CN101428069B - 一种桑叶多酚的制备方法及其微胶囊和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑叶多酚的制备方法及其微胶囊和应用，本发明桑叶多酚的制备过程为集成超声-微波协同萃取、超滤、大孔吸附树脂纯化等多项提取分离纯化工艺，获得高纯度桑叶多酚，采用微胶囊技术制备得桑叶多酚微胶囊，同时使其应用于具有抗氧化和护肝功效作用的功能食品。本发明方法具有提取时间短、温度低、提取率高等优点，该方法制备的桑叶多酚纯度高，且可应用于具有抗氧化和护肝功能食品方面。

Description

一种桑叶多酚的制备方法及其微胶囊和应用

技术领域

本发明涉及一种桑叶多酚的制备方法，本发明还涉及以该方法制成的桑叶多酚为原料制备的微胶囊，以及该微胶囊在制备具有抗氧化和护肝功能食品方面的应用。

背景技术

桑树属于桑科(Moraceae)，桑属(Morus L)。桑树自然分布范围广，亚洲、欧洲、大洋洲、美洲和非洲都有桑树生长，其中以亚洲最多。我国是世界蚕丝业的发源地，栽桑养蚕已有4600多年的历史，同时也是桑树的重要起源中心之一，因此我国桑树资源极为丰富，据《中国桑树品种志》载，目前我国有15个桑种及其4个变种，是世界上桑种最多的国家。

研究发现，桑叶中的主要多酚类物质包括绿原酸、芦丁、儿茶素、丁香酸、龙胆酸、表儿茶素、4-甲基邻苯二酚、愈创木酚、槲皮素、山奈素等，动物实验结果表明摄入多酚类化合物如矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)可以降低大鼠血清脂质过氧化产物含量，增强血清对脂质过氧化反应的抵抗性。除上述直接的抗氧化作用外，多酚类化合物还改变了许多氧化应激有关的病理生理过程。Bendia等发现C3G可以调节肝星形细胞增生和I型胶原蛋白的合成，对预防肝脏慢性纤维化有一定作用。Tsuda等观察到C3G的抗氧化作用可以减少肝脏缺血-再灌注后白细胞趋化因子的生成，从而减轻了肝脏的损伤程度。同样将从黑豆皮中提取的花色苷喂给大鼠后，可以减轻缺血-再灌注对心脏的损伤。

桑叶多酚的抗氧化活性与其结构有关，如桑叶多酚的重要组成部分的一类化合物一桑黄酮，其基本结构是由两个苯环(A-与B-环)通过中央三碳链(C-环)相互联结而成的一系列C₆-C₃-C₆化合物，具有2苯基-苯并吡喃阳离子结构。由于共轭效应，桑黄酮氧原子上的不成对电子并不固定于氧原子，而是靠近苯环，从而削弱氢氧键，使羟基上氢原子活性提高，易于脱去而成为氢供体。桑黄酮化合物清除自由基和抗氧化的作用机理在于它阻止了自由基在体内产生的3个阶段：即与O₂ ^-。反应阻止自由基引发；与金属离子螯合阻止OH·生成；与脂质过氧基(ROO·)反应阻止脂质过氧化过程。桑黄酮化合物的抗氧化、清除自由基的性质，是其具有某些生理活性的基础。

从桑叶中提取桑叶多酚目前采用的方法主要有溶剂萃取法、重金属盐沉淀法、超临界流体萃取法、超声法、微波法和树脂吸附法等，传统提取工艺不论是使用水或有机溶剂，提取时间都较长，在温度较高情况下桑叶多酚还易发生氧化，造成品质下降，得率降低；溶剂萃取法需用氯仿等有机溶剂脱除色素和咖啡因，沉淀法需采用重金属离子沉淀滤液中的多酚类化合物，这两种方法易导致植物多酚产品中有机溶剂或重金属残留，而且桑叶多酚得率不高，单独的超声法、微波法和树脂吸附法等也存在桑叶多酚的得率不高的问题。

