CN101423871B - 玉米杂交不亲和基因的分子标记scar/s2055/854及其检测方法 - Google Patents
玉米杂交不亲和基因的分子标记scar/s2055/854及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101423871B CN101423871B CN2008102292579A CN200810229257A CN101423871B CN 101423871 B CN101423871 B CN 101423871B CN 2008102292579 A CN2008102292579 A CN 2008102292579A CN 200810229257 A CN200810229257 A CN 200810229257A CN 101423871 B CN101423871 B CN 101423871B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- scar
- gene
- primer
- mark
- maize
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Abstract
一种玉米杂交不亲和基因的分子标记SCAR/S2055/854，其引物的核酸碱基序列为：正向：5’CAGGTTCCATTGGAACCCTA 3’；反向：5’TCAGACCAATACTCCGGTC 3’；该玉米杂交不亲和基因的分子标记SCAR/S2055/854的检测方法，先进行玉米基因组DNA的提取、RAPD多态性标记分析、PCR扩增、纯化、克隆、测序，将RAPD标记转化为SCAR标记，利用SCAR/S2055/854标记的引物进行PCR反应，通过电泳检测，含Ga基因的个体有854bp的特征带。可用于玉米品种选育，利用其杂交不亲和性，能使玉米品种免受其它玉米花粉的混杂，提高品种的纯度及品质。
Description
技术领域
本发明提供了玉米杂交不亲和基因的分子标记SCAR/S2055/854及其检测方法，属于分子育种领域，用于玉米种质资源的利用及杂交品种的选育。
背景技术
玉米是我国重要的粮食作物，播种面积达2400万公顷。玉米生产中由于外源玉米花粉的污染，导致玉米杂交种或玉米品种的纯度降低，也造成商品玉米的外观品质及理化性能的下降，影响特用玉米生产、玉米精细加工及产业化发展。
为了提高玉米杂交种纯度及玉米品质，需要对玉米进行遗传改良。玉米杂交不亲和性由配子体基因(Gametophyte gene，Ga)控制。携带Ga基因的玉米，其花粉可使其它玉米授精结实，但其它玉米的花粉却不能使它授精结实，能起到防杂保纯、遗传隔离的作用。
杂交不亲和性是一种遗传性状，杂交亲和性与杂交不亲和性的差异是由单基因控制的，为配子体基因控制型(gametophyte gene，Ga)。目前在玉米杂交不亲和性状上的研究比较少，对Ga基因进行分子标记，并进行辅助选择，以及将杂交不亲和性作为玉米杂种优势利用的新途径尚未发现。
发明内容
本发明的目的是要提供一种玉米杂交不亲和基因的分子标记SCAR/S2055/854及其检测方法，用于玉米品种选育，利用其杂交不亲和性，能使玉米品种免受其它玉米花粉的混杂，提高品种的纯度及品质。
首先从种质材料中选育出含有Ga基因的玉米杂交不亲和自交系，并以其为亲本，与甜玉米或糯玉米自交系进行杂交，构建Ga基因的分离群体；对Ga基因进行RAPD或AFLP标记，经过多态性标记片段的克隆和序列分析，设计PCR特异引物，将分子标记转化为SCAR标记。
该玉米杂交不亲和基因的分子标记，其特殊之处在于具有：
SCAR/S2055/854标记，其引物的核酸碱基序列为：
正向：5’CAGGTTCCATTGGAACCCTA 3’
或者具有SCAR/M16P22/303标记，其引物的核酸碱基序列为：
正向：5’GAGTAACACTCAGAATAAGC 3’
反向：5’CATGCAGATTGGCTGCTGCTG 3’
该玉米杂交不亲和基因的分子标记的检测方法，先进行玉米基因组DNA的提取、RAPD和AFLP多态性标记分析、PCR扩增、纯化、克隆、测序，将RAPD标记转化为SCAR标记，利用SCAR/S2055/854标记的引物，其核酸碱基序列为：
正向：5’CAGGTTCCATTGGAACCCTA 3’
反向：5’TCAGACCAATACTCCGGTC 3’
进行PCR反应，通过电泳检测，含Ga基因的个体有854bp的特征带；或者将AFLP标记转化为SCAR标记，利用SCAR/M16P22/303标记的引物，其核酸碱基序列为：
正向：5’GAGTAACACTCAGAATAAGC 3’
反向：5’CATGCAGATTGGCTGCTGCTG 3’
进行PCR反应，通过电泳检测，含Ga基因的个体有303bp的特征带。
首先以携带Ga基因的玉米杂交不亲和自交系为亲本，与甜玉米或糯玉米自交系进行杂交，构建Ga基因的分离群体BC1和F2代；利用混合花粉鉴定法对Ga基因的遗传规律进行研究，结果表明Ga基因为单显性基因，在F2代和BC1代中Ga∶ga的分离比率分别为3∶1和1∶1；提取Ga基因分离群体中的单株及亲本DNA，构建样品集团；
