CN101413010A - 用于转化嗜酸硫杆菌属细菌的质粒及转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)细菌，如嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)和嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)中的功能质粒。以及利用这些质粒成功转化嗜酸硫杆菌属细菌，如嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸喜温硫杆菌的方法。
Description
技术领域
本发明公开了嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)细菌，如嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)和嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)中的功能性质粒。以及利用这些质粒成功转化嗜酸硫杆菌属细菌，如嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸喜温硫杆菌的方法。
背景技术
嗜酸硫杆菌属的细菌具有嗜酸、自养和化能无机营养的特点，换言之，它们生活在pH 0-4的酸性环境中，其碳源为CO2，能量来源为无机化合物。嗜酸硫杆菌属细菌中有两种对于生物采矿具有重要意义，分别是嗜酸氧化亚铁硫杆菌和嗜酸氧化硫硫杆菌。另外，嗜酸喜温硫杆菌在生物采矿过程中也起着越来越重要的作用。
所谓生物采矿，通常来讲，是指利用微生物从矿石中提取金属。其最传统且重要的表述为生物浸矿，但生物采矿不只限于该过程，它还包括所涉及微生物的监视和干预-这些技术很复杂而且是不断发展的-及与过程优化相关的实验室水平研究或者新技术的发展。
生物浸矿被定义为在酸性介质中利用微生物的直接或间接作用从复杂基质中溶解金属的方法(Rawlings D.E.Microb.Cell Fact.2005；4(1)：13)。当微生物作用于金属本身或其抗衡离子(counter ion)，释放目的金属离子到溶液时，这种作用就是直接的。另一方面，当微生物并不将目的金属或者其抗衡离子作为底物，而是产生加速并促进所述金属溶解的化学环境，其中或者通过酸化介质(例如，产生硫酸)或者因为其产生氧化剂而最终与待溶解的盐分(金属和抗衡离子)相互作用，这种作用是间接的。属于嗜酸硫杆菌属的物种，嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸喜温硫杆菌，都能够产生成分，这些成分利用氧作为电子受体增加还原性硫化合物(例如硫化物、元素硫、硫代硫酸盐等等)的氧化速率。在该过程中，它们产生硫酸作为终产物，和还原型如亚硫酸盐和硫代硫酸盐作为中间产物，其能够溶解矿石中与硫化物相关的金属，特别提及的是，嗜酸氧化亚铁硫杆菌与某些生物学成分利用氧作为电子受体共同促进二价铁变成三价铁。产生的三价铁作为强氧化剂能够氧化硫化物或其它任何待氧化的化合物。
既然嗜酸硫杆菌属细菌如此重要，人们很自然地会想到通过建立有效的转化方法对这些细菌进行遗传操作，以提高其氧化活性、在其内整合目的功能如对有毒化合物的抗性、或更深入地了解其代谢机制。
修饰细菌遗传负荷的最传统方法是利用转化过程。该过程是指将目的DNA片段直接整合到待转化的微生物中。其中有很多种转化技术，最常见的是电穿孔。
嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus spp.)的所有操作都是非常复杂的；既使在实验室中进行培养也不是那么简单。这是因为该细菌必须保存在极端酸性pH值中，而且其所利用作为底物的矿石也是不清楚的，或者当遇到铁时在培养基中以盐的形式沉淀下来，或者是粒子如元素硫。可用肉眼观察到铁沉淀物，因为在菌落中可看到微红色的核。另一方面，由于细菌粘附于特定的物质，导致在洗涤阶段生物量的损失，而洗涤对于任何微生物操作技术都是必需的。