桑叶多酚粉末的稳定性较差，在潮湿、阳光、高温等条件下极易发生氧化、聚合、缩合等反应，使其分子结构中有生理活性的酚羟基变成醌，在模拟肠液和胃液经过肠胃消化，结构会遭到破坏，影响了其保健效果。另外，由于桑叶多酚自身存在的异味，同样影响了其进一步的应用。因此，寻找避免多酚类化合物等自动氧化的方法以期提高其活性一直是医学界和食品营养界关注的课题。此外，还存在外观品质方面发生诸多不良变化，桑叶多酚中的儿茶素等物质在非保护状态下生物利用率不高等问题。

微胶囊技术(Microencapsul-ation technology)，是将固、液、气态物质包埋到微小、半透性或封闭的胶囊内，使内容物在特定的条件下以可控的速度释放的技术。这一微小封闭的胶囊即微胶囊.其大小通常在1～1000μm之间。微胶囊的结构可分为芯材和壁材，所谓芯材即被包埋的物质，所谓壁材即用于包埋的物质。无论物质是具有亲水性还是具有亲油性.大多数气体、液体和同体均可以被包囊。微胶囊化的主要目的包括可控制释放，极大提高有效成分的生物利用度；改变药物的物理性质，增加药物的稳定性；避免首过效应，减少毒副作用；改变药物的性状，减少复方制剂中药物之间的配伍禁忌；掩盖不良异味与刺激性；药物的靶向性等。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种桑叶多酚的制备方法。

本发明的第二个目的在于提供以桑叶多酚为原料制成的微胶囊。

本发明的目的还在于提供该桑叶多酚微胶囊在制备具有抗氧化和护肝作用的功能食品中的应用。

本发明的技术方案以桑叶多酚含量为跟踪目标，集成超声-微波协同萃取、超滤、大孔吸附树脂纯化等多项提取分离纯化工艺，获得高纯度桑叶多酚，采用微胶囊技术制备得桑叶多酚微胶囊，同时使其应用于具有抗氧化和护肝功效作用的功能食品。

为实现本发明的第一个目的，本发明提供的桑叶多酚的制备方法，它包括以下步骤：

(1)取桑叶粉末，加入其8～10倍重量的乙醇磷酸溶液，超声-微波协同萃取2～3次，合并提取液，过滤，浓缩至原体积1/10～2/5的浓缩液，得桑叶多酚粗提液；

(2)取桑叶多酚粗提液经截留分子量为5万和8万Da的膜分离，得截留分子量为5～8万Da之间的桑叶多酚溶液；

(3)取桑叶多酚溶液，进行大孔吸附树脂柱层析得到洗脱液，将洗脱液在45～50℃浓缩至原体积的1/4～1/2后，冷冻干燥后得桑叶多酚粉末。

在上述桑叶多酚的制备方法中：

步骤(1)中乙醇磷酸溶液的浓度为60～80％。

步骤(1)中超声-微波协同萃取的pH为3～4，温度为45～55℃。

步骤(1)中超声波频率30～40kHz，微波功率为50～100W。

步骤(3)中的大孔吸附树脂柱层析包括以下步骤：a.吸附调节桑叶多酚溶液pH 2.0～4.0，浓度为3.0～5.0mg/mL，流速为3.5～5.5柱体积/h，体积为5.0～7.0柱体积，过柱；b.洗脱选择浓度为70～80％的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱速率为2～3柱体积/h，洗脱液的体积为3～4柱体积，收集洗脱液。

本发明提供的由上述方法制备的桑叶多酚为原料制成的微胶囊，它包括芯材，壁材和乳化剂，所述芯材为桑叶多酚，壁材经预处理后，加入桑叶多酚芯材，同时加入占芯材和壁材总重量3～5％的乳化剂进行乳化，调节总固形物的重量含量为5～8％，混匀，干燥后即得桑叶多酚微胶囊。

