CN101396554A

CN101396554A - 重组人干扰素γ在制备抗病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN101396554A
Application number: CNA2007100463821A
Authority: CN
Inventors: 周永春; 厉颖
Original assignee: SHANGHAI CLONBIOTECH CO Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Kayu bio Pharmaceutical Co., Ltd.; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2007-09-25
Filing date: 2007-09-25
Publication date: 2009-04-01

Abstract

本发明提供了重组人干扰素γ在制备抗病毒药物中的应用。本发明在重组人γ－干扰素体内对豚鼠皮肤感染单纯疱疹病毒(HSV)的药效学实验中，显示其3×10⁵－7.5×10⁴IU/kg剂量即有抑制作用；在体外细胞培养中对HSV－1、HSV－2的抑制试验中重组人γ－干扰素有抑制作用。本发明对制备抗病毒药，尤其是治疗生殖器疱疹、单纯疱疹、尖锐湿疣和扁平疣的药物有较大应用价值。

Description

重组人干扰素γ在制备抗病毒药物中的应用

技术领域：

本发明涉及生物技术，具体涉及重组人扰素γ在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术：

干扰素γ是Wheelock于1965年发现的，也称为免疫干扰素，是由有丝分裂原或外来抗原诱导的T淋巴细胞产生，具有较强的免疫调节功能，能增强抗原递呈细胞功能，加快免疫复合物的清除和提高吞噬异物功能，对淋巴细胞具有双向调节功能，提高抗体依赖的细胞毒反应，增强某些免疫活性细胞HLA-II类抗原表达。它的生物活性主要包括：

1、抑制细胞增殖作用：干扰素γ对细胞有直接抑制作用，而且对分裂迅速的细胞有选择性抑制。

2、免疫调节作用：可以激活效应细胞，增加B细胞抗体产生和单核细胞的细胞毒性；增强免疫细胞表面抗原和受体的表达；刺激其他细胞因子的产生。

天然干扰素γ的分子量为3.5—7.0万，这是由于糖基化程度不同和形成聚合体的结果。重组人干扰素γ是采用基因工程技术，由含有高效表达人干扰素γ基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化所得。与天然干扰素γ相比，有同等的生物活性。

另外，也有人认为干扰素γ具有抗病毒作用，它通过细胞基因组编码的一些蛋白质来发挥作用。当干扰素γ与细胞接触时，它首先与靶细胞表面结合，然后进入细胞，诱导基因组合成抗病毒蛋白。但是，目前重组人干扰素γ临床治疗的适应症为：类风湿性关节炎和肝纤维化，并无其它适应症的报道。

现代医学认为生殖器疱疹和单纯疱疹是由单纯疱疹病毒(HSV)感染所致的一种病毒性传播疾病，其中生殖器疱疹是最常见的性传播疾病之一。尖锐湿疣和扁平疣是由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的传染性疾病，尖锐湿疣主要通过性传播，近年来临床发病率呈上升趋势。目前临床上采用的常规治疗方法有一定的治疗效果，但不能消除尖锐湿疣的复发。

此前曾有文献报道，国外应用干扰素α及干扰素β联合其它疗法治疗尖锐湿疣有效，但目前为止没有任何报道表明干扰素γ亦有同样效果。

发明内容：

本发明要解决的技术问题在于研究重组人干扰素γ(rhIFN-γ)对某些病毒的抑制作用，设计制备抗病毒药。

本发明提供了重组人干扰素γ在制备抗病毒药物中的应用。

此项发明中，本发明人应用重组人干扰素γ对单纯疱疹病毒(HSV)进行了体内外药效学实验研究，结果表明，重组人干扰素γ对HSV病毒有确切疗效。其作用机理为，重组人干扰素γ作用于细胞后，促使诱导基因组合成抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白可以抑制病毒在细胞内的复制，增加NK细胞的活性及其它免疫调节作用，有效地遏制病毒感染的发生。