由于上述原因，有必要提供合适的尤其针对这些细菌设计的转化方法。已经设计了一种转化方法以成功进行嗜酸硫杆菌属细菌如嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸喜温硫杆菌等的转化。
正如上面提到的，最常用到的微生物转化方法之一是电穿孔。电穿孔本质是利用短暂的高强度放电使细胞膜暂时通透化。在细胞膜上形成瞬时通透的区域或结构称为微孔，载体正是通过这些区域或结构进入细胞。
如果利用硫化铁作为底物，则嗜酸硫杆菌属细菌的电穿孔就变得很难，因为细菌上亚铁盐的存在能够破坏转化载体。另一方面，如果利用硫磺作为底物，由于粘附于颗粒性物质上的部分细菌会丢失，因此培养物将会在洗涤后减少。
但是不仅转化方法不同，所用的遗传载体应当具有某些特性使其在细胞有功能。其中之一是复制起始原点(ori)。某些情况下它们对不同属是特异的甚至对特定种是特异的，正因为此，即使我们能够成功转化嗜酸硫杆菌属细菌，我们也不能实现载体表达，除非我们具有适于嗜酸硫杆菌属的复制系统。理想地，其需要获得嗜酸硫杆菌属质粒，而且其复制起始原点能够整合到转化载体上。最好还具有强启动子以保证目的基因转录。
到目前为止只报道过很少的嗜酸硫杆菌质粒，更不用说特征化了。Rawlings研究了其中的两种质粒(Rawlings D.E.，2005，Plasmid 53：137-147)，但没有描述它们在转化中的用途。
在English的文章(English等人1995，Appl.Environ.Microbiol.，61：3256-3260)中，利用分离的嗜酸中间硫杆菌(Acidithiobacillus intermedius)质粒的复制子和嗜酸那不勒斯硫杆菌(Acidithiobacillus neapolitanus)中与羧酶体形成有关的肽的基因构建的载体电穿孔转化嗜酸那不勒斯硫杆菌。在这种情况下，即使确实能发生转化，也察觉不到整合蛋白质的表达，所以不能产生成功转化类型。
涉及嗜酸硫杆菌转化主题的另一篇文章是Kusano所发表的(Kusano等人，1992，J.Bacteriol.，174：6617-6623)，其中对嗜酸氧化亚铁硫杆菌进行了转化，但并没有公开该物种的质粒。事实上，作者利用以前从嗜酸氧化亚铁硫杆菌中分离的抗汞操纵子mer操纵子来构建载体。共电穿孔30个独立的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株，但它们中仅有一个发生转化，效率为每微克载体120-200个抗汞菌落。这种转化效率是非常低的，因此并不是合适的转化方案。实际上，Kusano并没有其它涉及该技术的研究工作，而且其后来的适用性也没有得到验证，因为其他嗜酸硫杆菌研究组一直没能重复出Kusano的研究结果。
有3篇文章通过利用大肠杆菌作为供体以结合方式实现了嗜酸硫杆菌转化(Yankofsky等人，1983，J.Bacteriol.，153：652-657)，(Jin等人1992，Appl.Environ.Microbiol.，58：429-430)和(Liu等人2000，J.Bacteriol.，182：2269-2276)，但都没有得到较好的转化效率。
总之，在目前的技术发展水平下，既没有用于嗜酸硫杆菌属细菌转化的特异功能质粒，也没有能够实现有效转化的方法，特别是对于嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸喜温硫杆菌。
通过构建嗜酸硫杆菌属的特异功能质粒，并通过改进和发展嗜酸硫杆菌的特异转化方法使这一技术难题得到解决，该质粒包含分离的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Wenelen DSM 16786)和嗜酸氧化硫硫杆菌(Licanantay DSM 17318)质粒的复制起始原点(ori)，其连接到从Wenelen(DSM 16786)菌株分离的表达启动子。