进行RAPD标记分析；从RAPD随机引物中筛选到具有多态性的引物，其序列为5’CCAGACTCCA 3’，检测到的多态性可稳定地重复，差异片段大小为880bp；对RAPD标记片段回收、纯化、克隆和测序；根据测序结果，利用引物设计软件人工设计、合成PCR特异引物，在分离群体上进行单株分析和验证，将RAPD标记转化为SCAR标记；特异引物序列(5’→3’)：
正向：CAGGTTCCATTGGAACCCTA
反向：TCAGACCAATACTCCGGTC
标记为：SCAR/S2055/854
利用上述引物在Ga个体和杂合体中可扩增出854bp特征带；标记SCAR/S2055/854
为显性标记，检测结果表明该标记与Ga基因紧密连锁。
或者进行AFLP标记分析，筛选具有多态性的AFLP引物，其引物组合为M16P22，检测到的多态性可稳定地重复，差异片段大小为320bp；对AFLP标记片段回收、纯化、克隆和测序；根据测序结果，利用引物设计软件人工设计、合成PCR特异引物，在分离群体上进行单株分析和验证，将AFLP标记转化为SCAR标记；特异引物序列(5’→3’)：
正向：GAGTAACACTCAGAATAAGC
反向：CATGCAGATTGGCTGCTGCTG
标记为：SCAR/M16P22/303
利用上述引物在Ga个体和杂合体中可扩增出303bp特征带；标记SCAR/M16P22/303为显性标记，检测结果表明该标记与Ga基因紧密连锁。
本发明的优点是：本发明成功地将SCAR/S2055/854和SCAR/M16P22/303标记应用于辅助选择育种，结合混合花粉鉴定法，选育出具有杂交不亲和性的糯玉米和甜玉米自交系，其杂交不亲和性可稳定遗传。利用与Ga基因紧密连锁的SCAR标记，对以杂交不亲和自交系为Ga基因供体转育的甜玉米或糯玉米后代进行PCR检测，结合田间鉴定，进行辅助选择。利用该标记能鉴别出转育的材料是否含有Ga基因，从而有效地指导玉米种质改良，加速品种选育进程。
附图说明
图1是利用SCAR/S2055/854标记在Ga自交系和ga自交系间扩增的DNA片段；
图2是利用SCAR/S2055/854标记在分离群体BC1中检测Ga基因；
图3是利用AFLP标记M16P22在分离群体BC1中检测Ga基因；
图4是利用SCAR/M16P22/303引物在Ga自交系和ga自交系间扩增的Ga基因标记；
图5是利用SCAR/M16P22/303标记在分离群体BC1中检测Ga基因；
图6是利用SCAR/S2055/854标记在后代群体中检测Ga基因；
图7是利用SCAR/M16P22/303标记在后代群体中检测Ga基因。
图中：G-Ga个体，g-ga个体，图2、图4、图6、图7中M-DNA分子量标记为(λDNA/EcoR I+HindIII)，图3中M-DNA分子量标记(100-bpDNA ladder)。
具体实施方式
1、Ga基因分离群体的构建
以Ga自交系为亲本，与甜玉米自交系或糯玉米自交系进行杂交，经过自交和回交构建Ga基因的分离群体F2代和BC1代。
2、基因组DNA的提取
取3～4g玉米幼嫩叶片加液氮研磨成粉末后置移入10mL离心管中，加5mL 65℃预热的2×CTAB溶液，65℃水浴60min；5000rpm离心10min，移上清液至另一离心管中；加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)轻混；5000rpm离心10min，移上清液至另一离心管；加1/100体积的RNase A溶液，置37℃保温25min；加0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA；2mL(76％乙醇+0.2mol/L NaAc)清洗沉淀两次，吹干后溶于适量TE缓冲液中；95℃水浴中15min灭活残留的DNase；保存于-20℃冰箱备用。
3、RAPD标记分析、克隆、测序与SCAR转化
(1)RAPD标记分析
RAPD反应体积为20ul，PCR体系为：1×扩增缓冲液，2.0mmol/LMgCl2，0.15mmol/L dNTPs，1.0U Taq酶，0.5μmol/L 10-mer引物，50ng模板DNA，加ddH2O至终体积20μl。扩增反应在PCR仪上进行，热循环程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，37℃复性1min，72℃延伸1.5min，36个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用含有溴化乙锭(0.5μg/mL)的1.0～1.2％琼脂糖凝胶电泳，分子量Marker为λDNA/EcoRI+HindIII，在1×TAE缓冲液中电泳2.0h左右；凝胶成像系统拍照保存。
(2)RAPD标记、克隆与测序
RAPD标记电泳后，在长波紫外灯下精确切取待回收片段，置于1.5ml的离心管中。用UNIQ-10Column Gel Recovery kit回收。取2μl回收的PCR产物作为模板进行PCR扩增，取10μl PCR产物电泳检测片段大小是否与原片段一致。如果一致，则迅速取其相应保留的PCR产物进行酶连反应。
酶连反应参照pGEM-T Vector试剂盒进行。建立酶连反应体系如表1。把各种试剂小心混匀后，室温放置1小时，然后在4℃连接过夜。
表1PCR克隆的酶连反应体系.
