表33。

表33 本发明药物组对子宫肌瘤模型豚鼠在体平滑肌和催产素致敏后收缩的影响(x+s，n＝10)

注：自身给药前后比较，^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001；与生理盐水对照组或空白组比较，ΔP<0.05；ΔΔP<0.01；ΔΔΔP<0.001

从表33的结果可知，豚鼠在体子宫肌瘤平滑肌在较恒定的条件下，收缩幅度和收缩频率相对稳定，收缩幅度、收缩频率及活动力与正常子宫平滑肌比较明显减弱。本发明药物组I、II对豚鼠在体子宫肌瘤平滑肌的收缩幅度、收缩频率、活动力均有明显抑制作用，与生理盐水组比较，有极显著差异(P<0.01)；本发明药物组II与阳性对照组比较，前者对子宫肌瘤平滑肌活动的抑制作用明显较强。本发明药物组II能明显对抗催产素引起的豚鼠在体子宫肌瘤平滑肌的强烈痉挛，子宫活动明显减缓。

3.3.3 对模型动物离体子宫平滑肌活动的影响

选用子宫肌瘤模型动物豚鼠60只，随机分为生理盐水对照组，本发明药物组I、II，阳性对照组对照，催产素，催产素加本发明药物组II等6个组，实验前24小时按0.2mg/100g皮下注射己烯雌酚，实验开始时将动物击毙，迅速剪开腹腔，剪取2cm长之子宫，立即置于盛有乐氏液的玻璃平皿内，结扎两端，一端固定于生物机能实验系统BL410的L形通气管小钩上，另一端与肌力换能器相连，乐氏营养液为20ml，实验开始后先记录一段正常收缩曲线。然后加入不同药物溶液0.2ml，观察记录给药前5分钟及给药后15分钟的子宫平滑肌收缩变化情况，观察指标分别为收缩幅度、频率和收缩力(频率×幅度)，并作自身给药前后和组间比较，结果见表34。

表34 本发明药物组对子宫肌瘤模型平滑肌离体豚鼠和催产素致敏后收缩的影响(x+s，n＝10)

由表34可见，生理盐水对照组给药前后子宫肌瘤平滑肌收缩幅度和频率均无明显变化；本发明药物组I、II对子宫肌瘤平滑肌的收缩幅度、收缩频率、活动力均有不同程度的抑制作用，呈量效关系，与生理盐水组比较均有显著性差异，给药前后自身比较亦有显著性差异；本发明药物组II对子宫肌瘤平滑肌的抑制效果较阳性对照组强。稳定收缩的子宫肌瘤平滑肌加入催产素(10mU/ml)后，收缩频率明显增强，子宫活动力明显增加，约10分钟达到高峰，随后稳定在这水平，40分钟后逐步消退。实验时选择在催产素作用15分钟后加入本发明药物组II，再记录30分钟收缩曲线，结果见表10，可见收缩频率明显减弱，与催产素组比较，子宫活动亦明显下降。

3.4 增强细胞免疫功能的实验

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验取体重18～21g健康小鼠30只，随机分成上述三组，用药量同前，每日一次连续八天，于给药第五天每只鼠腹腔注射0.5％糖原生理盐水溶液0.5ml以活化腹腔巨噬细胞。三天后将20％的鸡红细胞悬液2.5ml注入小鼠腹腔，注射后半小时用颈椎脱臼法分别处死小鼠，立即剪开腹部皮肤自腹部中央腹膜处剪一小口，用长颈吸管吸取腹腔液约2ml置于倾斜二块并拢的盖玻片的青霉素瓶内，加Hank’s液将玻片淹没，摇匀于37℃恒温箱中温育30min，取出盖玻片用生理盐水冲洗，甲醇固定，姬姆萨染色，凉干后用油镜观察100个巨噬细胞。记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞数，求出吞噬百分率和吞噬指数，结果见表37。

表37 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验结果(X±S)

与对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与阳性对照组比较ΔP<0.05

结果表明：本发明药物组I能明显增加吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞数，本发明药物组I与阳性对照组比较，前者作用优于后者。

3.5 镇痛与镇静试验

3.5.1 对小鼠醋酸致痛扭体次数的影响

取健康小鼠，雌雄各半，随机分为5组，即生理盐水组(25ml/kg)、度冷丁组(50mg/kg)、本发明药物I、II(1.0g/kg)。阳性对照组测定前30min皮下注射，其余各组均连续给药3d，最后一次给药30min后腹腔注射0.6％醋酸溶液(0.2ml/只)，观察每只小鼠5min内因疼痛引起的扭体次数，结果见表38。