发明内容
本发明公开了能够成功转化嗜酸硫杆菌属细菌如嗜酸氧化亚铁硫杆菌种、嗜酸氧化硫硫杆菌种和嗜酸喜温硫杆菌种的质粒及转化方法。
这些质粒包含从嗜酸氧化亚铁硫杆菌中分离的质粒的复制起始原点(ori)，表示为序列1或其反向互补序列，和从嗜酸氧化硫硫杆菌分离到的质粒的复制起始原点(ori)，表示为序列2或其反向互补序列。还包括从Wenelen(DSM 16786)菌株分离的还原酶的表达启动子Pnit，Biosigma的性质，表示为序列3。如将在后面描述的Pnit启动子的优点(图3)是其强烈促进受其调控基因的表达。
描述了穿梭型克隆遗传载体(质粒)，这些载体包含至少一个序列1和2所示的ori，序列3所示的表达启动子Pnit，特异用于其它基因的另一个复制起始原点，多克隆位点以及至少一个标记或报告基因。
转化方法包括对嗜酸硫杆菌的培养条件进行逐步调整以使它们适于转化本发明的质粒。
调节嗜酸硫杆菌培养物的pH值到5-7，并且将底物修饰成连四硫酸盐。如有必要，可先将底物由硫酸亚铁修饰成元素硫作为中间底物，最后再修饰成连四硫酸盐。一旦培养物在该条件下保持稳定，就利用已知的任何转化技术尤其是电穿孔进行转化。
附图简述
图1.显示可用于转化嗜酸硫杆菌属细菌的优选遗传载体图谱。该图谱显示了pUC ori；本发明的ori 1或2；带有其自身启动子的赋予卡那霉素(Kan)抗性的基因，P kan；带有其自身启动子的1acZ基因，P 1ac；和多克隆位点，包括Pnit启动子及组氨酸尾(His 6)的MCS。具有本发明ori 1的载体对应于pBM-3 而具有本发明ori 2的载体对应于pBM-4 
图2.显示多克隆位点序列，显示MCS中的Pnit启动子，多克隆限制性位点和6个末端组氨酸序列。
图3.显示评估克隆在本发明载体中的蛋白质表达情况的凝胶照片。嗜酸氧化亚铁硫杆菌our Wenelen(DSM16786)菌株的铜蓝蛋白基因作为克隆基因被整合到pBM-3 
载体上。该载体用于转化大肠杆菌DH5α培养物，克隆的蛋白质随后利用组氨酸亲和柱(NTA-琼脂糖)进行纯化。作为阴性对照，用不带有所述克隆基因的pBM-3 PnH 
载体转化大肠杆菌DH5 α培养物。由化学发光western-blot检测纯化产物，其利用能识别六组氨酸序列的特异抗体，经化学发光和放射自显影洗涤显影。泳道1和2分别对应于用含有嗜酸氧化亚铁硫杆菌铜蓝蛋白基因构建体转化的两个大肠杆菌DH5α克隆的纯化物。泳道3显示仅转化了pBM-3 PnH 载体的大肠杆菌克隆阴性对照。
结论：在pBM-3 PnH 
载体中观察到克隆的铜蓝蛋白高表达。这证明Pnit启动子强力促进其调控基因的表达。
图4.显示对应于选择平板上嗜酸氧化亚铁硫杆菌转化体的两个培养平板照片。用含有卡那霉素抗性基因的pBM-3 PnH 
质粒转化嗜酸氧化亚铁硫杆菌培养物。平板A.对应于涂布在不含卡那霉素且pH 5.5 DOP的培养基中的转化体，其最初从kan 50μg/mL pH 5.5 DOP筛选的具有pBM-3 PnH 
的转化体获得。平板B.对应于在含有卡那霉素平板的影印，kan 50μg/mL，pH 5.5 DOP。
结论：在两个平板上都观察到转化的菌落生长，表明本发明的转化方法是成功的。只能在A平板上生长的菌落为不稳定的转化体。共得到4个稳定转化体。
图5.显示来自转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌株培养物的质粒DNA提取物的凝胶照片。泳道1和泳道2分别上样10μL和20μL提取混合物，泳道3和泳道4分别对应100bp和λ HindIII分子标准。
结论：因为能够回收到载体，所以嗜酸氧化亚铁硫杆菌的转化是稳定的。
图6.A.显示kan基因经PCR扩增的凝胶照片。泳道1中的样品，其PCR底物为从pBM-3 PnH 
