CN101357987A - 六胺型聚乙二醇衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了结构如式A所示的六胺型聚乙二醇衍生物A，及衍生物A的制备方法和它们作为水溶性不对称菁染料液相合成过程中支载体的用途。

Description

六胺型聚乙二醇衍生物

技术领域

本发明涉及六胺型聚乙二醇衍生物，及这些衍生物的制备方法和它们作为水溶性不对称菁染料液相合成过程中支载体的用途。

背景技术

聚乙二醇(PEG)是一性能优异的高分子材料，它在二氯甲烷、乙酸乙酯等溶剂中可溶，而在乙醚、异丙醚等溶剂中不溶，这种性能使它在许多反应中作为反应物的支载体，使反应可在均相条件下进行，而向反应体系中加入乙醚等有机溶剂之后，可使聚乙二醇支载体沉淀出来，通过简单地过滤与洗涤便可实现产物的有效分离与纯化。

菁染料(简称Cy)是一类重要的性能优异的光学材料，这类化合物具有摩尔消光系数大、荧光性能良好、与基质结合后荧光效率增大、吸收波长范围宽(540-1000nm左右)、吸收及发射光谱范围可调等优点。这些优点使菁染料已广泛地被用作光盘的记录介质，太阳能电池光敏剂，激光材料，光合成反应中的光采集部分；特别是结构不对称的水溶性吲哚菁染料作为荧光标记试剂与目标生物分子(如抗原、抗体、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸)结合成为生物分子的荧光探针在生物、医学等领域得到了重要的应用。

目前合成水溶性不对称吲哚菁染料的方法主要是溶液合成法。其制备过程首先是用亲电性缩合剂与等摩尔的2-位上带有亲核活性甲基的1-取代吲哚反应得到中间产物；然后再将中间产物与另一结构不同的2-位上带有活性甲基的1-取代吲哚反应得到不对称吲哚菁染料[Ratnakar B.Mujumdar，Lauren A.Ernst，Swati R.Mujumdar，Christopher J.Lewis，and Alan S.Waggoner.BioconjugateChemistry，1993，4(2)，105-111]。这种溶液合成方法所得产物是结构对称与不对称吲哚菁染料的混合物，产物的分离纯化十分困难，必须利用繁锁的色谱分离才能得到纯度较好的结构不对称的产品，并且所得产率较低。为了解决水溶性不对称吲哚菁染料传统合成方法的不足，本专利的发明者曾以聚乙二醇为支载体进行水溶性不对称吲哚菁染料合成，使得聚乙二醇支载的中间产物及最后目标化合物的合成反应均在均相体系中进行，而中间体和产物的分离只需要简单的过滤和洗涤便可，成功地解决了传统合成方法的不足[李宝林，窦丽芳，蒋林玲.中国发明专利，申请号：200710017321.2，申请日：2007.1.30.]。在上述方法中所用的支载体为聚乙二醇以分子两端的羟基各键连一个氨苯基的衍生物。由于这个支载体只有两个反应位点，其负载量较低，致使每一单元操作的产量较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述聚乙二醇衍生物作为水溶性不对称菁染料合成过程的支载体时负载量较低的缺点，提供一种负载量较高的结构如式A所示六胺型聚乙二醇衍生物A，

其中PEG部分的平均分子量为1000～8000。

本发明的另一个内容是提供衍生物A的制备方法。所述衍生物A的制备方法按照如下所示的反应方程式进行：

其具体的制备过程为：

将PEG支载的季戊四醇(1)、4-[(叔丁氧羰基)氨基]苯甲酸(2)按摩尔比为1∶10～20的配比加入到混合物总重量15～20倍的干燥二氯甲烷中。另称取化合物1物质的量1.5～3.0倍的4-二甲氨基吡啶和化合物1物质的量15～20倍的N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)溶于二者总重量45～50倍的干燥二氯甲烷中配成溶液，将该溶液逐渐滴加到上述含有化合物1和2的二氯甲烷溶液中，在20～30分钟内滴完。通氮气保护，氮气的流速为0.2～0.3L/min，搅拌下20～35℃反应12～24小时。反应完毕后将沉淀过滤后得黄色溶液，将其体积浓缩至原体积的5～10％，冷至0～10℃加入现有反应液体积0.9～4倍量的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得结构式为(3)的固体中间产物。

