CN101406452B - 环孢素a注射用微乳制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了一种含有环孢素A的注射用微乳制剂，及该注射用微乳制剂的制备方法。该制剂由以下成分组成：主药1-5％、油相1-30％、表面活性剂2-40％、助表面活性剂2-40％、注射用水余量。将处方量的油相和表面活性剂在40℃的水浴下使之溶解成液体，在常温下加入助表面活性剂，混合均匀后，将药物加入上述混合溶液中，轻微搅拌使药物溶解，再滴加水，调节pH值5.0-7.0，即得。本发明采用安全、无刺激性的非离子表面活性剂替代原注射剂中易导致过敏反应的聚氧乙烯蓖麻油。能够提高用药的安全性，降低毒性和不良反应。

Description

环孢素A注射用微乳制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种含有环孢素A的注射用微乳制剂，及该注射用微乳制剂的制备方法。

背景技术

环孢素A(cyclosporine A，CysA)是由11个氨基酸组成的环性多肽类物质，是一种新型的强效免疫抑制剂。该药于1969～1970年由Borel发现，是由霉菌培养而产生的代谢物再经提取而得。1972年发现它具有强大的免疫抑制作用，对T淋巴细胞活化和增殖有特异性的抑制作用。1978年首次用于临床，并获得成功从而大大降低了移植患者的死亡率，目前已广泛应用于实体器官和骨髓移植后的抗排斥反应，是一种广受欢迎的新型免疫抑制剂。

环孢素A因含疏水性氨基酸较多，故不溶于水，但能溶于甲醇、乙醇、丙酮等多种有机溶剂。临床使用的CysA注射剂为山德士公司生产的Sandimmun Sandoz，是一种静脉注射浓缩液。每mlCysA注射剂含CysA50mg、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL，为一种表面活性剂)650mg及体积含量33％的乙醇。由于其中含有65％以上的增溶剂聚氧乙烯蓖麻油，易导致过敏反应和组胺释放、肾血流量和肾小球滤过率的降低、胆汁郁塞、并毒害细胞、神经毒性和肝脏毒性等副作用，因此在某种程度上限制了该药的使用。故开发不含EL的CysA注射剂具有重要意义。如果将其开发成环孢素A微乳注射剂可以减少表面活性剂的用量，提高药物的疗效，会给那些进行器官移植手术后不能口服的病人带来福音。

发明内容

本发明的目的是提供一种环孢素A注射用微乳制剂，该注射用微乳制剂克服了原有注射剂的不足，不含易导致过敏反应的聚氧乙烯蓖麻油(EL)，具有无毒低刺激性的特点，提高注射给药的安全性。

本发明的另一个目的在于提供该注射微乳制剂的制备方法。

与市售的环孢素A注射剂相比，这种新剂型采用安全、生物相容性的非离子表面活性剂聚乙二醇(660)-12-羟基硬脂酸(Solutol HS-15)和卵磷脂等作为乳化剂，替代市售注射剂中易导致过敏反应的增溶剂聚氧乙烯蓖麻油，从而提高用药的安全性。该制剂具有功效成分明确、乳化剂用量小、药效显著以及副作用小等特点。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明所提供的CysA微乳注射制剂，包括以下主要成份：CysA为活性成分；注射用油，如中碳链三甘油酯(米格列醇)、大豆油或三辛酸癸酸甘油酯等为油相；安全、无刺激性的非离子表面活性剂如聚乙二醇(660)-12-羟基硬脂酸(Solutol HS-15)和卵磷脂等为表面活性剂；聚乙二醇-400(PEG-400)和乙醇等为助表面活性剂；注射用水适量。

本发明环孢素A注射用微乳制剂的各组成成份的重量百分比如下：

主药             1％-5％CysA

油相             1-30％中碳链三甘油酯(如米格列醇等)

表面活性剂       1％-10％卵磷脂，1％-30％HS-15

助表面活性剂     1％-10％PEG-400，1％-30％乙醇

注射用水         适量，补充至100％

上述配方中溶剂为注射用水；油相采用米格列醇、大豆油或三辛酸癸酸甘油酯等；表面活性剂采用HS-15和卵磷脂；助表面活性剂采用PEG-400和乙醇；其中环孢素A与油相的优选重量比为1:(1-5)；油相与乳化剂的优选重量比为1:(1-10)。