表38 小鼠扭体次数试验参数

结果表明，度冷丁组、本发明药物组I、II5min内扭体次数与生理盐水组比较，均有极显著性差异(P<0.01)；本发明药物组II作用优于本发明药物组I。

3.5.2 对小鼠热板痛阈值的影响

取雌性小鼠，挑选合格小鼠60只，随机分为5组，分组及给药剂量同3.5.1，给药组连续灌胃给药3d，度冷丁皮下注射，并分别于药后15min、30min、45min、60min测定其痛阈值。结果见表39。

表39 本发明药物组对小鼠痛阈值的影响(x±s)

注：与生理盐水组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

结果表明，本发明药物组II在给药后30min内痛阈增加，有镇痛作用。

下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果

实施例1

桂枝50g、牡丹皮150g、赤芍50g、白术80g、甘草80g

以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，再加入常规辅料，经常规方法，制成临床接受的制剂，如胶囊剂、丸剂、片剂、注射液、合剂。

实施例2

桂枝60g、茯苓60g、牡丹皮60g、赤芍60g、桃仁60g

本发明中药组合物制备方法优选为：以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，药粉与微晶纤维素以2：1混匀，以3％PVP的90％乙醇溶液为粘合剂制备丸剂。再加入常规辅料，经常规方法，制成临床接受的口服固体制剂，如胶囊剂、丸剂、片剂、注射液、合剂。

实施例3

桂枝50g、茯苓120g、牡丹皮50g、赤芍120g、桃仁50g

以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤；合并两次煎液，浓缩、干燥，药粉与微晶纤维素以2：1混匀，以3％PVP的90％乙醇溶液为粘合剂制备丸剂。

实施例4

桂枝100g、茯苓60g、牡丹皮100g、赤芍60g、桃仁60g

以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，粉碎，加入微晶纤维素240g，混匀，制粒，得颗粒剂360g。

实施例5

桂枝120g、茯苓50g、牡丹皮120g、赤芍50g、桃仁120g

桂枝60g、茯苓60g、牡丹皮60g、赤芍60g、桃仁60g五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，再与细粉量2％的2％羧甲基淀粉钠混匀，制成颗粒，干燥，整粒，压片，包衣，即得。

实施例6

桂枝60g、茯苓60g、牡丹皮60g、赤芍60g、桃仁60g

以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流。第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，粉碎，以豆油：吐温-80：乙基纤维素2：0.1：1.5为基质，搅匀，制成软胶囊。

实施例7 本发明制剂的质量控制方法

取实施例4内容物进行鉴别：

【鉴别】

(1)取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加乙醚50ml，超声处理2次，每次15分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

实施例8 本发明制剂的质量控制方法

取实施例6内容物进行含量测定：

【含量测定】(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定。

色谱条件与系统适用性试验HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20：1，进样量2μL。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于20000

内标溶液的制备 取正十五烷适量，精密稳定，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，作为内标溶液。

对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1mL含0.4mg的溶液，精密量取该溶液及内标溶液各2mL，置5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备 取样品内容物适量，精密称定，研细，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约400mL，用三氯甲烷振摇提取4次(60mL，40mL，40mL，30mL)，合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠使脱水，滤过，取滤液，用三氯甲烷液10mL分次洗涤无水硫酸钠及容器，滤过，合并三氯甲烷液，在70℃水浴上回收三氯甲烷至适量，转移至5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取2mL，置5mL量瓶中，加内标溶液2.0mL，用三氯甲烷至刻度，摇匀，做为样品溶液。

方法 用HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20∶1，进样量2μL。

本发明药物组相当于原料药每0.3g含牡丹皮以丹皮酚(C9H10O3)计，不得少于2.0mg。

(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—0.1％磷酸溶液(40：60)为流动相；检测波长为285mn。理论板数按肉桂酸峰计算不低于2000。

对照品溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品1.68mg，置100ml棕色量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置5ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含肉桂酸7μg)。

供试品溶液的制备 取本发明药物组，研细，取相当于原药材0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇10ml适量，超声提取30分钟，取出，放至室温，补足减失溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明药物组相当于原料药每0.03g含桂枝以肉桂酸(C9H8O2)计，不得少于40.0μg。

实施例9 本发明制剂的质量控制方法

取实施例6内容物进行鉴别和含量测定：

【鉴别】

(1)取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加乙醚50ml，超声处理2次，每次15分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

【含量测定】(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定。

色谱条件与系统适用性试验 HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20：1，进样量2μL。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于20000

内标溶液的制备 取正十五烷适量，精密稳定，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，作为内标溶液。

