CN101429546A - 检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片及其应用，属基因芯片技术领域。本发明的基因芯片是在固相载体表面固定有探针和阴性对照、阳性对照，其所述探针选自具序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；其阴性对照的阴性标记探针为人β－actin基因；其阳性对照的阳性标记探针中A为AF456789，B为AJ236200。本发明还提供了所述基因芯片在检测非洲菊在不同花序发育时期的基因表达和不同肥料处理的非洲菊花序材料不同发育时期的基因表达上的应用。通过本发明的基因芯片对非洲菊花序发育相关基因表达的检测，可为非洲菊生产中肥料的合理施用和非洲菊的基因功能分析及生物技术育种提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片技术，特别涉及一种检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片。
背景技术
基因芯片技术目前已经开始应用于基因组功能研究、疾病诊断、发现新基因、DNA测序、药物筛选、农业食品卫生和环境监测等领域。
基因芯片分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片，它们的作用机制是一样的，都是与标记的靶序列杂交，通过检测标记物激发的荧光来分析结果。相对于cDNA，寡核苷酸芯片具有更好的特异性、灵敏性和稳定性。因此，利用寡核苷酸芯片来研究基因的表达和功能会提供更为可靠的结果。
应用基因芯片技术研究植物发育过程中的基因表达，进而了解特定基因在植物发育阶段所起的作用具有巨大的优越性。将大量的某物种的基因排列在一个芯片上，提取不同个体、器官、组织，或者不同发育阶段、不同分化阶段、不同细胞周期，或者不同生长条件、诱导条件下的mRNA，再反转录成标记的cDNA与芯片杂交，从而可以一次性获取大量的信息，更好地了解不同基因在不同条件下表达的差异，从而更全面快速地了解基因的功能作用，也有助于分析各基因间的相互作用(Xiang C C，Chen Y.Micriarray techonology and itsapplication[J].Biotechnology Advances，2000，18(1)35-46)。
植物花的发育是植物发育中最引人注目的阶段，1990年Yanofsky等成功地分离花器官发育控制基因AGAMOUS(Yanofsky M F，Ma H，Bowman J L，et al.The protein encoded bythe Arabidopsis homeotic gene AGSMOUS resembles transcriptionfactors[J].Nature，1990，346：35-39)，从此植物发育生物学的研究取得了突破性的进展，花发育的分子生物学研究迅速成为植物发育生物学研究的新热点。开花是有花植物最主要的发育特点，这一过程由环境信号和内源信号共同决定。花发育分子遗传学的研究表明，植物花发育具有遗传保守性。植物花的发育可以分为四个阶段：花序的发育、花芽的发育、花器官的发育和花型的发育。花序的发育是花发育的第一步，标志着植物个体从营养生长向生殖生长的转变。花序的发育一般需要有一定的外界因子诱导。对于正常植物而言，经过一定的营养生长以后，营养型的顶端分生组织便处于“感受态”，进入开花诱导期。此时，植物能感受一定的外界环境因子，如光照长短、光质、温度、土壤水分等等。在一定的诱导条件下，营养型顶端分生组织属性发生渐变。到诱导结束，营养型分生组织发生不可逆转的变化，成为花序型分生组织。
在植物生殖生长启动阶段，茎端分生组织在形态上没有变化，但在生理生化和基因表达等方面却发生了明显的变化(雍伟东，种康，许智宏等.高等植物开花时间决定的基因调控研究[J].科学通报，2000，45：455-466)。不同植物在进化过程中演化出不同的生殖策略：一些植物的开花时间主要受光照、温度、水分、营养条件等环境因子的影响，以使植物能在最适条件下开花结果；另一些植物则对环境变化不敏感，由营养生长的积累量等内部信号引起开花。因此研究植物不同条件下的营养生长对开花的影响具有重要意义。
非洲菊(Gerbera jamesonii Bolu)又名扶郎花、太阳花，属菊科扶郎花属，多年生宿根草本观赏植物。非洲菊原产南非，因其花朵硕大、花枝清秀挺拔、花色丰富艳丽、产花量高，既可作盆栽又可作切花，切花瓶插期长，具有较高的观赏价值；在温暖条件下能周年开花，栽培管理省工，是目前国际市场畅销名花之一。
非洲菊花序是非洲菊的重要器官，研究其发育的分子机理是改良花色和花形的重要途径。近年来，植物花器官发育的分子机理研究取得了长足的进展。有关花发育中调控各类花器官形成的器官特征基因的克隆及其功能分析，是近年植物发育分子生物学研究中的重要突破之一(Coen E S，Meyerowitz E M.The war of the whorls：Genetic interactions controllingflower development[J].Nature，1998，63：1311-1322)。这些基因是由于对拟南芥和金鱼草获得各类花器官的同源异型突变体的研究而发现的(林忠平等.走向21世纪的植物分子生物学[M].科学出版社)。
植物生长发育是一个十分复杂的过程，涉及到众多基因的表达、调节、控制。以往的研究局限于某一种或某一类基因的行为和功能，不能反映该基因或该类基因与其他基因的互作，无法从整个基因组水平进行研究。利用基因芯片技术，可以高通量平行显示基因的表达，进而推断基因的功能，这有助于加快植物生长发育机理的研究。现有技术中对非洲菊花序基因表达的检测仅仅限于单个基因的独立分析，本研究采用基因芯片高通量地平行地分析栽培非洲菊的花序基因的表达谱，研究不同肥料处理与非洲菊花序基因表达的关系，研究花序基因表达对非洲菊切花质量和产量的影响，为培育低肥条件下开花的非洲菊新品种提供种质材料。本研究受云南省自然科学基金面上项目资助，项目编号：2003C0079M。
本实验所采用的寡核苷酸芯片含11个MADS基因(其中6个来源于非洲菊，5个来源于拟南芥)、4个NAC基因(全部来自于拟南芥)、3个LEAFY基因(全部来源于拟南芥)以及20个来自于非洲菊花序的ESTs序列。
MADS基因家族编码的是一类高度保守的转录因子，它在真核生物中普遍存在，在植物、动物、真菌的信号传导和发育中起重要作用，是控制开花的复杂基因网络中的重要成员(Theissen G，Kim J T，Saedler H.Classification and phylogeny of the MADS-boxmultigene family suggest defined roles of MADS-box gene subfamilies in themorphological evolution of eukaryotes[J].J Mol Evol，1996，43：484-516)。
NAC基因是植物特有的基因家族，在细菌、真菌、动物中至今还没有发现其存在。在对NAM和CUC2基因的分离和序列分析中发现，由它们编码的蛋白质在N-端具有高度保守的氨基酸序列，这个保守的区域被称为NAC domain(L Kikuchi，et al.Molecular analysis of theNAC gene family in rice[J].Mol Gen Genet，2000，262：1047-1051)，(所以具有)NAC domain的基因就被叫做NAC基因。编码包含NAC功能结构域的基因，如拟南芥中的NAP、CUC2、矮牵牛的NAM在植物的发育中具有极其重要的功能。有研究表明NAC基因家族在茎尖分生组织、花器官及叶的形态建成中起着重要作用(Souer E，etal.The no apical meristem gene ofpetunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expected atmeristem and primordial boundaries[J].Cell，1996，85：159-170)，但是，NAC domain的功能还有待进一步的研究。NAC是NO APICAL MERISTEM的缩写，NAC基因家族是植物特有的基因家族，首先是在拟南芥中发现和克隆的。现已从拟南芥、水稻等模式植物中克隆出100多个基因，然而各基因的具体功能却还不完全清楚。人们发现NAC基因在水稻花序发育的中后期表达水平较高，通常认为NAC基因在该发育时期起着重要的调节作用。有研究表明，NAC基因在雄蕊和花瓣的细胞分裂及细胞扩增的转换中起作用(Sa blowskiR W M，M eyerowitzEM.A homologue of No Apical Meristem is an immediate target gene of the floral homeoticgenes APETALA3/PISTILLA[J].Cell，1998，92：93-103)。