质粒转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌株中提取的DNA。泳道3中的样品为阳性对照，其PCR底物为纯化的pBM-3 PnH 
质粒，泳道2、4和5中的样品为阴性对照，其中泳道2和5中的底物为水，而泳道4中为从未转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌株中提取的DNA。泳道6和7分别为100bp和λHindIII分子标准。
结论：可以观察到转化的菌株(1)与阳性对照(3)存在相同的条带，而在未转化的阴性对照菌株(4)中没有条带。因此回收的质粒正是pBM-3 PnH 
质粒。图6.B.显示培养平板的照片，所述平板相应于大肠杆菌转化体选择平板。用从转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌克隆中回收的pBM-3 PnH 质粒转化大肠杆菌培养物，该质粒包含卡那霉素抗性基因。该平板为补充有50μg/mL卡那霉素的LB(Luria Bertani)琼脂培养基中的转化体。
结论：由于载体能够完整回收而且可以用于新的转化，因此嗜酸氧化亚铁硫杆菌的转化是成功的。
发明详述
建立一种高效转化嗜酸硫杆菌细菌的方法在生物采矿中至关重要，因为它通过在这些细菌中整合入有利于它们转化的基因来改良细菌，在它们所参与过程中提高它们的效率。为了达到上述目的，获得在该属中有功能的含有复制起始原点的质粒及完成转化的方法很重要。
得到该质粒的第一步是获得嗜酸硫杆菌ori。为了此目的，从嗜酸氧化铁硫杆菌和嗜酸氧化硫硫杆菌菌株中分离质粒。得到这些质粒之后，进行测序并加以研究以确认它们中可能的ori。
在所有情况下，确定可能的ori的存在，对于序列1，对应嗜酸氧化亚铁硫杆菌，对于序列2，对应嗜酸氧化硫硫杆菌。对本领域技术人员来说，每个DNA序列显然等价于其反向互补序列。据此，每次我们所指的某一序列，对于序列1或序列2，也指其反向互补序列。
获得嗜酸硫杆菌属细菌特异的ori允许我们首次构建高成功率的转化载体，当构建的载体不含有表达启动子时用来克隆，或者当构建的载体含有表达启动子时用于表达。
本发明的质粒优选含有从Biosigma所有的Wenelen(DSM 16786)菌株分离的表达启动子。选择在该菌株基因组中鉴定的固氮酶启动子Pnit作为不同培养条件下都能高水平表达的强启动子。Pnit如序列3所示。由于我们的载体中含有Pnit，因此能够确保受该启动子调控的目的基因强表达。
一旦获得了嗜酸硫杆菌的ori，序列1和序列2，以及Pnit启动子，序列3，就可以设计含有这些的转化载体。
特别设计了在两种不同的属或种中都有功能的穿梭载体。在这种情况下，除了嗜酸硫杆菌的ori，序列1和序列2外，所述载体还包含特异于其它属的另一个复制起始原点。该载体还包含Pnit启动子、多克隆位点以及至少一个标记基因或报告基因。
从本领域已知的任何一个复制起始原点中选择第二个复制起始原点，如ori pUC、ori ColE1、ori p15A、ori NTP1、ori pBR345、ori pBR322、ori R6K等，优选ori pUC。
设计遗传载体时，多克隆位点连接于报告基因，因此在所述克隆位点插入基因则造成报告基因不能表达。这样就能够确定在克隆位点是否成功插入目的基因。为了进行克隆，选择识别多克隆位点内序列的限制性内切酶，确保该序列不存在于目的基因中。
从已知的能够通过底物颜色变化、发光或其他特征进行鉴定的报告基因中选择连接克隆位点的报告基因，如1acZ(β-半乳糖苷酶)、gfp(绿色荧光蛋白)、1uc(萤光素酶)等。报告基因尤其是β-半乳糖苷酶，1acZ基因。
该载体具有能够通过筛选进行鉴定的标记基因，该基因从抗生素抗性基因中选择。尤其优选赋予卡那霉素(kan)抗性的基因。
优选的是多克隆位点还含有组氨酸尾，即编码6个组氨酸的序列，其被整合入我们要表达的蛋白质的羧基端并作为其末端氨基酸。包含该肽段的优点在于：首先，抗组氨酸抗体的存在能够方便地用来评估任何所克隆蛋白质的表达；其次，组氨酸六肽使包含它的嵌和蛋白质可以用镍或镉亲和柱进行纯化。
