CN101415823A - 修饰酶、生产修饰酶的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及经过修饰的木聚糖酶，其在苛刻的工业环境下，诸如增加的pH值和/或温度下，具有增加的稳定性。

Description

修饰酶、生产修饰酶的方法及其用途

发明领域

[0001]本发明涉及在苛刻的工业环境下，诸如增加的pH值和/或温度下，具有增加的稳定性的修饰酶。

发明背景

[0002]木聚糖酶存在于至少上百种不同生物体内。木聚糖酶是糖基水解酶，其水解β-1，4-连接的吡喃木糖苷链。在Hcnrissat和Bairoch(1993)建立的对糖基水解酶家族基于序列的分类中，多数木聚糖酶出现于家族10和11(第10家族和第11家族)。家族11中成员的共同特征包括高度的基因同源性，大约20kDa的大小，以及双取代催化机制(Tenkanen等，1992；Wakarchuk等，1994)。现在，根据其结构相似性，这些家族被分类成部族(或者异种集团(Clans))(Henrissat和Davies，1995)。家族11中的糖基水解酶，其主要为木聚糖酶，同家族12的酶一起归于部族C(Clan C)中，已知家族12(第12家族)的酶都是纤维素酶。[0003]木聚糖酶常常可被用于重要的应用，例如纸浆漂白、纺织品纤维修饰以及在动物饲料中(如木聚糖酶可以帮助动物消化，Prade，1996)。木聚糖酶在人类的食品生产中也有用处。例如，木聚糖酶改善面包生面团的性质和面包质量。木聚糖酶也可以通过改善包含木聚糖的啤酒的过滤性来辅助酿造过程。也可以用木聚糖酶来降解植物物质，包括处理/利用农业废物和农业产品加工中产生的废物，包括以生物质为原料生产燃料或者其它生物基产品和材料。

[0004]然而，经常性地，这些应用过程中的极端条件，比如高温度和/或高pH值等，致使木聚糖酶不如在常规条件下有效。比如，在纸浆的漂白中，从碱洗阶段输送而来的物料可能具有高温，有时高于80℃；以及高pH值，例如高于10。由于大多数的木聚糖酶都不能在这样的条件下很好地发挥作用，因此必须对纸浆冷却和碱性pH中和之后，通常的木聚糖酶才能发挥作用。考虑到其中某些步骤，因为必须做出改变来适应木聚糖酶，该过程的成本会大大增加。

[0005]在另外的例子中，木聚糖酶在动物饲料应用中也有用处。在这种情况下，木聚糖酶在饲料生产过程中要经受短时间的高温条件(如在95℃或更高温度下，0.5到5分钟)。在这样温度条件下可能发生酶的钝化，当需要在较低温度下比如～37℃下时这些酶变成无用的。[0006]已发现具有改良性质的木聚糖酶。已发现几种热稳定的、嗜碱的和嗜酸的木聚糖酶，并已经从嗜热生物中克隆(Bodie等，1995；Fukunaga等，1998)。然而，常常难于以经济有效的数量进行酶的生产。另一方面，里氏木霉(T.reesei)产生木聚糖酶，其热稳定性不如来自嗜热生物的木聚糖酶。已知里氏木霉(T.reesei)产生不同的木聚糖酶，其中木聚糖酶I和II(分别是Xyn I和Xyn II)已经被很好地表征(Tenkanen等，1992)。Xyn I的大小是19kDa，pI值是5.5，pH值为3到4。Xyn II的大小是20kDa，pI值是0.9，pH值最适值是5.0到5.5(

和Rouvinen，1995)。这些木聚糖酶在许多应用中显示出有利的pH曲线、特异性和比活性，并且可以在大规模生产过程中经济地生产。

[0007]为制得具有有利性质的木聚糖酶已经作出了许多努力。例如，有人尝试通过添加二硫桥来改善环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)木聚糖酶的稳定性，二硫桥连结该蛋白的N-末端到C-末端上，以及α螺旋的N-末端部分到邻近的β链上(Wakarchuk等，1994)。同时，Campbell等人为增加热稳定性(1995)，通过分子内和分子间的二硫键来修饰环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)木聚糖酶。相似地，里氏木霉(T.reesei)木聚糖酶II的稳定性也通过将其N末端区域改成嗜热木聚糖酶的相应部分而得到了改善(Sung等，1998)。除了改良的热稳定性以外，酶的活性范围也拓展到包括了碱性pH值。单点突变也被用来增加环状芽孢杆菌木聚糖酶(Bacillus circulans xylanase)的稳定性(Arase等，1993)。

[0008]通过比较嗜热(thermophilic)和嗜温(mesophilic)酶的结构，得到了大量信息(Vogt等，1997)。嗜热木聚糖酶的结构分析也给出了关于影响木聚糖酶热稳定性的因素的信息(Gruber等，1998；Harris等，1997)。

[0009]然而，当前需要在工业条件中具有改良性质的酶，特别是木聚糖酶。

发明概述

[0010]本发明涉及修饰酶(modified enzymes)。具体地说，本发明涉及在极端pH和温度条件下具有改良性能的修饰酶(modified enzymes)。

[0011]在第一个方面，本发明关于修饰木聚糖酶(modified xylanase)，其包含多肽，该多肽具有如SEQ ID NO：1提出的氨基酸序列，其中该序列在选自下面的位置上具有至少一个被取代的氨基酸残基，该位置选自：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。优选地，取代选自：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。优选地，修饰木聚糖酶具有至少一个取代，该取代选自：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。并且，优选地，同野生型木聚糖酶相比，修饰木聚糖酶表现出改良的嗜热性、嗜碱性或者二者的结合。

[0012]在第二个方面，本发明关于修饰酶(modified enzyme)，该修饰酶包含了氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1提出的序列同源，该氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。在优选实施方案中，该氨基酸序列具有至少一个选自下面的取代氨基酸残基：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。

[0013]在本发明优选实施方案中，修饰酶(modified enzyme)是部族C(Clan C)的糖基水解酶(glycosyl hydrolase)，其包含一个氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1提出的序列同源，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。在优选实施方案中，该氨基酸序列具有至少一个选自下面的取代氨基酸残基：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。优选的修饰酶如在此处公开的。

[0014]在一个优选的实施方案中，修饰酶是家族11木聚糖酶(第11家族的木聚糖酶)，其含有一个氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1提出的序列同源，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。在优选实施方案中，该氨基酸序列具有至少一个选自下面的取代氨基酸残基：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。优选修饰的家族11酶如此处公开的。[0015]在其它的优选实施方案中，修饰酶是家族12纤维素酶(第12家族的纤维素酶)，其含有一个氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1提出的序列同源，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。在优选实施方案中，该氨基酸序列具有至少一个选自下面的取代氨基酸残基：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C，其中该位置是等价位置，如此处定义的。优选的家族12修饰酶如此处公开的。

[0016]在一个优选的实施方案中，家族12纤维素酶是Trichoderma EGIII纤维素酶(木霉EGIII纤维素酶)，如SEQ ID NO：3中所阐明的，该修饰包括了至少一个选自下面的氨基酸：2，13，28，34，77，80，86，122，123，134，137，140，164，174，183，209，215和218，这些位置的编号相对于SEQ ID NO：3。在优选实施方案中，该取代为至少一个选自下面的突变：T2C，N13H，S28K，T34C，S77C，P80R，S86C，G122C，K123W，Q134H，Q134K，Q134R，V137H，G140C，N164C，N164K，N174C，K183H，N209C，A215D和N218C，位置编号相对于SEQ IDNO：3。

[0017]本发明的第一个和第二个方面的实施方案，如上面公开的，也提供编码任何上述修饰酶的核酸，以及互补体(complements)。在另一个优选实施方案中，本发明提供包含至少一种如此处公开的修饰酶以及另一成份的组合物。在另一优选实施方案中，本发明提供包含如此处公开的修饰酶的载体、包含修饰酶的细胞和表达修饰酶的方法。

[0018]在第三个方面，本发明关于一种对酶进行修饰的方法，包括对酶的第一位点进行修饰，使得第一位点可以与酶的第二位点相结合。在优选的实施方案中，第一位点位于与β-折叠邻近的环或序列中。在优选的实施方案中，第二位点位于β-折叠中。

[0019]在优选的实施方案中，修饰酶是木聚糖酶(xylanase)。例如，在一个优选实施方案中，本发明关于修饰的木聚糖酶(modifiedxylanase)，其中木聚糖酶被用下面方法中的至少一种进行修饰：(i)通过修饰N末端序列，使得N末端序列通过二硫键桥结合到邻近的β链上；(ii)通过修饰C末端序列，使得C末端序列结合到邻近的β链上；(iii)通过修饰α螺旋或者邻近α螺旋的序列，使得α螺旋或者邻近α螺旋的序列更加牢固地结合在蛋白质的主体上；(iv)通过修饰与β链邻近的序列，使得与β链邻近的序列可以更牢固地结合在邻近的序列上。例如，在优选的实施方案中，可以在毗邻于索(cord)的β链上进行修饰。

附图简述

[0020]图1显示的是家族11木聚糖酶中的氨基酸比对。氨基酸的编号与里氏木霉木聚糖酶II(T.Reesei Xylanase II)进行比较，如序列的最上面所示的。与家族11木聚糖酶的至少75％相同的残基被划了线。下述各项在图中进行了比对(用缩写)：XYN2_TRIRE内-1，4-β-木聚糖酶2前体(EC3.2.1.8)(木聚糖酶2)(1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶2)-里氏木霉(Trichoderma reesei(Hypocrea jecorina))>sp|P36217|；XYN1_TRIRE内-1，4-β-木聚糖酶1前体(EC3.2.1.8)(木聚糖酶1)(1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶1)-里氏木霉(Trichoderma reesei(Hypocreajecorina))>sp|P36218|；XYN2_BACST内-1，4-β-木聚糖酶前体(EC3.2.1.8)(木聚糖酶)(1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶)-嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)>sp|P45703|；XYN1_HUMIN内-1，4-β-木聚糖酶1前体(EC3.2.1.8)(木聚糖酶1)(1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶1)-孤独腐质霉(Humicola Insolens)>sp|P55334|；XYN1_ASPAW内-1，4-β-木聚糖酶I前体(EC3.2.1.8)(木聚糖酶I)(1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶I)-泡盛曲霉(Aspergillus awamori)>sp|P55328|；XYNA_BACST内-1，4-β-木聚糖酶A前体(EC3.2.1.8)(木聚糖酶A)(1，4-β-D-木聚糖>sp|P45705|。

