CN101360490A - 具有二十二碳五烯酸的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过给对象施用包含二十二碳五烯酸(22:5 n3；DPA)的组合物用于促进对象中的屏障完整性的方法。本发明还涉及包含DPA和二十碳五烯酸(EPA)的组合物。

Description

具有二十二碳五烯酸的组合物

技术领域

本发明涉及具有长链多不饱和脂肪酸的营养和药物组合物。

背景技术

由于长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)的有益效果，经常将它们包括在营养组合物中。尤其是在婴儿配制食品中，将LCPUFA如花生四烯酸和二十二碳六烯酸包括在致力于改善认识功能和视力的婴儿配制食品中。

二十碳五烯酸(EPA，20:5n3)是另一种重要的LCPUFA。与例如植物油相比，鱼油含有相对大量的EPA。然而，鱼油的缺点是经常导致营养产品具有不良气味。需要复杂的技术手段来解决这个问题。

发明概述

本发明人已发现LCPUFA能促进屏障完整性。在申请人的共同未决欧洲专利申请(申请号04748674.1)中，描述了不易消化的寡糖与LCPUFA(花生四烯酸(20:4n6；AA)、二十二碳六烯酸(22:6n3；DHA)和二十碳五烯酸(20:5n3；EPA))的组合可以改善屏障完整性。

本发明现在发现，除了AA、DHA和EPA外，二十二碳五烯酸(22:5n3；DPA)也可以明显降低人肠上皮细胞的屏障渗透性并提高屏障完整性。这些效应对于其中肠屏障功能受损或其中肠道成熟很重要的情形尤其重要。因此，一方面，本发明提供了DPA用于促进肠的成熟、降低肠道的渗透性和增加肠屏障抵抗力的用途。

与申请人的共同未决申请(申请号04748674.1)中所描述的发明相类似，本发明还提供了不易消化的寡糖与DPA的组合，该组合可协同加强屏障功能。令人惊讶地发现DPA有效地改善屏障完整性并降低上皮细胞旁渗透性，同时发现PUFA亚油酸和亚麻酸是无效的。寡糖还可以通过促进粘液生成而改善屏障完整性，这导致粘液层厚度增加。据信这种效应是由于促进短链脂肪酸(SCFA)生成而引起的。因此，当肠道施用给哺乳动物时，本发明的DPA与不易消化的寡糖的组合可以通过同时降低紧密连接渗透性和促进粘液生成来协同改善屏障完整性和/或协同降低肠渗透性。

此外，本发明人现在还发现，在用DPA温育人肠上皮细胞后，部分DPA作为EPA掺入所述细胞的膜磷脂中，这指示DPA在上皮细胞中部分转化为EPA。这一观察结果使得可以配制这样的营养组合物，其中至少部分EPA被DPA代替。这提供了制备包含更少的鱼油并因此具有降低的异味和不良气味的营养组合物的机会。

DPA可以高度有效地降低屏障渗透性而且部分DPA在上皮细胞中转化为EPA的组合观察结果现在使得可以配制具有降低的EPA含量和增加的DPA含量(即DPA∶EPA比率为约0.33或更高)的营养组合物，尤其是婴儿配制食品。本发明的组合物与高EPA组合物相比具有改良或至少相等的功能性，并且由于鱼油含量下降而具有潜在减少的不良风味。

发明详述

本发明提供了n-3二十二碳五烯酸(DPA)用于制备用于改善肠屏障完整性、改善屏障功能、促进消化道成熟和/或降低肠屏障渗透性的营养或药物组合物的用途。本发明还提供了用于改善对象的肠屏障完整性、改善屏障功能、促进消化道成熟和/或降低肠屏障渗透性的方法，所述方法包括给所述对象施用n-3二十二碳五烯酸(DPA)。

另一方面，本发明提供了n-3二十二碳五烯酸用于制备用于治疗和/或预防其中屏障完整性受损的疾病的营养或药物组合物的用途。本发明还提供了用于治疗和/或预防其中对象体内的屏障完整性受损的疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用n-3二十二碳五烯酸(DPA)。

另一方面，本发明提供了包含n-3二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳五烯酸(EPA)的营养或药物组合物，其中DPA∶(EPA)的比率等于或高于0.33。