最优处方如下：

CysA               2.5％

油相               9％中碳链三甘酯

表面活性剂         6％卵磷脂，12％HS-15

助表面活性剂       6％PEG-400，12％乙醇

注射用水           适量，补充至100％

制备工艺：

本发明环孢素A注射用微乳制剂制备方法的特点在于简单易行，其操作步骤为将处方量的油相和表面活性剂在40℃的水浴下使之溶解成液体，在常温下加入助表面活性剂，混合均匀后，将药物加入上述混合溶液中，轻微搅拌使药物溶解，再滴加水，调节pH值5.0-7.0，即得透明或半透明且有淡蓝色乳光的微乳浓缩液。制得的产品用0.45μm的微孔滤膜过滤，灌封、灭菌即得。该微乳制剂，乳滴平均粒径小于100nm，90％粒径累积值不大于200nm，显著低于普通剪切工艺制得的乳剂及亚微乳体系。

本发明具有如下特点：

1.采用注射用的表面活性剂卵磷脂和HS15代替原注射剂中的增溶剂聚氧乙烯蓖麻油，降低了过敏反应等毒副作用，提高了安全性。

2.筛选复合表面活性剂和复合助表面活性剂以提高药物的溶解度。

3.将原注射剂改成微乳注射剂，有利于提高稳定性。(有利于生产和贮存)

4.微乳一般很难被无限稀释，如果含水量超出了相图区域，立即形成乳剂，达不到应有的作用效果。从伪三元相图中发现对于o/w型微乳，当选择适当的油和混合表面活性剂，并且调整两者的比例，可以筛选出加水无限稀释的微乳，根据这个比例初步确定处方，再对其溶药能力进行考察，从而确定CysA注射微乳的最佳处方。

5.体内外分析方法的建立。确定流动相为乙腈-水-磷酸(75:25:0.05)，流速为1mL/min，柱温60℃，进样量为20μL。体内分析采用内标法时通常用环孢素D做内标，环孢素D很难买到且价格昂贵，考虑到外标法方便可行，因此选择外标法。

6.解决微乳在难溶性药物注射给药上的应用，有利于推进微乳注射剂的产业化。

本发明环孢素A注射微乳制剂的特点是采用安全、无刺激性的非离子表面活性剂替代原注射剂中易导致过敏反应的聚氧乙烯蓖麻油。本研究所研制的微乳制剂在保证环孢素A的吸收和生物利用度良好的同时，能够提高用药的安全性，降低毒性和不良反应。使其应用更加广泛，为国产的CysA注射剂的临床应用奠定了基础。对于推动微乳注射剂的产业化具有重要意义。制剂新技术的采用填补了国内外空白。

具体实施方式

实施例1 微乳制剂的制备

将9g米格列醇和12g的HS 15及6g卵磷脂在40℃的水浴下加热使之混合均匀，冷却至室温后加入6g的PEG-400和12g的乙醇，然后将2.5g环孢素A溶解在上述油和表面活性剂的混合物中，加入注射用水至100g，并调节pH值5.0-7.0，搅拌均匀即得微乳浓缩液，制得的产品用0.45μm的微孔滤膜过滤，灌封、灭菌即得。

粒径的考察：微乳的粒径采用马尔文激光散射粒径测定仪(Zetasizer3000，Malvern，UK)测定，光散射度定为90°，测定温度为25±1℃。测定处方1含药微乳的粒径在100nm以内(55.7nm)，适合注射使用。

实施例2

将10g中碳链三甘油酯(GTCC)和15g的HS15及5g卵磷脂在40℃的水浴下加热使之混合均匀，冷却至室温后加入5g的PEG-400和10g的乙醇，然后将2.5g环孢素A溶解在上述油和表面活性剂的混合物中，加入注射用水至100g，并调节pH值5.0-7.0，搅拌均匀即得微乳浓缩液，制得的产品用0.45μm的微孔滤膜过滤，灌封、灭菌即得。

实施例3：本发明环孢素A注射用微乳制剂的溶血性试验

(1)试验材料与条件：

试验材料：按照上述实施例1的方法制备环孢素A注射用微乳制剂，该微乳处方的浓度为2.5％(w/w)，用0.9％氯化钠注射液稀释25倍，作为供试液；对照组为生理盐水；

试验动物：清洁级新西兰白兔1只，体重2-3公斤(购自沈阳药科大学动物实验中心)；

动物饲养环境：室温：20℃

              湿度：30％-70％

              照明：人工光线，12小时日光，12小时黑暗

              实验动物设施合格证号：SYXK(辽)2006-0012

(2)试验方法

取雌性新西兰家兔1只，颈动脉放血大于10mL(约30mL-50mL)，置洁净烧杯中，玻棒搅拌除去纤维蛋白原，加入等量生理盐水，摇匀，1000-1500rpm离5分钟，倾去上清液，再加入红细胞压积5倍量的生理盐水，摇匀，离心，倾去上清液，如此反复用生理盐水洗4-5次，至上清液不显红色后，取1000-1500rpm压积兔红细胞2mL，加生理盐水混悬至100mL(2％兔红细胞生理盐水混悬液)供试验用。