[0021]图2显示了家族12纤维素酶与Xyn II的氨基酸比对。下述各项在图中进行了比对(用缩写)：1ENX木聚糖酶II Trichoderma reesei(里氏木霉)，和cel12家族成员Q8NJY2 Aspergillus awamori(泡盛曲霉)，Q8NJY3 Humicola grisea(腐质霉菌)，Q8NJY4 Trichoderma viride(绿色木霉)，Q8NJY5 Hypocrea koningii，Q8NJY6 Hypocrea schweinitzii，Q8NJY7 Stachybotrys echinata，Q8NJY8 Bionectria ochroleuca，Q8NJY9 Bionectria ochroleuca，Q8NJZ0 Bionectria ochroleuca，Q8NJZ1Bionectria ochroleuca，Q8NJZ2 Fusarium solani(subsp.Cucurbitae)(镰刀菌)，Q8NJZ3 Fusarium solani(subsp.Cucurbitae)，Q8NJZ4 Fusariumequiseti(Fusarium scirpi)(木贼镰刀菌(藨草镰刀菌))，Q8NJZ5Emericella desertorum，Q8NJZ6 Chaetomium brasiliense，Q9KIH1Steptomyces sp.11AG8(链霉菌种11AG8)。在图中，两个箭头指出的是二硫键桥的位置(信号序列没有去除)。

[0022]图3显示的是用来进行木聚糖酶诱变的里氏木霉寡核苷酸(Trichoderma reesei oligonucleotides)的核苷酸序列，改变的密码子用下划线标出。

[0023]图4出示一个图表，显示的是：同野生型XynII相比，Y2和Y5突变的木聚糖酶的活性随温度变化的情况。突变的木聚糖酶具有下面的突变：K58R并且一个天冬氨酸添加到190位的C末端丝氨酸上(+191D)(＝Y2)；T2C，T28C，K58R+191D，(＝Y5)。这个图示例性说明了盐桥单独不能增加嗜热性和热稳定性。确切的说，引入二硫键桥增加了稳定性和温度依赖性活性。活性测量按照Bailey等，1992进行。

[0024]图5的图比较了Xyn II野生型和Y5突变的木聚糖酶的活性随pH值变化的情况。Y5突变的木聚糖酶具有下面的突变：T2C，T28C，K58R连同添加在190位置的C末端丝氨酸的天冬氨酸(+191D)。活性测量按照Bailey等，1992进行。

[0025]图6的图比较了Xyn II野生型和Y5突变的木聚糖酶的活性随温度变化的情况。Y5突变的木聚糖酶具有下面的突变：T2C，T28C，K58R连同添加在C末端丝氨酸190位上的天冬氨酸(+191D)。活性测量按照Bailey等，1992进行。

[0026]图7的图比较Y5突变的木聚糖酶和野生型Xyn II木聚糖酶，在pH8下钝化后，二者在pH5.0下的残留活性随温度变化情况。Y5突变的木聚糖酶具有下面的突变：T2C，T28C，K58R连同添加在C末端丝氨酸190位上的天冬氨酸(+191D)。活性测量按照Bailey等，1992进行。[0027]图8的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(SS105/162)，在pH8下钝化后，二者在pH5.3下的残留活性随温度的变化情况。其中Xyn II木聚糖酶(SS105/162)具有下面的额外突变：Q162C和L105C。按照Bailey等，1992进行活性测量。

[0028]图9的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(P9)，在pH9下钝化后，二者在pH5下残留的活性随温度的变化情况。其中的Xyn II木聚糖酶(P9)具有下面的额外的突变：F93W，N97R和H144K。按照Bailey等，1992进行活性测量。

[0029]图10的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(P12)，在pH5下钝化后，二者在pH5下残留的活性随温度的变化情况。其中的Xyn II木聚糖酶(P12)具有下面的额外的突变：H144C和N92C。按照Bailey等，1992进行活性测量。

[0030]图11的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(P12)，在pH9下钝化后，二者在pH5下残留的活性随温度的变化情况。其中的Xyn II木聚糖酶(P12)具有下面的额外的突变：H144C和N92C。按照Bailey等，1992进行活性测量。

[0031]图12的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(P15)，在pH8下钝化后，二者在pH5.2下残留的活性随温度的变化情况。其中的Xyn II木聚糖酶(P15)具有下面的额外的突变：F180Q，H144C和N92C。按照Bailey等，1992进行活性测量。

[0032]图13的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(P21)，在pH8下钝化后，二者在pH5下残留的活性随温度变化情况。其中的Xyn II木聚糖酶(P21)具有下面的额外的突变：H22K，F180Q，H144C和N92C。按照Bailey等，1992进行活性测量。

[0033]图14的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(P20)，在pH7.8下钝化后，二者在pH5.17下残留的活性随温度变化情况。其中的Xyn II木聚糖酶(P20)具有下面的额外的突变：H22K和F180Q。活性测量按照Bailey等，1992进行。

[0034]图15的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(J17)在pH8下活性随温度变化的情况，其中的Xyn II木聚糖酶(J17)具有下面的额外的突变：V108H。按照Bailey等，1992进行活性测量。

[0035]图16的图比较了Y5突变的木聚糖酶和Xyn II木聚糖酶(J21)在pH8下活性随温度变化的情况，其中的Xyn II木聚糖酶(J21)具有下面的额外的突变：S65C和S186C(图中的J21)。按照Bailey等，1992进行活性测量。

[0036]图17显示的是里氏木霉木聚糖酶II(Trichoderma reeseixylanase II)(Xyn II，PDB1ENX，蓝色)和里氏木霉内切葡聚糖酶III(Trichoderma reeseiendoglucanaseIII)(Cal12A，PDB1H8V，红色)的结构比对。

[0037]图18列出了Xyn II序列的核苷酸氨基酸。

[0038]图19列出了EGIII序列的核苷酸氨基酸。

[0039]图20列出了Xynl I序列的核苷酸氨基酸。

优选实施方案的详细描述

[0040]本发明现在将通过参考的方式、仅仅使用下面给出的定义和实施例进行详细描述。除非在此处另外定义，所有此处使用的技术和科学术语都和本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的术语意义相同。Singleton等所著的由纽约John Wiley and Sons于1994年出版的DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY第二版，以及由Hale和Marham所著，由纽约Harper Perennial于1991年出版的THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，向技术人员提供用于本发明中的许多术语的综合词典。尽管与此处的描述相似或等价的任何材料和方法可以在本发明的实际应用和试验中使用，本发明还是描述了优选的方法和材料。数字范围包括了界定范围的数字。除非另外指出，分别地，核酸按照5′到3′的方向从左到右写出；氨基酸序列按照从氨基到羧基的方向从左到右写出。特别地，从业者可以参照Sambrook等，1989和Ausubel FM等，1993来理解本领域的定义和术语。应该理解，本发明不局限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些是可以改变的。

[0041]此处提供的标题并不是对本发明多个方面和实施方案的限制，通过参考作为整体的说明书可以知晓本发明各个方面和实施方案。因此，接下来定义的术语是通过参考作为整体的说明书而被更完整地定义出来。

[0042]在此明确地引入此处所引用的所有出版物作为参考，以此来描述和公开可能与本发明共同使用的组合物和方法学。

[0043]正如此处所用，术语“多肽(polypeptide)”，指的是由氨基酸残基以肽键相连而成的单链构成的化合物。此处的术语“蛋白”可以与术语“多肽”同义，或者可以另外指两个或多个多肽的复合物。

[0044]正如此处所用，术语“表达(expression)”，指的是基于基因的核酸序列产生出多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

[0045]正如此处所用，术语“基因(gene)”，意思是参与多肽链产生的DNA片段，它可以包含或者也可以不包含编码区域之前或者之后的区域。

[0046]如此处用到的，当提到位置编号时，术语“等价(equivalent)”指的是如此处提供的、以里氏木霉木聚糖酶II(Trichoderma reeseixylanase II)(Xyn II)作为参考序列或参考结构，通过序列和结构比对而确定的位置(参见，例如，图2是多序列比对以及里氏木霉(Trichoderma reesei)Xyn II与其它序列比对，图17是里氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶III与里氏木霉木聚糖酶II(Trichoderma reesei Xyn II)的结构比对)。位置的编号相对于里氏木霉Xyn II(Trichoderma reesei XynII)，如SEQ ID NO：1所描述。即便可以使用特定的序列作为碱基参考点，编号系统同样适用于所有相关的同源序列。蛋白质之间的序列同源性可以这样确定，用已知的和如此处所描述的比对程序，以及使用此处所描述的杂交技术。

[0047]正如此处所用，术语“邻近(adjacent)”指的是蛋白质的氨基酸残基或区域或范围之间的线性靠近或者空间靠近。例如，第一个残基或第一个区域或第一个范围分别邻近于第二个残基或第二个区域或第二个范围(在线性的意义上)，它们之间将优选地有约7个，优选地约5个，优选地约2个插入其中的氨基酸残基。可选地，例如，当第一个残基集或者第一个区域或者第一个范围邻近于第二个残基集或者第二个区域或者第二个范围时，那么该第一个残基集或者第一个区域或者第一个范围将最接近于第二个残基集或者第二个区域或者第二个范围(在空间上，例如，由蛋白质三级结构所显示)。本领域的技术人员在可能的情况下，将会知道怎样解析蛋白质的三级结构。

[0048]如此处所使用，当涉及到序列位置的时候，整数前面的标记“+”的意思是多肽被修饰，使其在由该整数具体指明的假定位置包含一个或多个额外的氨基酸。例如，标记+191是指在正常状态下具有190个氨基酸的氨基酸序列的多肽有了一个添加的氨基酸。

[0049]如此处使用的，术语“核酸分子(nucleic acid molecule)”包括RNA，DNA和cDNA分子。可以理解，由于遗传密码的简并性，可能产生多个编码一个给定蛋白质的核酸序列，诸如编码本发明的突变蛋白的的核酸序列。

[0050]如此处使用的，术语“二硫桥(disulphide bridge)”或者“二硫键(disulphide bond)”指的是，在多肽或蛋白质中，在半胱氨酸残基的硫原子之间形成的键。在本发明中，二硫桥或二硫键可以是非自然发生的以及可通过点突变方式引入的。

[0051]如此处使用的，术语“盐桥(salt bridge)”指的是多肽或蛋白中的电性相反的残基，氨基酸间形成的键。在本发明中，盐桥可以是非自然发生的并且可通过点突变方式引入。