多不饱和脂肪酸

本发明人惊讶地发现n-3二十二碳五烯酸(DPA)有效降低肠紧密连接渗透性。本发明人发现即使低浓度的DPA也是有效的。注意DPA可能涉及PUFA的n3和n6家族。本发明涉及DPAn3的用途，无论何时都使用缩写形式DPA，它指二十二碳五烯酸，22:5n3。

用于本发明的方法中的组合物(下文也称为本发明的组合物)的DPA∶EPA重量比优选高于约1∶3(即高于约0.33)，更优选高于1∶2，更优选高于1∶1，更优选高于1.2∶1，甚至更优选高于1.5∶1，最优选高于2∶1。最优选地，所述重量比介于1∶1和10∶1之间，更优选介于2∶1和5∶1之间。

优选地，本发明的组合物含有至少10mg DPA，优选至少50mg，更优选至少100mg，最优选至少250mg。本发明的组合物优选不含超过25gDPA，优选不超过1g DPA。这些量优选单份施用。

本发明的组合物优选是含有脂肪、脂质和碳水化合物的营养组合物。本发明的组合物的DPA含量优选不超过总脂肪的5wt.％，更优选不超过1wt.％，但优选为总脂肪的至少0.05wt.％，更优选至少0.1wt.％，最优选至少0.15wt.％。因为DPA部分转化为EPA，所以EPA在本发明的组合物中的量可以相对较低。EPA含量优选不超过总脂肪的5wt.％，更优选不超过1wt.％，最优选不超过0.5wt.％。但是存在EPA可有益地改善屏障功能性。因此，本发明的组合物优选包含基于总脂肪的至少0.02wt.％，更优选至少0.05wt.％，更优选至少0.1wt.％的EPA。

为了进一步提高本发明的组合物改善屏障完整性的效应，本发明的组合物优选还包含AA和/或DHA。这些LC-PUFA也可以改善屏障完整性。DHA含量优选不超过总脂肪的5wt.％，更优选不超过1wt.％，但至少为0.1wt％。由于发现AA在减少紧密连接渗透性方面特别有效，所以本发明的组合物优选包含相对大量的AA，优选为总脂肪的至少0.1wt.％，甚至更优选至少0.25wt.％，最优选至少0.40wt.％。AA含量优选不超过总脂肪的5wt.％，更优选不超过1wt.％。在本发明的含有AA经肠组合物中，有益地添加EPA和DHA以平衡AA的作用，例如减少AA代谢产物的潜在促炎作用。来自AA的过量代谢产物可能引起炎症。因此，本发明的组合物优选包含DPA、AA、EPA和DHA，其中AA/DHA重量比优选高于0.25，优选高于0.5，甚至更优选高于1。所述比率优选低于25。AA/EPA重量比优选介于1和100之间，更优选介于5和20之间。

为制备适合喂养人，优选喂养婴儿的组合物，本发明的组合物中具有20和22个碳原子的LCPUFA的含量优选不超过总脂肪含量的15wt.％，优选不超过总脂肪含量的10wt.％，甚至更优选不超过总脂肪含量的5wt.％。优选地，按总脂肪含量计，本发明的组合物包含至少0.1wt.％，优选至少0.25wt％，更优选至少0.5wt.％，甚至更优选至少0.75wt.％的具有20和22个碳原子的LC-PUFA。

基于总脂肪，本发明的组合物优选包含介于5wt.％和75wt.％之间(优选介于10wt.％和50wt.％之间)的多不饱和脂肪酸。

如果将本发明的组合物用作婴儿配制食品(例如在喂养婴儿的方法中，所述方法包括给婴儿施用本发明的组合物)，因为希望尽可能地模拟人乳，因此LC-PUFA(尤其是具有20和22个碳原子的LC-PUFA)的含量优选不超过总脂肪含量的3wt.％。出于相同的原因，ω-3LC-PUFA含量优选不超过总脂肪含量的1wt.％；ω-6LC-PUFA含量优选不超过总脂肪含量的2wt.％；AA(ω-6)含量优选低于总脂肪含量的1wt.％；和/或EPA/DHA重量比优选为1或更低，更优选低于0.5。

