CN101444628A - 一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物及其药盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗勃起功能障碍症的基因药物，所述的药物是大钾通道基因－腺相关病毒载体重组体的水剂、油剂、滴入剂和注射剂，经由rAAV的大规模生产化培养，采用三质粒共转染方法，分离、纯化制成。本发明还提供包括上述药物的药盒。本发明的药物在使用上简单方便，可有效改善或治疗ED，且药效持久，安全无毒副作用，有巨大的社会和经济效益。

Description

一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物及其药盒

技术领域

本发明属于基因治疗领域，具体地说，是涉及一种治疗勃起功能障碍症(Erectile Dysfunction，简称ED)的基因治疗药物及其药盒，更具体地说，是涉及一种大钾通道(maxi-K)基因-腺相关病毒(AAV)载体重组体的基因治疗药物及其药盒。

背景技术

北京人民医院在2004年进行的一项为期6个月的对1000多名成年男性的调查表明，40岁以上的中国男性52.5％患有程度不等的阳痿。美国的一项调查研究也表明，40-50岁的男性中，40％的人曾发生过ED；而60-70岁的男性则为70％。最近统计美国约有超过三千万ED患者，全球约有一亿以上患者。随着生活节奏的加快和社会老龄化，ED患者将逐年增多。过去将男性性功能障碍症称之为“阳痿”，近年来，医学界改称其为“勃起功能障碍”，英文为Erectile Dysfunction，简称ED。治疗勃起功能障碍的方法很多，目前，临床上以物理、心理和药物治疗为主。药物治疗中以口服药物较受欢迎，典型的例子是柠檬酸昔多酚(Sildenatil Citrate，商品名为Viagra，国人称伟哥)，美国辉瑞公司在1992年开发治疗心绞痛药物时，在临床试验中，其治疗心绞痛效果不理想，而病人发现，对性功能提高有帮助，经病理生理学和药理分析，它是一种阴茎动脉扩张剂，有助阴茎在应激情况下勃起。经重新申报新用途后，美国FDA于1997年3月批准上市，至今，该药是世界上公认的较成功的ED治疗药物。目前，全球有多家公司在开发ED的治疗药物，可以预测，今后几年内类似伟哥的产品将会相继上市。

尽管伟哥的起效快，有效率较高，颇受消费者欢迎，但它同样存在其它合成药的弱点。在上市以来几年中相继有500多人服后死亡或出车祸的报道，故医学界认为伟哥有毒副作用，特别对血压异常和心脏病人不能随便使用；而且伟哥价格不菲，在国内很多人消费不起，即使在国外也会让很多人负担不起。英国等国家对伟哥的销售采取严格的管制措施，对消费者来说，这无疑是一种消极负面的影响。寻找和开发一种功能类似伟哥而无副作用且不要每次服药的长效药物倍受瞩目，而基因治疗药物是研发热门。

基因药物是指利用有治疗效果的目的基因，用高通量功能筛选和体内外药效研究开发得到，经生物信息学分析、动物实验研究其表达的蛋白有治疗作用。基因药物治疗可以说是现代医疗技术上的一次革命，相对于传统的化学合成药物的治疗，基因药物有着特有的优势：(1)高疗效和长疗效，好的载体能使治疗基因在细胞内长期稳定表达治疗蛋白，从而达到一劳永逸的效果：而传统药物代谢快，需经常服用。(2)副作用少，与传统药物的全身性作用相反，基因治疗药物的靶向性极强，可特异性地作用于某类组织及细胞上；(3)针对性强，基因治疗可以解决那些对传统药物效果不好的疾病，如各类肿瘤、遗传性疾病以免疫相关的疫病等。

基因疗法是指将正常基因植入靶细胞代替病人细胞中的遗传缺陷基因，或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和医疗疾病目的的一种临床医疗技术。基因治疗中最重要的一个环节是选择适当的基因载体(Vector)。基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。病毒载体具有天然的感染能力，转染效率高，常用的有单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒、腺病毒(Adeno virus，Ad)和腺相关病毒(Adeno-Associated virus，AAV)等载体。

2004年10月19日，国际性阳痿研究协会召开的一次会议宣布了一个消息，三名志愿者参与的一项基因治疗ED的试验证明，基因疗法治疗ED不仅有效，而且不会产生与治疗相关的副作用。这项研究是由美国纽约爱因斯坦医学院的阿尔伯特.梅尔曼博士等支持进行的，他们对病人采用一种称为大钾(maxi-K)基因阴茎注射液，试验其疗效，也评价其安全性。