[0052]如此处使用的，“酶(enzyme)”指的是催化化学反应的蛋白质或多肽。

[0053]如此处使用的，术语“活性(activity)”指的是与特定蛋白相关的生物活性，比如与蛋白酶相关的酶活性。生物活性指的是本领域技术人员一般将其归属于该蛋白质的任何活性。

[0054]如此处使用的，术语“木聚糖酶(xylanase)”指的是水解β-1，4-连接的吡喃木糖苷链的糖基水解酶。

[0055]如此处使用的，“Xyn I”指的是里氏木霉木聚糖酶(Trichodermareesei xylanase)，木聚糖酶I。Xyn I的大小是19kDa，pI值为5.5，最适pH值是3到4之间。

[0056]此处用到的“Xyn II”指的是里氏木霉木聚糖酶(Trichodermareesei xylanase)，木聚糖酶II。Xyn II的大小是20kDa，pI值是9.0，最适pH值是5到5.5之间。

[0057]如此处使用的，“吡喃木糖苷(xylopyranoside)”指的是木糖的β-1，4-连接聚合物，包括木糖的取代聚合物，即支化的β-D-1，4连接吡喃木糖聚合物，其被乙酰基、阿拉伯糖基和糖醛基(uronyl)基团高度取代(参见，例如，Biely，P.(1985)Microbial Xylanolytic Systems.TrendsBiotecho1.，3，286-290.)。

[0058]如此处使用的，术语“糖基水解酶(glycosyl hydrolase)”指的是水解两个或多个糖类间、或者糖类和非糖类部分间的糖苷键的酶。糖苷键的酶促水解通过一般的酸催化来发生，需要两个关键的残基：一个质子供体和一个亲核体/碱基。糖基水解酶的IUB-MB酶命名法是根据底物特异性，有时也根据分子机理。

[0059]如此处使用的，术语“水解酶(hydrolase)”指的是催化化学键酶切反应的酶，在该反应中，通过添加一个水分子将化学键酶切。

[0060]如此处使用的，“水解(hydrolysis)”指的是通过添加一个水分子将化学键切开的反应过程。

[0061]如此处使用的，“部族C(Clan C)”指的是拥有共同的三维折叠和相同催化机理的家族的集合。(参见，例如，Henrissat，B.和Bairoch，A.，(1996)Biochem.J.，316，695-696)。

[0062]如此处使用的，“家族11”指的是一个酶家族，正如由Henrissat和Bairoch(1993)Biochem J.，293，781-788(同样参见，Henrissat和Davies(1997)Current Opinion in Structural Biol.1997，&637-644)所建立的。家族11成员的共同性质包括：高度基因同源性，大小为大约20kDa以及双取代催化机理(参见Tenkanen等，1992；Wakarchuk等，1994)。家族11木聚糖酶的结构包括两个大的β折叠，其由β链和α螺旋组成。家族11的木聚糖酶包括下面的成员：黑曲酶(Aspergillus niger)XynA，白曲酶(Aspergillus kawachii)XynC，Aspergillus tubigensis XynA，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)XynA，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)XynA，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XynA，Neocallimastixpatriciarum XynA，变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)XynB，变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)XynC，热紫链酶菌(Streptomycesthermoviolaceus)Xyn II，褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)XynA，哈茨木酶(Trichoderma harzianum)Xyn，里氏木酶(Trichoderma reesei)Xyn I，里氏木酶(Trichoderma reesei)Xyn II，绿色木酶(Trichoderma viride)Xyn。

[0063]如此处使用的，“家族12”是指由Henrissat和Bairoch(1993)建立的一个酶家族，其中已知的糖基水解酶被根据氨基酸序列相似性划分成了家族。目前，所有的家族12的酶都是纤维素酶。家族12的酶通过双取代反应(double displacement reaction)和葡糖基-酶中间体水解纤维素中的β-1，4-糖苷键，该葡糖基-酶中间体使产物的端基异构构型(anomeric configuration)得以保持。对家族12成员的结构研究揭示了一个紧密的β夹层结构，该结构被弯曲从而形成一个延展的底物结合位点，位于β折叠凹面上。

[0064]如此处使用的，术语“蛋白酶(protease)”指的是一种酶，它通过水解其肽键中至少一些肽键进行降解。

[0065]如此处使用的，术语“肽键(peptide bond)”指的是一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间的化学键。

[0066]如此处使用的，“野生型(wild-type)”指的是天然的或自然发生的序列或蛋白质。

[0067]如此处使用的，“点突变(point mutations)”指的是DNA中单核苷酸的改变，尤其是在这个改变将会导致蛋白质的改变的情况下。

[0068]如此处使用的，“突变型(mutant)”指的是生物体或蛋白不同于野生型的类型。这种改变可通过本领域技术人员所熟知的方法加以实现，例如，通过点突变，其中得到的蛋白质就可以被称为突变型。

[0069]如此处使用的，“诱变(mutagenesis)”指的是实现从野生型变为突变型的过程。

[0070]如此处使用的，“取代的(substituted)”和“修饰的(modified)”被交替使用，指的是一个序列，诸如包含多肽的氨基酸序列，其包括对自然发生序列的删除、插入、替换或截断。例如经常出现在本发明的文件中的，取代的序列指的将是对自然发生残基的替换。

[0071]如此处使用的，“修饰酶(modified enzyme)”指的是一种酶，它包含对自然存在序列的删除、插入、替换和截断。

[0072]如此处使用的，“β链(β-strands)”指的是氨基酸序列的部分，该氨基酸序列构成出现于β折叠中的线性序列。

[0073]如此处使用的，“β折叠(β-sheets)”指的是当氨基酸通过氢键相互连结从而形成折叠状结构的时候，所得到的折叠型结构。

[0074]如此处使用的，“α螺旋(α-helix)”指的是这种情况下所形成的结构：单条多肽链绕着自身规则地旋转，从而形成刚性圆柱体，其中每个肽键都规则地和附近链上的其他肽键通过氢键相互作用。

[0075]如此处使用的，“拇指(thumb)”指的是位于Xyn I和Xyn II中的β链B7和B8之间的环(参见，例如在Torronen，A.and Rouvinen，J.；Biochemistry 1995，34，847-856中)。

[0076]如此处使用的，“索(cord)”指的是β链B7和B8之间形成拇指的环以及在裂缝一端横穿而过的β链B6a和B9之间环的一部分(参见，例如在Torronen，A.and Rouvinen，J.；Biochemistry 1995，34，847-856中)。

[0077]如此处使用的，“碱性(alkaline)”指的是碱性的状态或性质。

[0078]如此处使用的，“嗜碱(alkalinophilic)”指的是在碱性环境下比非嗜碱成员更加茁壮的性质。例如，嗜碱生物指的是一个生物，它可以在普通生物不能生存或不能健壮生长的碱性条件下生存或健壮生长，嗜碱蛋白质是在碱性条件下具有活性或者活性更好的蛋白质，而在这种条件下普通的蛋白质活性将相对较小。

[0079]如此处使用的，“酸性(acidic)”指的是酸性的状态或性质。

[0080]如此处使用的，“嗜酸(acidophilic)”指的是在酸性环境下比非嗜酸成员更加茁壮的性质。例如，嗜酸生物指的是一个生物，它可以在普通生物不能生存或不能健壮生长的酸性条件下生存或健壮生长，嗜酸蛋白质是在酸性条件下具有活性或者活性更好的蛋白质，而在这种条件下普通的蛋白质活性将相对较小。

[0081]如此处使用的，“热稳定的(thermostable)”指的是在涉及温度的环境下保持稳定的性质。例如，热稳定生物指的是特定温度条件下比非热稳定生物更稳定的生物。

[0082]如此处使用的，“热稳定性(thermostability)”指的是热稳定的性质。

[0083]如此处使用的，“嗜热(thermophilic)”指的是在热环境下比非嗜热成员更加茁壮的性质。例如，嗜热生物指的是一个生物，它可以在普通生物不能生存或健壮生长的热条件下生存或健壮生长；嗜热蛋白是在热条件下具有活性或者活性更好的蛋白，而在这种条件下普通蛋白的活性将相对较小。

[0084]如此处使用的，“嗜温(mesophilic)”指的是在通常环境下比非嗜温成员更加茁壮的性质。例如，嗜温生物体指的是一个生物体，它可以在其它生物体不能生存或健壮生长的通常条件下生存或健壮生长；嗜温蛋白是在通常条件下具有活性或者活性更好的蛋白，而在这种条件下其它蛋白的活性将相对较小。

[0085]如此处使用的，“寡核苷酸(oligonucleotides)”指的是短核苷酸序列，它可能用来，例如，作为形成突变蛋白的反应中的引物。

[0086]如此处使用的，“密码子”指的是DNA或mRNA分子中的由三个核苷酸组成的序列，其代表将特定氨基酸引入多肽链的指示。

[0087]如此处使用的，“Y5”指的是突变体木聚糖酶，例如在公布号为WO 01/27252中公开的木聚糖酶。

[0088]如此处所使用，下列标识指的是下面的突变体：

“P2”＝N97R+H144K/Y5

“P3”＝F93W+Y5中H144K

“P8”＝Y5中F180Q

“P9”＝F93W中N97R+Y5中H144K

“P12”＝H144C+Y5中N92C

“P15”＝H144C中F180Q+Y5中N92C

“P16”＝H144C中N97R+Y5中N92C

“P18”＝Y5中H22K

“P20”＝H22K+Y5中F180Q

“P21”＝H22K+F180Q+H144C+Y5中N92C

“J17”＝Y5中V108H

“J21”＝S65C+Y5中S186C

其中位置编号相对于Xyn II。

[0089]本发明涉及极端条件，例如温度和pH值下具有改进性能的修饰酶。

[0090]在第一个方面，本发明涉及一种修饰酶，该修饰酶包含含有SEQID NO：1中列出的氨基酸序列的多肽，其中该序列在选自下面的位置具有至少一个取代氨基酸残基：2，5，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191，其中位置编号是对于SEQ ID NO：1而言。优选地，取代选自：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。优选地，修饰木聚糖酶具有至少一个选自下面的取代：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。同时，优选地，修饰木聚糖酶和野生型木聚糖酶相比，具有改良的嗜热性(thermophilicity)、嗜碱性(alkalophilicity)或者二者的结合。[0091]在第二个方面，本发明涉及一种修饰酶，该修饰酶包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1中提出的序列同源，该氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，44，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191，其中位置编号是关于SEQ ID NO：1而言。在优选的实施方案中，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。在优选实施方案中，氨基酸序列具有至少一个选自下面的取代氨基酸残基：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。