具有20和22个碳原子的LCPUFA优选以甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯的形式，以磷脂形式作为游离脂肪酸提供；或作为上述一或多种形式的混合物提供。这些来源优选被交酯化以提高稳定性。本发明的组合物优选包含磷脂和/或甘油三酯形式的至少一种AA和DHA。

优选地，本发明的组合物包含选自如下一组的脂肪来源：植物脂肪、真菌脂肪或动物(除了人)脂肪。

本发明人还发现DPA能够降低IL-4对肠渗透性的影响。因此，本发明的一个方面提供了用于治疗和/或预防其中肠IL-4浓度上升的疾病(例如变应性疾病)的方法，所述方法包括施用本发明的含有DPA的组合物，优选与本发明的不易消化的寡糖联合施用。因此，本发明的组合物还可以有益地用于治疗和/或预防遗传过敏性皮炎的方法中。

本发明的营养组合物优选还提供ω-9(n-9)脂肪酸(优选油酸，18:1)，以提供足够的营养。优选地，本发明的组合物提供基于总脂肪酸的重量的至少15wt.％(更优选至少25wt％)的n-9脂肪酸。n-9脂肪酸的含量优选低于80wt.％。

本发明的组合物优选含有维生素E和/或维生素C作为自由基清除剂以防止DPA的氧化。优选地，本发明的组合物包含至少1mg(优选至少5mg)的维生素E/100g干重。对于营养组合物，维生素E含量优选不超过100mg/100g干重。

寡糖

除DPA外，本发明的组合物优选包含不易消化的寡糖，优选包含至少两种不同的不易消化的寡糖。所述寡糖优选直接地或通过改变肠内微生物区系来影响粘膜结构并有益地影响粘液层中的粘蛋白异质性。相信每种不同的不易消化的寡糖对于粘液数量和质量具有不同的影响。而且，两种不同的寡糖还能够提高粘液质量，这可以通过它们协同促进SCFA生成的硫酸化程度反映出来。本发明人发现，两种不同寡糖的混合物可以协同促进乙酸酯生成。本发明人还发现粘液生成依赖于乙酸酯生成。

另一方面，本发明的组合物可以改善肠粘液层的质量。所述粘液层包括粘蛋白。粘蛋白是由杯形细胞合成和分泌的高分子量糖蛋白。它们在粘膜表面形成凝胶样层，从而改善屏障完整性。粘液层包含不同类型的粘蛋白，例如酸性、中性和磺酸化的粘蛋白。据信粘液层的异质性提高可以改善屏障功能性。

优选通过提供长链和短链寡糖两者进一步改善本发明的组合物。提供不同的链长导致促进在回肠和结肠的不同部分生成粘液。短链寡糖(聚合度(DP)典型地为2、3、4或5)促进近侧结肠和/或远侧回肠中的粘蛋白生成，同时相信具有更长链长的寡糖(聚合度(DP)优选为大于5到高至60)可以促进结肠更远部分的粘蛋白生成。

通过同时提供既有短链又有长链寡糖的至少两种不同的寡糖可以实现更进一步的改良。这些优选的实施方式全都有助于进一步改善整个回肠和/或结肠的屏障完整性。

本发明的组合物优选含有聚合度(DP)为至少2个糖单位的寡糖，所述寡糖在肠内不能或只能部分地通过人上消化道(小肠和胃)内存在的酸或消化酶的作用而被消化，但可以被人肠内微生物区系发酵。术语“糖单位”指具有闭环结构的单位，优选己糖，例如吡喃糖或呋喃糖形式。寡糖的聚合度典型地低于60个(优选低于40个，甚至更优选低于20个)糖单位。

本发明的组合物优选包含至少两种不同的寡糖，其中所述寡糖的糖单位同种性(homology)低于约90％，优选低于50％，甚至更优选低于25％，甚至更优选低于5％。本发明中所用术语“同种性”是在不同寡糖中相同糖单位的累积百分比。例如，寡糖1(OL1)具有fruc-fruct-glu-gal结构，因此包含50％果糖(fruc)、25％半乳糖(gal)和25％葡萄糖(glu)。寡糖2(OL2)具有fruc-fruc-glu结构，因此包含66％果糖、33％葡萄糖。因此所述不同的寡糖具有75％(50％果糖+25％葡萄糖)的同种性。