对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1mL含0.4mg的溶液，精密量取该溶液及内标溶液各2mL，置5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备 取样品内容物适量，精密称定，研细，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约400mL，用三氯甲烷振摇提取4次(60mL，40mL，40mL，30mL)，合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠使脱水，滤过，取滤液，用三氯甲烷液10mL分次洗涤无水硫酸钠及容器，滤过，合并三氯甲烷液，在70℃水浴上回收三氯甲烷至适量，转移至5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取2mL，置5mL量瓶中，加内标溶液2.0mL，用三氯甲烷至刻度，摇匀，做为样品溶液。

方法 用HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20∶1，进样量2μL。

本发明药物组相当于原料药每0.3g含牡丹皮以丹皮酚(C9H10O3)计，不得少于2.0mg。

(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—0.1％磷酸溶液(40：60)为流动相；检测波长为285mn。理论板数按肉桂酸峰计算不低于2000。

对照品溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品1.68mg，置100ml棕色量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置5ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含肉桂酸7μg)。

供试品溶液的制备 取本发明药物组，研细，取相当于原药材0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇10ml适量，超声提取30分钟，取出，放至室温，补足减失溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明药物组相当于原料药每0.03g含桂枝以肉桂酸(C9H8O2)计，不得少于40.0μg。

实施例10

【处方】桂枝60g、茯苓60g、牡丹皮60g、赤芍60g、桃仁60g

【制法】以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，制粒，压制成1000粒，包衣，即得。

【鉴别】

(1)取本品除去包衣，研细，称取6g，加乙醚50ml，超声处理2次，每次15分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

【含量测定】

(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定。

色谱条件与系统适用性试验 HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20∶1，进样量2μL。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于20000

内标溶液的制备 取正十五烷适量，精密稳定，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，作为内标溶液。

对照品溶液的制备 丹皮酚对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1mL含0.4mg的溶液，精密量取该溶液及内标溶液各2mL，置5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备 取样品内容物适量，精密称定，研细，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约400mL，用三氯甲烷振摇提取4次(60mL，40mL，40mL，30mL)，合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠使脱水，滤过，取滤液，用三氯甲烷液10mL分次洗涤无水硫酸钠及容器，滤过，合并三氯甲烷液，在70℃水浴上回收三氯甲烷至适量，转移至5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取2mL，置5mL量瓶中，加内标溶液2.0mL，用三氯甲烷至刻度，摇匀，做为样品溶液。

方法 用HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20∶1，进样量2μL。

本发明药物组相当于原料药每0.3g含牡丹皮以丹皮酚(C9H10O3)计，不得少于2.0mg。

(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—0.1％磷酸溶液(40：60)为流动相；检测波长为285mn。理论板数按肉桂酸峰计算不低于2000。

对照品溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品1.68mg，置100ml棕色量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置5ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含肉桂酸7μg)。

供试品溶液的制备 取本发明药物组，研细，取相当于原药材0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇10ml适量，超声提取30分钟，取出，放至室温，补足减失溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明药物组相当于原料药每0.03g含桂枝以肉桂酸(C9H8O2)计，不得少于40.0μg。

Claims (10)

1、一种治疗妇科癥块或血瘀经闭的中药组合物，其特征在于该中药组合物的原料药组成为：桂枝50-150重量份、牡丹皮50-150重量份、赤芍50-150重量份、白术50-150重量份、甘草50-150重量份。

2、如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物还可以由下列原料药组成：桂枝50-120重量份、牡丹皮50-120重量份、赤芍50-120重量份、茯苓50-120重量份、桃仁50-120重量份。

3、如权利要求2所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物的原料药组成为：桂枝60重量份、茯苓60重量份、牡丹皮60重量份、赤芍60重量份、桃仁60重量份。

4、如权利要求2所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物的原料药组成为：桂枝100重量份、牡丹皮100重量份、赤芍60重量份、茯苓60重量份、桃仁60重量份。

5、如权利要求2-4任一项所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为：以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，再加入常规辅料，经常规方法，制成临床接受的制剂。

6、如权利要求5所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为：以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，再加入常规辅料，经常规方法，制成临床接受的口服固体制剂。

7、如权利要求2-4任一项所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为：以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以80-100％乙醇为溶剂，80-95℃水浴回流。第1煎加入6-10倍量溶剂，回流提取1-3h，过滤；滤渣加入4-8倍量溶剂，继续回流提取1-3h，过滤。合并两次煎液，浓缩干燥，经常规方法，制成临床接受的制剂。