[0092]在本发明的优选实施方案中，修饰酶是部族C(Clan C)中的糖基水解酶(glycosyl hydrolase)，其含有一个氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1中提出的序列同源，该氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，110，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列具有至少一个选自下面的取代氨基酸残基：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。优选的修饰酶如此处公开的。

[0093]在优选的实施方案中，修饰酶是家族11木聚糖酶，包含一个氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1提出的序列同源，该氨基酸在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列具有至少一个选自下面的取代氨基酸残基：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。优选的家族11的修饰酶如此处公开的。

[0094]在又一优选实施方案中，修饰酶是家族12纤维素酶，包含一个氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1提出的序列同源，该氨基酸在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。在优选的实施方案中，该氨基酸序列具有至少一个选自下面的取代氨基酸残基：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。优选的家族12的修饰酶如此处公开的。

[0095]在优选的实施方案中，家族12纤维素酶是如SEQ ID NO：3提出的木霉EGIII纤维素酶(TrichodermaEGIII cellulase)，修饰包含至少一个选自下面的氨基酸：2，13，28，34，77，80，86，122，123，134，137，140，164，174，183，209，215和218，位置编号是相对于SEQ ID NO：3而言。在优选的实施方案中，取代是至少一个选自下面的突变：T2C，N13H，S28K，T34C，S77C，P80R，S86C，G122C，K123W，Q134H，Q134K，Q134R，V137H，G140C，N164C，N164K，N174C，K183H，N209C，A215D和N218C，位置编号是相对于SEQ IDNO：3而言。

[0096]Xyn II显示出与家族11其它成员显著的氨基酸同源性，大约20-90％，以及整体结构相似性。此处使用的同源性可以由本领域的技术人员测定。特别地，至少20％，优选为30％或以上，优选为40％或以上，优选为50％或以上，优选为60％或以上，优选为70％或以上，优选为80％或以上，优选为90％或以上，优选为95％或以上以及优选为97％或以上的同源性是所考虑的(正如在氨基酸水平以及核酸水平上计算的，以及正如本文所用的)。第11家族和第12家族的酶之间具有结构相似性。β蛋白具有两个堆砌的β折叠，并且有一个α螺旋，该α螺旋压靠其中一个β折叠，形成所谓的β-果冻卷结构(beta-jelly roll structure)。(参见Stirk，H.J.，Woolfson，D.N.，Hutchison，E.G.and Thornton，J.M.(1992)Depicting topology and Handedness in jellyroll structures.FEBS Letters308p1-3)。

[0097]基于这种结构相似性，两个酶家族被归于一个“超家族(superfamily)”，称为“部族C(Clan C)”(参见Sandgren，M.等，J.Mol.Bio.(2001)308，295-310)。

[0098]尽管家族11和家族12间的序列同源性低，但两个家族的整体结构相似性是显著的，如从图2和图16的比较可以看出的。连结两个β折叠的环的长度构成了家族之间的主要结构差异(Sandgren等，J.Mol.，Biol.，2001)。当前，已知，任何一个家族11的酶都不包含N末端的二硫桥，而许多家族12的纤维素酶总体上都显示出包含N末端附近的二硫桥(例如，T.reesei Cel 12A的残基4和32之间)。家族12酶中的二硫桥处于木霉(Y5)(Trichoderma(Y5))变异体引入二硫桥的位置附近，尽管这个位置远离N-末端(参见，例如，出版物WO 01/27252)。在Trichoderma reesei(里氏木霉)xylanase II(Xyn II)中，检验了约束作用的重要性，该约束作用稳定了家族11酶的N-末端区域。通过在残基间(T2C和T28C)插入非天然的二硫桥，获得的T_m增加为11℃。在家族11和家族12这两个结构类似的家族中，N-末端的二硫桥起着类似的与稳定性相关的作用。在Cel12A中用一个丙氨酸替换32位的半胱氨酸导致Tm显著减少了18.5℃，这证实了上面提到的作用。有趣的是，通过向Xyn II中加入一个非自然的N-末端二硫键所得到的稳定性的改变程度，比得上与通过去除Cel 12A中一个自然的二硫键所得到的稳定性的改变程度(参见表A)。

表A

 

酶	ΔTm	Tm(摄氏度℃)
			WT Cel 12A		54.4
C32A	-18.5	35.9
			WT xyn II		58.6
Y5	+10.7	69.3

表A显示了野生型Cel 12A的解链温度Tm与32位取代的变异体的对比情况，以及野生型Xyn II与该酶Y5变异体的对比。

[0099]三种已为公众所知的家族12糖基水解酶(Trichoderma reesei-PDB1H8V(里氏木霉-PDB1H8V)，Aspergillus niger-PDB 1KS5(黑曲霉-PDB1KS5)，Streptomyces lividans-PDB 2NLR(变铅青链霉菌-PDB 2NLR))结构中N末端二硫桥的三维结构，与Y5木聚糖酶中2位和28位间的非自然二硫桥相比，显示在二硫桥的位置上有位移。表B显示了Y5木聚糖酶(“PDB1ENX”为野生型Xyn II木聚糖酶)和三种已知家族12结构中二硫桥的位置。在Y5木聚糖酶的2和28处突变的结构位置可以被翻译到Cel 12结构上相应的残基上。在每种情况下，来自Y5的非自然的二硫键更加靠近N-末端；对于黑曲霉(A.niger)的结构(PDB1KS5)，可以设计一个能够利用N末端残基本身的二硫键(在残基Q1C、V35C处，依据黑曲霉(A.niger)编号)。不受其自然序列所限制，可以用X射线数据来对N末端的延长和平截进行设计，从而有助于特异性连结新N-末端残基的非自然二硫键。

表B

 

编码	野生型N-末端S-S位置	对应于xyn II的2-28	在N末端上，可以插入S-S的位置(根据结构)
				PDB1ENX	无	-
Y5	C2-C28	T2-T28	T2C-T28C
				PDB1H8V	C4-C32	T2-T34	T2C-T34C
PDB1KS5	C4-C32	T2-Y34	Q1C-V35C
				PDB2NLR	C5-C31	T3-T33	T3C-T33C

[0100]已知大量的家族12序列(表C)可以潜在地通过N末端二硫桥使其稳定，特别是那些可以引入非自然的二硫桥的或者天然二硫键可以被移到更接近N-末端的分子。表C列出一些序列，其中信号序列的预测性移除产生出成熟蛋白序列，其与已知的家族12结构非常相似的成熟蛋白序列相似。表C也列出了两个N末端半胱氨酸(26-28氨基酸)之间的距离，其与Y5中的二硫键相似。在切割位点预测中，以具有已知的、公认参数的手段，理论地移除信号序列(参见，例如，“Identification ofprokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavagesites”.Henrik Nielsen，Jacob Engelbrecht，

 Brunak and Gunnar vonHeijne，Protein Engineering 10，1-6(1997))。

[0101]表C中大批三维结构未知的序列落入家族12酶的结构相似的集群中，其在N末端、在5+/-2残基的位点上以相似的方式具有半胱氨酸残基，与32+/-7的残基形成二硫桥，使得第一个β链或者β折叠的多个β链可以结合在邻近的β折叠上。所有这些序列都可以使用围绕表B进行的讨论中所描述的方式进行处理，以便改进稳定性。

表C

 

ID	序列	真核生物/革兰氏阴性/革兰氏阳性	预测的切割位点	适当的半胱氨酸编号(二硫键中的第一个)	至二硫键中第二个半胱氨酸的氨基酸数目
						Q8NJY2	内切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE：CEL12B}泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(var.kawachi)	Eu	16-17	6	28
Q8NJY4	内切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE：CEL 12A}-绿色木霉(Trichoderma viride)	EU	16-17	4	28
						Q8NJY5	内切葡聚糖酶{GENE：CEL 12A}-Hypocrea koningii	Eu	16-17	4	28
Q8NJY6	内切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE：CEL 12A}-Hypocrea schweinitzii	Eu	16-17	4	28
						Q8NJY7	内切葡聚糖酶	Eu	16-17	4	28

 

	(Eendoglucanase){GENE：CEL12A}-Stachybotrys echinata
						Q8NJY8	内切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE：CEL12D}-Bionectria ochroleuca	Eu	17-18	4	28
Q8NJY9	内切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE：CEL 12C}-Bionectria ochroleuca	Eu	17-18	3	28
						Q8NJZ1	内切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE：CEL12A}-Bionectria ochroleuca	Eu	18-19	4	28
Q8NJZ4	内切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE：CEL 12A}-木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)(藨草镰刀菌(Fusarium scirpi))	Eu	17-18	4	28
						Q9KIH1	纤维素酶(Cellulase 12A){GENE：CEL 12A}-链霉菌属(Streptomyces sp.)11AG8	革兰氏阳性	31-32	5	26

[0102]表D进一步列出了具有未切割信号序列的家族12酶的一些序列。它们都有由30-39个氨基酸分开的半胱氨酸，并且在信号序列去除以后(去除可以如同表C进行)，这些半胱氨酸在结构上能够在N-末端形成二硫桥(如可以在公众所知的结构中看到的，参见表B)。建议突变的位点与Y5突变体的位点2-28之间的二硫桥所对应的部位相关。使用MOE程序(Chemical Computing Corp)、使用标准序列匹配方法(standard sequence matching method)，对糖基水解酶序列进行比对。

                        表D

序列编码        酶      物种                    突变

Tr O94218       Cel12   Aspergillus aculeatus   D22C/G52C

                               (棘孢曲霉)

Sp P22669     Cel12            Aspergillus aculeatus      Q20C/T52C

                               (棘孢曲霉)

Sp Q12679     Cel12            Aspergillus awamori        T18C/Y50C

                               (泡盛曲霉)

Tr O13454     Cel12            Aspergillus oryzae         E18C/Y50C

                               (米曲霉)

Sp P16630     Cel12            Erwina carotovora           A32C/I68C

                               (白菜软腐病菌)

Tr O31030     Cel12            Pectobacterium              A32C/V68C

                               carotovora

Tr Q9V2TO    Cel12             Pyrococcus furiosus         P57C/T96C

                               (激烈火球菌)

Tr O33897     Cel12            Rhodothermus                E40C/E70C

                               marinus

Tr Q9RJY3     Cel12            Streptomyces                T43C/T73C

                               coelicolor

                               (天蓝色链霉菌)