在一个优选的实施方式中，除PDA和任选的EPA、DHA和/或AA外，本发明的组合物还包含半乳糖寡糖以及选自果寡糖和菊粉的至少一种物质。

按其中所含的糖单位总数计算，本发明寡糖中的每一种优选包含至少66％、更优选至少90％的选自如下一组的糖单位：甘露糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、核糖、葡萄糖、木糖、糖醛酸及其衍生物。

根据一个优选的实施方式，本发明的组合物包含选自如下一组的至少一种寡糖：果聚糖、果寡糖、不易消化的糊精、半乳糖寡糖(包括反式半乳糖寡糖)、木寡糖、阿拉伯寡糖、葡萄糖寡糖、甘露寡糖、岩藻糖寡糖、酸性寡糖(见下，例如糖醛酸寡糖如果胶水解产物)及其混合物。优选地，本发明的组合物包含选自如下一组寡糖中的至少一种、优选至少两种：果寡糖或菊粉、半乳糖寡糖和果胶水解产物。

为了良好的粘液数量和质量，本发明的组合物优选包含至少一种寡糖，所述寡糖包含至少66％的半乳糖或果糖作为糖单位。在一个优选的实施方式中，所述组合物包含至少一种包含至少66％的半乳糖作为糖单位的寡糖和至少一种包含至少66％的果糖作为糖单位的寡糖。在一个特别优选的实施方式中，本发明的组合物包含半乳糖寡糖以及选自果寡糖和菊粉的寡糖。果寡糖可以促进人菌群相关性大鼠远结肠的硫粘蛋白生成(Kleessen等，(2003)Brit J Nutr 89：597-606)，半乳糖寡糖可以促进酸性粘蛋白生成(Meslin等，Brit.J.Nutr(1993)，69：903-912))。

优选的重量比：

a.(DP为2-5的寡糖)：(DP为6、7、8和/或9的寡糖)＞1；和

b.(DP为10-60的寡糖)：(DP为6、7、8和/或9的寡糖)＞1

两者均高于1。

优选两个重量比均高于2，甚至更优选高于5。

为了进一步改善整个结肠区域的粘液层厚度和质量，优选所提供的至少两种不同的寡糖分别具有不同的链长，优选地基于各寡糖的总重量的至少10wt.％的每种寡糖具有2-5(即2、3、4和/或5)的DP，至少5wt.％具有介于10和60之间的DP。优选地，基于寡糖的总重的至少50wt.％、更优选至少75wt.％的所述寡糖具有介于2和10之间的DP，因为相信它们可以在整个回肠以及结肠近段和中段起作用。

当作为即食液体形式时，本发明的组合物优选包含0.1-100克不易消化的寡糖/升，更优选0.5-50克/升，甚至更优选1-25克/升。过高的寡糖含量可能由于过度发酵而引起不适，而太低的含量则可能导致不足的粘液层。

至少两种不同的寡糖的重量比优选介于1和10之间，更优选介于1和5之间。这些重量比可以最佳地促进不同类型的粘蛋白在肠的不同位置生成。

优选地，包括在本发明的组合物中的寡糖占所述组合物的总干重的量超过0.1wt.％，优选超过0.2wt.％，更优选超过0.5wt.％，甚至更优选超过1wt.％。本发明的组合物的寡糖含量优选低于20-wt.％，更优选低于10-wt.％，甚至更优选低于5-wt.％。

向本发明的组合物中添加核苷酸和/或核苷可进一步改善肠粘膜屏障功能，特别是因为它可以抑制和/或降低细菌移位的发生率并减少肠损伤。因此，本发明的组合物优选还包含1-500mg(甚至更优选5-100mg)核苷和/或核苷酸/100克干重。

应用

本发明的组合物能够有益地用于改善哺乳动物，尤其是人的屏障完整性的方法中。本发明的组合物还能够有益地用于治疗或预防与屏障完整性降低相关的疾病的方法中，所述方法包括给哺乳动物施用本发明的组合物。本发明的组合物优选经肠施用，最优选口服施用。