LEAFY基因家族是控制茎向花转变的一类主要基因，其强突变体基部花完全转变为叶芽，顶部花表现出部分花的特性(Schultz E A，Haughn G W.LEAFY，a homeotic gene thatregulates inflorescence development in Arabidopsis[J].Plant Cell，1991，3：771-781)。LEAFY基因能促进花分生组织的形态建成。即使在LEAFY基因失活的情况下，最终还是会成花，表明还有其他基因促进花序向花的转变。AP1的功能与LEAFY部分冗余，其表达时期晚于LEAFY，二者具有加性效应，能互相促进表达(Liljegren S J，et al.Interactions amongAPETALA1，LEAFY，and TERMINAL FLOWER 1 specify meristem fate[J].PlantCell，1999，11：1007-1018)。组成型表达LEAFY或AP1能提早花期(Weigel D，Meyerowitz EM.The ABCs of floral homeotic genes[J].Cell，1994，78：203-220)。自Weigel实验室首次鉴定了LEAFY基因在成花中起关键调节作用以来，国内外学者对该基因的表达调控及生物学功能已有深入的研究，并发表了许多高质量的研究论文，已从苹果、柑橘、牵牛、水稻、烟草、番茄、黄瓜等植物中克隆到其同源基因。LEAFY基因参与花分生组织属性的决定，还参与花分生组织的进一步发育(SawaS，etal.Role of Arabidopsis PIN gene on floral meristemformation[J].Plant Cell Physiol，1996，37(supp)：s119，443(2pHO2)，因此，LEAFY基因在成花中的作用不局限于调控开花时间和花转变，而是在花序和花发育的各个阶段中都起着作用。
EST是长约150-500bp的基因表达序列片段。EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5’或3’进行一步法测序，所获序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术(Hatey F，et al.Expressed sequenced tags for genes：a review[J].Genet Sel Evol，1998，30(5)：521-541)。由于EST反映的是基因的编码部分，因此它是用于制备DNA芯片很好的基因资源，同时芯片技术也是高通量筛选EST的有效方法。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片，其目的是通过该基因芯片对非洲菊花序发育相关基因表达的检测，可为非洲菊的基因功能分析及生物技术育种提供依据和指导非洲菊生产中肥料的合理施用。
本发明是在优化RNA提取、mRNA反转录标记第一链cDNA、芯片制备、芯片杂交条件的基础上，成功地应用寡核苷酸芯片检测了不同肥料条件下生长的非洲菊花序不同发育时期的基因表达，发现了四个非洲菊MADS-box基因、一个拟南芥MADS-box基因、一个拟南芥NAC基因及五个非洲菊ESTs基因在非洲菊花序的不同发育时期有着不同程度的表达，而对于不同的肥料条件下生长的非洲菊，其花序发育的基因表达差异主要体现在非洲菊ESTs序列上。本发明为功能基因组学的进一步研究奠定了基础，同时对下一步进行非洲菊花序发育相关基因的分离、克隆和利用基因工程技术改良非洲菊品种的研究，为非洲菊的切花生产奠定一定的基础。
本发明的技术方案是本发明的检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片在固相载体表面固定有探针和阴性对照、阳性对照，其所述探针具有序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；其阴性对照的阴性标记探针为人β-actin基因；其阳性对照的阳性标记探针中A为AF456789，B为AJ236200。
上述基因芯片的每条探针纵向重复两点，每点的探针的用量为0.048μg，点直径0.2mm，点间距0.8mm。
上述基因芯片的探针排布成11×10的矩阵，其固相载体选自载玻片。
本发明的又一方面，提供了上述基因芯片在检测非洲菊不同花序发育时期花序基因表达的应用。所述的不同花序发育时期分别为P1期花序：花序直径<1.0cm，舌状花与中间盘状花等高；P3期花序：花序直径2.0～3.0cm，舌状花长于苞片0.2～0.8cm，花尖部开始着色；P5期花序：花序直径7.0～9.0cm，花序完全开放。
本发明的又一方面，还提供了上述基因芯片在检测不同肥料处理的非洲菊花序材料相同花序发育时期的基因表达的应用。上述的不同肥料处理是用配比为N:K:P＝15:15:15的磷酸钾复合肥，在苗期处理分别为每株非洲菊0克、每株非洲菊0.5克、每株非洲菊1.0克；在花期的处理分别为每株非洲菊0.5克、每株非洲菊1.0克、每株非洲菊1.5克。
本发明还提供了一种制备检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片的方法，该方法用本领域制备基因芯片的通用方法，但为保证制备成功，也特别提出制备方法中应注意的事项。
本发明的检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片是通过以下方法制备的：
检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片(寡核苷酸芯片)的制备
1、寡核苷酸芯片的探针及筛选结果
从Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov)上及国内外相关文献中查询到非洲菊花序及拟南芥花序发育相关基因的mRNA。这些基因为MADS框基因家族(11个，其中5个来源于拟南芥)、NAC基因家族(4个，来自于拟南芥)、LEAFY基因家族(3个，来源于拟南芥)以及来自于非洲菊花序的ESTs(20个)。通过计算机设计探针，并到www.ncbi.nlm.gov./blast进行探针的筛选，结果见序列表或表1。候选探针符合下列条件：①探针特异性好；②自身不形成二级结构；③GC含量45％～55％；④探针长度均为100nt；⑤除ESTs序列外的基因全部为保守区序列。
2、寡核苷酸探针PCR扩增
我们利用在线引物设计软件Primer3.0，对探针基因的保守区设计相关引物，其中非洲菊基因设计一对引物，拟南芥基因设计镶套引物，引物长度均在19～23bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表2。模板DNA采用CTAB法提取，结果见图2。利用设计好的引物对探针基因连续进行两次PCR扩增(目的片段均为100nt)。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测发现寡核苷酸探针PCR克隆均为阳性。第二次PCR扩增后电泳结果如图3所示。
表1 寡核苷酸芯片探针序列
| SEQID NO | 探针序列(5’→3’) | 参考文献 |
| 1 | GGATCGAAAACACGACGAATCGACAAGTGACTTTTTGCAAACGCCGTAATGGGCTGCTTAAGAAGGCGTATGAGTTGTCTGTTCTTTGTGATGCCGAGGT | Yu，D.，et.al.Organ identity genes andmodified patterns of flower developmentin Gerbera hybrida(Asteraceae)，PlantJ.17(1)，51-62(1999) |
| 2 | GCCCTTCCACTACGACTAAAAAGATGTATGATCAGTACCAGAGTACTGTAGGGTTTGATCTATGGAGTTCTCACTATGAGAGGATGAAGGAGACAATGAA | Yu，D.，et.al.Organ identity genes andmodified patterns of flower developmentin Gerbera hybrida(Asteraceae)，PlantJ.17(1)，51-62(1999) |
| 3 | ATTCCAAAAGGAGGAATGGATTGTTCAAGAAGGCGAGTGAACTCACTGTATTGTGCGATGCTAAAGTCTCCATTATCATGGTGTCGTGCACTGATAAGCT | Yu，D.，et.al.Organ identity genes andmodified patterns of flower developmentin Gerbera hybrida(Asteraceae)，PlantJ.17(1)，51-62(1999) |
| 4 | AACACCAGTAACAGGCAAGTCACCTACTCAAAGAGAAAGAATGGCATCATCAAGAAAGCTAAAGAAATTACTGTTCTTTGTGATGCTAATGTTTCCCTTG | Yu，D.，et.al.Organ identity genes andmodified patterns of flower developmentin Gerbera hybrida(Asteraceae)，PlantJ.17(1)，51-62(1999) |