利用CaCl2法和冻融法制备和转化感受态细胞，在LB培养基上(含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal)筛选白色单菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用于PCR扩增和电泳检测扩增片段大小是否与原特异片段大小一致。经检测含完整插入片段的重组质粒DNA用ABI 377进行测序。
(3)RAPD标记的SCAR转化
根据序列人工设计合成PCR引物，进行SCAR标记转化
标记引物 序列(5’→3’)
SCAR/S2055/854 正向：CAGGTTCCATTGGAACCCTA
反向：TCAGACCAATACTCCGGTC
用上述引物进行PCR反应，将RAPD标记转化为SCAR标记。SCAR/S2055/854标记为显性标记，在Ga个体和杂合体中可扩增出854bp的特征带。如图1和图2所示，分别在亲本和分离群体BC1中检测到与Ga基因紧密连锁的标记，从而成功地应用于玉米Ga基因的辅助选择与杂种选育。
4、AFLP标记的扩增、克隆和SCAR转化
(1)总DNA的酶切与连接
取总DNA 300ng，加入3U EcoRI(或PstI)和3U MseI限制性内切酶(反应体积为25μl)，先在37℃水浴5h，后转入65℃水浴45min，完全酶切后加入1U T4DNA连接酶和24μl连接混合液(5pmol EcoRI或PstI接头，50pmol MseI接头，40mmol/L Tris-Cl，10mmol/L MgCl2，10mmol/LDTT，1.0mmol/L ATP)，将混合液置于22℃连接过夜。连接完毕70℃灭活10min，再用ddH2O将其稀释10倍作为PCR扩增的底物。AFLP接头和引物上海生工合成。
EcoR I接头左引物：5′-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3′
接头右引物：3′-CTG ACG CAT GGT TAA-5′；
Mse I接头左引物：5′-GAC GAT GAG TCC TGA G-3′
接头右引物：3′-TA CTC AGG ACT CAT-5′。
Pst I接头左引物：5′-CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA-3′
接头右引物：3′-CA TCT GAC GCA TGT-5′；
对应的预扩增引物E为：5′-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3′；P为：5′-GAC-TGC GTA CAT GCA G-3′；M为：5′-GAT GAG TCC TGA GTAAC-3′。
(2)AFLP分析
预扩增：在25μl PCR反应体系中，含有50ng E(或P)引物，50ng M引物，3μl酶切-连接产物，0.2mmol/L dNTPs，1U Taq酶，1×PCR缓冲液。20个PCR反体循环参数为：94℃(30s)-56℃(30s)-72℃(1min)。取5μl PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶检测，分子量应在50～900bp之间。剩余产物稀释30倍，作为下一步PCR扩增的模板。
选择性扩增：在20μl PCR反应体系中含有3μl预扩增产物，50ng E+3(或P+3，带3个选择性碱基)引物，50ng M+3引物，0.2mmol/L dNTPs，1U Taq酶，1×PCR缓冲液(含2.0mmol/L MgCl2)。第一个循环参数为94℃(30s)-65℃(30s)-72℃(1min)，此后每个循环复性温度下降0.7℃，共计13个循环，然后94℃(30s)-56℃(30s)-72℃(1min)运行23个循环。选择性扩增引物见表2。
表2AFLP选择性扩增引物
E＝5′-GAC TGC GTA CCA ATT C-3′；M＝5′-GAT GAG TCC TGA GTA A-3′；P＝5′-GAC TGC GTA CAT GCA G-3′；
(3)AFLP标记的扩增、克隆与测序
制备6％PAGE凝胶，利用Bio-Rad电泳系统进行电泳。接通电源120W电泳预热30min。在选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.005％二甲苯青FF，0.005％溴酚蓝)，95℃变性3min后立即冰浴冷却，上样4μl，70～90W电泳2h左右，当二甲苯青FF跑过2/3胶板时中止电泳。电泳完毕，进行银染法染色(0.1％AgNO3，0.056％HCHO)，然后用自来水漂洗5min，室温下自然晾干，拍照保存。
在6％变性聚丙烯酰胺凝胶胶板上用刀片轻轻挖下特异扩增片段，转入0.5ml离心管中，加入20μl ddH2O并用一次性无菌枪头捣碎，于95℃保温10min后放于4℃备用，用前稍加离心。取2μl上清液做模板，再扩增的引物及反应条件与AFLP完全相同。PCR完成之后将产物置于72℃保温30min。取20μl PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上检测，用UNIQ-10Column GelRecovery kit回收目标片段。酶连反应参照pGEM-T Vector试剂盒进行目标片段的克隆。建立酶连反应体系如表1。把各种试剂小心混匀后，室温放置1小时，然后在4℃连接过夜。利用CaCl2法和冻融法制备和转化感受态细胞，在LB培养基上(含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal)筛选白色单菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用于PCR扩增和电泳检测扩增片段大小是否与原特异片段大小一致。经检测含完整插入片段的重组质粒DNA用ABI377进行测序。图3中显示AFLP引物M16P22在分离群体BC1中检测到Ga基因的多态性标记，大小为320bp左右。