在上述微胶囊的制备方法中：

步骤(4)中所述芯材和壁材的重量份比为1.5～3∶1。

步骤(4)中所述壁材为羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙基纤维素、麦芽糊精、明胶中的一种或几种组成的复合壁材。

本发明所述壁材均为生物可降解高分子材料，是重要的壁材填充剂和基质形成剂，具有溶胶及凝胶的可逆转化、成膜性能好等特点。

步骤(4)中所述乳化剂为大豆卵磷脂、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇中的一种。

本发明所述乳化剂可分散在分散质的表面时，形成薄膜或双电层，可使分散相带有电荷，能阻止分散相的小液滴互相凝结，使形成的乳浊液比较稳定。

本发明提供的桑叶多酚的微胶囊，可与一种或多种食品学上所能接受的载体，制备成胶囊、片剂、冲剂或饮料等剂型。

本发明以桑叶多酚微胶囊粉为主要原料，与桑椹花青素提取物、黑米花色苷提取物或黑大豆花色苷提取物中的一种或几种混合配制成具有抗氧化作用的胶囊产品，各组分的重量含量为桑叶多酚微胶囊粉40～60％，桑椹花青素提取物20～30％，黑米花色苷提取物10～20％，黑大豆花色苷提取物10～20％。

本发明还能以桑叶多酚微胶囊粉为主要原料，与β-环糊精、麦芽糊精、蔗糖或葡萄糖中的一种或几种混合均匀后经高效制粒机制粒及干燥后获得具有护肝作用的桑叶多酚护肝颗粒产品，各组分的重量含量为桑叶多酚微胶囊粉20～40％，β-环糊精0～2％，麦芽糊精20～30％，蔗糖20～30％，葡萄糖20～30％。

药学试验表明，本发明提供的桑叶多酚微胶囊，可研制成对抗氧化和护肝有保健作用的功能食品，如复合多酚胶囊和桑叶多酚颗粒。

本发明提供的桑叶多酚微胶囊的制备方法，具有以下优点：

(1)采用超声-微波协同低温萃取技术提取桑叶多酚克服了传统方法的缺点，可在低温短时间内有效浸提桑叶多酚，具有提取时间短、温度低、提取率高等优点。

(2)通过大孔吸附树脂对桑叶多酚的富集和纯化，桑叶多酚树脂吸附前桑叶多酚纯度为15.33％，树脂吸附后纯度为95.21％。

(3)通过桑叶多酚微胶囊化，解决了桑叶多酚粉末的稳定性较差的问题，同时还解决了桑叶多酚自身存在的异味和桑叶多酚中的儿茶素等物质在非保护状态下生物利用率不高问题。

(4)本发明桑叶多酚微胶囊与其它载体合用，可制备成具有抗氧化和护肝有保健作用的功能食品，附加值高，为桑叶的深加工提供了方向，有重大的经济效益。

附图说明

图1是不同组别小鼠体重变化图；

图2是小鼠肝组织形态图；

图2a是小鼠肝组织正常对照组肝组织形态图；

图2b是小鼠肝组织模型对照组肝组织形态图；

图2c是小鼠肝组织低剂量组肝组织形态图；

图2d是小鼠肝组织中剂量组肝组织形态图；

图2e是小鼠肝组织高剂量组肝组织形态图。

具体实施方式

以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例，所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。

(一)桑叶多酚的制备方法

实施例1

(1)取桑叶粉末，加入其8倍重量的体积浓度为60％乙醇磷酸溶液，调节pH为3，温度为45℃，超声-微波协同萃取2次，调节超声波频率30kHz，微波功率为50W，合并提取液，过滤，浓缩至原体积1/10的浓缩液，得桑叶多酚粗提液。