进行这项试验的机理是，人的阴茎细胞结构里有一种大钾离子通道，这种通道参与了缓解阴茎平滑肌收缩的过程，而正是由于阴茎平滑肌的舒缓才使得血液能充盈阴茎，使阴茎能正常勃起。研究人员在人体试验前，对小鼠进行了试验，结果表明能有效增加性功能和减少小鼠的ED。参与这项试验的三名志愿者有中度到重度不同的ED，他们接受了低剂量由腺病毒作载体的大钾基因注射液，在以后的1-5月没有人出现任何副作用。这种基因药物疗法最大的好处是比较长效，一次注射可以让男性性功能改善6个月。基于这次研究结果的鼓舞，梅尔曼博士在2004年再招募6人以上的志愿者进行试验。现已申报临床三试验。

尽管梅尔曼博士的研究计划很完美，仍有几个棘手问题需要解答：1.由腺病毒(Ad)作载体，Ad有潜在的安全性问题和副作用，不能轻易回避；2.腺病毒的缺点是，表达外源基因时间短，免疫原性强，可引发机体产生强烈的毒性反应和免疫反应，毒性大，免疫反应重，有抗药性，不能多次注射；3.注射剂直接在阴茎上注射，使用者会产生害怕心理。

腺相关病毒(AAV)是微小病毒科成员，基因组为4682个核苷酸组成的单链DNA，用于基因治疗的载体，它有一定的优势：AAV本身不引起任何人类疾病。腺相关病毒病毒本身只有两个基因，即复制基因Rep和编码基Cap，后者易于清除或降低细胞的毒性及T淋巴细胞反应的危险性。AAV感染人体后，可在19号染色体上进行位点特异性整合，如果没有辅助病毒如腺病毒、疱疹病毒或水痘病毒等共感染，野生型就潜伏在19号染色体上的特定部位(无功能区)，直到辅助病毒出现才复制；腺相关病毒的DNA能够稳定有效整合到人细胞基因组，而且有宽广的宿主范围，能潜伏感染非分裂细胞，研究表明AAV能有效转导脑、骨骼肌、肝脏、肺、皮肤、视网膜、血管内皮、胃肠道粘膜，在猴子的实验中表达可持续6年以上。因此，AAV被认为是一种用于人类基因治疗的很有前途的安全载体。

因此，本发明采用腺相关病毒(AAV)做载体，提供一种更安全有效，能长期使用，无抗药性，且不用注射，直接涂抹在阴茎龟头表皮或尿道口滴入就能导入治疗基因的更为理想和符合需要的药物。当然，本发明也包括注射剂。此外，本发明还提供包括上述药物的药盒。

发明内容

为实现本法的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物，其中，所述的药物为大钾通道(maxi-K)基因-腺相关病毒(AAV)载体重组体的水剂、油剂、注射剂或滴入剂。本发明的大钾通道基因具有SEQ ID NO：1所示的序列。

根据本发明所述的基因治疗药物，其中较好地是，所述的水剂、注射剂或滴入剂还包括作为保护液的5％的山梨醇或甘露醇。

根据本发明所述的基因治疗药物，其中较好地是，所述的油剂还包括动物油或植物油(如甘油或油脂等)。

根据本发明所述的基因治疗药物，其中较好地是，所述的腺相关病毒(AAV)载体是各种血清型的AAV载体。本发明采用的腺相关病毒载体(AAV)，根据转染或感染皮肤和尿道内膜的转染率不同，从AAV1-AAV8中筛选感染率高的血清型AAV，优选的是AAV2型。

本发明还提供一种药盒，其中，所述的药盒包括上面所述的药物和说明书。

根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为水剂，其组成还包括作为保护液的5％的山梨醇或甘露醇。

根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为滴入剂，其组成还包括作为保护液的5％的山梨醇或甘露醇。