本发明人在重组人干扰素γ体内对豚鼠皮肤感染HSV-1的药效学实验中，HSV-1感染豚鼠皮肤后肌注重组人干扰素γ，重组人干扰素γ 3×105—7.5×104 IU/kg剂量对豚鼠皮肤感染HSV-1有抑制作用，且与等量重组人干扰素α 2a作用强度相当。

重组人干扰素γ在体外细胞培养中对HSV-1、HSV-2的抑制试验中，重组人干扰素γ及对照药重组人干扰素α 2a对HSV-1、HSV-2质控株及HSV-1、HSV-2临床株分别致HEK-293细胞株病变的半数抑制浓度(IC₅₀，IU/ml)分别为613.84、953.62、688.85、866.29及701.32、1097.26、692.25、1060.49，提示rhIFN-γ体外对HSV-1、HSV-2质控株及临床株致HEK-293细胞株病变有抑制作用，其效价较对照药rhIFN-α 2a接近或稍高。标准抗HSV药物ACV20.0μg/ml对HSV-1、HSV-2质控株抑制率分别为90％及85％，表明本试验系统处于正常反应状态。

由于目前国内外均未对人乳头瘤病毒(HPV)建立起可行的药效学研究模型，而HPV与HSV同属于DNA病毒，重组人干扰素γ对DNA病毒的作用机理是一致的，结合以上重组人干扰素γ对HSV病毒的体内外药效学研究结果，本发明人认为，重组人干扰素γ对HPV病毒具有同样疗效。

综上所述，重组人干扰素γ对于单纯疱疹病毒确有良好效果，因此，重组人干扰素γ可用于制备抗病毒药物，尤其是治疗生殖器疱疹、单纯疱疹、尖锐湿疣、扁平疣等抗病毒药物。

本发明提供的重组人干扰素γ可与药用辅料按常规方法制成注射剂(包括注射液及注射用无菌粉末)。

本发明提供的重组人干扰素γ在医学上新用途，将对治疗病毒引起的疾病，尤其是由单纯疱疹病毒感染所致的生殖器疱疹及单纯疱疹，以及人乳头瘤病毒感染引起的生殖器尖锐湿疣及扁平疣有治疗作用，扩大了在临床的应用，也对治疗该类病症带来新的机制。

具体实施方式：

实例一重组人γ-干扰素在体外细胞培养中对HSV-1和HSV-2的抑制作用

1.摘要：重组人γ-干扰素及对照药重组人干扰素α 2a对HSV-1、HSV-2质控株及HSV-1、HSV-2临床株分别致HEK-293细胞株病变的半数抑制浓度(IC₅₀、IU/ml)分别为613.84、953.62、688.85、866.29及701.32、1097.26、692.25、1060.49，提示两药对HSV-1的作用强于对HSV-2的作用。标准抗HSV药ACV20.0μg/ml对HSV-1、HSV-2质控株抑制率分别为90％及85％，表明本试验系统处正常反应状态。

2.试验目的：以抗HSV-1、HSV-2质控株及临床株致体外培养的HEK-293细胞株病变为指标，检测重组γ-干扰素体外抗病毒活性及其效价，以此预测其抗HSV感染的可能性，按其抗HSV的活性、和干扰素的广谱抗病毒特性可以认为本重组γ-干扰素也具有抗其它病毒的活性。

3.试验材料

3.1 药物

3.1.1 受试药物

3.1.1.1 名称：重组人γ-干扰素(rhIFN-γ)。

3.1.1.2 提供单位：上海克隆生物高技术有限公司。

3.1.1.3 编号或批号：990321。

3.1.1.4 含量、效价、制剂标示量：100万IU/支(比活性1.4×10⁷IU/mg)，冻干粉。

3.1.1.5 溶剂：2％小牛血清RPMI 1640培养基。

3.1.1.6 配制方法：以1ml上述培养基稀释成100万IU/ml原液，待用。

3.1.2 对照药(1)