本发明的组合物不包括天然人乳汁。本发明的组合物优选通过将成分(优选来自植物、动物或真菌来源的至少一种成分)与一或多种其它成分混合而获得。优选地，本发明的组合物包含植物油、动物脂肪、动物蛋白、植物蛋白中的至少一种。术语“动物”在本申请中不包括人。优选地，本发明的组合物是合成组合物，即不是从有生命的动物或人获得的体液。

对于疾病和婴儿，本发明的组合物优选与完全营养物(包括蛋白质、碳水化合物和脂肪)结合使用。本发明的组合物有益地施用给年龄介于0岁和2岁之间的婴儿。所述组合物优选施用给屏障完整性受损的患者和具有产生受损的屏障功能的风险的健康患者。本发明的组合物有益地用于为早产儿(在妊娠37周前出生的婴儿)提供营养需求的方法中。

还可以通过在可能引起肠损伤的医学治疗之前或之后给患者施用本发明的组合物而将本发明的组合物有益地用于治疗和/或预防肠损伤的方法中。所述医学治疗可以例如是手术或肠道药物治疗，尤其是用抗生素、止痛药、非甾体抗炎药(NSAID)和/或化疗剂进行的治疗。

本发明的组合物还可以有益地用于治疗或预防在疾病发展进程中具有潜在肠屏障破坏的疾病，例如在用于治疗或预防慢性炎症疾病(尤其是炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、乳糜泻、胰腺炎、肝炎、关节炎或糖尿病)的方法中。此外，本发明可以用于为已经经受或正在经受腹部手术的患者和经历术后肠道功能障碍的患者和/或营养不良的患者提供营养的方法中。

在本发明的另一个实施方式中，将本发明的组合物有益地施用给患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的患者和/或感染了人免疫缺陷病毒(HIV)的患者，例如在用于治疗AIDS和/或HIV感染的方法中。所述方法包括口服施用本发明的组合物，优选与选自碳水化合物、蛋白质和脂肪的营养物联合施用。

此外，本发明还可以用于治疗或预防由屏障完整性降低导致的并发症，尤其是用于治疗和/或预防腹泻(尤其是婴儿腹泻)的方法中。由于婴儿腹泻发生率下降，所以本发明的组合物还可以有益地用于减少尿布疹。

施用本发明的组合物能减少膳食和微生物抗原(尤其是食品过敏原)由肠腔通过进入粘膜循环或体循环，从而可以有益地用于治疗或预防变态反应和/或变应性反应的方法中，尤其是在用于治疗或预防食物过敏(例如由于食物的摄入引起的变应性反应)、遗传过敏性皮炎和/或哮喘的方法中。

由于新生儿的屏障功能没有发育完全，所以本发明的组合物可以有益地使用给低龄婴儿，即年龄为0-6个月的婴儿。所述组合物可以以婴儿配制食品或与人乳混合的形式施用给婴儿。因此，本发明还提供了包含人乳和本发明的组合物的食品配方。包括人乳和本发明的组合物的所述组合物特别适合喂养早产儿。本发明的组合物适用于治疗和/或预防坏死性小肠结肠炎(NEC)的方法，尤其是在早产儿中。

本发明的组合物优选以包装好的粉末或包装好的即食配方奶提供。为防止产品酸败，即食配方的包装尺寸优选不超过一份，例如优选不超过500ml；粉末形式的本发明的组合物的包装尺寸优选不超过250份。粉末的合适包装尺寸为2000克或更少，优选1000克或更少。

本发明包括提供有标签的包装好的产品，所述标签根据一或多种上述或下列目的明示或暗示消费者所述产品的用途。通过包括如“减少食物敏感性”、“改善肠耐受性”、“改善的食物耐受性”的措词或类似措词，这些标签可以涉及本发明的用于预防对食物过敏原的变应性反应的方法。类似地，通过包括与“改善的抵抗力”或“降低的敏感性”等价的术语，可涉及本发明的用于治疗和/或预防变态反应得方法。所述包装还可以含有用于改善的屏障完整性的指示，例如“改善的肠道健康”、“支持健康肠功能发育”、“加强肠防御性”、“强化健康的肠道功能”或类似术语。本发明包括了这些内容。