图1代表本发明优选的遗传载体，其中含有pUC ori；本发明的ori1或2；带有其自身启动子的赋予卡那霉素(Kan)抗性的基因，P kan；带有其自身启动子的1acZ基因，P 1ac；以及含有Pnit和组氨酸尾(His 6)的多克隆位点(MCS)。具有本发明ori 1的载体对应pBM-3 PnH 而具有本发明ori 2的载体对应pBM-4 PnH 
可在图2中详细观察该多克隆位点。
图3中证明了Pnit启动子的强度，其显示了克隆在pBM-3 PnH 
中的嗜酸氧化亚铁硫杆菌铜蓝蛋白的表达，而且经亲和柱纯化后被检测到。利用抗组氨酸序列的特异抗体通过化学发光western-blot方法进行检测。泳道1和2对应于用构建体转化的两个大肠杆菌DH5 α克隆的纯化物。泳道3对应作为阴性对照的仅pBM-3 PnH 
空载体转化的菌株的纯化物。可以观察到受Pnit调控蛋白质的强力表达。
本发明的质粒采用本领域已知的方法构建，主要包含嗜酸硫杆菌的ori，序列1和2，以及Pnit启动子，序列3。
嗜酸硫杆菌的ori，序列1和序列2，以及Pnit启动子，序列3都可以单独应用于此说明书未明确预见的其他遗传构建体，这对于本领域技术人员来说是显而易见。每次将序列1的ori或序列2的ori整合入遗传构建体，将显著提高嗜酸硫杆菌中的表达。每次将序列3的Pnit启动子整合入遗传构建载体，连接到所述启动子的序列也将强力表达。所述公开序列用于上述目的的所有应用都将作为本发明的明显修改。
一旦已经构建本发明的质粒，就有必要提供能够使该质粒得以整合入嗜酸硫杆菌的方法。
转化这些细菌首先遇到的困难在于所用的底物几乎干扰所有已知的操作方法。已知这些嗜酸硫杆菌需要铁源和/或硫源作为能量来源。嗜酸氧化亚铁硫杆菌通常以硫酸亚铁作为底物。硫酸亚铁是一种优良底物，虽然当其氧化成铁离子时，培养物的氧功能会升高，在转化发生前通过破坏DNA载体或通过增加电弧形成可能性而干扰电穿孔，所述电弧损伤细胞。适合嗜酸硫杆菌的另一种能量来源是具有不可溶缺点的元素硫，因此只能以微粒的形式加入到培养物中，而且当它将其从培养物中去除时会带走很多存在于培养物中的细菌，因为这些细菌黏附于底物颗粒上。
为了解决该方法中遇到的第一个困难，我们选择利用可溶硫源：连四硫酸盐(tetrathionate salts)。我们已经发现，如果逐渐改变培养，嗜酸硫杆菌属细菌接收连四硫酸盐作为硫源。
在第一阶段，先用元素硫替代常用的硫酸亚铁，然后再用连四硫酸盐替代元素硫。每次改变底物都是通过从原来的培养物中取出一些接种物并使其生长在不同的底物培养基中。在执行新的培养基改变前有必要等待培养物达到稳定。这通常发生在3天到2周内，最通常在改变底物一周后。
转化嗜酸硫杆菌遇到的第二个麻烦是这些细菌生长所需的极端酸性pH值，该pH值通常在甚至小于2的一定范围内。
为了验证转化是否发生，通常在转化载体中整合入一种能赋予转化细胞某种性质的筛选基因，通过该性质可从未转化细胞中区分转化细胞。多数情况下，整合赋予某种抗生素抗性的基因，并通过在培养基中加入这种抗生素来筛选转化体。绝大多数抗生素都是复杂的有机分子，在酸性pH下会发生变性并且其活性被部分或全部抑制。因此pH2给转化的嗜酸硫杆菌的筛选带来了困难。
为了解决这个问题，本发明的方法包括逐渐调节培养物pH值的。每次升高培养基pH 0.5-1，而且每次升高以5-15天时间间隔进行，以确保培养物在每次pH升高之前保持稳定。
通过制备等同于原始组合物的培养基溶液来升高培养基的pH值，利用氢氧化钠调节到较高的pH(每次升高的值介于0.5和1之间)。
培养物pH的升高和培养物底物的改变可以同时或相继实施，先实施哪一步并没有不同。
一旦达到了接近5-7的中性pH值，并利用连四硫酸盐作为底物的嗜酸硫杆菌稳定培养物，就可以运用本领域已知的任一技术实施培养物的转化，特别是电穿孔。如果转化方法需要，可以在转化前用合适的缓冲液进行冰浴漂洗。