3.1.2.1 名称：注射用重组人干扰素rhIFN-α 2a(迪恩安)。

3.1.2.2 提供单位：辽宁卫星生物制品研究所。

3.1.2.3 编号或批号：990701-1。

3.1.2.4 含量、效价、制剂标示量：100万IU/支，冻干粉。

3.1.2.5 溶剂：2％小牛血清RPMI 1640培养基。

3.1.2.6 配制方法：以1ml上述培养基稀释成100 IU/ml。

3.1.2.7 选择依据：上市产品，比较两型rhIFN产品体外相对效价。

3.1.3 对照药(2)

3.1.3.1 名称：阿昔洛韦(ACV)。

3.1.3.2 提供单位：潜江制药厂。

3.1.3.3 编号或批号：9905043。

3.1.3.4 含量、效价、制剂标示量：甘泰注射液、250mg/瓶、粉剂。

3.1.3.5 溶剂：生理盐水(NS)。

3.1.3.6 配制方法：以5mlNS稀释成50mg/ml原液，待用。

3.1.3.7 选择依据：已知抗选择性抗疱疹病毒药、对HSV有效、为检验本实验系统可靠性。

3.2 细胞

3.2.1 类型：人胚肾-293传代细胞株(HEK-293细胞)。

3.2.2 提供单位：中国科学院细胞生物研究所细胞库。

3.3 病毒

3.3.1 株、型：HSV-1型Sm44株、HSV-2型333株、HSV-1型临床分离株、HSV-2型临床分离株。

3.3.2 提供单位：HSV-1、HSV-2质控株(卫生部生物制品药品检验所)。

HSV-1临床株(中国医学科学院皮肤病研究所)。

HSV-2临床株(南京医科大学)。

3.4 培养基

3.4.1 种类：RPMI 1640培养基。

3.4.2 提供单位：GIBCO/BRL。

4.试验方法

4.1 种类：体外试验。

4.2 内容：体外细胞培养检测药物抗病毒活性和效价。

4.3 选择依据：按《新药(西药)临床前指导原则汇编》P163～168执行。

5.剂量设置和给药方法

5.1 受试药：rhIFN-γ。

5.1.1 剂量组：终浓度2000、1000、500、250、125IU/ml五个浓度。

5.1.2 途径：体外加于细胞培养瓶中。

5.2 对照药(1)：注射用rhIFN-α 2a

5.2.1 剂量组：终浓度为2000、1000、500、250、125 IU/ml五个浓度。

5.2.2 途径：体外加于细胞培养瓶中。

5.3 阿昔洛韦(ACV)

5.3.1 剂量：终浓度20μg/ml。

5.3.2 途径：体外加于细胞培养瓶中。

6.试验主要步骤

6.1 病毒毒力测定

6.1.1 0.5ml病毒悬液分别接种生长良好、呈单层的HEK-293细胞培养瓶内，吸附1小时后倒去，补充维持液继续培养。

6.1.2 至75％以上细胞单层出现明显细胞病变后洗脱细胞，并反复冻融3次，离心，收集上清液作病毒毒力测定。

6.1.3 用培养液对上述病毒上清液作10倍或5倍稀释，接种到已长成单层细胞的10ml培养瓶中，每个稀释度3瓶，病毒吸附同上，然后换加维持液，37℃继续培养，培养20～24小时后观察细胞病变情况。

6.1.4 计数方法：用0.5mm网格形测微计置于目镜内，网格内分100个小方格，移动培养瓶，选择2个网格，共计数200个小方格，计出病变细胞(P)/正常细胞+病变细胞(N+P)的比率，以3瓶共6个网格计数之和，求出P的百分率。

6.1.5 TC ID₅₀计算，病毒半数感染剂量TC ID₅₀计算，按Reed和Muencl法常规。

6.2 药物对HEK-293细胞毒性测定

6.2.1 药物浓度：首管3.2万IU/ml，对倍稀释至所需浓度，现配现用。

6.2.2 细胞：选择生长良好的单层HEK-293细胞，加上含药的维持液，37℃继续培养，逐日观察细胞生长情况，连续一周，以7日结果判断。

6.3 抗病毒试验

6.3.1 指标：病毒接种量为6～10倍TC ID₅₀，接种于长成单层细胞的培养瓶中，每瓶加入0.3ml病毒液，平行3瓶。吸附时间45分钟后，再换成含不同浓度药液或空白维持液，继续培养约20～48小时，以无药对照瓶细胞病变率达98％左右时中止培养，计数各瓶细胞病变率，计数方法同6.1病毒毒力测定。以N/N+P×100％计算药物抑制百分率。上述试验重复3次，合并计算。