将中间产物3和3重量4～8倍的三氟乙酸加入到其总重量1～3倍的二氯甲烷中，回流5～12小时，冷至室温加入反应液体积2.5～10倍量的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得黄色固体。将该黄色固体溶于其重量5～10倍的二氯甲烷中，再加入黄色固体重量1～3倍的三乙胺，室温搅拌2小时后浓缩至原体积的20～50％，再加入现体积3～6量的乙醚，搅拌30分钟，静置，过滤得黄色固体六胺型聚乙二醇衍生物A。

本发明的再一个内容是提供所述衍生物A作为结构如式I所示水溶性不对称菁染料合成过程中支载体的用途。

式I中，R₁、R₂为-SO₃H、-SO^- ₃、-SO₃K、-COOH、-COO^-、-COOK、-H、-Ph的一种，R₁、R₂相同或不相同，R₁、R₂在吲哚结构单元的4-、5-、6-、7-位中一处；R₃、R₄为C_1～10烷基或m为0～8的-CH₂(CH₂)_mCOOH基或m为0～8的-CH₂(CH₂)_mSO₃H基，R₃与R₄为不相同的基团；n为1或2。

此处所说的支载体是指在结构如式I所示的水溶性不对称菁染料合成过程中，通过衍生物A中的氨基生成聚乙二醇支载的半菁染料；当此被支载的半菁染料与另一亲核性杂环化合物反应时使半菁染料从支载体上离解下来的同时生成水溶性不对称菁染料化合物；利用衍生物A这种支载体在二氯甲烷、乙酸乙酯中可溶，而在乙醚中不溶的性质，使水溶性不对称菁染料合成过程中的各步反应可在均相条件下进行，通过向反应体系中加入乙醚使反应的中间产物或衍生物A析出，利用过滤和洗涤实现产物的分离。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，但并不是本发明内容范围的任何限制。

实施例中所用聚乙二醇支载的季戊四醇(1)按文献[Alexander Fishman，Mohammad Elmi Farrah，Jian-Hua Zhong，Subakar Paramanantham，ClaudiaCarrera，and Edward Lee-Ruff.J.Org.Chem.，2003，68(25)，9843-9846]的方法制备；1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐和1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐按文献[Ratnakar B.Mujumdar，Lauren A.Ernst，Swati R.Mujumdar，Christopher J.Lewis，and Alan S.Waggoner.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111]方法制备；其它化学试剂均为分析纯。化合物结构鉴定所用的核磁共振仪为Bruker AVANCE 300超导核磁共振仪，TMS作为内标；红外光谱采用Nicolet 170SX FT-IR红外光谱仪测定，质谱采用Kratos PC Axima CFRplusMALDI-TOF质谱仪测定。

实施例1

六胺型聚乙二醇衍生物A的制备

取PEG-2000支载的季戊四醇(1)1.53g(0.68mmol)，4-[(叔丁氧羰基)氨基]苯甲酸(2)1.95g(8.2mmol)溶入45mL二氯甲烷。另取N，N’-二环己基碳二亚胺2.49g(11.7mmol)和4-二甲氨基吡啶0.114g(1.2mmol)溶于90mL二氯甲烷中配成溶液，将该溶液逐渐滴加到上述含有化合物1和2的溶液中，在20分钟内滴完；通入氮气保护，氮气的流速为0.2～0.3L/min；电磁搅拌下室温反应24小时。反应完毕后将固体N，N’-二环己基脲过滤后得黄色溶液，将其体积浓缩到原体积的5～10％，冷至0～10℃加入10mL的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得结构式为(3)的固体中间产物。

