CN101355972A - 基于玻璃化转变温度通过干法加热的病毒灭活方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对存在或可能存在于根据玻璃化转变温度干燥的生物制品中的病毒通过干法加热的病毒灭活方法。首先确定所述干制品的玻璃化转变温度，接着在不低于所述确定的玻璃化转变温度的温度加热所述制品。

Description

基于玻璃化转变温度通过干法加热的病毒灭活方法
本发明涉及通过干法加热的病毒灭活方法。
技术领域
病毒污染的风险存在于任何固体生物材料中，其后续的或衍生的产品或使用这样的材料的加工品必须用病毒灭活方法处理以便用于治疗或预防的目的。
在治疗和预防领域中，使用的活性物质源自生物来源，或在其生产处理过程中可能被生物来源污染。
这些活性物质可以是蛋白、肽、多肽、抗体；可能被脂质或糖类基团取代的蛋白、肽、多肽、抗体；核酸、DNA、RNA、多糖、细菌、病毒颗粒或其它。
它们所起源的生物来源或者在其生产处理过程中可能污染它们的生物来源可以是任何人或动物组织、血液、血浆、骨、任何植物组织、任何微生物、细胞培养基、病毒培养基、细菌培养基、酵母培养基、霉菌培养基或真菌培养基。
因此，在从这样的生物来源生产活性物质的提取步骤中，通常包括病毒减少或灭活步骤。
对于本发明，生物制品是指包含由生物来源制得的活性物质和源自所述活性物质的生产处理的其它化合物和赋形剂的制品。
基于用化学品和/或加热处理的病毒灭活方法是背景领域已知的。其中大多数来自病毒灭活效力至关重要的输血领域，因为必须尽力使得没有得自捐献者血液导致的可能污染。
加热已经被推荐用于灭活HIV，因为已经特别公认其病毒源在血液和血浆以及血液和血浆的衍生制品中。干法加热，即将干制品加热到温度T并维持时间段t，已经被推荐用于例如尚未以液体形式加热的凝血因子的冻干或冷冻干燥的浓缩物。例如，过去常常将从人类血浆中提取的凝血因子VIII以冻干的形式在60℃加热72-96小时以使这种生物学活性物质安全地用于治疗血友病患者。然而，病毒滴度的不一致减少导致这种方法被放弃，因为尽管进行了加热灭活，仍记录了一些被HIV感染的血友病患者污染病例。
因此，建议将这些制品经受所谓的“严格的”加热条件，即以干燥形式在80℃的温度下加热72小时。
根据以这种方式处理因子VIII所获得的临床结果，这种病毒灭活方法后来被批准用于HIV(有包膜病毒)(L.Winkelman et al.，SevereHeat Treatment of Lyophilised Coagulation Factors(冻干凝血因子的严格加热处理)Curr.Stud.Hematol.Blood Transfus.[1989] 56：55-69)。
用溶剂和洗涤剂的混合物处理纯化的蛋白也通常用于防止通过源自生物来源的蛋白的有包膜病毒的传染(Piet et al.，Transfusion(输液)[1990]30：592-98)。这种处理对具有脂质包膜的病毒有效但对那些没有这样的结构的病毒则逊色很多。最近，描述了通过使用溶剂/洗涤剂处理的生物制品的至少两个无包膜病毒的传染。无包膜RNA病毒甲型肝炎病毒被传染给使用已经用溶剂/洗涤剂处理过的因子VII的患者(Purcell et al.，Vox Sang[1994]67：2-7)。因子VIII也与无包膜细小病毒B19的传染有关(Lefrère et al.Lancet[1994]343：211-12)。
纯化蛋白的加热处理已经被推荐将病毒灭活谱延伸至无包膜病毒。然而，无包膜病毒的加热灭活通常比有包膜病毒更难，并且通常要求更长的处理时间和/或更高的温度以保证灭活令人满意。B19已经通过已在100℃下干法加热30分钟的因子VIII传染给患者(Santagostino et al.，Lancet[1994]343：798)。
因此，很明显弄清楚能够如何改进病毒灭活方法以保持或增强生物制品的安全性非常重要。