Tr O08468    Cel12             Streptomyces                L40C/T70C

                               halstedii

                              (郝氏链霉菌)

TrQ59963    Cel12              Streptomyces rochei         T40C/T70C

Tr Q9KIH1   Cel12              Streptomyces sp.            Q34C/N64C

                              (链霉菌属)

                              11AG8

Tr Q60032   Cel12             Thermotoga                   V2C/K38C

                              maritima

                              (海栖热孢菌)

Tr Q60033  Cel12              Thermotoga                   V20C/K56C

                              maritime

                              (海栖热孢菌)

TrO08428   Cel12              Thermotoga                   V2C/R38C

                              neopolitana

Tr P96492    Cel12         Thermotoga                V20C/K56C

                           neopolitana

AF435072    Cel12A         Aspergillus Kawachi       Q20C/T52C

                           (白曲霉)

AF434180   Cel12A          Chaetium brasilience      S28C/Y61C

AF434181   Cel12A          Emericella                D30C/G63C

                           desertorum

AF434182   Cel12A          Fusarium equiseti         D19C/H51C

                           (木贼镰刀菌)

AF434183   Cel12A          Nectria ipomoeae          Q25C/T58C

AF434184   Cel12B          Nectria ipomoeae          T32C/T65C

AF435063   Cel12A          Bionectria                T20C/Y52C

                           ochroleuca

AF435064   Cel12B          Bionectria                T34C/T66C

                           ochroleuca

AF435065   Cel12C          Bionectria                A18C/T50C

                           ochroleuca

AF435066   Cel12D          Bionectria                S19C/Y51C

                           ochroleuca

AF435071  Cel12A           Humicola grisea           S34C/Y67C

                           (腐质霉菌)

AF435068  Cel12A           Hypochrea                 T18C/T50C

                           schweinitzii

AF435067  Cel12A           Stachybotrys               S18C/Y50C

                           echinata

不仅家族11和12的N-末端区域表现出了高度的结构相似性；而且两个家族都显示出手形结构(hand like structure)，如

等.1997中描述的“半握的右手”中的手形结构。两个β折叠形成“拇指以外的手指(fingers)”，从一个β折叠和α螺旋而来的一个扭曲成对物形成了“手掌”。β链B7和B8间的长环形成了“拇指”，β链B6b(xyn II中的95-102残基和Cel12A中的125-131残基)和B9间的环的一部分形成了“索(cord)”，其在一端上穿过该裂缝(Torronen A.和Rouvinen，J.Biochem.1995，34，847-0856)。在β链B6b和邻近的环和/或“索”之间插入刚性化取代的稳定化效果可以在92、93、144位的突变(N92C-H144C，下面突变中的至少一个：N97R、F93W+H144K(Xyn II))中看到，并且可以使用类似的办法引入到家族12的相应部位。

[0103]表E显示在xyn II和Cel 12A之间选择结构等价位点的编号。两个家族之间的高度结构相似性使大量的类似取代成为可能(对于结构比较，参见Sandgren等，J.Mol.，Biol.，2001)。

表E

[0104]本发明的修饰酶可含有上面所述的突变以外的一个或多个突变。也可能包括在一个或多个其它位置的其它突变，诸如删除、插入、取代、颠换、转换和倒位(inversions)。同样地，修饰酶也可缺少上面所述取代中的至少一个。

[0105]修饰酶也可包括保守性取代，保守性取代可以以相似-对-相似取代(like-for-like substitution)发生(例如，碱性的对碱性的，酸性的对酸性的，极性的对极性的等等)。非保守性取代也可能发生，即，从一种类型的残基到另一种，或者可选择地涉及引入非自然的氨基酸，诸如鸟氨酸、二氨基丁酸鸟氨酸，正亮氨酸鸟氨酸，吡啶丙氨酸(pyriylalanine)，噻吩丙氨酸，萘丙氨酸，和苯甘氨酸。

[0106]序列也可具有氨基酸残基的复数个删除、复数个插入或者复数个取代，这些产生沉默的变化，形成功能等价的物质。有意的氨基酸取代可基于氨基酸性质(诸如极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性以及/或者残基的两性性质)的相似性来进行，因此将氨基酸在功能组中分组在一起是有用的。氨基酸可以仅基于其侧链的性质分组在一起。然而同时包括突变数据在内更有用处。这样生成的氨基酸集合可能出于结构的原因而是保存性的。这些集合可以用Venn表(Venn diagram)的形式被描述(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)“Protein sequencealignments：a strategy for the hierarchical analysis of the residueconservation”Comput.Appl Biosci.9：745-756)(Taylor W.R.(1986)“Theclassification of amino acid conservation”J.Theor.Biol.199：205-218)。保守性取代可以如此进行，例如根据下面的表进行，下面的表描述了将氨基酸分组的普遍接受的Venn表。

[0107]变异体氨基酸序列也可包括插入于该序列中的任意两个氨基酸残基之间的适当的间隔基(spacer groups)，除了氨基酸间隔基诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，还包括烷基基团，诸如甲基、乙基或丙基。进一步的突变形式还包括一个或多个以甘氨酸胺基取代的阳离子寡聚合物(类肽(peptoid))形式存在的氨基酸残基。

[0108]同源性比较(homology comparisons)可以用肉眼来进行，或者更经常地，借助容易获得的序列比较程序来进行。这些可通过商业途径获得的计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性百分数。可以在相邻的序列上计算同源性百分数，即一个序列同另一个序列进行比对，一个序列上的每个氨基酸都直接同另一个序列上的相应的氨基酸进行比较，每次进行一个残基的比较。这称为“无空位(ungapped)”比对。一般地，这样的无空位比对仅在数目相对较少的残基上进行。

[0109]尽管这是一个非常简单和一贯的方法，但它没有考虑到，例如，在另外的相同序列对中，一个插入或者删除将会导致后面的氨基酸残基无法进行比对，从而在进行全局比对的时候潜在地导致同源性百分数上的大幅减小。因此，大多数序列比较方法都设计成产生优化的比对过程，考虑可能的插入和删除而不过度惩罚总同源性分数。这通过这样的手段实现：在序列比对中插入“空位(gap)”以便使局部同源性最大化。

[0110]然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个空位赋予“空位罚分(gap penalties)”，以至于对于相同氨基酸的相同数目来说，一个具有尽可能少空位的序列比对—反映被比较的两个序列的更高相关性(relatedness)—将比具有许多空位的序列比对得到更高的分数。“仿射空位罚分(affine gap cost)”一般被用来对空位的存在施加一个相对较高的罚分，对该空位中每个后来的残基施加较小的罚分。这是最普遍应用的空位打分系统(gap scoring system)。高空位罚分当然会产生优化的比对，具有较少的空位。多数的比对程序允许对空位罚分进行修正。然而，在使用这些软件进行序列比较的时候优选使用默认值。例如，在使用GCG Wisconsin Bestfit软件包的时候，对氨基酸序列的默认的空位罚分是：每个空位为-12，及每个延长为-4。

[0111]因此最大％同源性的计算首先要求生产优化的比对，考虑空位罚分。能够实现这样的比对的一个合适的计算机程序是GCG WisconsinBestfit软件包(Devereux等，1984 Nuc.Acids Research 12 p387)。可进行序列比较的其它软件的例子包括，但不仅限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999 Short Protocols in Molecular Biology，4^thEd-Chapter18)，FASTA(Altschul等，1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具包。BLAST和FASTA都可用于离线搜索和在线搜索(参见Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第7-58页至第7-60页)。然而，在一些应用中，优选使用GCG Bestfit程序。BLAST 2Sequences也是可得到的、用于比较蛋白和核酸序列的程序(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett1 999177(1)：187-8以及tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。

[0112]尽管最终的同源性百分数可以根据同一性(identity)来衡量，但比对过程本身一般并不基于一种全或无的序列对比较(all-or-nothingpair comparsion)。做为代替，一般使用成比例相似性打分矩阵(scaledsimilarity score matrix)，它基于化学相似性或进化距离(evolutionarydistance)给每个成对的比较打分。这种矩阵的一个普遍使用的例子是BLOSUM62矩阵—BLAST程序包的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般使用公用的默认值或者定制的符号比较表，如果提供了的话(进一步的细节参见使用者手册)。在一些应用中，优选使用GCG软件包的公用默认值，或者在使用其它软件的时候，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。

[0113]替代地，同源性百分数可以使用DNASIS^TM(Hitachi Software)中的多比对特征进行计算，其基于类似于CLUSTAL(HigginsDG&Sharp PM(1988)，Gene73(1)，237-244)的算法。

[0114]一旦软件生成了优化的比对，就可能计算同源性百分数，优选为序列同一性百分数。软件一般把这做为序列比较的一部分并生成数字结果。

[0115]本发明的第一个和第二个方面的实施方案，如上面公开的，提供了编码如上提出的修饰酶的核酸及其互补物(complements)。在又一优选实施方案中，本发明提供包括至少一种此处公开的修饰酶以及其它成份的组合物。在另外的优选实施方案中，本发明提供包含此处公开的修饰酶的载体、包含修饰酶的细胞以及表达修饰酶的方法。

[0116]本领域的技术人员会了解核酸序列和多肽序列之间的关系，特别是遗传密码和该密码的简并性，并且能够轻易地构建这样的修饰酶。例如，本领域的技术人员会知道，对于每个修饰酶序列的氨基酸中的取代，都可能有一个或多个编码该取代氨基酸的密码子。因此，显而易见，依赖于该特定氨基酸残基相关遗传密码的简并性，可以产生一个或多个修饰酶核酸序列，它们对应于该修饰酶多肽序列。

[0117]在氨基酸序列和核酸序列中的突变可以用本领域所知许多技术中的任意技术来进行。在特别优选的实施方案中，通过PCR(聚合酶链反应)，使用合适的引物向亲代序列中引入突变，如实施例中所说明的。亲代酶可能在氨基酸水平或者核酸水平被修饰，产生此处描述的修饰酶序列。因此，优选的实施方案通过向编码修饰酶的核苷酸序列中引入一个或多个相应的密码子改变来提供修饰酶的产生。

[0118]应该理解，可以在任何修饰酶核酸序列中做出上述的密码子改变。例如，可以对此处描述的任何同源序列做出序列改变。

[0119]修饰酶可包含“全(complete)”酶，即具有它在自然界存在(或突变的)的完整长度，或者它可能包含其截短的形式。从此衍生而来的修饰酶可因此为如此截短的或者是“全长的(full-length)”。截短可在N-末端或C-末端。修饰酶可缺少一个或多个部分，诸如亚序列(sub-sequence)、信号序列(signal sequence)、域(domain)或者部分(moiety)，无论其是有活性的或者无活性的。