根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为注射剂，其组成还包括作为保护液的5％的山梨醇。

根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为油剂，其组成还包括动物或植物油(如甘油、油脂等)。

根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的说明书记载内容如下：

(1)药物使用方法为涂抹在龟头表皮、滴入尿道口或阴茎注射；

(2)药物在4℃或-20℃储存。

(3)药物使用前先行排尿。

本发明大钾通道基因—rAAV重组体大规模生产工艺可采用下面的方法：

(1)细胞种子扩大

取50L发酵罐所要的HEK293细胞库的种子细胞，接种HEK293至专用发酵罐中，发酵罐培养基在接种前预热至37℃，用二氧化碳来平衡培养液的pH，发酵罐在发酵培养中能自动检测各项参数指标(如氧分压、二氧化碳分压、pH值、温度、葡萄糖浓度、氨浓度、呼吸比等)，细胞在发酵罐中培养至所需的培养密度约需3-4天的时间，每天检测细胞生长的密度，中间的培养液更换和补充以程控仪表显示参数为依据，培养液为无血清培养液。

(2)质粒转染(符合GMP标准的三质粒共转染技术)

重组Maxi-K基因的腺相关病毒(rAAV)载体包括ITRs携带目的基因功能区；AAV的Rep启动子和转录子系统Cap；腺相关病毒的辅助系统质粒是腺病毒的表面蛋白的基因，整个转染过程是包装质粒与HEK293共转染。当HEK293细胞培养到适当的密度，约占培养密度的80％左右，历时5天时间，将适量的rAAV质粒加入发酵罐中，进行转染培养。质粒行将转染时，发酵罐暂时停止转动，加入质粒后作轻微搅拌后，再停止一小时，再轻微搅拌几次，再停止一小时，在约5-6小时内，每小时作相同动作，使rAAV与HEK293细胞能很好地受到转染，直至大部分细胞受到转染。必须有充足的营养供应，绝对不能含有有害的物质，甚至极微量有害离子；保证有适量的氧气供应；及时清除细胞代谢产生的有害物质；有良好的适宜细胞生存的外界环境，包括渗透压、离子浓度、氨基酸浓度、氧分压、二氧化碳分压、葡萄糖浓度、pH值等(具体条件指明，或方法来源的文献)，保持合适的细胞密度。

(3)营养更新(介质更新)

细胞在培养过程中由于细胞自我的代谢需要，将吸取营养物质，排出代谢产物，在大容量的培养过程中，要及时补充各种营养物质和氧气等，也要及时清除代谢产物如二氧化碳、氨等，特别在质粒转染前，要先更新和补充培养液，使质粒转染过程中，细胞能大多受到转染，增加转染率，进一步提高产量。

(4)细胞收集

当HEK293与rAAV质粒转染时，达到收集的时候时，将细胞全部收集。可收集程度的指标，依照抽样经显微镜下观察已有大量细胞产生报告基因Lacz，或肉眼观察见大量细胞呈簇状，此时也可以收集细胞。将收集的细胞和培养液进行过滤或离心，富集细胞。

(5)细胞破壁和纯化

富集的细胞经匀浆机(或超声波)破壁，然后离心除去细胞碎片，作过柱的预处理，在快速纯化仪中快速过柱纯化，最后将病毒液转移至透析袋，在4℃下透析，后经安全性和生物活性检测，即得到所需的GMP条件下重组腺相关病毒载体的产品。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明采用腺相关病毒(AAV)做载体，更加安全而无毒副作用；

(2)本发明的水剂和滴入剂临床用药更加方便，而顺应性好的患者也可以选择注射剂，效果更快些，便于患者选用；

(3)本发明采用三质粒共转染的生产工艺，便于工业化、规模化生产；

(4)本发明的药物药效持久、且与现有药物相比比较经济廉价。

具体实施方式

下面参照实施例，更具体地说明本发明内容。应当理解，下面的实施例用于说明本发明的内容，而非限定本发明的内容，任何形式上的变动和/或变通，将落入本发明的保护范围。

实施例1

本发明基因治疗药物——水剂的生产工艺如下：

(1)细胞种子扩大

取50L发酵罐所要的HEK293细胞库的种子细胞，接种HEK293至专用发酵罐中，发酵罐培养基在接种前预热至37℃，用二氧化碳来平衡培养液的pH，发酵罐在发酵培养中能自动检测各项参数指标，如氧分压、二氧化碳分压、pH值、温度、葡萄糖浓度、氨浓度、呼吸比等。细胞在发酵罐中培养至所需的培养密度约需3-4天的时间，每天检测细胞生长的密度，中间的培养液更换和补充以程控仪表显示参数为依据，培养液为无血清培养液。