一旦用本发明的质粒完成转化，就应在含有筛选成分的平板上培养所述细胞(其抗性包含在转化载体中)。平板在25-45℃下孵育7-14天。长出的菌落就是成功转化的细胞。
本发明实施的一些实例列举如下。这些实例只是对本发明的举例说明，决不限制本发明。
实施例
实施例1.载体构建
通过PCR扩增含有序列1所示ori的片断，然后通过限制性内切酶(PagI/HpaI)定向。从pTOPO载体获得kan片段，并且在ScaI位点连接至图2所示的多克隆位点(MCS)和从pBluescript载体获得的pUC复制起始原点。通过利用T4连接酶将得到的片断在PagI/HpaI位点处与ori1连接。随后将位于XhoI/HindIII酶切位点之间的Pnit启动子和位于SacI位点的六组氨酸序列连接到遗传载体上。
产生的质粒命名为pBM-3 PnH
该质粒预期大小约4500bp，其结构如图1所示。
在标准条件下，通过电穿孔将连接产物转化大肠杆菌。在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上筛选转化体。
在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养卡那霉素抗性菌落，分离抗性克隆的质粒DNA，并且鉴定通过限制性图谱设计的质粒(利用HindIII、HpaI、EcoRI、SmaI等酶切)，并PCR扩增构建的质粒中存在的不同片段。结果表明分离的质粒是构建的载体。
实施例2.通过电穿孔转化嗜酸氧化亚铁硫杆菌
首先，将培养物底物调整成本发明的底物，连四硫酸盐，并且培养物的pH保持不变。
制备10mL在pH 2.5条件下生长的嗜酸氧化亚铁硫杆菌培养物，该培养物以硫酸亚铁作为硫酸盐来源。
吸取1mL所述培养物中作为接种物并将其转移到9mL1％的S培养基中。培养物在30℃培养一周。
然后，将S培养基中的1mL培养液转移到9mL含0.1％连四硫酸盐的9K培养基中，其组成如表1所示。培养物在30℃下培养一周。
表1.
随后将培养物的pH调至接近中性，并维持底物。
为此目的，取1mL含有1％连四硫酸盐、pH 2.5的9K培养物并将其接种入9mL含有0.1％连四硫酸盐的、pH 3.5的9K培养基中。培养物在30℃下培养一周。重复上述步骤，先接种入pH 4.5的培养基，再接种入pH 5.5的培养基。
为了在转化之前提高生物量，将10mL含有0.1％连四硫酸盐、pH 5.5的9K培养物接种入90mL同样的培养基中。该培养物在30℃下培养一周直至饱和。
从该饱和培养物中取出一些培养液，并将其在同样的培养基中稀释至10％，过夜培养以获得新鲜的培养物。
次日上午，8,000rpm离心10分钟收集细胞。将细胞在冰浴中用40mL A溶液(9K盐培养基基础，pH 1.8)漂洗。接着，在冰浴中用40mL B溶液(PBS 5mM、蔗糖0.3M、10mM EDTA，pH 8.0)进行第二次漂洗。最后，在冰浴中用30mL电穿孔缓冲液，即溶液C(PIPES 3mM 
蔗糖272mM，pH 6.4)进行第三次漂洗。
漂洗后，用1mL C溶液悬浮沉淀，在冰上放置直至进行电穿孔。
如实施例1所描述的，利用pBM-3 PnH
载体进行电穿孔。
使用10μL含7g pBM-3 PnH 
载体，然后将其DNA渗析30分钟。在0.2cm容器中对400μL细胞在2,500-3,000V和400Ω条件下进行电穿孔。
每批400μL电穿孔的细胞分别在10mL含有0.1％连四硫酸盐的9K培养基中培养，不进行筛选。另外，作为阴性对照，在不同的烧瓶中用10mL含有1.0％连四硫酸的9K培养基单独培养400μL未电穿孔的细胞。所有的培养物在30℃振荡培养过夜。