取CysA微乳用0.9％氯化钠注射液稀释25倍，作为供试液。

取洁净试管9支，按表1顺序加入各种溶液；将各试管轻轻摇匀，置37℃恒温水浴中，以生理盐水管上清液为空白，蒸馏水管上清液作为100％溶血，观察并记录0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3小时的结果。

Tab.1 The sequence of application of sample in hemolysis test for CyA microemulsion

(3)各试验时间点家兔溶血性试验结果见表2

Tab.2 The results of hemolysis test for CyA microemulsion

生理盐水对照管(8号)上清液各时段均不显红色；蒸馏水对照管(9号)溶液显红色，清亮透明，未见下沉的红细胞层，表明已完全溶血。加入CysA微乳25倍稀释液的1～7号试管上清液各时段均不显红色，表明CysA微乳25倍稀释液不引起溶血反应。

实施例4：本发明环孢素A注射用微乳制剂的过敏性试验

(1)试验方法

临用前取CysA微乳用0.9％氯化钠注射液稀释20倍作为供试液；人血白蛋白注射液临用前以0.9％氯化钠注射液稀释成10％浓度供试验用。

根据预试结果，取健康雄性豚鼠12只，随机分为2组，分别腹腔注射CysA 20倍稀释液(CysA组)和10％人血白蛋白生理盐水溶液(阳性对照组)0.5mL/只，隔天注射1次，连续3次，然后于首次注射后第14天和21天，各组每次取3只豚鼠，分别静脉注射CysA 20倍稀释液和10％人血白蛋白生理盐水溶液2mL/只，按全身过敏性反应评级标准(表3)观察并判定豚鼠过敏反应分值，结果见表4。

Tab.3 The rank standards of systemic anaphylactic reaction

Results judge：when Rank≥2，anaphylactic test is positive

Tab.4 The results of systemic anaphylactic reaction of CysA

(2)试验结果

致敏后14天或21天CysA组豚鼠在静脉注射CysA 20倍稀释液2mL攻击后30分钟内均未见出现竖毛、蜷缩、咳嗽、喷嚏和呼吸困难等过敏反应，也未出现死亡现象，按全身过敏性反应评级标准评级均为0级，提示CysA豚鼠注射给药过敏反应阴性；人血白蛋白组致敏后14天、21天攻击中所有豚鼠均出现咳嗽、呼吸困难、痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡等过敏反应，并均于注射攻击后5分钟内死亡，按全身过敏性反应评级标准评级均为4级，表明人血白蛋白注射液过敏反应阳性。

实施例5：本发明环孢素A注射用微乳制剂的稳定性试验

按照实施例1所述的处方和方法制备的CysA注射用微乳制剂分装于若干棕色西林瓶中(5g/瓶)。室温留样试验表明，微乳在室温条件下，并无药物析出，离心也无分层，微乳液仍为浅黄色并澄清透明，粒径无明显变化，测定微乳6个月前后CysA的含量，未有明显的降低。

实施例6：本发明环孢素A注射用微乳制剂的药动学实验

试验方案：以临床使用的CysA注射剂为参比制剂(50mg/mL)，使用时稀释50倍，以实施例1所述的处方和方法制备的CysA微乳注射剂为受试制剂(25mg/g)，使用时稀释25倍，以大鼠为试验动物，采用双周期交叉给药。

给方式：大鼠尾静脉注射

给药剂量：5mg/kg

取样时间：0、5min、10min、20min、1h、2h、4h、8h、12h、24h

每个时间点取血0.3mL，离心取上层血浆，冷冻待测。采用高效液相色谱法测其浓度，用Topfit软件进行数据处理，通过药时曲线下的面积，结果表明受试制剂与参比制剂相比生物等效。表明该微乳注射剂在减小表面活性剂用量的前提下可以达到良好的治疗效果，从而避免了过敏反应等毒副作用，提高了用药的安全性。

Claims (2)

1.一种环孢素A注射用微乳制剂，其特征在于：其处方重量百分组成为：

2.根据权利要求1所述的环孢素A注射用微乳制剂，其特征在于乳滴平均粒径小于100nm，90％粒径累积值小于等于200nm。