[0120]编码具有如此处定义的特殊性质的酶，或者编码适合做出修饰的酶，如修饰酶的核苷酸序列可从产生上述酶的任何细胞或者生物体中被鉴定和/或被分离和/或被纯化出来。有多种在本领域熟知的鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的方法。举例来说，一旦合适的序列被鉴定和/或分离和/或纯化，就可以使用PCR扩增技术来制备一个序列的多个拷贝。

[0121]进一步举例，可以使用来自产生酶的生物体中的染色体DNA或者信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果酶的氨基酸序列或者酶的氨基酸序列的一部分已知，就可以合成标记的寡核苷酸探针，并用于鉴别从生物体制备的基因文库中的酶编码克隆(enzyme-encodingclone)。替代地，含有标记寡核苷酸探针的序列，其与另一个已知酶基因是同源的，可以被用来鉴别酶编码克隆。在后一种情况中，使用严格程度相对较低的杂交和洗涤条件。

[0122]可选地，酶编码克隆可以这样鉴别：向表达载体，诸如质粒中插入基因组DNA片段；用作为结果而形成的基因组DNA文库转化酶阴性细菌(enzyme-negative bacteria)；然后将转化的细菌铺板于含有酶的底物的琼脂平板上，从而使克隆表达该将要被鉴别的酶。

[0123]在更进一步的可选方案中，编码修饰酶的核苷酸序列可以使用已经建立的标准方法合成制备，例如，Beucage S.L等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p1859-1869中描述的磷酸酰胺(phosphoroamidite)方法或者Matthes等，(1984)EMBO J.3，p801-805中描述的方法。在phosphoroamidite方法中，寡核苷酸被合成，例如在DNA自动合成仪中；被纯化；被退火；被连接；和在合适的载体中被克隆。

[0124]核苷酸序列可具有混合基因组的及合成的来源，可具有混合合成的及cDNA的来源，或者可具有混合基因组的及cDNA的来源，依照标准的技术，通过连接合成的、基因组的或者cDNA起源的片段来制备。每个连接起来的片段相应于整个核苷酸序列的不同部分。DNA序列也可以通过聚合酶链反应，使用特定的引物来制备，例如在US 4，683，202或Saiki R K等，(Science(1998)239，pp487-491)中描述的。

[0125]此处描述的以及适合用于此处描述的方法和组合物的核苷酸序列，可在它们之内包括合成的或修饰的核苷酸。已知本领域有许多不同类型的对寡核苷酸的修饰。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3′末端和/或5′末端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本文件的目的，应该理解，此处描述的核苷酸序列可使用本领域可使用的任何方法进行修饰。进行这些修饰是为了增强核苷酸序列的体内活性或者延长寿命跨度。

[0126]本发明的一个优选实施方案提供核苷酸序列以及核苷酸序列的用途，该核苷酸序列与此处提出的序列、或者任何衍生物、片段或者其衍生物是互补的。如果序列与其中的片段互补，那么该序列可以用作探针，在其它生物体等等中鉴别相似的编码序列。

[0127]不与修饰酶序列100％同源的多核苷酸可以用许多手段获得。此处描述序列的其它变体可以通过例如探测用一定范围的个体制得的DNA文库来获得，例如，所述个体来自不同种群。另外，可以得到其它同系物并且这些同系物及其片段通常能够选择性地与在此列出的序列列表中所展示的序列杂交。这样的序列可以通过如下方式获得：探测从其它物种制得的cDNA文库或者基因组DNA文库；以及在中等到高度严格条件下，使用探针来探测这些文库，其中使用的探针包含所附序列列表(attached sequence listing)中任何序列之一的全部或一部分。相似的考虑用来得到此处描述的多肽或核苷酸序列的物种同系物和等位基因变异体。

[0128]变异体和株/种同系物也可以通过简并PCR(degenerate PCR)获得，其中PCR使用被设计靶向在变异体和同系物之中的序列，这些序列编码保守的氨基酸序列。简并PCR中使用的引物将包含一个或多个简并位置，并且在比针对已知序列用单个序列引物克隆序列中所采用条件的严格性更低的条件下被使用。保守序列可以通过例如比对来自几个变异体/同系物的氨基酸序列来预测。序列比对可以使用此处描述的本领域所知的计算机软件来进行。

[0129]可选地，这样的多核苷酸可以通过如此处提供的已表征序列的定点诱变(site directed mutagenesis)来得到。在有些场合这可能会有用，例如需要沉默密码子序列改变，以便优化密码子对特定宿主细胞的优先选择性，其中在该宿主细胞中多核苷酸序列得到表达。为了引入限制酶识别位点，或者改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能，也可能需要作出其它的序列改变。

[0130]多核苷酸可以用来产生引物，例如PCR引物、交替扩增反应(alternative amplification reaction)的引物；产生探针，例如使用放射性或者非放射性标记，通过传统方法用显色标记(revealing label)进行标记的探针，或者多核苷酸可以被克隆进入载体。这样的引物、探针以及其它片段的长度将有至少15个，优选为至少20个，例如至少25个、30个、40个核苷酸，并且也包含在术语多核苷酸内。

[0131]多核苷酸，诸如DNA多核苷酸和探针可以以重组、合成或者本领域技术人员可以使用的任何方法来制得。它们也可以用标准技术被克隆。一般地，引物用合成方法来制得，该方法涉及每次一个核苷酸的逐步制造期望核酸序列。在本领域已经可以容易地获得实现这些的自动化技术。

[0132]更长的多核苷酸一般使用重组的方法来制得，例如使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可以被设计成，包含合适的限制酶识别部位，以使得扩增的DNA可以被克隆进入合适的克隆载体。优选地，变异体序列至少与此处提出的序列具有同样的生物活性。

[0133]本发明优选的实施方案包括与修饰酶互补的序列或者能够杂交到修饰酶的核苷酸序列上的序列(包括此处提出的那些互补序列)，以及可与修饰酶核苷酸序列杂交的序列互补的核苷酸序列(包括此处提出的那些互补序列)。优选的实施方案提供在中等到最大严格性条件下能够杂交到此处提出的核苷酸序列的多核苷酸序列。

[0134]优选的实施方案包括在严格条件下(例如50℃，0.2xSSC下)可以杂交到修饰酶核酸的核苷酸序列，或者其互补序列的核苷酸序列。更加优选地，该核苷酸序列可以在高度严格条件下(例如65℃，0.1xSSC下)杂交到修饰酶的核苷酸序列，或者其互补体上。

[0135]期望对序列进行突变来制备修饰酶。因此，可以从此处提供的修饰酶来制备突变体。可以通过合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包括位于期望突变位点的侧翼的核苷酸序列。Morinaga等，(Biotechnology(1984)2，p646-649)中公开了一个合适的方法。在Nelsonand Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)中描述了另一个向酶编码核苷酸序列引入突变的方法。Sarkar and Sommer(Biotechniques(1990)，8，p404-407“The megaprimer method of sitedirected mutagenesis”)描述了又一方法。对序列进行突变的其它方法也在此处使用和公开。

[0136]在优选的实施方案中，此处描述的方法和组合物中用到的序列为重组序列—即使用重组DNA技术制备的序列。这样的技术在文献中得到解释，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Books1-3，Cold SpringHarbor Laboratory Press.

[0137]另外的实施方案提供含有修饰酶的组合物和配方。该组合物含有修饰酶，同时还含有其它成份。

[0138]另外的实施方案提供包含修饰酶的载体、包含修饰酶的细胞和表达修饰酶的方法。此处描述的方法和组合物中使用的核苷酸序列可被掺入到重组可复制载体上。该载体可以用来复制以及在相容的宿主细胞中和/或从可相容的宿主细胞，以酶的形式表达核苷酸序列。表达过程可以用调控序列，例如调节序列进行调控。通过表达核苷酸序列由宿主重组细胞产生的酶可以被分泌出来或者内含于胞内，这取决于使用的序列和/或载体。编码序列可以设计成具有信号序列，该信号序列引导物质编码序列分泌通过原核或真核细胞膜。多核苷酸可以被插入到重组可复制载体中。该载体可以用来在相容性宿主细胞中复制核酸。包含多核苷酸序列的载体可以转化进入合适的宿主细胞内。合适的宿主包括细菌、酵母菌、昆虫和真菌细胞。

[0139]修饰酶及其多核苷酸可以通过向可复制载体引入多核苷酸，向相容性宿主细胞中引入该载体以及在可使载体复制的条件下培养宿主细胞来表达。载体可以从宿主细胞中回收。

[0140]修饰酶核酸可以操控性地连接在感兴趣的宿主细胞中的活性转录和翻译调控元件之上。修饰酶核酸也可以编码融合蛋白，该融合蛋白包含信号序列，诸如，例如那些从来自Schwanniomyces occidentalis的葡糖淀粉酶基因、来自Saccharomycen cerevisiae的α-因子交配型基因以及来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的TAKA-淀粉酶衍生出的序列。可选地，修饰酶核酸可编码包括膜结合区(membrane binding domain)的融合蛋白。

[0141]在宿主生物体中使用表达载体，可以使修饰酶在期望的水平被表达。包含修饰酶核酸的表达载体可以是能够在所选宿主生物体中表达编码修饰酶核酸序列的基因的任何载体，并且载体的选择取决于其将被引入的宿主细胞。因此，载体可以为自主复制载体，即，以游离实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，诸如，例如质粒、噬菌体或者附加体成份、微型染色体或者人工染色体。可选地，载体可以是这样的载体，当被引入宿主细胞时，它被整合到宿主细胞的基因组并且与染色体一同被复制。

[0142]表达载体一般包括克隆载体的组分，诸如，例如允许载体在选出的宿主生物体中自主复制的成份，以及一个或多个出于选择目的的表型地探测的标记物。表达载体通常包含控制核苷酸序列，该控制核苷酸序列编码启动子、操纵基因、核糖体结合部位、翻译起始信号以及任选地，阻遏基因或者一个或多个激活基因。另外，表达载体可以包含编码氨基酸序列的序列，该氨基酸序列能够将修饰酶靶向宿主细胞细胞器，如过氧化物酶体或者靶向特定宿主细胞区室。这样的靶向序列包括但不仅限于SKL序列。对于在调控序列引导下的表达，修饰酶核酸序列以与表达相关的合适的方式可操控地连接于调控序列(control sequence)上。