(2)取桑叶多酚粗提液经截留分子量为5万和8万Da的膜分离，得截留分子量为5～8万Da之间的桑叶多酚溶液。

(3)取桑叶多酚溶液，进行大孔吸附树脂柱层析，柱层析包括以下步骤：a.吸附调节桑叶多酚溶液pH 2.0，浓度为3.0mg/mL，流速为3.5柱体积/h，体积为5.0柱体积，过柱；b.洗脱选择浓度为70％的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱速率为2.0柱体积/h，洗脱液的体积为3.0柱体积，收集洗脱液，将洗脱液在45℃浓缩至原体积的1/4后，冷冻干燥后得桑叶多酚粉末。

实施例2

(1)取桑叶粉末，加入其9倍重量的体积浓度为70％乙醇磷酸溶液，调节pH为3.5，温度为50℃，超声-微波协同萃取3次，调节超声波频率35kHz，微波功率为70W，合并提取液，过滤，浓缩至原体积1/4的浓缩液，得桑叶多酚粗提液。

(2)取桑叶多酚粗提液经截留分子量为5万和8万Da的膜分离，得截留分子量为5～8万Da之间的桑叶多酚溶液。

(3)取桑叶多酚溶液，进行大孔吸附树脂柱层析，柱层析包括以下步骤：a.吸附调节桑叶多酚溶液pH 3.0，浓度为4.0mg/mL，流速为4.0柱体积/h，体积为6.0柱体积，过柱；b.洗脱选择浓度为75％的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱速率为2.5柱体积/h，洗脱液的体积为3.5柱体积，收集洗脱液，将洗脱液在48℃浓缩至原体积的2/5后，冷冻干燥后得桑叶多酚粉末。

实施例3

(1)取桑叶粉末，加入其10倍重量的体积浓度为80％乙醇磷酸溶液，调节pH为4，温度为55℃，超声-微波协同萃取3次，调节超声波频率40kHz，微波功率为100W，合并提取液，过滤，浓缩至原体积2/5的浓缩液，得桑叶多酚粗提液。

(2)取桑叶多酚粗提液经截留分子量为5万和8万Da的膜分离，得截留分子量为5～8万Da之间的桑叶多酚溶液。

(3)取桑叶多酚溶液，进行大孔吸附树脂柱层析，柱层析包括以下步骤：a.吸附调节桑叶多酚溶液pH 4.0，浓度为5.0mg/mL，流速为5.5柱体积/h，体积为7.0柱体积，过柱；b.洗脱选择浓度为80％的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱速率为3.0柱体积/h，洗脱液的体积为4.0柱体积，收集洗脱液，将洗脱液在50℃浓缩至原体积的1/2后，冷冻干燥后得桑叶多酚粉末。

(二)以上述方法制成的桑叶多酚为原料制备的微胶囊

实施例4

将羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)溶于体积浓度为80％的乙醇溶液中，高速分散器分散，混合均匀后得微胶囊壁材，按桑叶多酚和HPMCP的重量份比1.5∶1加入桑叶多酚，并加入占芯壁材总重量3％的十二烷基硫酸钠，调节总固形物的重量含量为5％，用高速分散器持续处理30min，混匀，将所得溶液进行喷雾干燥，可得到桑叶多酚微胶囊产品。

实施例5

取重量份比为1∶1的明胶和麦芽糊精溶于70℃热水中，混均后得明胶和麦芽糊精复合壁材，按桑叶多酚∶明胶和麦芽糊精复合壁材的重量份比2∶1加入桑叶多酚，并加入占芯壁材总重量4％的大豆卵磷脂，调节总固形物的重量含量为6％，调节高速分散器的转速为10000r/min，持续处理1～2min，高压均质两次后进行喷雾干燥，即得到桑叶多酚微胶囊产品。