次日，制备含有50μg/mL卡那霉素，pH 5.5的DOP平板。DOP固体培养基描述于文献(Liu，Z.等人1999，p.39-49，R.Amils和A.Ballester(编辑)International Biohydrometallurgy Symposium，Elsevier，Amsterdam，The Netherlands)，(Peng，J.B.等人，1994，J.Gen.Appl.Microbiol.40：243-253)中。每批培养物中取200μL样品均匀地涂布在制备的平板上，两次重复。平板在30℃下培养7天。所有的平板都显示存在转化体。然后，将其中一个平板影印在无卡那霉素、pH 5.5的DOP固体培养基中(A.)，和含有50μg/mL卡那霉素、pH 5.5的DOP液体培养基中(B.)。图4显示了这两个平板的照片。在没有卡那霉素平板A中，获得所有的最初转化克隆。然而，在含有卡那霉素的平板B中，只有能继续表达基因的稳定转化体才能生长。在这种情况下，获得了4个稳定转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌克隆。
利用能识别转化载体中存在的卡那霉素抗性基因的引物，同时针对筛选培养基(B)上生长的4个菌落，即1、2、3和4进行PCR检测。也检测了未修饰的阴性对照，以pBM-3 PnH 
载体作为阳性对照的模板。扩增结果表明这些克隆含有卡那霉素基因，并且得到了与阳性对照相同大小的条带。
实施例3.从转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株中回收载体。
用碱裂解法从用pBM-3 PnH转化的
并在含有50μg/ml卡那霉素的9K硫培养基中生长的嗜酸氧化亚铁硫杆菌克隆中分离质粒DNA。如图5所示，先制备一块凝胶来确定载体的存在，在第一个泳道加入10μL提取混合物，在第二个泳道加入20μL从转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株中提取的同样的质粒DNA提取混合物。第三个和第四个泳道分别对应100bp和λ HindIII分子标准物样品。显示的条带与载体的预期大小一致。这就表明，既然载体能被回收，那么转化是稳定的。
另外一种验证转化成功的方法是用PCR扩增载体中包含的卡那霉素(kan)抗性基因。分别对用pBM-3 PnH 
转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、未转化菌株、pBM-3 PnH 
载体和水(作为阴性对照)进行PCR反应。图6.A显示了反应结果，泳道1对应用pBM-3 PnH 
转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株；泳道3是pBM-3PnH载体，作为阳性对照；泳道4对应未转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株；泳道2和泳道5是利用水的阴性对照；泳道6和泳道7分别对应100bp和λ HindIII分子标准。可以看到，转化的菌株(1)与阳性对照(3)显示了相同的条带。而阴性对照未转化的菌株(4)没有条带显示。因此，回收的质粒对应pBM-3 PnH
用从转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌株系中分离的质粒DNA转化大肠杆菌培养物。结果如图6.B所示，从图中可以看出转化的大肠杆菌株系在含有卡那霉素的培养平板上生长。
上述的实施例作为本发明的例子，决不限制在所附的权利要求书中所描述的本发明的范围。
序列表
序列号：1
长的：1647pb
类型：DNA
分类：嗜酸氧化亚铁硫杆菌复制起始原点(Acidithiobacillus ferrooxidans ori)
序列：
序列号：2
长的：1104pb
类型：DNA
分类：嗜酸氧化亚铁硫杆菌复制起始原点(Acidithiobacillus ferrooxidans ori)
序列：
序列号：3
长的：106pb
类型：DNA
分类：Pnit，Wenelen株(DSM 16786)固氮酶启动子
序列：
序列表
<110>BIOSIGMA S.A.