7.判断方法

7.1 指标：定量指标。

7.1.1 病毒毒力测定：计算TC ID₅₀。

7.1.2 药物对细胞毒性：计算TC₅₀、TC₀。

7.1.3 药物对病毒作用：观察细胞病变(CPE)、计算IC₅₀及TI。

7.2 观察时间

7.2.1 病毒毒力测定：20小时。

7.2.2 药物对细胞毒性测定：以观察7日结果为准。

7.2.3 药物对病毒作用：20～30小时，以无药对照组病变达98％左右时中止培养。

8.计算方法与统计方法

8.1 计算方法：用直线回归方程，求IC₅₀。

8.2 统计方法：相关系数的显著性测验。

9.试验结果

9.1 病毒毒力测定结果：

表1 各型HSV对HEK-293的毒力(TC ID₅₀)测定

TC ID₅₀＝>50％病变率稀释度的对数+距离比

9.2 药物对细胞毒性测定结果

表2 rhIFN-γ对HEK-293细胞的毒性(TC₅₀)测定

9.3 rhIFN-γ与rhIFN-α 2a及ACV对各型HSV致HEK-293细胞病变的抑制作用

表3-1 HSV-1(Sm44)株实验

表3-2 HSV-2(333)株实验

表3-3 HSV-1(临床)株实验

表3-4 HSV-2(临床)株实验

HSV-1(Sm44)株，

HSV-2(333)株，

HSV-1(临床分离)株，

HSV-2(临床分离)株，

10.试验结论：

rhIFN-γ体外对HSV-1、HSV-2质控株及临床株致HEK-293细胞株病变有抑制作用，其效价较对照药rhIFN-α 2a接近或稍高。本系统对标准抗HSV药ACV反应正常。

实例二重组人γ-干扰素体内对豚鼠皮肤感染HSV-1的药效

1.摘要：注射用重组人γ-干扰素3×10⁵～7.5×10⁴IU/kg剂量对豚鼠实验性HSV-1皮肤感染有抑制作用，3×10⁵IU/kg与等剂量的迪恩安作用强度相当。

2.试验目的：用HSV-1感染豚鼠皮肤后每日肌注重组γ-干扰素，并用重组α-干扰素作对照，检测本制剂体内有无抗HSV活性及其效价，按干扰素广谱的抗病毒特性，推测其对其它病毒感染的可能效果。

3.试验材料

3.1 药物(制剂)