| 5 | AGAACAAAATAAACAGGCAAGTCACTTTTGCCAAGAGAAGAAATGGTCTCCTCAAGAAAGCTTACGAGCTTTCTGTTCTCTGCGATGCCGAAGTTGCTCT | Kotilainen，M.，et.al.GRCD1，an AGL2-likeMADS box gene，participates in the Cfunction during stamen development inGerbera hybrida.Plant Cell 12(10)，1893-1902(2000) |
| 6 | GCTCAAGCGAATAGAGAACAAAATTAACCGACAGGTTACCTTCTCCAAGCGCAGAAATGGCCTGCTCAAGAAAGCTTACGAACTCTCCGTTCTCTGCGAC | Teeri，T.H.Direct Submission.Submitted(16-JUL-2004)Teeri T.H.，Department ofApplied Biology，University of Helsinki，P.O.Box 27，FIN-00014 Univ.Helsinki，FINLAND |
| 7 | ATCAACTACATCGCCGATCATGGTGAA | Elomaa，P.，et.al.Activation of |
| GGTGTTTGGAACACTCTTGCAAAATCTGCAGGTCTTAAAAGAACCGGAAAGAGTTGCAGACTTCGATGGTTGA | anthocyanin biosynthesis in Gerberahybrida(Asteraceae)suggests conservedprotein-protein and protein-promoterinteractions between the ancientlydiverged monocots and eudicots.PlantPhysiol.133(4)：1831-1842，2003 | |
| 8 | GTGGTCCAGTCCCACCAGCATGTTGCAATGGAGTTCGGGGACTTAATAACGCTGCAAAAACTACCCCAGACCGTCAGACAGCTTGTGGTTGCCTAAAAGG | Laitinen，R.A.，et.al.Analysis of thefloral transcriptome uncovers newregulators of organ determination andgene families related to flower organdifferentiation in Gerbera hybrida(Asteraceae)，Genome Res.15(4)：475-4862005 |
| 9 | TAAGACGTTAGGGAAATTGAATCCTTTTAAACACGGATCAAAGGACACTTCTAATATTGATGACAACGAAGTTGACCATACCAAGCCGAGGAGGAGAAGG | 同上 |
| 10 | ATGCATCACTAATCGTCCCTGAAAAGCGTAAACGTGGCCGCCCACGTAAGGACCCAAGTGAAAGACGCACACAAAAAGCCCGTTCACTAGCCGCTCGCAT | 同上 |
| 11 | GAGAAATCCTGTGAAAAACACGATCGCCTGCCAGTGGAAGGTTTTCTGCGTTCAGTCAATCTACGCAGAGTGAATCGGTCCCTAAGGAACCCCCGAAAGG | 同上 |
| 12 | AGACATCATTTGATCGTTGTGAAGCTTCTGGTCAAAGCGTGGATTGAAGGTTGTAAGCTGTGGTAGCTGCTTATGGTTAAATGGTGATCAATCAATCGCA | 同上 |
| 13 | CACCACCACAGACCCAAACAAGCGGATCCATGGAGCAAAGCTATGATCCGTACGTCGCCCATGGTACGGTGTATGCATCTCCACCAATCGTGAGTTATGG | 同上 |
| 14 | AAAAGTTTTCGCCTTTTTGGAAAAGTACTTGAAAAGGCCTTCTATAGATAAAAACGCAGGCGCAATGGCCGTGGATTTGGATGGGAATATAATTCAACGA | 同上 |
| 15 | ATGACTTCAGGGTTCTCACTGCTGTTGAGATGGGAATGCGGAATCATGAAATTGTACCTGCAGAACTCATTGATCGCATTGCATCACTCAGACATGGTGG | 同上 |
| 16 | CTCTTATTCCCAACTCTGACGTGACAGTTTTAGAAGGTCATACTTCTGAGGTTTTTGTATGTGCATGGAGTCCAGCTGGTTCTCTTTTGGCTTCTGGGTC | 同上 |
| 17 | CCCCCTGCATCTACTCCTCCCAAAGAA | 同上 |
| AAGGCCGTTGAGAAACCAATCAGCCCACCCGAACCAAAAGCTGCAAAGCCAAGTGCAGCTACCGAAACAGATC | ||
| 18 | CTAGCAAAGATGAGCAAGAACGATGAAGATGTTATCGGATCTCTTGATGGACTCACTGAGAAGGAGATCGGTGTTCTTGACGACTGGGAGAAGAAATTCG | 同上 |
| 19 | GACATTGAGGGTTGCCGAGTCCCTGGTCCAGGTACTTGTGCTTCAAACCCTTCTAACTGGTGGGAGGGTTCGACATACCAACAACTTGACCCAATTGCGG | 同上 |
| 20 | CAGGGCTTCTTATGTCATTCGTCCTTTCTATTTACATTTTGCAATCGTCTCGCGATAAAATAGAAAGGTTTGTTAGAGAGACAGTTGCTGAAAGCAGCAT | 同上 |
| 21 | ATTCTTCATTGGCGCACGAAAACCTGGTCGCAAGTTACTTTTAACCCAGGCGGCCAAAGCCACTGCACTTGTAGATGGAAATAAGAAGAGCCGTGCCAAA | 同上 |
| 22 | GCGGGGAGAAGAATTTGGATCCAGGAGTGAAGGAGTCACTGAAGAAATGTTTGCCGGACAGCAAGGTCGTGATGGGCAGAGCTAACCGTGGAATTTTCGC | 同上 |
| 23 | TTTGATCATGCGGAGAAAGGAGATGCACTCTATGCCATGGAGCTTGCATTGTCACTTGAGAAGTTAACAAACGAGAAACTTCTACACGTTCACGCGGTAG | 同上 |
| 24 | ACAGGGCCCTCAGGAGAGAGCCCCAGCTGCAGCTCCGGCCGCACAACCTGCACAGGCATCAAAGAAATCGAAGAAATGAGGTCTGTAAGGGATGGAGGAT | 同上 |
| 25 | ACACGGGGTTTTGTTTTTGTTTTTGTGTTTTTGCTTTGGGTTTTCTTGAACTCAATGTTTCCGCAACAATGGGGGTTTAGCCTTGTTGCACACCACATTG | 同上 |
| 26 | TCAAATCCTTGAACAAAGGTGACATTATGGTTTTCCCACAAGGGTTGCTTCATTTTCAGATAAACTCCGGCAAGGTGCCAGCACTTGCGTTTGTTAGTTT | 同上 |
| 27 | CAGCAGCTTGACACTGCTCTTAAGCACATCCGCACTAGAAAAAACCAACTTATGTACGAGTCCATCAATGAGCTCCAAAAAAAGGAGAAGGCCATACAGG | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.This record has beencurated by TAIR.This record is derivedfrom an annotated genomic sequence(NC_003070).The reference sequence wasderived from AT1G69120.1. |
| 28 | GAAGGCCATACAGGAGCAAAACAGCAT | 同上 |
| GCTTTCTAAACAGATCAAGGAGAGGGAAAAAATTCTTAGGGCTCAACAGGAGCAGTGGGATCAGCAGAACCAA | ||
| 29 | GTACACGTACTTCGCCGACAAAGCACAGGCTTCCCTCGAGGAAGTTCGAAGTATAGAGGTGTCACTTTGCATAAGTGTGGTCGTTGGGAAGCTCGAATGG | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.This record has beencurated by TAIR.This record is derivedfroman an notated genomic sequence(NC_003075).The reference sequence wasderived from AT4G36920.1. |