实施例6

将乙基纤维素、聚乙烯醇加入到有机溶剂环己烷中，用玻棒搅拌，同时将聚乙烯醇、乙基纤维素和环己烷组成的混合体系进行水浴加热至70～80℃，使乙基纤维素和聚乙烯醇在环己烷中完全溶解，并加入芯材桑叶多酚，满足芯材和壁材的重量份比为3∶1，同时满足聚乙烯醇占芯壁材总重量的5％，调节总固形物的重量含量为8％，继续搅拌15min，使桑叶多酚微细颗粒均匀分散于乙基纤维素、聚乙烯醇的环己烷溶液中，然后缓慢降温，使乙基纤维素溶解度下降而以黄酮物质微细颗粒为核凝聚析出，形成桑叶多酚微胶囊，分离微胶囊，水洗后真空干燥。

实施例7

取桑叶多酚微胶囊粉与桑葚花青素提取物，按2∶1重量份的配比，混合配制成胶囊，体重50～70kg的成人每日参考用量3～5g，可达到抗氧化的目的。

实施例8

取桑叶多酚微胶囊粉与黑米花色苷提取物或黑大豆花色苷提取物，按4∶1的重量份配比，混合配制成冲剂，体重50～70kg的成人每日参考用量3～5g，可达到抗氧化的目的。

实施例9

取桑叶多酚微胶囊粉与桑葚花青素提取物和黑米花色苷提取物或黑大豆花色苷提取物，按3∶1∶1的重量含量配比，混合配制成冲剂，体重50～70kg的成人每日参考用量3～5g，可达到抗氧化的目的。

实施例10

取桑叶多酚微胶囊粉、桑椹花青素提取物、黑米花色苷提取物和黑大豆花色苷提取物，各组分按2∶1∶1∶1的重量含量配比混合配制成具有抗氧化作用的胶囊产品，体重50～70kg的成人每日参考用量3～5g，可达到抗氧化的目的。

实施例11

取桑叶多酚微胶囊粉和麦芽糖精或蔗糖或葡萄糖，按1∶1的重量含量配比，混合均匀后经高效制粒机制粒及干燥后得桑叶多酚护肝颗粒产品，体重50～70kg的成人每日参考用量3～5g，可达到护肝的目的。

实施例12

取桑叶多酚微胶囊粉和麦芽糖精或蔗糖或葡萄糖以及β-环糊精，按10∶15∶1的重量含量混合均匀后，经高效制粒机制粒及干燥后得桑叶多酚护肝颗粒产品，体重50～70kg的成人每日参考用量3～5g，可达到护肝的目的。

实施例13

取桑叶多酚微胶囊粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖和β-环糊精，按25∶2∶25∶25∶23的重量含量混合均匀后，经高效制粒机制粒及干燥后获得具有护肝作用的桑叶多酚护肝颗粒产品，体重50～70kg的成人每日参考用量3～5g，可达到护肝的目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

(三)桑叶多酚微胶囊粉的药学试验

桑叶作为传统中药，有许多清肝明目作用的记载，桑叶多酚类化合物具有很强清除自由基的能力，以下通过桑叶多酚微胶囊的动物药效试验来说明其抗氧化和护肝作用。

CCl₄是肝脏毒理中研究较多的亲肝性毒物，对肝脏具有较强的损伤作用，本试验采用CCl₄腹腔注射诱导小鼠急性肝损伤模型。

试验材料：

1、样品：本药效试验的样品桑叶多酚微胶囊由上述方法制备。

2、试剂：超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒，考马斯亮蓝G-250，牛血清白蛋白，四氯化碳(CCl₄)。