背景技术
很多研究者设法观察影响干法加热的病毒灭活的主要参数。其目标在于限定物理化学参数，所述参数会允许预测所给处理是否适合于待处理的固体材料，即该处理是否会在保持制品的稳定性令人满意时将病毒灭活至充分的程度。此外，如果能够调节这种参数以有利于病毒灭活或制品稳定性，则会极为有趣。
病毒灭活处理的病毒减少因子被定义为病毒滴度减少的因子，即灭活步骤前的病毒滴度和灭活步骤后的病毒滴度的比值的常用对数。
水分含量被定义为每100g制品中物质的重量。这是为什么将它表达为总重百分数的原因。传统的测量方法是在100℃以上的温度加热至其重量保持恒定后测量制品重量的减少。
Wilkommen等人(Paul Ehrlich Institute)表明：对于含有低水分水平的冻干粉(＜0.8％)，通过在80℃加热72小时得到的甲型肝炎病毒(HAV)减少因子为0-0.4log10，而对于含有较高水分水平的冻干粉(＞0.8％)，在同样条件下得到的甲型肝炎病毒减少因子大于或等于4.3log10。
Bunch等人(Alpha Therapeutic Corporation)表明：对于重组因子VIII的两个样品，在80℃加热72小时时甲型肝炎病毒减少因子大于等于6.9log10。
Roberts PL等人(Biologicals[2000]Sept；28(3)：185-8 Comparisonof the Inactivation of Canine and Bovine Parvovirus by Freeze-Dryingand Dry-Heat Treatment in Two High-Purity Factor VIII Concentrates(在两个高纯度因子VIII浓缩物中通过冻干和干法加热处理的犬和牛细小病毒的灭活比较))表明：在将因子VIII浓缩物的两个冻干制剂在80℃加热72小时时，通过两个细小病毒(牛和犬)的病毒灭活对生物制品的成分和病毒的抵抗力的影响。
Hart HF等人(Vox Sang[1994]67(4)：345-50 Effect of Terminal(Dry)Heat Treatment on Non-Enveloped Viruses in Coagulation FactorConcentrates(最终(干法)加热处理对凝血因子浓缩物中无包膜病毒的作用))在80℃加热24小时或90℃加热2小时的因子VIII冻干粉中获得了相同的甲型肝炎病毒减少因子。
Tomokiyo等人(Vox Sang[2003]Jan；84(1)：54-64 Large-ScaleProduction and Properties of Human Plasma-Derived Activated FactorVII Concentrate(人类血浆衍生的活化因子VII浓缩物的大规模生产及性质))表明：通过灭活因子VIIa的冻干粉中的CMV(巨细胞病毒)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、BVDV(牛病毒性腹泻病毒)、脊髓灰质炎病毒、PPV(猪细小病毒)的不同病毒，冻干粉中的病毒灭活在65℃是可能的。将含有小于1.7％的水分水平的制品在65℃加热96小时表明：除了PPV之外，所有病毒的病毒减少因子大于4log10。
专利申请EP 0 844 005表明，待处理的干生物制品的残留水分含量是通过在80℃干法加热处理72-77小时的病毒灭活效力中的关键因素。所测试的病毒是HAV、猪细小病毒和假性狂犬病病毒。本发明人表明：残留水分必须大于或等于0.8％以达到用这种处理使病毒减少因子大于等于4 log10。对于残留水分小于等于0.8％的情形，平均病毒减少因子为0.12 log10。
技术问题
鉴于这些及不连续的结果，看来没有定义参数，所述参数的测量会允许可靠地确定基于干法加热的病毒灭活处理的特有操作变量，所述干法加热根据待处理的生物制品而使用。