[0143]优选地，载体中的多核苷酸可操控地连接于调控序列上，该调控序列能够提供宿主细胞对编码序列的表达，即该载体是表达载体。调控序列可以被修饰，例如，通过添加进一步的转录调节元件来使调控序列所指导的转录水平对转录调节剂更加响应。该调控序列(controlsequence)可以特别地包含启动子。

[0144]在载体中，编码修饰酶的核酸序列可操控地与合适的启动子序列相结合。启动子可以是在选定的宿主生物体中具有转录活性的任何DNA序列，并且可以衍生自与宿主生物体同源或异源的基因。指导修饰核苷酸序列转录，诸如细菌宿主中修饰酶核酸的转录的合适的启动子例子包括E.coli(大肠杆菌)的lac操纵子的启动子，Streptomycescoelicolor(天蓝色链霉菌)琼脂糖酶基因dagA启动子，Bacilluslicheniformis(地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子，Bacillussubtilis(枯草芽孢杆菌)的aprE启动子，Bacillus stearothermophilus(嗜热脂肪芽胞杆菌)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子，Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子，Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)xylA和xylB基因的启动子以及衍生自Lactococcus sp.(乳球菌种)-衍生启动子的启动子，包括P170启动子。当编码修饰酶的基因在菌种，诸如E.coli(大肠杆菌)中得到表达，就可以从例如包括T7启动子和噬菌体λ启动子(phage lambda promoter)的噬菌体启动子中挑选出合适的启动子。对真菌种中的转录，有用的启动子例子是那些衍生自编码Aspergillus oryzae(米曲霉)TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei(米黑根毛霉)天冬氨酸蛋白酶、Aspergillus niger(黑曲霉)中性α-淀粉酶、A.niger(黑曲霉)酸稳定α-淀粉酶、A.niger(黑曲霉)葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei(米黑根毛霉)脂酶、Aspergillusoryzae(米曲霉)碱性蛋白酶、Aspergillus oryzae(米曲霉)丙糖磷酸异构酶或Aspergillus nidulans(构巢曲霉)乙酰胺酶的基因的启动子。适合在酵母种中表达的启动子的例子包括但不仅限于Saccharomycens cerevisiae的Gal 1和Gal 10启动子以及Pichia pastoris(甲醇酵母)AOX1或AOX2启动子。

[0145]合适的细菌宿主生物体的例子是那些革兰氏阳性细菌菌种，诸如Bacillaceae(芽孢杆菌科)，包括Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)、Bacillus lichenifomis(地衣芽孢杆菌)、Bacillus lentus(迟缓芽孢杆菌)、Bacillus brevis(短小芽孢杆菌)、Bacillus stearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)、Bacillus coagulans(凝结芽孢杆菌)、Bacillus lautus、Bacillusmegaterium(巨大芽孢杆菌)和Bacillus thuringiensis(苏芸金芽孢杆菌)；Streptomyces(链霉菌)菌种，诸如Streptomyces murinus，包括Lactococcusspp.(乳球菌属)的乳酸菌种，诸如Lactococcus lactis(乳酸乳球菌)，Lactobacillus spp.(乳杆菌属)，包括Lactobacillus reuter i(路氏乳杆菌)，Leuconostoc spp.(明串珠菌属)，Pediococcus spp.(片球菌属)和Streptococcus spp.(链杆菌属)。可选地，属于Enterobacteriaceae(肠杆菌科)，包括E.coli(大肠杆菌)，或者属于Pseudomonadaceae(假单孢菌科)的革兰氏阴性细菌菌株可以被选为宿主生物体。合适的酵母酵母宿主生物体可以从生物技术相关的酵母菌种中选出，诸如但不仅限于这些酵母菌种，例如：Pichiasp.(毕赤酵母属)，Hansenula sp(汉逊酵母属)或Kluyveromyces(克鲁维酵母)，Yarrowinia菌种或Saccharomyces菌种，包括Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)或者属于Saccharomyce的菌种，诸如，例如S.Pombe(裂变酵母)菌种。优选使用甲基营养酵母菌种Pichia pastoris(甲醇酵母)菌株作为宿主生物体。优选地，宿主生物体为Hansenula(汉逊酵母)菌种。丝状真菌中合适的宿主生物体包括Aspergillus(曲霉)菌种，例如Aspergillus niger(黑曲霉)，Aspergillusoryzae(米曲霉)，Aspergillus tubigensis，Aspergillus awamori(泡盛曲霉)或Aspergillus nidulans(构巢曲霉)。可选地，使用Fusarium(镰刀菌)种的菌株，例如Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)或者Rhizomucor(根霉)种的菌株，诸如Rhizomucor miehei(米黑根霉)作为宿主生物体。其它合适的菌株包括Thermomyces(嗜热菌)和Mucor(毛霉)菌种。

[0146]包含多核苷酸的宿主细胞可以用来表达多肽，诸如此处公开的修饰酶及其片段、同系物、变体或者衍生物。宿主细胞可以在允许蛋白表达的合适的条件下培养。多肽的表达可以为组成型(constitutive)，使得它们可以不断地被生产出来；或者为诱导型，需要刺激来引发表达。在诱导型表达的情况下，在需要的时候可以通过例如向培养基中添加诱导物，例如地塞米松或IPTG来引发蛋白生产。可以使用本领域已知的多种技术将多肽从宿主细胞中提取出来，这些技术包括酶学的、化学的和/或渗透裂解(osmotic lysis)以及物理的破坏。多肽也可以在体外无细胞系统中重组地生产，诸如TnT^TM(Promega)兔网织红细胞系统(TnT^TM(Promega)rabbit reticulocyte system)。

[0147]在第三个方面，本发明涉及对酶进行修饰的方法，包括在结构定义区域的酶部分上修饰第一位点，使得第一位点可以结合第二位点上。在优选的实施方案中，第一位点在环上或者在邻近β折叠的序列上。在优选的实施方案中，第二位点位于β折叠中。在优选的实施方案中，修饰酶为木聚糖酶或者部族C酶。

[0148]在优选的实施方案中，本发明涉及修饰的木聚糖酶或对木聚糖酶(或修饰酶)进行修饰的方法，该方法依照下面至少一条：(i)修饰N-末端序列，使得N末端区域被二硫桥结合在邻近的β链上(参见Gruber，等，1998，T.reesei Xyn II中分别对应氨基酸1-4和24-30)；(ii)对C-末端(T.reesei Xyn II中氨基酸183-190，参见Gruber，等，1998)进行修饰，使得它连接在邻近的β链上；(iii)对酶的α螺旋进行修饰，使其更加牢固地结合在蛋白质的主体上；(iv)对至少一个邻近的环进行修饰，使其与邻近的β链B6a相结合(T.reesei Xyn II中氨基酸91-94，Gruber等，1998)或者(v)对Xyn II的等价残基进行修饰，如上面提供的。

[0149]如另一个实施方案，(通过实施例)可以用诱变，在不同区域形成二硫桥、盐桥和独立的点突变(point mutation)。例如，酶可以被修饰，形成至少一个二硫桥，使得在至少一个的二硫桥处可以：1)稳定N-末端区域或者将N-末端β链连接到邻近的β折叠上(Xyn II上2-28，5-19，7-16，10-29位，或者等价的位置，如此处公开的)；2)稳定α螺旋区域(Xyn II上105-162，57-153，110-151，111-151，或者如此处公开的等价的位置)；3)稳定C-末端区域(Xyn II中63-188，61-190，36-186或34-188，或者如此处公开的等价的位置)；或者4)通过结合到在诸如B6b(Xyn II中92-144，113-143或者如此处公开的等价的位置)的β链上来稳定环，以及/或者5)稳定β折叠(Xyn II中26-38，61-149，63-147，65-186，67-184位，或者如此处公开的等价位置)。[0150]可以在酶的不同位置(例如Xyn II中的22，180，58或者+191D位，或者等价的位置，如此处公开的)生成盐桥，并且可以在分子的不同位置(例如Xyn II中108，26，30，67，93，97，132，157，160，165，169或者186位，或者等价位置，如此处公开的)引入单点突变，从而增加蛋白质的热稳定性和/或嗜热性和/或嗜碱性。如Y5突变体中，作为重组改变，添加一个氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，使得C-末端可以与酶的主体结合得更牢固，该氨基酸可以随后在C-末端和酶的主体之间形成盐桥。如果合适的话，可以在蛋白质的主体上进行适当的氨基酸替换，使其可以通过α螺旋或者α螺旋的邻近区域，形成盐桥或者稳定酶的C-末端部分。

[0151]依照本发明的这个方面，可以产生另外的突变型。家族11和12酶的N末端β链A1或者N末端环的结构，被描述成先于/直到通向β链B1的β转角结构的β链、β折叠A的一部分，或者被描述为β折叠的第一个β链之前的N-末端环(参见

等，Biochemistry 1995，34，847-856；Sandgren，等，J.Mo1.Bio.(2001)308，295-310；Gruber，等，1998)。N-末端区域的B1β链被描述成先于/直到β转角结构的β折叠B的β链部分，该β转角结构通向β链B2，或者被描述为β折叠的第一个β链之前的环。β链A1区域优选结合于β链A2或者结合于任何邻近的其它区域(XynII或者它的等价物)。β链B1区域优选结合于β链B2或者结合于任何邻近的其它区域(XynII或者它的等价物)。在Xyn II中A1包含残基1-4，A2包括残基25-30，B1包含残基6-10，B2包含残基13-19。

[0152]家族11和12酶中C末端β链A4或者C末端环的结构为β链A3和A5之间β折叠的β链部分或者如下面的β折叠A4的环(参见等，Biochemistry 1995，34，847-856；Sandgren，等，J.Mol.Bio.(2001)308，295-310；Gruber，等，1998)。β链A4区域优选结合于β链A3或A5或者结合于任何其它邻近区域。在Xyn II中A4为残基183-190，A3为残基33-39，A5为残基61-69。家族11和12的索被描述为连接β链B6b与B9的环。家族11和12B6b的β链被描述为索之前的β链(参见

等，Biochemistry 1995，34，847-856；Sandgren，等，J.Mol.Bio.(2001)308，295-310；Gruber，等，1998)。β链B6b区域可以连接于索或者β链A6和B7之间的环上，或者连接于任何其它邻近的区域上。在Xyn II中，B6b为残基90-94，B9为残基103-110，索为95-102，β链A6为残基148-152，β链B7为残基134-142，β链A6和B7之间的环为143-147。