3、器材：高速离心机，UV-1700分光光度计，真空冷冻干燥机，漩涡混合器，FJ-200高速分散均质机，电子天平，DM2500光学显微镜。

4、试验动物：NIH级小鼠，雄性，体重18～22g，小鼠50只，每组10只。

试验方法：

1、动物分组：将经SPSS检验无显著差异的小鼠按体重随机分为5组：空白对照组、模型对照组、桑叶多酚低剂量组、桑叶多酚中剂量组和桑叶多酚高剂量组。

2、造模及给药：

适应性喂养一周后，开始灌胃桑叶多酚微胶囊，剂量为：桑叶多酚低剂量组给药量100mg/kg·(bw)；桑叶多酚中剂量组给药量200mg/kg·(bw)；桑叶多酚高剂量组给药量400mg/kg·(bw)；正常对照和模型对照组每次给予等体积的生理盐水，每天经口灌胃1次，连续30天，期间自由摄食饮水，每3天称量一次体重。

各组小鼠给药第30天后，造模。

空白对照组：空白对照组腹腔注射生理盐水0.01ml/g；

模型对照组：腹腔注射0.3％四氯化碳(CCl₄)食用油溶液0.01ml/g；

低剂量组：腹腔注射0.3％四氯化碳(CCl₄)食用油溶液0.01ml/g；

中剂量组：腹腔注射0.3％四氯化碳(CCl₄)食用油溶液0.01ml/g；

高剂量组：腹腔注射0.3％四氯化碳(CCl₄)食用油溶液0.01ml/g。

禁食12小时，摘眼球取血，颈椎脱臼处死动物，解剖分离心、肝、脾、肾等脏器。

数据处理：

数据处理和统计分析采用SPSS 14.0软件包，结果以均数±标准差(x±s)表示，各组间的比较采用最小显著差异法(Least Significant Difference，LSD)。

试验结果：

1、小鼠体重变化

各桑叶多酚剂量组和对照组小鼠整个喂养期间的体重变化如附图1所示，从图1和下表1中可以看出，在喂养过程中，各组小鼠初始体重组间无显著差异(P＞0.05)，试验期间各组体重都有大幅的增长，其中空白对照组和模型对照组体重增长大于各剂量组，对小鼠终体重分析，对照对照组和模型对照组体重与低剂量和中剂量体重存在显著性差异(P＜0.05)，与高剂量组无显著性差异(P＞0.05)。说明灌胃桑叶多酚对小鼠体重有一定的影响，可能是桑叶多酚对小鼠的味觉取食欲有影响，或者桑叶多酚加速了小鼠体内物质代谢。

2、对小鼠脏体比值的影响

解剖小鼠，剥离各脏器，吸干表面污物，称重，脏体比值＝脏器重量(g)/体重(100g)。

表1不同组别的小鼠脏体比

注：a、b、c、d表示模型对照组、各剂量组与空白对照组比较P＜0.05。

试验结果表明：在肝脏/体重比方面，空白对照组与其它各组均有显著性差异，各剂量组与模型组之间无显著差异；其它脏体比各组间均无显著性差异，表明腹腔注射CCl₄主要造成小鼠肝脏损伤。

3、对CCl₄引起的急性肝损伤小鼠血清和肝匀浆中抗氧化能力影响

超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤；丙二醛(MDA)的含量常常反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞受损伤程度；MDA的测定常与SOD的测定相互配合，SOD活性的高低间接反映出机体清除自由基的能力，而MDA的高低又反映了细胞受自由基攻击的程度。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，从而起到抗氧化作用。

SOD活力的测定：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，可用于比色。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，通过比色可以计算亚硝酸盐的减少量，从而推算SOD活力。

小鼠肝匀浆的制备：将小鼠肝脏组织块置于冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，以灭菌生理盐水作为匀浆介质(生理盐水的量为肝组织重量的9倍)，用组织捣碎机研磨制成肝匀浆悬液，然后离心分离上清液即得10％(w/v)肝匀浆。

蛋白质含量的测定：采用Bradford测定法(Bradford，1976)。

表2对CCl₄引起的急性肝损伤小鼠血清SOD、MDA和GSH-PX的影响

(x±s，n＝10)