将上述所得中间产物1.65g(0.46mmol)和三氟乙酸4.5mL加入到7.0mL二氯甲烷中，电磁搅拌下回流反应10小时。冷至室温，向反应液中加入50ml乙醚，电磁搅拌5分钟后静置10～20分钟，过滤得黄色固体。将该黄色固体溶于9.0mL二氯甲烷中，加入2.2mL三乙胺，室温搅拌2小时后浓缩溶液到约5mL，加入15mL乙醚，搅拌30分钟，静置，过滤得黄色固体六胺型聚乙二醇衍生物A 1.15g，收率80.3％。IR(KBr)：3428，2911，1742，1605，1460cm^-1.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.83(d，12H，J＝7.3Hz)，6.64(d，12H，J＝7.3Hz)，4.40-3.40(m，PEG)。波谱数据表明衍生物A的结构为：

实施例2

衍生物A在合成水溶性不对称菁染料Cy3中的应用

步骤1 衍生物A支载的二次甲基半菁染料的制备

取衍生物A 0.418g(0.14mmol)、原甲酸三乙酯1.5mL(9mmol)溶解在5mL冰醋酸中，电磁搅拌下55℃反应5.5小时。冷至室温，向反应液中加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟后静置10～20分钟，过滤得淡黄色固体物质0.302g，收率85.7％。

取上述所得淡黄色固体物质0.320g(0.097mmol)，1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.096g(0.361mmol)和原甲酸三乙酯0.3mL(1.83mmol)溶解在5mL无水乙醇中，通入氮气保护，氮气的流速为0.2～0.3L/min。电磁搅拌下回流反应2.5小时。冷至室温加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得橙色固体六胺型聚乙二醇衍生物A支载的二次甲基半菁染料0.28g，收率65.1％。IR(KBr)：3431，2879，1698，1602，1458，1186，1112cm^-1。反应式如下：

步骤2 水溶性不对称菁染料Cy3的制备

取衍生物A支载的二次甲基半菁染料0.301g(0.065mmol)、1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.046g(0.13mmol)溶解在由2mL醋酸酐和1mL吡啶形成的混合溶剂中，通入氮气保护，氮气的流速为0.2～0.3L/min，电磁搅拌下110℃反应15分钟。冷至室温后加入40mL乙酸乙酯得深红色沉淀。该沉淀用二氯甲烷洗涤至二氯甲烷洗液为无色后得0.019g红色固体水溶性不对称菁染料Cy3，收率23.2％。¹H NMR(300MHz，D₂O)：δ8.31(t，1H，βprotonof the bridge，J＝13.9Hz)，7.73-7.64(m，4H，4-H，4’-H，6-H，6’-H)，7.18-7.15(m，2H，7-H，7’-H)，6.22-6.17(m，2H，α，α’proton of the bridge)，3.94-3.89(m，4H，α-，α’-CH₂)，2.03(t，2H，-CH₂COOH，J＝7.1Hz)，1.64-1.15(m，21H，3CH₂groups，1 CH₃ and 2(CH₃)₂groups).¹³C NMR(300MHz，D₂O)：δ183.5，175.8，175.5，151.9，144.1，143.7，141.7，141.5，139.7，139.60，126.8，119.8，111.5，111.3，103.4，49.3，44.3，39.6，37.3，27.1，27.0，26.6，26.1，25.6，11.9.MALDI-TOF-MS：m/z for C₃₁H₃₈S₂O₈N₂[M+Na]⁺ calcd 653.20，found 653.09。反应式如下：

实施例3

衍生物A在合成水溶性不对称菁染料Cy5中的应用

步骤1 衍生物A支载的四次甲基半菁染料的制备

取六胺型聚乙二醇衍生物A 0.522g(0.17mmol)、1，1，3，3-四甲氧基丙烷2.1mL(12.6mmol)溶解在5mL冰醋酸中，电磁搅拌下55℃反应5.5小时。冷至冷至室温，向反应液中加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟后静置10～20分钟，过滤得黄色固体物质0.493g，收率82.1％。

取上述所得黄色固体物质0.465g(0.14mmol)，1-乙基-2，3，3-四甲基吲哚-5-磺酸盐0.112g(0.422mmol)加入到5mL冰醋酸中，通入氮气保护，氮气的流速为0.2～0.3L/min。在电磁搅拌下80℃反应1小时。冷至室温后加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤得褐色固体六胺型聚乙二醇衍生物A支载的四次甲基半菁染料0.452g，收率69.2％。IR(KBr)：3430，2874，1709，1635，1458，1189，1109cm^-1。反应式如下：