8、如权利要求7所述的中药组合物的丸剂制备方法，其特征在于该方法为：以上五味，粉碎成24～65目的粗粉，以95％乙醇为溶剂，90℃水浴回流；第1煎加入8倍量溶剂，回流提取2h，过滤；滤渣加入6倍量溶剂，继续回流提取2h，过滤；合并两次煎液，浓缩、干燥，药粉与微晶纤维素以2：1混匀，以3％PVP的90％乙醇溶液为粘合剂制备丸剂。

9、如权利要求2-4所述的中药组合物的质量控制方法，其特征在于该质量控制方法包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：

【鉴别】

(1)取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加乙醚40-60ml，超声处理1-3次，每次12-18分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(15-19：1-5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(7-9：1-3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇15-25ml，超声处理10-20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10-20ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取1-3次，每次15-25ml，合并正丁醇液，用水洗涤1-3次，每次5-15ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇(8-12：1-3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点；

【含量测定】

(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定；

色谱条件与系统适用性试验HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：110-120℃，载气流速：每分钟1.0-3.0mL；分流进样，分流比为30-50：1-3，进样量2μL；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于20000；

内标溶液的制备取正十五烷适量，精密稳定，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，作为内标溶液；

对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1mL含0.4mg的溶液，精密量取该溶液及内标溶液各2mL，置5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备取本发明药物适量，精密称定，研细，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约400mL，用三氯甲烷振摇提取3-5次(每次30-60mL)，合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠使脱水，滤过，取滤液，用三氯甲烷液10mL分次洗涤无水硫酸钠及容器，滤过，合并三氯甲烷液，在60-80℃水浴上回收三氯甲烷至适量，转移至5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取2mL，置5mL量瓶中，加内标溶液2.0mL，用三氯甲烷至刻度，摇匀，做为样品溶液；

方法用HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：110-120℃，载气流速：每分钟1.0-3.0mL；分流进样，分流比为30-50：1-3，进样量2μL；

本发明药物组相当于原料药每0.3g含牡丹皮以丹皮酚(C9H10O3)计，不得少于2.0mg；

(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—0.1％磷酸溶液(30-50：50-80)为流动相；检测波长为285mn；理论板数按肉桂酸峰计算不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取肉桂酸对照品1.68mg，置100ml棕色量瓶中，用45-55％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置5ml量瓶中，加45-55％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

供试品溶液的制备取本发明药物，研细，取相当于原药材0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加40-60％甲醇10ml适量，超声提取20-40分钟，取出，放至室温，补足减失溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本发明药物组相当于原料药每0.03g含桂枝以肉桂酸(C9H8O2)计，不得少于40.0μg。

10、如权利要求9所述的中药组合物的质量控制方法，其特征在于该质量控制方法包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：

【鉴别】

(1)取本发明药物制剂，研细，称取相当于原药材6g，加乙醚50ml，超声处理2次，每次15分钟，滤过，药渣备用，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取[鉴别](1)项下的供试品溶液及上述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇试液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取[鉴别](1)项下的药渣，加乙醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，弃去水洗液，将正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点；

【含量测定】(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定；

色谱条件与系统适用性试验HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20∶1，进样量2μL；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于20000；

内标溶液的制备取正十五烷适量，精密稳定，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，作为内标溶液；

对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1mL含0.4mg的溶液，精密量取该溶液及内标溶液各2mL，置5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备取样品内容物适量，精密称定，研细，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约400mL，用三氯甲烷振摇提取4次(60mL，40mL，40mL，30mL)，合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠使脱水，滤过，取滤液，用三氯甲烷液10mL分次洗涤无水硫酸钠及容器，滤过，合并三氯甲烷液，在70℃水浴上回收三氯甲烷至适量，转移至5mL量瓶中，用三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取2mL，置5mL量瓶中，加内标溶液2.0mL，用三氯甲烷至刻度，摇匀，做为样品溶液；

方法用HP-1甲基硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：120℃，载气流速：每分钟2.0mL；分流进样，分流比为20∶1，进样量2μL；

本发明药物组相当于原料药每0.3g含牡丹皮以丹皮酚(C9H10O3)计，不得少于2.0mg；

(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—0.1％磷酸溶液(40：60)为流动相；检测波长为285mn；理论板数按肉桂酸峰计算不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取肉桂酸对照品1.68mg，置100ml棕色量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置5ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

供试品溶液的制备取本发明药物组，研细，取相当于原药材0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇10ml适量，超声提取30分钟，取出，放至室温，补足减失溶剂至刻线，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本发明药物组相当于原料药每0.03g含桂枝以肉桂酸(C9H8O2)计，不得少于40.0μg。