| 30 | TGCATAAGTGTGGTCGTTGGGAAGCTCGAATGGGTCAATTCTTAGGCAAAAAGTATGTTTATTTGGGTTTGTTCGACACCGAGGTCGAAGCTGCTAGAGC | 同上 |
| 31 | CTGGCAAGAAACTATGGGATGCTAAGCATGAGAACCTTAGCAATGAGATTGATAGGATCAAGAAAGAGAATGATAGCTTACAACTGGAGCTCAGGCATTT | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.Thisrecord has beencurated by TAIR.Thisrecord is derived from an an notatedgenomi csequence(NC_003076).Thereference sequence was derived fromAT5G20240.1. |
| 32 | ACAACTGGAGCTCAGGCATTTGAAGGGAGAAGATATACAGTCTCTCAACTTGAAAAATCTGATGGCTGTCGAGCACGCCATTGAACATGGCCTCGACAAA | 同上 |
| 33 | TCTCTAGCTCCAACAAGCTTCATGAGTATATCAGCCCTAACACCACAACGAAGGAGATCGTAGATCTGTACCAAACTATTTCTGATGTCGATGTTTGGGC | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.This record has beencurated by TAIR.This record is derivedfrom an annotated genomic sequence(NC_003074).The reference sequence wasderived from AT3G54340.1. |
| 34 | CCAAACTATTTCTGATGTCGATGTTTGGGCCACTCAATATGAGCGAATGCAAGAAACCAAGAGGAAACTGTTGGAGACAAATAGAAATCTCCGGACTCAG | 同上 |
| 35 | TGCGTCAACAAATAATCAGCATACAAAACTCCAACAGGCAATTGATGGGTGAGACGATAGGGTCAATGTCTCCCAAAGAGCTCAGGAACTTGGAAGGCAG | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.This record has beencurated by TAIR.This record is derivedfrom an annotated genomic sequence(NC_003075).The reference sequence wasderived from AT4G18960.1. |
| 36 | CAGGAACTTGGAAGGCAGATTAGAGAGAAGTATTACCCGAATCCGATCCAAGAAGAATGAGCTCTTATTTTCTGAAATCGACTACATGCAGAAAAGAGAA | 同上 |
| 37 | TCTCCCAGGGACAGAAAATATCCCAACGGTTCGCGTCCTAACCGGTCCGCTGGT | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.This record has been |
| TCTGGTTACTGGAAAGCTACCGGAGCTGATAAACCGATCGGACTAC | curated by TAIR.This record is derivedfroman an notated genomic sequence(NC_003070).The reference sequence wasderived from AT1G01720.1. | |
| 38 | ATAAACCGATCGGACTACCTAAACCGGTCGGAATTAAGAAAGCTCTTGTTTTCTACGCCGGCAAAGCTCCAAAGGGAGAGAAAACCAATTGGATCATGCA | 同上 |
| 39 | CAAAGACTTGTGCACTTGTTGGGATGAAGAAGACTCTTGTCTTTTACAAAGGAAGAGCTCCGAAAGGAGAGAAGAGTAATTGGGTTATGCATGAATATCG | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.This record has beencurated by TAIR.This record is derivedfrom an annotated genomic sequence(NC_003076).The reference sequence wasderived from AT5G53950.1. |
| 40 | CGAAAGGAGAGAAGAGTAATTGGGTTATGCATGAATATCGTCTTGAAGGCAAATTCTCTTACCATTTCATCTCAAGAAGCTCCAAGGATGAATGGGTGAT | 同上 |
| 41 | CTGGTACAGATAAACCGGTGATTTCAACCGGCGGTGGTGGTAGTAAAAAAGTGGGAGTTAAAAAGGCTCTAGTGTTTTACAGTGGTAAACCACCAAAAGG | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.This record has beencurated by TAIR.This record is derivedfrom an annotated genomic sequence(NC_003070).The reference sequence wasderived from AT1G52880.1. |
| 42 | CAGTGGTAAACCACCAAAAGGAGTTAAATCAGATTGGATTATGCATGAATATCGGTTAACTGATAATAAACCTACTCATATTTGTGACTTCGGCAACAAG | 同上 |
| 43 | GGAGCAAGTAAGCTTCTGAATGAGCAAGAGGGTTTCATGGACGAAGTACTAATGGAGGATGAGACAAAAGTTGTAGTTAACGAAGCAGAGAGAAGAACTG | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.This record has beencurated by TAIR.This record is derivedfrom an annotated genomic sequence(NC_003070).The reference sequence wasderived from AT1G69490.1. |
| 44 | AACGAAGCAGAGAGAAGAACTGAAGAAGAGATAATGATGATGACGTCGATGAAACTTCCAAGGACGTGTTCGCTGGCTCATTTGTTGGAAATGGATTACA | 同上 |
| 45 | TCTGACGACGCCAAAGAAACGATTCAAGAATGTGTCTCCGAGTACATCAGCTTCGTGACCGGTGAAGCCAACGAGCGTTGCCAACGTGAGCAACGTAAGA | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.Thisrecord has been curated by TAIR.Thisrecord is derived from an annotatedgenomic sequence(NC_003070).Thereference sequence was derived fromAT1G21970.1. |
| 46 | CGTGAGCAACGTAAGACCATAACTGCT | 同上 |
| GAAGATATCCTTTGGGCTATGAGCAAGCTTGGGTTCGATAACTACGTGGACCCCCTCACCGTGTTCATTAACC | ||
| 47 | GAAGCTTAGGGTTTTGTGTGAGAAGGAATTGAAGAACAGCGATGTTGGGTCACTCGGGAGGATAGTTCTACCAAAGAGAGATGCAGAAGCAAATCTTCCG | This record has not yet been subject tofinal NCBI review.Thisrecord has been curated by TAIR.Thisrecord is derived from an annotatedgenomi csequence(NC_003070).Thereference sequence was derived fromAT1G28300.1. |
| 48 | GAGATGCAGAAGCAAATCTTCCGAAGCTATCTGATAAAGAAGGAATCGTTGTACAGATGAGAGATGTTTTCTCTATGCAGTCTTGGTCTTTCAAATACAA | 同上 |