<120>用于转化嗜酸硫杆菌属细菌的质粒及转化方法
<130>NA
<150>CL 2115-2007
<151>2007-07-19
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1647
<212>DNA
<213>嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)
<400>1
<210>2
<211>1101
<212>DNA
<213>嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)
<400>2
<210>3
<211>106
<212>DNA
<213>嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)
<400>3
Claims (26)
1.一种用于转化嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)细菌的质粒，其特征在于它包含一个从嗜酸硫杆菌属细菌分离的复制起始原点，并且主要包括序列1和2所示ori之一的核苷酸序列或各自的反向互补序列，和序列3所示从Wenelen株系(DSM 16786)分离的固氮酶启动子Pnit，该启动子强烈地促进受其调控的基因的表达。
2.根据权利要求1的质粒，其特征在于它基本包含序列No.1所示ori之一的核酸序列或其反向互补序列，使其能够转化嗜酸硫杆菌属细菌，尤其是嗜酸氧化亚铁硫杆菌种(Acidithiobacillus ferrooxidans)细菌。
3.根据权利要求1的质粒，其特征在于它基本包含序列No.2表达的ori之一的核酸序列或其反向互补序列，使其能够转化嗜酸硫杆菌属细菌，尤其是嗜酸氧化硫硫杆菌种(Acidithiobacillus thiooxidans)细菌。
4.根据权利要求1的质粒，其特征在于它是一个能用于多种不同属或不同种的微生物的载体(穿梭载体)。
5.根据权利要求4的质粒，其特征在于它包含特异于其它种的第二个复制起始原点、克隆位点和至少一个标记基因。
6.根据权利要求5的质粒，其特征在于Pnit启动子邻接于多克隆位点，并且调节所述克隆了的基因的表达。
7.根据权利要求5的质粒，其特征在于邻接于克隆位点，优选多克隆位点，有一段编码六组氨酸肽的序列，该六组氨酸肽可以作为质粒所克隆的蛋白质的C-末端的组氨酸尾。
8.根据权利要求5的质粒，其特征在于所述第二个复制起始原点选自oripUC、ori ColE1、ori p15A、ori NTP1、ori pBR345、ori pBR322、ori R6K。
9.根据权利要求8的质粒，其特征在于报告基因选自已知的报告基因，如lacZ(β-半乳糖苷酶)、gfp(绿色荧光蛋白)、luc(荧光素酶)或可通过底物颜色变化进行鉴定的其它报告基因。
10.根据权利要求9的质粒，其特征在于报告基因与克隆位点相连，因此在所述克隆位点插入基因决定了报告基因不表达。
11.根据权利要求10的质粒，其特征在于该报告基因是β-半乳糖苷酶lacZ基因。
12.根据权利要求9的质粒，其特征在于它含有第二个选自抗生素抗性基因的报告基因。
13.根据权利要求12的质粒，其特征在于优选地该基因赋予对卡那霉素(Kan)抗性。
14.根据权利要求8的质粒，其特征在于第二个复制起始原点是pUC ori。
15.一种转化嗜酸硫杆菌属细菌的方法，其特征在于它包括以下步骤：
a.制备嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus spp.)培养物；
b.逐渐调整培养物的pH值，使其介于5和7之间；
c.修饰培养底物为连四硫酸盐；
d.制备权利要求1-14中任一项所定义的能在嗜酸硫杆菌中表达自己的转化载体；
e.从步骤d提供的以转化载体修饰的培养物获得嗜酸硫杆菌转化体，以获得转化的嗜酸硫杆菌；
其中步骤b和c可以同时或按相继实施，哪一步先实施并无不同。
16.根照权利要求15的方法，其特征在于步骤b是在如下条件下实施的：每次升高的pH值介于0.5和1之间，每升高一次间隔时间是5-15天，每次升高pH之前要确保培养的稳定性。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于合适的间隔时间是5-7天。
18.根据权利要求15的方法，其特征在于步骤c中的培养底物先从硫酸铁修饰成元素硫，然后再修饰成连四硫酸盐。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于底物的每次改变都是一个持续3天至2周的阶段，以保证培养的稳定性。
20.根据权利要求16的方法，其特征在于合适的间隔时间是5-9天。
21.根据权利要求15的方法，其特征在于步骤d制备的载体具有从嗜酸硫杆菌质粒分离的复制起始原点。
22.根据权利要求15的方法，其特征在于转化是利用现有技术中的任一转化技术实施。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于电穿孔是优选使用的技术。
24.根据权利要求15的方法，其特征在于嗜酸硫杆菌培养物是嗜酸氧化亚铁硫杆菌培养物。
25.根据权利要求15的方法，其特征在于嗜酸硫杆菌培养物是嗜酸氧化硫硫杆菌培养物。
26.根据权利要求15的方法，其特征在于嗜酸硫杆菌培养物是嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)培养物。
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|---|---|---|---|---|
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