然而，在待处理制品的水分水平扮演很重要角色的事实上，在研究者中似乎仍然有某种程度的一致，尽管所述研究者不同意将残留湿度水平作为获得令人满意的病毒灭活的阈值。实际上，有时候将该值减少仅十分之几就足够导致不完全灭活。
然而，与某些研究者可能引导我们相信的形成对照，本申请人已经表明能够在含有少量残留水分的冻干粉中实现病毒灭活。将含有0.1％的残留水分的人纤维蛋白原的冻干制剂在77℃干法加热72小时，所获得的甲型肝炎病毒(HAV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪细小病毒(PPV)的减少因子如表1所示。
表1
病毒  减少因子
HAV  4.10±0.303.75±0.26
 HIV  4.53±0.364.62±0.304.88±0.28
 BVDV  5.96±0.405.21±0.38
 PPV  2.97±0.432.88±0.37
这些各种观察结果的分布意味着仅能得出如下结论：待处理制品的残留水分不是通过干法加热的病毒灭活结果的决定性因子，而是决定性因子会依赖的重要因子。
因此，问题是鉴别可测量的多因子物理化学参数，所述参数能够提供区分令人满意与不满意的病毒灭活的阈值。
发明概述
在令人吃惊的开发中，本申请人鉴别出这种可测量的物理化学参数是待处理生物制品的玻璃化转变温度。
玻璃化转变是二级转变，即包含热容变化而不是潜热变化的热转化。它是过冷液体的特征，所述过冷液体被足够快速地冷却至足够低的温度以防止结晶，并形成从硬脆状态向软柔状态变化的玻璃和无定形聚合物或晶体聚合物的无定形部分。
玻璃化转变温度或Tg是玻璃化转变发生的温度。
当将聚合物冷却到该温度以下时，它变得硬而脆，像玻璃一样-因此将它称为玻璃态。
弹性体橡胶样聚异戊二烯和聚异丁烯在它们的玻璃化转变温度以上使用，即当它们有弹力、柔软而灵活的时候。
对于本领域技术人员来说，已知玻璃化转变温度取决于某套参数。在聚合物的情况下，它取决于它们的分子量、链的化学结构和所包含的增塑剂的量。
增塑剂是类似于盐的小分子，其插入聚合物分子之间并帮助它们在彼此上方滑动，从而促进它们的运动。因此，加入增塑剂可以降低玻璃化转变温度。
与之相反，高分子量分子阻止聚合物分子在它们之间的运动并升高玻璃化转变温度。
另外，本申请人已经表明玻璃化转变温度与血管性血友病因子(Von Willebrand Factor)(vWF)的给定冻干粉的残留水分直接相关。
冻干粉的玻璃化转变温度与其残留水分的关系图示于图1中。
因此，生物制品的玻璃化转变温度取决于活性物质的性质和赋形剂的性质：含增塑剂与否、晶体或无定形形式、赋形剂的分子量和生物制品的残留水分。
发明详述
本发明涉及基于通过干法加热存在和可能存在于干生物制品中的病毒的病毒灭活方法，其特征在于包括如下步骤：
a)确定待处理的干生物制品的玻璃化转变温度Tg，然后
b)在等于或大于步骤a)中确定的所述玻璃化转变温度Tg的干法加热温度T加热来自步骤a)的所述待处理的干生物制品。
干制品是使用诸如冻干、真空干燥、全蒸发或喷雾法的本领域技术人员熟悉的方法将其干燥的制品。
特别地，干制品是冻干制品，即首先冷冻并已使其水分含量的至少一些随后在真空下升华的制品。
实际上，本申请人观察到：在加热温度等于或大于Tg时，病毒减少因子和病毒灭活动力学都增强。
因此得知玻璃化转变温度值使得能够预测灭活方法是否会令人满意，并且如果必要的话，能够据此调节该方法。
干生物制品的玻璃化转变温度的测量包括将这种制品的样品经受-50℃至+100℃的渐进地程序性升高的温度，并观察其状态变化，包括玻璃化转变。
从而获得干生物制品的温谱图，特别是其玻璃化转变温度。
已经测量出玻璃化转变温度的值，本领域技术人员使用基于加热的病毒灭活方法领域的普通知识能够判断为了满足T≥Tg的要求：