| 49 | TCATCACGCTCTTGATGCTCTCTCCCAAGAAGGGTTATCTGAGGAACCGGTGCAGCAACAAGACCAGACTGATGCGGCGGGGAATAACGGCGGAGGAGGA | This record has not yet been subject tofinal NCB Ireview.Thisrecord has been curated by TAIR.Thisrecord is derived from an annotatedgenomic sequence(NC_003076).Thereference sequence was derived fromAT5G61850.1. |
| 50 | GGAATAACGGCGGAGGAGGAAGTGGTTACTGGGACGCAGGTCAAGGAAAGATGAAGAAGCAACAGCAGCAGAGACGGAGAAAGAAACCAATGCTGACGTC | 同上 |
表2 寡核苷酸芯片探针PCR扩增引物
| SEQIDNO | 基因 | 上游引物 | 下游引物 |
| 1 | AJ009723(非洲菊MADS基因) | GGATCGAAAACACGACGAAT | ACCTCGGCATCACAAAGAAC |
| 2 | AJ009724(非洲菊MADS基因) | GCCCTTCCACTACGACTAAAAA | TTCATTGTCTCCTTCATCCTCTC |
| 3 | AJ009725(非洲菊MADS基因) | ATTCCAAAAGGAGGAATGGA | AGCTTATCAGTGCACGACACC |
| 4 | AJ009726(非洲菊MADS基因) | AACACCAGTAACAGGCAAGTCA | CAAGGGAAACATTAGCATCACA |
| 5 | AJ400623(非洲菊MADS基因) | AGAACAAAATAAACAGGCAAGTCA | AGAGCAACTTCGGCATCG |
| 6 | AJ784157(非洲菊MADS基因) | GCTCAAGCGAATAGAGAACAAAA | GTCGCAGAGAACGGAGAGTT |
| 7 | AJ554702(非洲菊EST) | ATCAACTACATCGCCGATCA | TCAACCATCGAAGTCTGCAA |
| 8 | AJ750012(非洲菊EST) | GTGGTCCAGTCCCACCAG | CCTTTTAGGCAACCACAAGC |
| 9 | AJ750404(非洲菊EST) | TAAGACGTTAGGGAAATTGAATCC | CCTTCTCCTCCTCGGCTTG |
| 10 | AJ752843(非洲菊EST) | ATGCATCACTAATCGTCCCTGA | ATGCGAGCGGCTAGTGAAC |
| 11 | AJ755043(非洲菊EST) | GAGAAATCCTGTGAAAAACACG | CCTTTCGGGGGTTCCTTAG |
| 12 | AJ758665(非洲菊EST) | AGACATCATTTGATCGTTGTGAA | TGCGATTGATTGATCACCAT |
| 13 | AJ758671(非洲菊EST) | CACCACCACAGACCCAAAC | CCATAACTCACGATTGGTGGA |
| 14 | AJ758691(非洲菊EST) | AAAAGTTTTCGCCTTTTTGG | TCGTTGAATTATATTCCCATCCA |
| 15 | AJ760779(非洲菊EST) | ATGACTTCAGGGTTCTCACTGC | CCACCATGTCTGAGTGATGC |
| 16 | AJ760982(非洲菊EST) | CTCTTATTCCCAACTCTGACGTG | GACCCAGAAGCCAAAAGAGA |
| 17 | AJ761183(非洲菊EST) | CCCCCTGCATCTACTCCTC | GATCTGTTTCGGTAGCTGCAC |
| 18 | AJ762815(非洲菊EST) | CTAGCAAAGATGAGCAAGAACG | CGAATTTCTTCTCCCAGTCG |
| 19 | AJ762838(非洲菊EST) | GACATTGAGGGTTGCCGAGT | CCGCAATTGGGTCAAGTT |
| 20 | AJ762883(非洲菊EST) | CAGGGCTTCTTATGTCATTCG | ATGCTGCTTTCAGCAACTGT |
| 21 | AJ762942(非洲菊EST) | ATTCTTCATTGGCGCACGA | TTTGGCACGGCTCTTCTTAT |
| 22 | AJ762965(非洲菊EST) | GCGGGGAGAAGAATTTGGAT | GCGAAAATTCCACGGTTAGC |
| 23 | AJ762989(非洲菊EST) | TTTGATCATGCGGAGAAAGG | CTACCGCGTGAACGTGTAGA |
| 24 | AJ763012(非洲菊EST) | ACAGGGCCCTCAGGAGAGA | ATCCTCCATCCCTTACAGACC |
| 25 | AJ763052(非洲菊EST) | ACACGGGGTTTTGTTTTTGT | CAATGTGGTGTGCAACAAGG |
| 26 | AJ763150(非洲菊EST) | TCAAATCCTTGAACAAAGGTGA | AAACTAACAAACGCAAGTGCTG |
| 27 | NM105581(拟南芥MADS基因) | CAGCAGCTTGACACTGCTCT | CCTGTATGGCCTTCTCCTTTT |
| 28 | NM105581(拟南芥MADS基因) | GAAGGCCATACAGGAGCAAA | TTGGTTCTGCTGATCCCACT |
| 29 | NM119856(拟南芥MADS基因) | GTACACGTACTTCGCCGACA | CCATTCGAGCTTCCCAAC |
| 30 | NM119856(拟南芥MADS基因) | TGCATAAGTGTGGTCGTTGG | GCTCTAGCAGCTTCGACCTC |
| 31 | NM122031(拟南芥MADS基因) | CTGGCAAGAAACTATGGGATG | AAATGCCTGAGCTCCAGT |
| TG | |||
| 32 | NM122031(拟南芥MADS基因) | ACAACTGGAGCTCAGGCATT | TTTGTCGAGGCCATGTTCA |
| 33 | NM115294(拟南芥MADS基因) | TCTCTAGCTCCAACAAGCTTCA | GCCCAAACATCGACATCAG |
| 34 | NM115294(拟南芥MADS基因) | CCAAACTATTTCTGATGTCGATG | CTGAGTCCGGAGATTTCTATTTG |
| 35 | NM118013(拟南芥MADS基因) | TTGCGTCAACAAATAATCAGCA | CTGCCTTCCAAGTTCCTGAG |
| 36 | NM118013(拟南芥MADS基因) | CAGGAACTTGGAAGGCAGAT | TTCTCTTTTCTGCATGTAGTCGAT |
| 37 | NM100054(拟南芥NAC基因) | TCTCCCAGGGACAGAAAATATC | GTAGTCCGATCGGTTTATCAGC |
| 38 | NM100054(拟南芥NAC基因) | ATAAACCGATCGGACTACCTAAAC | TGCATGATCCAATTGGTTTTC |
| 39 | NM124774(拟南芥NAC基因) | CAAAGACTTGTGCACTTGTTGG | CGATATTCATGCATAACCCAAT |
| 40 | NM124774(拟南芥NAC基因) | CGAAAGGAGAGAAGAGTAATTGG | ATCACCCATTCATCCTTGGAG |
| 41 | NM104166(拟南芥NAC基因) | CTGGTACAGATAAACCGGTGA | CCTTTTGGTGGTTTACCACTGT |
| 42 | NM104166(拟南芥NAC基因) | CAGTGGTAAACCACCAAAAGG | CTTGTTGCCGAAGTCACAAA |
| 43 | NM105616(拟南芥NAC基因) | GGAGCAAGTAAGCTTCTGAATGA | CAGTTCTTCTCTCTGCTTCGTT |
| 44 | NM105616(拟南芥NAC基因) | AACGAAGCAGAGAGAAGAACTGA | TGTAATCCATTTCCAACAAATGA |
| 45 | NM102046(拟南芥LEAFY基因) | TCTGACGACGCCAAAGAAAC | TCTTACGTTGCTCACGTTGG |
| 46 | NM102046(拟南芥LEAFY基因) | CGTGAGCAACGTAAGACCAT | GGTTAATGAACACGGTGAGG |
| 47 | NM102595(拟南芥LEAFY基因) | GAAGCTTAGGGTTTTGTGTGAGA | CGGAAGATTTGCTTCTGCAT |