食品组合物

发现本发明的组合物可以有益地用于食品，例如儿童食品和临床食品。这些食品优选包含脂质、蛋白质和碳水化合物，并优选以液体形式施用。本发明中所用术语“液体食品”包括干食品(例如粉末)，所述干食品随附有如何将所述干食品混合物与合适的液体(如水)混和的说明书。

因此，本发明还涉及营养组合物，所述营养组合物优选包含5-50en％的脂质、5-50en％的蛋白质、15-90en％的碳水化合物以及本发明的寡糖与LC-PUFA的组合。优选地，本发明的营养组合物含有10-30en％的脂质、7.5-40en％的蛋白质和25-75en％的碳水化合物(en％是能量百分比的缩写，表示每种成分对制剂的总卡路里值的相对贡献量)。

优选地，本发明的组合物包含植物脂质的组合，并使用选自如下一组中的至少一种油：真菌油、鱼油、海豹油、海藻油或细菌油。

所述营养制剂中所用的蛋白质优选选自非人动物蛋白质(例如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)、植物蛋白(例如大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)、游离氨基酸及其混合物。特别优选源自牛奶的氮源，尤其是牛奶蛋白如酪蛋白和乳清蛋白。

可以将可消化的碳水化合物来源添加到营养配方中。它优选提供营养组合物的能量的约40％-约80％。可以使用任何合适的碳水化合物(来源)，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体和麦芽糖糊精及其混合物。

本发明的组合物优选用作婴儿配制食品，并优选含有7.5-12.5能量％的蛋白质、40-55能量％的碳水化合物和35-50能量％的脂肪。由于本发明的组合物适用于减少婴儿的变应性反应，所以所述婴儿配制食品中的蛋白质优选选自水解的乳蛋白(例如水解的酪蛋白或水解的乳清蛋白)、植物蛋白和/或氨基酸。这些蛋白质的使用进一步减少了婴儿的变应性反应。

在许多婴儿和接受液体食品的患病对象中，大便不规律(例如大便发硬、大便体积不足、腹泻)是一个主要的问题。发现通过在液体食品中给予本发明的寡糖可以减轻大便问题，所述液体食品的重量摩尔渗透压浓度为50-500mOsm/kg，更优选100-400mOsm/kg。

鉴于上述问题，所述液体食品不具有过度的热量密度但仍能提供足够的卡路里来喂养对象，这也很重要。因此，所述液体食品的热量密度优选为0.1-2.5kcal/ml，甚至更优选0.5-1.5kcal/ml的热量密度，最优选0.6-0.8kcal/ml。

实施例

实施例1：DPA对TER和流量的影响

在transwell转孔过滤器(Corning，Costar BV，The Netherlands)上培养肠上皮细胞系T84(美国典型培养物保藏中心(ATTC)，Manassas，USA)的单层(MC)，所述过滤器允许粘膜和浆膜取样并刺激人肠上皮细胞。汇合两周后，在具有多不饱和脂肪酸DPA(7、10、13、16、19-二十二碳五烯酸，22:5n3)、AA(花生四烯酸；5、8、11、14-二十碳四烯酸)、DHA(顺式-4、7、10、13、16、19-二十二碳六烯酸)、EPA(二十碳五烯酸)或对照棕榈(C 16:0)酸(Palm)(Sigma，St.Louis，USA)的腔室内温育所述单层。选择后一程序模拟膳食化合物的体内施用途径。以100μM，用DPA、AA、DHA、EPA或棕榈酸将细胞温育0、24、48和72小时。

进行实验以评价基础屏障完整性和细胞因子(IL-4)诱导的屏障破坏。通过用上皮伏特-欧姆计(EVOM；World Precision Instruments，Germany)测量经上皮电阻(TER，Ω.cm²)确定上皮屏障功能和对4kD FITC葡聚糖(细胞旁渗透性标记物，Sigma，USA)的渗透性。如下确定上皮对4kD FITC-葡聚糖的渗透性。在葡聚糖流动前，用不含酚红的培养基将介质更新一小时，然后向腔室中添加5μl(原液100mg/ml)4kDa FITC-葡聚糖。在温育60min后，从浆膜室中收集100μl样品，并在485nm激发波长和520nm发射波长(FLUOstar Galaxy