注：a表示模型对照组与空白对照组比较P＜0.05，c、d表示剂量组与模型组比较P＜0.05。

试验结果表明：

(1)模型对照组与空白对照组相比血清中SOD活力显著下降，MDA含量显著升高，GSH-PX活力无显著变化，表明腹腔注射CCl₄引起小鼠血清抗氧化能力下降；

(2)SOD活力中剂量组和高剂量组比模型组明显升高，达到显著水平(P＜0.05)，低剂量组比模型组也有升高，但差异不显著；

(3)MDA含量高剂量组比模型组明显降低，达到显著水平(P＜0.05)，中剂量组和低计量组比模型组也有降低，但差异不显著；

(4)GSH-PX活力各给药剂量组比模型组均有一定的升高，但没有显著差异(P＞0.05)。

表3对CCl₄引起的急性肝损伤小鼠肝匀浆SOD、MDA和GSH-PX的影响(x±s，n＝10)

注：a表示模型对照组与空白对照组比较P＜0.05，c、d表示剂量组与模型组比较P＜0.05。

试验结果表明：

(1)模型对照组与空白对照组相比肝匀浆中SOD活力显著下降，MDA含量显著升高，GSH-PX活力显著下降，表明腹腔注射CCl₄引起小鼠肝匀浆抗氧化能力下降；

(2)SOD的活力中剂量组和高剂量组比模型组明显升高，达到显著水平(P＜0.05)，低剂量组比模型组也有升高，但差异不显著；

(3)MDA含量高剂量组比模型组明显降低，达到显著水平(P＜0.05)，中剂量组和低计量组比模型组也有降低，但差异不显著；

(4)GSH-PX活力中剂量组比模型组有明显提高，达到显著水平(P＜0.05)，低剂量组和高剂量组比模型组有所提高，但没有显著差异(P＞0.05)。

4、对CCl₄引起的急性肝损伤小鼠血清和肝匀浆中ALT、AST的影响

谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是肝功能检测的重要指标，通过测定ALT和AST可以客观地推测肝脏的损害程度。

采用赖氏法，测定按照试剂盒测定步骤进行，查标准曲线得到相应的活力单位。

表4对CCl₄引起的急性肝损伤小鼠血清和肝匀浆中ALT、AST影响(x±s，n＝10)

注：a*表示模型对照组与空白对照组比较P＜0.01，a表示模型对照组与空白对照组比较P＜0.05，d表示各剂量组与模型组比较P＜0.05。

试验结果表明：

(1)模型对照组与空白对照组相比，血清中ALT和AST活力显著升高，达到极显著水平(P＜0.01)，肝匀浆中ALT和AST活力显著升高，达到显著水平(P＜0.05)，表明腹腔注射CCl₄导致了小鼠肝脏严重损伤。

(2)小鼠血清中ALT和AST活力高剂量组比模型组明显降低，达到显著水平(P＜0.05)，中剂量组比模型组也有所降低，但差异不显著，低剂量反而比模型组有所升高，但没有显著差异；小鼠肝匀浆中ALT活力高剂量组比模型组明显降低，达到显著水平(P＜0.05)，中剂量组和低剂量比模型组也有所降低，但差异不显著，小鼠肝匀浆中各给药剂量组AST活力均比模型组有所降低，但差异不显著。