| 48 | NM102595(拟南芥LEAFY基因) | GAGATGCAGAAGCAAATCTTCC | TTGTATTTGAAAGACCAAGACTGC |
| 49 | NM125579(拟南芥LEAFY基因) | TCATCACGCTCTTGATGCTC | TCCTCCTCCGCCGTTATT |
| 50 | NM125579(拟南芥LEAFY基因) | GGAATAACGGCGGAGGAG | GACGTCAGCATTGGTTTCTTT |
3、寡核苷酸芯片探针分布情况
将第二次PCR扩展后的寡核苷酸探针用点样液稀释，调整终浓度为0.3μg/μL，将其用点样仪点于醛基玻片上，每个探针点印两次，制成11×10的矩阵。探针布局情况如表3所示。
表3 寡核苷酸芯片探针分布情况
| 阴 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 阴 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 |
| 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 |
| 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 阳A | 阳B | 27 | 28 | 29 | 30 |
| 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 阳A | 阳B | 27 | 28 | 29 | 30 |
| 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 |
| 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 |
| 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 阳A | 阳B |
| 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 阳A | 阳B |
注：阴：阴性标记探针为人β-actin基因
阳：阳性标记探针，其中A为AF456789，B为AJ236200
附图说明
图1 本发明的技术路线图。
图2 DNA1％琼脂糖凝胶电泳结果其中1为非洲菊DNA，2为拟南芥DNA。
图3 第二次PCR扩增寡核苷酸探针电泳图从左至右，上排依次为：SEQ ID NO.1至SEQID NO.23，DNA Maker；下排依次为：SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.50，DNA Maker。
图4处理1材料的总RNA1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果，从左至右依次为P1期、P3期、P5期花序材料。
图5处理2材料的总RNA1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果，从左至右依次为P1期、P3期、P5期花序材料
图6处理3材料的总RNA1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果，从左至右依次为P1期、P3期、P5期花序材料。
图7反转录标记第一链cDNA1％琼脂糖电泳结果其中a：加入灭菌DEPC水补足体系体积的反转录产物；b：加入过量RNA溶液补足体系体积的反转录产物。
图8处理1的非洲菊P1花序的基因表达谱。
图9处理1的非洲菊P3花序的基因表达谱。
图10处理1的非洲菊P5花序的基因表达谱。
图11：处理2的非洲菊P1花序的基因表达谱。
图12：处理2的非洲菊P3花序的基因表达谱。
图13：处理2的非洲菊P5花序的基因表达谱。
图14：处理3的非洲菊P1花序的基因表达谱。
图15：处理3的非洲菊P3花序的基因表达谱。
图16：处理3的非洲菊P5花序的基因表达谱。
图17：基因NM118013的RT-PCR电泳图，其中1：P1期；2：P3期；3：P5期
图18：基因AJ009726的RT-PCR电泳图，其中1：P1期；2：P3期；3：P5期
图19：基因AJ554702的RT-PCR电泳图，其中1～3：处理1的P1～P5期；
4～6：处理2的P1～P5期；7～9：处理3的P1～P5期
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案及其有益效果。
实验仪器与材料
1主要仪器
DU640紫外分光光度计 BECKMAN公司
SYNGENE凝胶成相系 Gene Company Limited
ACADEMIC-Q超纯水仪 MILLIPORE公司
J2-MI高速离心机 BECKMAN公司
PTC200PCR仪 MJ公司
ULTRA LOW低温冰箱 SANYO公司
Gene Pix 4000B扫描仪 AXON Instruments，Inc产品
2、主要试剂
Taq酶 上海生工生物工程有限公司
RNasin Inhibitor 上海生工生物工程有限公司
Cy5-dUTP Amersham Pharmacia Biotech公司
AMV Reverse Transcriptase Promega公司
3、常用试剂配制
按萨姆布鲁克，E F弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[M].1998(第二版)方法配制
异硫氰酸胍裂解液：4M异硫氰酸胍0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.75M柠檬酸钠，1％β-巯基乙醇。
5×甲醛凝胶电泳缓冲液：将20.6g3-(N-玛琳代)丙磺酸(MOPS)溶于800ml经用DEPC处理的50mM乙酸钠溶液。用2M氢氧化钠将溶液的pH值调至7.0，加10ml经用DEPC处理的0.5M的EDTA(pH8)，再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。上述溶液经用0.21m微孔滤膜过滤除菌，避光保存于室温。光照或高压后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用。
20×SSC：在800ml水中溶175.3gNaCl，88.2g柠檬酸钠，调pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌待用。
10％SDS：在900ml水中溶解100gSDS，加热至68℃助溶，用浓盐酸调节pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。
50×Denhardt贮存液：5g聚蔗糖，5g聚乙烯毗咯烷酮，5g牛血清白蛋白溶解于500ml水中，过滤除菌，备用。
杂交液：组成为50％甲酞胺、5xDenhardt、6xSSC、0.5％SDS及100ug/ml蛙鱼精DNA。
4、非洲菊材料
三种不同肥料条件下生长的非洲菊粉色Wendy品种P1、P3、P5期花序(采自云南省农科院花卉基地)
5、本发明的技术路线如图1所示
实施例1 检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片(寡核苷酸芯片)的制备
本发明的基因芯片(寡核苷酸芯片)的制备中寡核苷酸芯片的探针及筛选结果、寡核苷酸芯片探针分布情况、寡核苷酸探针PCR扩增等制备方法如前所述。
实施例2 检测不同花序发育时期非洲菊花序发育基因表达
1、待检测非洲菊材料的处理与采集
选取具有良好市场前景的非洲菊材料粉色品种Wendy在一定光照、温度、水分条件下进行种植。栽培基质为：腐殖土、红土、珍珠岩，肥料为：国产尿素，芬兰产磷酸钾复合肥，N：K：Ca＝15：15：15，含硝态氮。分成三个处理，其中处理1：苗期施尿素0(CK)，花期施复合肥0.5g/株；处理2：苗期施尿素0.5g/株，花期施复合肥1.0g/株；处理3：苗期施尿素1.0g/株；花期施复合肥1.5g/株，每周一次。
分别在实验的Wendy品种花序的P1期(花序直径<1.0cm，舌状花与中间盘状花等高)、P3期花序(花序直径2.0～3.0cm，舌状花长于苞片0.2～0.8cm，花尖部开始着色)、P5期花序(花序直径7.0～9.0cm，花序完全开放)采集三种处理的花序材料，拿回实验室后立即冲洗干净，立即用液氮将其速冻，放入-70℃冰箱中保存，备用。
2、实验器皿的处理
实验器皿的处理按《核酸分离纯化产品用户手册》(2002，上海生工生物工程技术服务有限公司)操作。
RNA酶(RNase)是导致RNA降解最主要的物质，非常稳定。在一些极端的条件可暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。常规的高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。不同的物品可分别处理如下：
(1)移液器：根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70％乙醇擦洗移液器的内部和外部，可基本达到要求。