，BMG Labtechnologies，USA)测定荧光信号。将FITC-葡聚糖流量计算为pmol FITC-葡聚糖/cm²/h。使用方差分析(ANOVA)(SPSS 10版)进行统计分析。

表1给出了在温育72小时后，脂肪酸(100μM)对天然屏障完整性和IL-4介导的屏障破坏的影响。表1显示LC-PUFA DPA、AA、EPA和DHA在基础条件以及屏障破坏条件下均可改善上皮电阻。相反，对照实验显示棕榈酸是无效的。而且，DPA、AA、EPA和DHA而非棕榈酸(PA)有效地降低了由于用细胞因子温育而引起的渗透性增加。

表1

成分(LC-PUFA)	基础电阻(TER)	IL-4破坏的电阻(TER)	IL-4提高的渗透性(流量)
				对照	490±55	281±7	514±109
棕榈酸	496±50	272±11	646±106
				DPA	605±27	368±4	216±123
DHA	584±50	328±7	304±75
				AA	634±29	337±13	273±76
EPA	584±7	375±9	236±145

这些结果指示DPA、EPA、DHA和AA，尤其是DPA在本发明的组合物中的有益作用，并可用于本发明的方法例如用于改善屏障完整性的方法中。

实施例2：寡糖对乙酸酯生成的影响

从用奶瓶喂养的婴儿的新鲜粪便中获得微生物。将年龄为1-4个月的婴儿的新鲜粪便材料汇合，在2小时内放入防腐介质中。使用益生元(TOS)、比率为9/1(w/w)的TOS/菊粉(HP)混合物、菊粉、比率为1/1(w/w)的果寡糖(OS)/菊粉混合物作为底物，或不使用底物(空白)。还参见申请人的申请号为04748674.1的共同未决欧洲专利申请中的实施例。

结果显示，与单一成分相比，两种不同寡糖(TOS/菊粉)的混合物导致每克纤维的SCFA(尤其是乙酸酯)量明显地协同上升，其中所述两种不同的寡糖具有低于90的单糖单位同种性和不同的链长。结果还显示，添加TOS/菊粉的组合可产生更高比例的有益的乙酸酯。乙酸酯生成在体内转变为杯形细胞所致的粘液生成的改善，以及对肠粘液层厚度的度量(参见实施例3)。这些结果指示了本发明的组合物的有益用途。

实施例3：SCFA对粘液生成的影响

用短链脂肪酸乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯(SCFA，Merck，USA)温育肠上皮T-84的单层，以比较SCFA对MUC-2表达的刺激作用，扣除基础MUC-2表达水平。还参见申请人的申请号为04748674.1的共同未决欧洲专利申请中的实施例。

结果显示SCFA(乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯)对肠上皮细胞(MC T84)和上皮-间充质细胞共培养物(CC T84)中的MUC-2表达具有不同的影响。结果还显示与丙酸酯和丁酸酯相比，乙酸酯在刺激MUC-2表达(粘液生成)方面更有效。因此，本发明的寡糖的组合(其显示可提高乙酸酯生成(参见实施例2))在促进粘液生成方面特别有用，并可以有益地用于促进屏障完整性的方法中。

这些结果指示EPA、DHA、DPA和/或AA，尤其是DPA，在本发明的组合物中的有益作用，并可用于本发明的方法中，即用于改善屏障完整性的方法中。这些结果还支持本发明的脂肪酸与不易消化的寡糖的组合的协同作用。