5、对CCl₄引起的急性肝损伤小鼠肝组织形态的影响

试验动物处死后，立刻取小鼠肝脏左叶同一部位组织，10％福尔马林试剂固定，石蜡包埋，切片，H.E.染色，光镜下观察组织形态及变化。

在光镜下观察各组小鼠肝组织形态及变化见图1，从图中可以看出：

(1)空白对照组(图2a)光镜下肝细胞索排列整齐，肝细胞无水肿、无脂肪变性；

(2)模型组(图2b)小鼠肝细胞有明显的大范围脂肪变性，细胞内形成大量脂滴，胞浆疏松，呈气球样变，并有核固缩现象，局部可见细胞嗜酸性改变和点状坏死灶；

(3)低剂量组(图2c)也有明显的脂肪变性，但相对于模型组范围减小，细胞气球样变程度和范围均较模型组有所减轻；

(4)中剂量组(图2d)肝细胞呈弥散性脂肪变性，肝细胞内有大量小脂滴形成，未见明显气球样变和核固缩；

(5)高剂量组(图2e)仅在中央静脉周围有小范围的脂肪变性，肝细胞水肿，胞浆疏松，未见明显气球样变和脂滴沉积。

综上试验可知：

(1)空白对照组和模型对照组体重与低剂量和中剂量体重存在显著性差异(P＜0.05)，与高剂量组无显著性差异(P＞0.05)；

(2)在肝脏/体重比方面，各剂量组与模型组之间无显著差异，与空白对照组有显著性差异(P＜0.05)；其它脏体比各组间均无显著性差异，表明腹腔注射CCl4主要造成小鼠肝脏损伤；

(3)桑叶多酚高剂量组能显著提高小鼠血清和肝匀浆的SOD活力，显著降低MDA含量；中剂量组能显著提高小鼠血清SOD活力和肝匀浆SOD、GSH-PX活力；低剂量组无显著差异；

(4)桑叶多酚高剂量组能显著降低小鼠血清和肝匀浆的ALT活力和血清的AST活力；中低剂量组无显著差异；

(5)小鼠肝组织形态观察表明：腹腔注射CCl4造成小鼠急性肝损伤，肝细胞受损严重，桑叶多酚各剂量组均能降低小鼠的肝损伤程度，其中高、中剂量作用效果明显。

Claims (8)

1.一种桑叶多酚的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取桑叶粉末，加入其8～10倍重量的乙醇磷酸溶液，超声-微波协同萃取2～3次，合并提取液，过滤，浓缩至原体积1/10～2/5的浓缩液，得桑叶多酚粗提液；

(2)取桑叶多酚粗提液经截留分子量为5万和8万Da的膜分离，得截留分子量为5～8万Da之间的桑叶多酚溶液；

(3)取桑叶多酚溶液，进行大孔吸附树脂柱层析得到洗脱液，将洗脱液在45～50℃浓缩至原体积的1/4～1/2后，冷冻干燥后得桑叶多酚粉末；

步骤(1)中乙醇磷酸溶液的体积浓度为60～80％；步骤(1)中超声-微波协同萃取的pH为3～4，温度为45～55℃。

2.根据权利要求1所述桑叶多酚的制备方法，其特征在于，步骤(1)中超声波频率为30～40kHz，微波功率为50～100W。

3.根据权利要求1所述桑叶多酚的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的大孔吸附树脂柱层析包括以下步骤：a.吸附调节桑叶多酚溶液pH 2.0～4.0，浓度为3.0～5.0mg/mL，流速为3.5～5.5柱体积/h，体积为5.0～7.0柱体积，过柱；b.洗脱选择浓度为70～80％的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱速率为2～3柱体积/h，洗脱液的体积为3～4柱体积，收集洗脱液。

4.一种用权利要求1所述方法制备的桑叶多酚制成的微胶囊，其特征在于，包括芯材，壁材和乳化剂，所述芯材为桑叶多酚，壁材经预处理后，加入桑叶多酚芯材，同时加入占芯材和壁材总重量3～5％的乳化剂进行乳化，调节总固形物的重量含量为5～8％，混匀，干燥后即得桑叶多酚微胶囊。

5.根据权利要求4所述微胶囊，其特征在于，所述芯材和壁材的重量份比为1.5～3∶1。

6.根据权利要求4所述微胶囊，其特征在于，所述壁材为羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙基纤维素、麦芽糊精、明胶中的几种组成的复合壁材。

7.根据权利要求4所述微胶囊，其特征在于，所述乳化剂为大豆卵磷脂、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇中的一种。

8.权利要求4所制备的微胶囊在制备具有抗氧化及护肝作用的功能食品中的应用。

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