(2)塑料制品：尽可能使用一次性无菌塑料制品。己标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。对于国产塑料制品，原则上处理后方可使用。处理方法如下：①在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.01％(后文中记作DEPC-H20)。注意：DEPC为活性很强的剧毒物，须在通风柜中小心使用。②将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H20，使塑料制品的所有部分都浸泡其中，在通风柜中37℃或室温下处理过夜。③将DEPC-H20小心倒入废液瓶中，将装有DEPC-H20处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。④灭菌塑料制品在合适的温度(80-90℃)烘烤干燥。置洁净处备用。
(3)玻璃和金属物品：150℃烘烤4小时以上。
3、非洲菊总RNA提取
总RNA提取参照“非洲菊不同组织总RNA提取”(张伟等.西南农业学报，2006，19(4)：705-708)的方法。步骤如下：
(1)、称取0.1g样品，在液氮条件下研成灰白色粉末后，迅速转入到已加入500μL异硫氰酸胍裂解液的1.5mL离心管中。
(2)、充分混匀后，4℃，10000r/min，高速离心5min。
(3)、加入400μL饱和酚、100μL氯仿和100μ L2MNaAc(pH4.8)，充分混匀。
(4)、4℃，10000r/min，高速离心10min。
(5)、取上清，转入1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，-20℃冰浴30min以上。
(6)、4℃，10000r/min，高速离心5min。
(7)、弃上清，向沉淀中加入500μL异硫氰酸胍裂解液溶解，4℃，10000r/min，离心10min。
(8)、取上清，加入等体积异丙醇，在-20℃冰浴30min以上，4℃，10000r/min，离心5min。
(9)、弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥后加入适量灭菌DEPC水溶解，-20℃保存。
4、总RNA纯度鉴定
(1)、保存的总RNA样品5μL，用DEPC-H20稀释100倍，紫外分光光度计测其OD260、OD280的值。OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，表明RNA纯度符合实验要求；
(2)、用RNA浓度计算公式：RNA(μg/μL)＝OD260值×40×稀释倍数÷1000，求出RNA浓度。
5、甲醛变性琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性
(1)、将甲醛贮存液、琼脂糖水溶液(1％).5×甲醛凝胶电泳缓冲液按1:3.5:1.1比例混合，制备凝胶；
(2)、甲醛-甲酰胺凝胶变性电泳样品的制备：
总RNA溶液 2μL
5×甲醛凝胶电泳缓冲液 2μL
甲醛 3.5μL
甲酰胺 10μL
混匀后65℃温浴15min，冰浴1min；
(3)、上样，50V预电泳5min，80V电泳30min。在紫外灯下观察，可见25S，18S，5S三条带，且25S:18S(亮度比)＝2:1时，表明RNA完整，在凝胶成相系统中成相，结果见图4至图6。
6、mRNA纯化(按上海华舜生物工程有限公司提供的方法操作)
(1)、用自备的DEPC处理的水将总RNA的浓度调整至小于/等于500ug/mL，再加入0.1体积的5M Nacl，混合后，65℃加热5min，立即置于冰上。
(2)、来回颠倒Oligo(dT)Cellulose suspension数次以悬浮。使用切去头部的Tip移取适量Oligo(dT)cellulose suspension至RNA样品中，来回颠倒以混匀，室温静止10min，其间再混匀2次。
(3)、4000g室温离心2min，小心将上清液移至另一干净的离心管中，以备用。
(4)、在沉淀中按上表加入Binding Buffer，温和地悬浮Oligo(dT)cellulose，4000g室温离心2min，小心弃上清。
(5)、再重复洗涤两次。
(6)、在沉淀中加入0.5ml Binding Buffer，温和地悬Oligo(dT)cellulose，
全部移入过滤柱放入同一收集管中。
(7)、在过滤柱中加入0.3ml Binding Buffer，移液器小心吹打悬浮Oligo(dT)cellulose，4000g室温离心30s，将过滤柱放入一个干净的1.5ml离心管中。
(8)、在过滤柱中按上表加水，用移液器小心吹打Oligo(dT)cellulose，4000g
30s。再用相同体积的水同样洗脱一次。1.5ml离心管中即为Mrna溶液。将mRAN溶液混匀后，10000g离心1min，小心将上清液移至另外一个1.5ml离心管中。
(9)、取适量mRNA，稀释后分光光度仪测定OD260，及OD260/OD280，以计算mRNA的含量及纯度。
7、mRNA反转录Cy5-dUTP标记第一链cDNA(总体系40μL)
(1)、在一干净的离心管中加入：
mRNA溶液 20.6μL
oligo(dT) 2.0μL
随机引物 1.0μL
(2)、70℃温浴5min，立即冰浴5min；
(3)、按顺序加入：
5×reaction buffer 8.0μL
25mM 4dNTP mix 1.6μL
Cy5-dUTP 4.0μL(0.2nmol)
RNasin Inhibitor 0.8μL(20units)
AMV Reverse Transcriptase 2.0μL(200units)
(4)、混匀后于42℃温浴2小时；
(5)、70℃加热15min，冰浴5min；
(6)、加入100μL冰浴乙醇，小心混匀；
(7)、4℃，12000g高速离心15min；
(8)、去上清，适当干燥后加入10μL杂交液(37℃预热)，充分溶解，-20℃保存备用。电泳结果见图7。
8、第一链标记cDNA与芯片杂交、洗脱及检测
(1)、用0.2％SDS浸洗芯片，拿出后自然干燥；
(2)、在芯片上加入10μL杂交液，于42℃加热2小时，进行预杂交；
(3)、取-20℃保存备用的已经加入杂交液的第一链标记cDNA于96℃变性2min，立即冰上制冷；
(4)、将上述溶液滴在芯片上，盖上盖玻片，使溶液分布均匀，放入杂交盒，滴上3×SSC溶液，避免在杂交过程中杂交液干掉；
(5)、42℃杂交过夜，尽可能地使标记的DNA与芯片探针进行饱和杂交，有利于杂交信号的读取；
(6)、取出芯片，用清洗液A、B、C各洗两次，每次0.5-2min，干燥芯片；
9、扫描结果图
杂交完毕后，使用ScanArray3000进行扫描，芯片杂交结果如图8-图16所示。
10、杂交数据分析比较结果
用Gene Pix软件对杂交后所获得的芯片数据进行处理，分析比较得结果如表4、5所示。
实施例3 应用本发明的基因芯片检测不同肥料条件下非洲菊花序在相同花序发育时期的基因表达
实验方法同前所述。
将不同肥料条件下种植的非洲菊花序RNA提取出来，用Cy5进行反转录标记，与芯片杂交，然后使用ScanArray3000进行扫描，芯片杂交结果如图8至图16所示。用Gene Pix软件对杂交后所获得的芯片数据进行处理，分析比较得出基因表达结果(详见表4和表5)。
表4 非洲菊不同花序发育时期花序基因表达比较
注：A值表示信号值，B值表示背景值
表5 不同肥料处理对非洲菊花序基因表达的影响
注：A值表示信号值，B值表示背景值
本发明基因芯片应用的分析
1、总RNA提取
一种好的RNA提取方法要求RNA没有降解，同时，还应有较高的产量，特别是mRNA不能在提取过程中丢失，这是进行基因操作之必须。每一种植物及植物自身的不同部位都有其各自的特点，这些特点反应在自身的结构和组成上，如有的组织木质化程度高，有的细胞壁较厚，有的含某类物质多，有的易于降解等，因此很难用一种方法来适应所有的植物组织。所以，实验人员不能用一套固定的操作去提取不同物种、不同组织的RNA，而应该在谙熟RNA提取基本原理及要点的情况下，根据实验要求对实验方法进行灵活地改进与组合。每一套方法都有自身的优缺点，只要掌握了它们的要点与基本原理，就可以对其进行有效地改进，适应各种实验要求。本研究对非洲菊不同组织的总RNA提取方法进行了对比优化(张伟，曾黎琼，李援亚，等.非洲菊不同组织总RNA提取[J].西南农业学报，2006，19(4)：705-708)，最终采用改良的异硫氰酸胍法。同时在实验中应非常注意做到以下几点：(1)尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。操作过程中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内和污染用具。尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具的RNase传递到RNase-free处，扩大污染。(2)尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips，tube：等，以防交叉污染。(3)配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂并专用。(4)提取过程要迅速，尽量减少操作步骤。