(2)质粒转染

重组Maxi-K基因的腺相关病毒(rAAV)载体包括ITRs携带目的基因功能区；AAV的Rep启动子和转录子系统Cap；腺相关病毒的辅助系统质粒是腺病毒的表面蛋白的基因，整个转染过程是包装质粒与HEK293共转染。当HEK293细胞培养到适当的密度，约占培养密度的80％左右，历时5天时间，将适量的rAAV质粒加入发酵罐中，进行转染培养。质粒行将转染时，发酵罐暂时停止转动，加入质粒后作轻微搅拌后，再停止一小时，再轻微搅拌几次，再停止一小时，在约5-6小时内，每小时作相同动作，使rAAV与HEK293细胞能很好地受到转染，直至大部分细胞受到转染。必须有充足的营养供应，绝对不能含有有害的物质，甚至极微量有害离子；保证有适量的氧气供应；及时清除细胞代谢产生的有害物质；有良好的适宜细胞生存的外界环境，包括渗透压、离子浓度、氨基酸浓度、氧分压、二氧化碳分压、葡萄糖浓度、pH值等，保持合适的细胞密度。

(3)营养更新(介质更新)

细胞在培养过程中由于细胞自我的代谢需要，将吸取营养物质，排出代谢产物，在大容量的培养过程中，要及时补充各种营养物质和氧气等，也要及时清除代谢产物如二氧化碳、氨等，特别在质粒转染前，要先更新和补充培养液，使质粒转染过程中，细胞能大多受到转染，增加转染率，进一步提高产量。

(4)细胞收集

当HEK293与rAAV质粒转染时，达到收集的时候时，将细胞全部收集。可收集程度的指标，依照抽样经显微镜下观察已有大量细胞产生报告基因Lacz，或肉眼观察见大量细胞呈簇状，此时也可以收集细胞。将收集的细胞和培养液进行过滤或离心，富集细胞。

(5)细胞破壁和纯化

富集的细胞经匀浆机(或超声波)破壁，然后离心除去细胞碎片，作过柱的预处理，在快速纯化仪中快速过柱纯化，最后将病毒液转移至透析袋，在4℃下透析，后经安全性和生物活性检测，即得到所需的GMP条件下重组腺相关病毒载体的产品。

(6)包装和储存

收集到重组大钾基因maxi-K产品后，在4℃包装，加入5％山梨醇或5％甘露醇作为保护液，包装为所需的水剂，在4℃或-20℃低温保存。

实施例2

本发明基因治疗药物——滴入剂的生产工艺如下：

除了步骤(6)包装为滴入剂外。

其他操作同实施例1。

实施例3

本发明基因治疗药物——注射剂的生产工艺如下：

除了步骤(6)包装为注射剂，加入5％山梨醇作为保护液。

其他操作同实施例1。

实施例4

自愿受试者三人，男性，年龄分别为47、55、65岁，有ED症状，使用本发明制备的水剂，从阴茎尿道口滴入1毫升水剂，每天一次，连续使用二周。五个月后阴颈勃起功能明显改变，性交时间延长。受试者非常满意。

序列表：

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物及其药盒

<130>/

<150>200710171734.6

<151>2007-11-30

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>576

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

Claims (10)

1、一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物，其特征在于，所述的药物为大钾通道基因—腺相关病毒载体重组体的水剂、油剂、注射剂或滴入剂，所述大钾通道基因具有SEQ ID NO：1所示的序列。

2、如权利要求1所述的基因治疗药物，其特征在于，所述的水剂、注射剂或滴入剂还包括5％的山梨醇或甘露醇。

3、如权利要求1所述的基因治疗药物，其特征在于，所述的油剂还包括动物油、甘油或油脂。

4、如权利要求1所述的基因治疗药物，其特征在于，所述的腺相关病毒载体是各种血清型的腺相关病毒载体，其中所述的腺相关病毒载体根据转染或感染皮肤和尿道内膜的转染率不同，优选AAV1-AAV8中感染率高的血清型AAV，最优选的是AAV2型。

5、一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物药盒，其特征在于，所述的药盒包括如权利要求1所述的药物和说明书。

6、如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药物为水剂，其组成还包括5％的山梨醇或甘露醇。

7、如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药物为滴入剂，其组成还包括5％的山梨醇或甘露醇。

8、如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药物为注射剂，其组成还包括5％的山梨醇。

9、如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药物为油剂，其组成还包括动物油、甘油或油脂。

10、如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的说明书记载内容如下：(1)药物使用方法为涂抹在龟头表皮、滴入尿道口或阴茎注射；

(2)药物在4℃或-20℃储存。

(3)药物使用前先行排尿。