[0153]家族11和12酶的螺旋被描述成β链A6后面的区域并且形成平行于β链B9的螺旋结构(

等，Biochemistry 1995，34，847-856；Sandgren，等，J.Mol.)。家族11和12酶的螺旋优选结合于β链B9或者其它任何邻近的区域。在Xyn II中，螺旋为残基153-162，β链A6为残基148-152和β链B9为残基103-110。

实施例

实施例1

用于木聚糖酶II表达和诱变模板的质粒

[0154]编码Trichoderma reesei(里氏木霉)XYNII基因产品的开放式阅读框(open reading frame)，通过聚合酶链反应(PCR)，从T.reesei(里氏木霉)cDNA文库被扩增。XYNII cDNA被克隆进入pKKtac(VTT，Espoo，Finland)或者可选地被克隆进入pALK143(ROAL，

，Finland)。

实施例2

用定点诱变来产生木聚糖酶II突变体

[0155]正如在实施例1中描述的，包含cDNA编码木聚糖酶II的表达载体，被用作连续PCR扩增中分步定点诱变的模板。包含X-Y突变的改变密码子的合成寡核苷酸引物，被用来将期望的改造插入到天然木聚糖酶II原来的氨基酸序列中。通过该方法，产生了野生型酶突变体的92，93和144位的残基，将xyn II上环N143-S146结合到邻近的β链上。另外，执行诱变过程，在木聚糖酶原先序列的22，65，97和108位产生突变。图3显示了诱变中使用的寡核苷酸序列。根据标准的PCR过程，如QuickChange Site-directed mutagenesis(快速改变定点诱变)(Stratagene，LaJolla，Ca，USA)中所述，进行PCR。用PfuTurbo(Stratagene)作为DNA聚合酶来扩增质粒DNA。定点诱变PCR扩增得到的质粒DNA被转化入E.coli XL-1 blue，然后经转化的细菌细胞在LB上进行繁殖，用100μg/ml的氨苄青霉素，进行质粒DNA的选择和突变DNA的扩增。质粒被分离和测序，以确认其包含期望的突变。编码突变变异体的突变质粒DNA在E.coli中被过量表达，以检查诱变对T.reesei木聚糖酶Y5突变体酶性质的影响。

实施例3

E coli菌株中修饰XYN II基因产物的产生以及木聚糖酶活性的测试

[0156]对于木聚糖酶II的突变变异体过量表达的E.coli菌株，在补充了1％桦木木聚糖(Sigma，Steinheim，Germany)以及考马斯亮兰(Rhemazol Brilliant Blue)的平板中被培养。考马斯亮兰加上木聚糖可以用来检测木聚糖酶的活性，由于细菌菌落周围蓝色的消失显示木聚糖酶的活性，因此通过特征环的形成可以很容易地显示木聚糖酶的活性(Biely等，1985)。

[0157]突变的木聚糖酶基因(参见上面的实施例2)，于+37℃，在摇瓶中，在LB培养基中，在E.coli中被表达。对表达酶突变体的细胞培养物进行离心，细胞沉淀从包含酶的上清液中分离出来，该酶是从细胞中分泌到培养基中的。根据标准的方法，对木聚糖酶的酶活性进行检测。包含分泌的木聚糖酶突变体的生长培养基被置于1％的桦木木聚糖(Sigma)中，在50℃下，在50mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph5.0-t)以及50mM pH7-9的Tris-HCl中，温育10分钟(Bailey等，1992)。如果需要的话，用高温灭活生长培养基稀释样品。突变变异体的酶促活性与野生型和Y5突变酶，在不同的条件下对照检测(参见Bailey等，1992)。

实施例4

测定木聚糖酶II突变体的温度依赖稳定性和pH依赖活性

作为温度函数的活性

[0158]突变变异体的木聚糖酶活性在不同的温度和选定的pH之下被测定(参见此处的图)。突变体用1％的桦木木聚糖(Sigma)，在50mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph4.5-7)或者50mM pH7-9的Tris-HCl中温育10分钟。对释放的还原性糖的相对量，用实施例3中描述的DNS方法进行检测。

残留活性

[0159]突变变异体在无底物的条件下，在不同温度下温育10分钟。灭活以后，样品在冰中冷却，用实施例3中描述的DNS方法检测残留活性。

pH依赖活性

[0160]pH依赖的木聚糖酶活性是通过检测pH变化范围为XX-YY下的酶活性来确定，该酶在选定温度(参见图)下，1％桦木木聚糖中，在50mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph4.5-7)以及50mM pH为7，5-9的Tris-HCl中，温育10分钟。这依照实施例3中描述的DNS检测。

实施例5

制备和测试改进性质的突变木聚糖酶

[0161]突变木聚糖酶被制备成，在分子不同区域上具有一个或多个取代。该取代或者为与其它独立点突变相联系的独立点突变，或者它们被制备成，对普遍存在于家族11和12酶的结构要素起作用。如实施例所述对酶进行检测。“结构”取代(“structural”substitution)的例子在此被公开并在实施例中显示。

[0162]二硫桥可以放置于2位和28位(T2C，T28C)之间。图4显示了在取代野生型的残基以得到更嗜热的突变体的过程中N-末端区域的重要性。相似地，去除T.seesei EGIII中原有的二硫桥(Cel 12A编号，C4和C32残基)对酶的稳定性造成了巨大的影响，如提供的图中以及此处的表中所显示(特别参见表A)。

[0163]被称为β链B6b(如在Gruber等)的家族11和12所普遍拥有的β折叠区域，显示出对稳定性很重要，特别是在碱性条件下。这个影响可以在取代中(与Y5变异体比较)看到，如对P12，pH9与pH5比较，稳定性改善，如图中显示(参见，例如，图9，图10，图11)。

[0164]可以通过影响相同β链的不同突变集合(尽管处于相同区域)，清楚地证明该区域的重要性。当93位、97位和144位被取代(F93W，N97R，H144K，图中的P9)时，可以在图9中看到，对酶稳定性的影响与取代92位和144位(N92C，H144C＝图中P12)时相似。

[0165]下面可以看到在22位和180位独立取代的改进性质的例子。包含H22K和F180Q取代(图14中的P20)的变异体在pH7.8下，比Y5显示出了增强的热稳定性。

[0166]C-末端区域同样对稳定性很重要。在取代S65C、S186C(图中的J21)，酶在pH8下对于温度显示了改进的活性。

[0167]本领域的技术人员会很容易地意识到，本发明可以被很好地改动，以实施对象，获得提及的结果和好处，以及其中所固有的结果和好处。在此所描述的分子复合物、方法、过程、处理、分子、特定化合物目前都是优选实施方式的代表，都是示例性的，并且并不意欲对本发明的范围进行限制。对本领域的技术人员来说，显而易见，可以对此处公开的发明进行各种替代和修饰而不背离本发明的范围和精神。

[0168]本说明书中提及的所有专利和出版物都表示本发明所属领域的技术人员的水平。在此引入所有专利和出版物作为参考，其引用程度如同每个出版物个体都特别地和单独地被引用来作为参考。

[0169]在此说明性地适当描述的本发明，在缺少此处没有特别公开的一个或多个任何成份、一个或多个限制条件的情况下，也可以被实施。所使用的术语和表达方式是作为描述的术语，而并不是作为限制的术语，并且并不意图使用这些术语和表达来排除所示和所述特性的任何等价特性或其部分，但应该认识到，在本发明要求保护的范围内，多种修饰都是可行的。因此，应该理解，尽管本发明通过优选实施方案和优化的特性被具体地公开，但本领域的技术人员可以对此处所公开的概念进行修饰和改变，并且这些修饰和改变被认为落入所附权项要求所定义的本发明的范围内。

[0170]在此宽泛地和一般性地描述了本发明。每个落入总的公开内容之内的较窄范围的种类和从属种类集合也形成本发明的部分。这包括用附带条款和负向限制对本发明的总体描述，这些附带条款和负向限制从类别中去除任何从属的内容，无论去除的材料是否在此处被特别地陈述。

Claims (32)

1.核酸，其编码修饰的木聚糖酶，所述木聚糖酶包含具有如SEQID NO：1所示的氨基酸序列的多肽，其中所述序列在选自下面的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。

2.如权利要求1所述的核酸，其中所述取代选自：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。

3.如权利要求2所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有至少一个取代，取代选自：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。

4.如权利要求3所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：F93W，N97R和H144K。

5.如权利要求3所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：H144C和N92K。

6.如权利要求3所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：F180Q，H144C和N92C。

7.如权利要求3所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：H22K和F180Q。

8.如权利要求3所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：V108H。

9.如权利要求3所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：S65C和S186C。

10.如权利要求3所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：H22K，F180Q，H144C和N92C。

11.修饰的木聚糖酶，其包含具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽，其中所述序列在选自下面的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。

12.如权利要求11所述的木聚糖酶，其中所述取代选自2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。

13.如权利要求12所述的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶具有至少一个取代，取代选自：H22K，S65C，N92C，F93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F180Q和S186C。

14.如权利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：F93W，N97R和H144K。

15.如权利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：H144C和N92K。

16.如权利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：F180Q，H144C和N92C。

17.如权利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：H22K和F180Q。

18.如权利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：V108H。

19.如权利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：S65C和S186C。

20.如权利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突变：H22K，F180Q，H144C和N92C。

21.修饰酶，所述修饰酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：1所示的序列同源，所述氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。

22.如权利要求21所述的酶，其中与SEQ ID NO：1中所示的序列的同源性为至少20％。

23.如权利要求22所述的酶，其中所述氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。

24.部族C的糖基水解酶，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示的序列同源，所述氨基酸序列在与选自下面位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。

25.如权利要求24所述的糖基水解酶，其与SEQ ID NO：1中所示的序列的同源性为至少20％。

26.如权利要求25所述的糖基水解酶，其中所述氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。

27.修饰的家族11木聚糖酶，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示的序列同源，所述氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。

28.如权利要求27所述的木聚糖酶，其与SEQ ID NO：1所示的序列的同源性为至少20％。

29.如权利要求28所述的木聚糖酶，其中所述氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。

30.家族12纤维素酶，其包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示的序列同源，所述氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代氨基酸残基：2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。

31.如权利要求30所述的纤维素，其与SEQ ID NO：1中提出的序列的同源性为至少20％。

32.如权利要求31所述的纤维素，其中所述氨基酸序列在与选自下面的位置等价的位置上具有至少一个取代的氨基酸残基：2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。

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