(4)AFLP标记的SCAR转化
根据序列人工设计合成PCR引物，进行SCAR转化：
标记引物 序列(5’→3’)
SCAR/M16P22/303 正向：GAGTAACACTCAGAATAAGC
反向：CATGCAGATTGGCTGCTGCTG
PCR反应体系如下：1×扩增缓冲液，2.5mmol/L MgCl2，0.25mmol/LdNTPs，1.0U Taq酶，1.0μmol/L特异性引物，30ng模板DNA，加ddH2O至终体积25μl。扩增反应在PCR仪上进行。热循环程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，56℃、54℃各复性1min，72℃延伸2.0min，35个循环；72℃延伸15min；4℃保存。1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，或进行6％PAGE凝胶电泳检测扩增产物。
利用上述引物进行PCR反应，将AFLP标记M16P22转化为SCAR标记。SCAR/M16P22/303为显性标记，在Ga个体和杂合体中可扩增出303bp的特征带。如图4和图5所示，分别在亲本和分离群体BC1中检测到与Ga基因紧密连锁的标记，从而成功地应用于玉米Ga基因的辅助选择与杂种选育。
5、SCAR标记在Ga玉米自交系选育中的应用
本发明成功地将SCAR/S2055/854和SCAR/M16P22/303标记应用于辅助选择育种(如图6、图7)。通过自交和回交转育，结合混合花粉鉴定法，选育出具有杂交不亲和性(Ga基因)的糯玉米和甜玉米自交系，其杂交不亲和性可稳定遗传。
Claims (2)
1.一种玉米杂交不亲和基因的分子标记SCAR/S2055/854，其特征在于，其引物的核酸碱基序列为：
正向：5’CAGGTTCCATTGGAACCCTA 3’
反向：5’TCAGACCAATACTCCGGTC 3’。
2.一种玉米杂交不亲和基因的分子标记SCAR/S2055/854的检测方法，其特征在于玉米基因组DNA的提取、RAPD多态性标记分析、PCR扩增、纯化、克隆、测序，将RAPD标记转化为SCAR标记，利用SCAR/S2055/854标记的引物，其核酸碱基序列为：
正向：5’CAGGTTCCATTGGAACCCTA 3’
反向：5’TCAGACCAATACTCCGGTC 3’
进行PCR反应，通过电泳检测，含Ga基因的个体有854bp的特征带。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008102292579A CN101423871B (zh) | 2008-11-30 | 2008-11-30 | 玉米杂交不亲和基因的分子标记scar/s2055/854及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008102292579A CN101423871B (zh) | 2008-11-30 | 2008-11-30 | 玉米杂交不亲和基因的分子标记scar/s2055/854及其检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101423871A CN101423871A (zh) | 2009-05-06 |
| CN101423871B true CN101423871B (zh) | 2012-02-15 |
Family
ID=40614752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008102292579A Expired - Fee Related CN101423871B (zh) | 2008-11-30 | 2008-11-30 | 玉米杂交不亲和基因的分子标记scar/s2055/854及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101423871B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102505044B (zh) * | 2011-11-10 | 2013-08-07 | 南京农业大学 | 一种糯玉米杂交种遗传纯度的快速鉴定方法 |
| CN103352071B (zh) * | 2013-05-02 | 2015-06-17 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种定位玉米单向异交不亲和基因的新方法 |
| CN108329383B (zh) * | 2018-02-08 | 2020-04-21 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种与玉米杂交不亲和相关的蛋白及其编码基因与应用 |
| CN109349101A (zh) * | 2018-12-19 | 2019-02-19 | 重庆三峡农业科学院 | 一种玉米单向杂交不亲和基因导入系单株基因型判定方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1419407A (zh) * | 2000-03-30 | 2003-05-21 | 威斯康星校友研究基金会 | 玉米草的杂交不亲和性特征及其在玉米中的应用 |
-
2008