2、总RNA反转录标记第一链cDNA及芯片杂交
本实验中，总RNA反转录出Cy5-dUTP标记的第一链cDNA是至关重要的一步。cDNA是与芯片上探针杂交结合的直接样品，如何简单高效地获取标记的cDNA，涉及到整个实验结果的好坏，同时杂交条件对实验结果也有很大的影响。参照前人的工作，并经过多次反转录、杂交预实验，得出如下一些结论：(1)本实验进行的反转录的直接模板是mRNA，若实验中直接采用总RNA做模板进行反转录，由于总RNA中还含有一定量的蛋白质和其它杂质，这些都对后面的芯片杂交和数据读取有很大的影响，因此对mRNA进行纯化是实验取得成功的因素之一。(2)在预实验中采用20μL和40μL的反转录体系进行对比，发现20μL体系杂交后芯片信号值较低，不利于实验结果的分析，而40μL体系杂交后能得到较为满意的实验结果。(3)操作过程中尽可能地避光，以防Cy5-dUTP分解。(4)反转录产物的质量对后面的杂交有很大的影响，我们在反转录过程中利用加入过量的样品mRNA溶液代替灭菌DEPC水，结果发现在这样处理有利于防止RNA在反转录过程中的降解，有效增加反转录产物的得率。(5)在标记反转录反应结束后，要在70℃下温浴15min，以灭活反转录酶，避免其在后续实验中对结果产生不良的影响。(6)在杂交之前对芯片进行2小时的预杂交，这样能够尽可能地封闭芯片上的背景信号。(7)杂交进行12小时，尽可能地与芯片探针进行饱和杂交，有利于杂交信号的读取。
3、非洲菊花序发育基因的表达
(1)同一肥料处理的非洲菊不同花序发育时期的基因表达
从检测结果可以看出，非洲菊MADS-box基因AJ009726、AJ400623、AJ784157在整个花序发育时期均有很强的表达，非洲菊MADS-box基因AJ009723和拟南芥MADS-box基因NM118013在中后期表达较强，凸显了MADS-box基因时空表达和功能上的复杂多样性及保守性。在非洲菊中AJ009726、AJ400623、AJ784157基因起着一种自始至终的、保守的管家基因的作用，保障着非洲菊生长发育的基本需要，而AJ009723基因则主要参与调控花序的中后期生长发育。基因NM118013是拟南芥MADS-box基因家族中的AG基因，它属于C类基因，控制着雄蕊和雌蕊的发育。由于非洲菊是头状花序，其外围为盘状花中间为管状花，而其雄蕊和雌蕊主要是着生于中间的管状花中。在非洲菊花序发育的中后期，中间管状花雄蕊和雌蕊开始发育直至花序完全盛开，研究表明在这一发育阶段，NM118013的同源基因对非洲菊雄蕊和雌蕊的发育起调控作用，在非洲菊花序发育的中后期表达较强。
20个非洲菊ESTs序列中AJ750404、AJ758671、AJ762815在整个花序发育时期均有很强的表达，AJ750012在中后期表达较强，AJ761183则基本在后期有很强的表达。这预示AJ750404、AJ758671、AJ762815三个基因的表达参与保证非洲菊花序生长发育的基本需要，AJ750012和AJ761183基因的表达对雄蕊和雌蕊的发育有一定的影响。
有研究表明，NAC基因在雄蕊和花瓣的细胞分裂及细胞扩增的转换中起作用。我们在实验中成功检测到拟南芥NAC基因NM100054(ATAF1)在整个花序发育时期均有很强的表达，这说明，在非洲菊中，该基因的同源基因起着相似的作用。
LEAFY基因参与花分生组织属性的决定，还参与花分生组织的进一步发育，因此，LEAFY基因在成花中的作用不局限于调控开花时间和花转变，而是在花序和花发育的各个阶段中都起着作用。然而，尽管LEAFY同源基因所编码的蛋白序列很保守，但在进化过程中，由于一些结构上的改变，导致其功能作用及表达调控上发生了变化，从而使LEAFY同源基因在不同植物中的表达效果有很大差异。可能正是这一点是我们在实验中没有检测到非洲菊的LEAFY同源基因。
(2)、不同肥料处理的非洲菊花序材料相同发育时期的基因表达
检测结果显示，对于不同肥料处理的非洲菊，其花序发育的基因表达差异主要体现在非洲菊ESTs序列上。如AJ554702在低肥条件下(即处理1)表达的很弱，而在中肥(即处理2)和高肥条件下(即处理3)其在花序发育中期表达有了明显增强；AJ750012在低肥条件下表达的很弱，在中高肥条件下其在花序发育早期(即P1期)就开始有了明显表达；AJ755043在低肥条件下表达的很弱，随着肥料浓度的增加，其表达从中期(即P2期)开始逐渐推后；AJ758691的表达在低肥条件下很弱，肥料浓度越高，其表达强度越强；AJ761183在P1期的表达随着肥料浓度的提高逐渐提高，而AJ762965和NM124774则与之相反；在低肥条件下AJ763012主要在早期表达，在中高肥条件下主要在中后期(即P2、P3期)表达较强；AJ763052在中低肥料条件下表达较弱，而在高肥条件下其在中后期有很强的表达。可见，在不同肥料中差异表达的ESTs基因AJ554702、AJ755043、AJ763052、AJ758691、AJ761183、AJ763012是非洲菊适应不同肥料生长发育的一些调控基因，而MADS-box、NAC和LEAFY同源基因的表达不受或很少受实验中肥料条件的诱导。
RT-PCR验证
我们选取有差异表达的基因NM118013、AJ009726和AJ554702分别进行了RT-PCR试验，步骤如下：在反转录反应体系中依次加入：RNA样品5.0μl，Radome引物2.0μl，RNasin0.5μl，65℃温浴15min，立即冰浴5min；依次加入：RNasin0.5μl，10mMdNTP1.0μl，5×RT缓冲液4.0μl，25mM MgCl24.0μl，AMV逆转录酶3.0μl，37℃温浴90min，94℃温浴10min。PCR反应体系为：ddH2O 34μl，10×PCR缓冲液5.0μl，25mM MgCl22.0μl，10mMdNTP1.0μl，10pmol/μl上下游引物2.5μl×2，Taq酶0.5μl，cDNA模板2.5μl，轻质石蜡油50μl。反应程序为94℃变性45s，55℃复性40s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，-20℃保存。
RT-PCR试验的电泳结果如图17至图19所示，从图中可以看出，在非洲菊花序不同的发育时期，基因NM118013在P3和P5期的表达很强，而在P1期只有比较微弱的表达；基因AJ009726在P1、P3、P5三个时期都有比较强的表达，但其在P5期的表达比P1和P3期的表达要略为减弱；在中高肥料的中期扩增到了基因AJ554702的相应基因片段。这些RT-PCR扩增结果与利用基因芯片杂交的分析结果相吻合，说明采用制备的基因芯片检测不同肥料条件下生长的非洲菊花序发育相关基因的表达谱是可行的。
序列表
<110>云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
<110>检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片及其应用
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Claims (9)
1、一种检测非洲菊花序发育基因表达的基因芯片，其特征在于：在固相载体表面固定有探针和阴性对照、阳性对照，其探针具有序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；其阴性对照的阴性标记探针为人β-actin基因；其阳性对照的阳性标记探针中A为AF456789，B为AJ236200。
2、权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的固相载体选自载玻片。
3、权利要求1或权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：所述的基因芯片的每条探针纵向重复两点，每点的探针的用量为0.048μg，点直径0.2mm，点间距0.8mm。
4、权利要求1或权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：探针排布成11×10的矩阵。
5、权利要求1或权利要求2所述的基因芯片的应用，其特征在于：检测非洲菊在不同花序发育时期花序发育基因表达。
6、权利要求5所述的基因芯片的应用，其特征在于：所述的不同花序发育时期分别为P1期花序：花序直径<1.0cm，舌状花与中间盘状花等高；P3期花序：花序直径2.0～3.0cm，舌状花长于苞片0.2～0.8cm，花尖部开始着色；P5期花序：花序直径7.0～9.0cm，花序完全开放。
7、权利要求1或权利要求2所述的基因芯片的应用，其特征在于：检测不同肥料处理的非洲菊花序材料在相同花序发育时期的基因表达。
8、权利要求7所述的基因芯片的应用，其特征在于：所述的不同肥料处理是用配比为N：K：P为15：15：15的磷酸钾复合肥，在苗期处理分别为每株非洲菊0克、每株非洲菊0.5克、每株非洲菊1.0克；在花期的处理分别为每株非洲菊0.5克、每株非洲菊1.0克、每株非洲菊1.5克。
9、权利要求5或权利要求7所述的基因芯片的应用，其特征在于：其杂交条件为在芯片上加入10μL杂交液，于42℃加热2小时，进行预杂交；再于42℃杂交12小时。
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