步骤2 水溶性不对称菁染料Cy5的制备

取六胺型聚乙二醇衍生物A支载的四次甲基半菁染料0.361g(0.075mmol)、1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.042g(0.120mmol)溶解在由2mL醋酸酐和1mL吡啶形成的混合溶剂中，通入氮气保护，氮气的流速为0.2～0.3L/min，电磁搅拌下110℃反应15分钟。冷至室温后加入40mL乙酸乙酯得蓝色沉淀。该沉淀用二氯甲烷洗涤至二氯甲烷洗液为无色后得0.020g蓝色固体水溶性不对称菁染料Cy5，收率26.1％。¹H NMR(300MHz，D₂O)：δ7.86-7.70(m，6H，4-H，4’-H，6-H，6’-H，β，β’protons of the bridge)，7.27-7.25(m，2H，7-H，7’-H)，6.38(dd，1H，γproton of the bridge，J＝12.6，12.5Hz)，6.11-6.00(m，2H，α，α’proton of the bridge)，4.00-3.95(m，4H，α-，α’-CH₂)，2.18(t，2H，-CH₂COOH，J＝7.00Hz)，1.72-1.27(m，21H，3CH₂ groups，1CH₃and 2(CH₃)₂groups).¹³C NMR(300MHz，D₂O)：δ183.1，173.9，173.7，154.3，144.2，143.7，141.9，141.8，139.4，139.3，126.6，119.8，111.1，110.9，104.0，103.8，49.1，49.0，44.1，39.4，37.1，26.8，26.7，26.1，25.6，11.7.MALDI-TOF-MS：m/z for C₃₃H₄₀S₂O₈N₂[M]⁺ calcd 656.81，found 656.86；[M+Na]⁺calcd 679.80，found 679.90。反应式如下：

Claims (3)

1、一种六胺型聚乙二醇(PEG)衍生物A，其结构如式A所示：

其中PEG部分的平均分子量为1000～8000。

2、权利要求1所述六胺型聚乙二醇衍生物A的制备方法；按照如下所示的反应方程式进行；

具体的制备过程为：

将PEG支载的季戊四醇(1)、4-[(叔丁氧羰基)氨基]苯甲酸(2)按摩尔比为1∶10～20的配比加入到混合物总重量15～20倍的干燥二氯甲烷中。另称取化合物1物质的量1.5～3.0倍的4-二甲氨基吡啶和化合物1物质的量15～20倍的N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)溶于二者总重量45～50倍的干燥二氯甲烷中配成溶液，将该溶液逐渐滴加到上述含有化合物1和2的二氯甲烷溶液中，在20～30分钟内滴完。通氮气保护，氮气的流速为0.2～0.3L/min，搅拌下20～35℃反应12～24小时。反应完毕后将沉淀过滤后得黄色溶液，将其体积浓缩至原体积的5～10％，冷至0～10℃加入现有反应液体积0.9～4倍量的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得结构式为(3)的固体中间产物；

将中间产物3和3重量4～8倍的三氟乙酸加入到其总重量1～3倍的二氯甲烷中，回流5～12小时，冷至室温加入反应液体积2.5～10倍量的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得黄色固体。将该黄色固体溶于其重量5～10倍的二氯甲烷中，再加入黄色固体重量1～3倍的三乙胺，室温搅拌2小时后浓缩至原体积的20～50％，再加入现体积3～6量的乙醚，搅拌30分钟，静置，过滤得黄色固体六胺型聚乙二醇衍生物A。

3、权利要求1所述衍生物A作为结构如式I所示水溶性不对称菁染料合成过程中作为支载体的用途；

式I中，R₁、R₂为-SO₃H、-SO^- ₃、-SO₃K、-COOH、-COO^-、-COOK、-H、-Ph的一种，R₁、R₂相同或不相同，R₁、R₂在吲哚结构单元的4-、5-、6-、7-位中一处；R₃、R₄为C_1～10烷基或m为0～8的-CH₂(CH₂)_mCOOH基或m为0～8的-CH₂(CH₂)_mSO₃H基，R₃与R₄为不相同的基团；n为1或2。