实施例4：DPA在上皮肠细胞中转化为EPA

如上所述制备肠上皮细胞系T84的单层(MC)，分析脂肪酸组成。根据Blight，E.G.& Dyer，W.J.，1959(Can J Med Sci 37：911-917)所述方法，使用C19:0作为内标，提取所收集的T84细胞的脂肪酸。简言之，在氮气氛下，通过添加2ml甲醇、0.9ml EDTA溶液(1g/100ml MQ)和1ml二氯甲烷，从1ml上皮膜悬浮液中提取脂质。使用SPE(固相提取)从提取物的其它脂质中分离磷脂。在分离后，根据Morrison，W.R.& Smith，L.M.，1964(J Lipid Res 53：600-608)公开的方法，使用于甲醇中的14％BF₃将所述磷脂甲基化1小时。在用己烷提取后，将脂肪酸甲酯溶于异辛烷中，通过毛细管柱(50mx0.25mm，CP-SIL88-fame)气相色谱法进行定量。自动积分峰下面积(灵敏度500μg/L)。

将PUFA掺入肠上皮膜磷脂中。表2显示补充脂肪酸导致所有的个体PUFA的掺入。在与α-亚麻酸(18:3，n3；ALA)、EPA和DHA温育后，这些个体脂肪酸各自的水平得以掺入。令人惊讶地，当用DPA温育细胞时，不仅掺入了DPA，而且EPA水平明显上升(4.48)，这表明补充DPA还可以提高膜EPA水平(^*p＜0.015)。检查DPA原液的纯度，没有发现EPA污染。该观察结果指示DPA在本发明中的有益用途。

                            表2

实施例5：具有DPA的婴儿配制食品

通过将13.9g粉末与水混合产生100ml最终产品而制备液体婴儿营养品，所述液体产品每100ml包含：

能量：66kcal

蛋白质：8en％

可消化的碳水化合物：44en％(含7.3g乳糖)

脂质：48en％(含棕榈油、椰子油、吞拿鱼油(tuna fish oil)、菜籽油、葵花子油和二十二碳五烯酸(docopentaenoic acid)(Cayman Chemicals，AnnArbor，MI，USA)，基于脂质总重的0.2wt.％DHA、0.1wt.％DPA n-3、0.05wt.％EPA、2.2wt.％ALA、0.2wt.％GLA、0.35wt.％AA、13wt.％LA)

纤维：0.8g(含0.05g果糖多糖，0.55g反式半乳糖寡糖)

核苷酸：

0.89mg胞苷-5-单磷酸酯；

0.55mg尿苷-5-单磷酸酯；

0.82mg腺苷-5-单磷酸酯；

0.20mg鸟苷-5-单磷酸酯；

0.34mg肌苷-5-单磷酸酯。

重量摩尔渗透压浓度：300mOsmol/l

所述组合物还含有胆碱(6mg/100ml)和牛磺酸(6.3mg/100ml)；矿物质和微量元素(包括2mg锌/100ml)以及其量符合婴儿乳品配方的国际指南的维生素。

Claims (11)

1.n-3二十二碳五烯酸(DPA)用于制备改善肠屏障完整性、改善屏障功能、促进肠道成熟和/或降低肠屏障渗透性的营养或药物组合物的用途。

2.n-3二十二碳五烯酸用于制备治疗和/或预防其中屏障完整性受损的疾病的营养或药物组合物的用途。

3.权利要求1或2的用途，用于治疗和/或预防炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、乳糜泻、胰腺炎、肝炎、关节炎、变态反应、脓毒症、坏死性小肠结肠炎、HIV/AIDS、感染、遗传过敏性皮炎或糖尿病。

4.前述权利要求中任一项的用途，其中所述组合物还包含不易消化的寡糖。

5.前述权利要求中任一项的用途，其中所述组合物包含5-60en％的蛋白质、5-95en％的碳水化合物和5-75en％的脂肪。

6.包含n-3二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳五烯酸(EPA)的营养或药物组合物，其中DPA∶(EPA)的比率等于或高于0.33。

7.权利要求6的组合物，其中所述组合物还包含不易消化的寡糖。

8.权利要求6或7的组合物，所述组合物包含5-60en％的蛋白质、5-95en％的碳水化合物和5-75en％的脂肪。

9.权利要求6-8中任一项的组合物，还包含花生四烯酸和/或二十二碳六烯酸。

10.婴儿配制食品，其包含权利要求6-9中任一项的组合物。

11.权利要求6-9中任一项的组合物用于制备改善肠屏障完整性、促进肠道成熟、改善屏障功能和/或降低肠屏障渗透性的组合物的用途。