3.1.1 受试制剂

3.1.1.1 名称：注射用重组人γ-干扰素(rhIFN-γ)。

3.1.1.2 提供单位：上海克隆生物高技术有限公司。

3.1.1.3 编号或批号：990321。

3.1.1.4 制剂标示量：100万IU/支，比活性1.4×10⁷IU/mg，冻干粉。

3.1.1.5 溶剂：灭菌注射用水。

3.1.1.6 配制方法：用灭菌注射用水分别配制成3×10⁵、1.5×10⁵、7.5×10⁴、3.75×10⁴/ml，每次用药新鲜配制。

3.1.2 对照制剂

3.1.2.1 名称：迪恩安。

3.1.2.2 批号：990701-1。

3.1.2.3 提供单位：辽宁卫星生物制品研究所，100万IU。

3.1.2.4 选择依据：为上市产品，比较两型rhIFN产品体内相对效价。

3.2 细胞

3.2.1 类型：Vero细胞。

3.2.2 提供单位：中国科学院细胞生物研究所细胞库。

3.3 病毒

3.3.1 型、株：HSV-1型Sm44株。

3.3.2 提供单位：卫生部生物制品药品检验所。

3.4 动物

3.4.1 种属、品系、来源、合格证：白化豚鼠，中国药科大学实验动物中心，苏动环字第97004号，苏动质字第97004号。

3.4.2 体重：250～300g。

3.4.3 性别：

♀不论。

3.4.4 各组动物数：每次试验用5～6组，每组4～6只，共3次试验。

4.试验方法

4.1 种类：体内试验。

4.2 内容：豚鼠皮肤感染HSV-1后，用不同浓度的重组γ-干扰素处理，以评分法判断药物的药效，并以迪恩安为对照药。

5.剂量设置和给药方法

5.1 受试药：rhIFN-γ。

5.1.1 剂量组：3×10⁵、1.5×10⁵、7.5×10⁴、3.75×10⁴IU/kg四个浓度。

5.1.2 途径：肌肉注射，每100g豚鼠注射0.1ml。

5.1.3 给药方法：在感染2小时后腿肌肉注射，1天1次，连续8天。

5.2 对照药：rhIFN-α 2a(迪恩安)。

5.2.1 剂量组：均为3×10⁵IU/kg。

5.2.2 途径：同受试药。

5.2.3 给药方法：同受试药。

6.试验主要步骤

6.1 病毒毒力测定

6.1.1 病毒上清液准备，同体外试验(见实验一、6.1项)。

6.1.2 用原液及10倍稀释至10^-1～10^-3四个浓度，以0.05ml接种于豚鼠井形划痕皮肤上，观察4～8天左右，以出现皮肤损害为致病。

6.2 体内抗病毒试验

6.2.1 豚鼠皮肤准备及病毒接种：豚鼠背中部两侧皮肤用剪刀及腋毛剃刀剃毛约φ4cm区，用锐器作井字形划破见出血点，每侧各接种能引起100％致病率的病毒液0.05ml，逐日观察和记录病变情况。

6.2.2 观察指标：病毒接种部位出红斑、水疱、硬结、糜烂以及消退后结痂。

7.判断方法

7.1 指标及评分

7.1.1 病毒毒力测定：以出现红斑及疱损害为致病指标，确定能引起动物100％致病的病毒稀释度作药物抗病毒试验。

7.1.2 药物抗病毒试验的皮肤病变评分标准：

0：正常，无病变

0.5：微红

1：红斑，或伴皮损消退时结痂

2：红斑、水疱，或伴皮损消退时结痂

3：红斑、硬结，或带有糜面

4：红斑、硬结扩大，或带水疱或糜面

7.2 观察时间

7.2.1 病毒毒力测定：连续观察10天，观察自然病程，在d4出现典型病变为致病。

7.2.2 药物抗病毒试验：连续观察到第10天，直至基质对照组病变自然消退为止。

8.计算方法与统计方法

8.1 计算方法：求每组每鼠双侧皮损评分平均值及标准误差。

8.2 统计方法：t检验。

9.试验结果

9.1 病毒致病毒力测定结果

表1 接种不同浓度HSV-1稀释液于豚鼠划痕皮肤的发病情况

表2 不同浓度的重组γ干扰素，迪恩安对豚鼠实验性HSV-1皮肤感染的药效

* 与空白对照比 *：P<0.05 **：P<0.01 ***：P<0.001

● 与阳性对照迪恩安比 ●：P<0.05 ●●：P<0.01 ●●●：P<0.001、

表3 不同浓度的重组γ干扰素，迪恩安对豚鼠实验性HSV-1皮肤感染三次试验合并结果

统计学符号同表2。

10.试验结论：

rhIFN-γ对豚鼠实验性HSV-1皮肤感染有抑制作用，与等量rhIFN-α 2a作用强度相当。

Claims

1、一种重组人干扰素γ在制备抗病毒药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的一种重组人干扰素γ在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于所述的抗病毒药的治疗病症为生殖器疱疹、单纯疱疹、尖锐湿疣或扁平疣。

3、根据权利要求1所述的一种重组人干扰素γ在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于所述药物为重组人干扰素γ与药用辅料制成的注射剂，包括注射液及注射用无菌粉末。