- 2008-11-30 CN CN2008102292579A patent/CN101423871B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1419407A (zh) * | 2000-03-30 | 2003-05-21 | 威斯康星校友研究基金会 | 玉米草的杂交不亲和性特征及其在玉米中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 何余堂.PCR步行法克隆油菜自交不亲和基因.《中国油料作物学报》.2004,1-5. * |
| 何余堂.玉米配子体基因研究进展.《玉米科学》.2005, * |
| 何余堂.配子体基因在糯玉米种质改良中的应用.《作物杂志》.2007, * |
| 旦巴.西藏油菜种质资源的RAPD分子标记分析.《作物学报》.2003, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101423871A (zh) | 2009-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Peng et al. | Microsatellite tagging of the stripe-rust resistance gene YrH52 derived from wild emmer wheat, Triticum dicoccoides, and suggestive negative crossover interference on chromosome 1B | |
| Reddy et al. | Genetic analysis of temperature-sensitive male sterilty in rice | |
| CN102154281B (zh) | 与谷子抽穗期基因紧密连锁的分子标记SIsv0010 | |
| CN107988420B (zh) | 玉米雄性核不育基因ms39的分子标记及其应用 | |
| BRPI0911551B1 (pt) | Método para produzir planta de soja resistente a ferrugem asiática da soja (asr) | |
| CN101423871B (zh) | 玉米杂交不亲和基因的分子标记scar/s2055/854及其检测方法 | |
| CN109055598B (zh) | 水稻抗褐飞虱基因bph6共显性分子标记及其应用 | |
| CN107338310A (zh) | 一种检测小麦抗赤霉病基因pft的标记及使用方法 | |
| WO2014154115A1 (zh) | 水稻spt转化事件及其检测方法 | |
| CN105256031A (zh) | 利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物 | |
| CN117344054B (zh) | 一种扩增小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记引物及其应用 | |
| CN110512025A (zh) | 一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| Ke et al. | Identification of AFLP markers linked to one recessive genic male sterility gene in oilseed rape, Brassica napus | |
| CN111593135B (zh) | 一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法 | |
| CN110777218B (zh) | 一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记及其应用 | |
| CN101736084A (zh) | 哲罗鲑微卫星序列与多态性微卫星标记的获取方法和哲罗鲑多态性微卫星标记 | |
| CN108588273B (zh) | 玉米隐性核雄性不育突变基因ms30的功能标记及其应用 | |
| Geng et al. | An integrated genetic map for Brassica napus derived from double haploid and recombinant inbred populations | |
| CN107475418B (zh) | 与谷子分蘖性状紧密连锁的分子标记、引物及应用 | |
| CN112011637B (zh) | 一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| CN104946644A (zh) | 玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记及其应用 | |
| CN112575101B (zh) | 与西葫芦prsv-w病毒病抗性相关的分子标记及其应用 | |
| CN108085404A (zh) | 印度南瓜强雌性状分子标记与鉴定印度南瓜强雌性状的引物对 | |
| CN108998557A (zh) | 玉米隐性核雄性不育突变基因ms7的功能标记及其应用 | |
| WO2015066832A1 (zh) | 与玉米粗缩病抗性相关的主效数量性状位点及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120215 Termination date: 20121130 |