-Tg对于有关病毒选择大于等于Tg的温度T是否是令人满意的；
-或者为了能够选择T是否必须调节Tg以保证所研究的病毒灭活和制品的稳定性都得到满足。
例如，如果本领域技术人员知道在T下对于所研究病毒的灭活来说Tg太低，如Tg≤T，并且为了保持制品稳定，本领域技术人员会使Tg升高使得T落入已知能灭活病毒的温度范围，并且T与Tg的差异不会大到引起制品的降解。
另一方面，如果本领域技术人员知道对于T≥Tg来说Tg太高并且为了保持制品的稳定，则在选择T之前会使Tg降低。
本发明的生物制品的干法加热病毒灭活方法特别适合于无包膜病毒的情况。
这种方法能够用于处理作为干生物制品的含有一种或多种提取自血液-血浆的蛋白的组合物。
在具体的实施方案中，选择干法加热温度T以允许灭活无包膜病毒。
以优选的方式，通过向该生物制品中加入高分子量赋形剂或通过减少该生物制品的水分使玻璃化转变温度升高；可选地，通过向该生物制品中加入盐或低分子量赋形剂或通过增加该生物制品的水分使玻璃化转变温度降低。
特别地，使用差示扫描量热仪测量玻璃化转变温度。状态变化被定义为与在考虑的温度范围内没有转化的惰性制品相比测量出的热容的变化。
优选地，为了保持令人满意的制品稳定性，本发明方法的加热温度T应当被包括在Tg至Tg+20℃之间。在这种范围内，可以选择T以便增加Tg与T(至最大值Tg+20℃)的差异以有利于病毒减少因子和病毒灭活动力学，或者可以选择T以便减小Tg与T的差异以有利于制品的稳定性。
以特别优选的方式，选择干法加热温度T以获得大于等于3log10、优选大于等于4log10的病毒减少因子。
在具体实施方案中，在最后的步骤中，测量处理过的干生物制品中的病毒灭活效力，并且如果认为所述效力不够，则在增加加热温度T和玻璃化转变温度Tg之间的差异后继续进行干生物制品的病毒灭活。
在另一具体实施方案中，在最后的步骤中，评价处理过的干生物制品的稳定性，并且如果认为所述稳定性不够，则在减小加热温度T和玻璃化转变温度Tg之间的差异后继续进行干生物制品的病毒灭活。
附图
图1：Tg与RM的相关性：Tg＝玻璃化转变温度；RM＝残留水分
图2：依赖于Tg在62℃干法加热后的PR772减少因子
图3：依赖于Tg在80℃干法加热后的PR772减少因子
图4：依赖于Tg在80℃干法加热后的PPV减少因子
图5：在T＝Tg＝80℃的PPV、HAV、BVDV、PR772、Phi174减少因子
图6：在T＝Tg＝62℃的PPV、HAV、BVDV、PR772、Phi174减少因子
实施例
实施例1：冻干粉中噬菌体PR772的干法加热灭活：
改变冻干粉的物理性质以便调节玻璃化转变温度(Tg)。
使用差示扫描量热仪测定玻璃化转变温度。使用铟(Tm 156.6℃)和正十八烷(Tm 28.2℃)校准差示扫描量热仪的温度。使样品经受20℃/分钟的改变速率的从-50℃至130℃的温度。使用液氮在低于室温的温度下进行试验。将玻璃化转变温度作为表观比热中吸热性改变的中点。测量进行两次，其平均值作为Tg。
在低于Tg的温度(即在固体、玻璃态)、或在高于Tg约20℃的温度(即在粘弹[橡胶]态)进行加热。
所有冻干粉的含水量低于1％。
使用本领域技术人员熟知的基于水与碘之间的反应的Karl-Fisher方法测定含水量。
制品A的配方(pH 7.0±0.5)
-甘氨酸        7.5g/l
-盐酸赖氨酸    5.5g/l
-CaCl2         0.15g/l
-甘露醇        40g/l
-蔗糖          50g/l
-FVIII         100IU/ml
制品A的Tg为62℃。
制品B与含有增加的NaCl的制品A的配方相同。这允许将Tg降低至约40℃(水分RM相同)。
C是冻干的vWF浓缩物，D是冻干的人纤维蛋白原。
制品C的配方(pH 7.0±0.5)
-柠檬酸三钠    10mM
-CaCl2         1mM
-甘氨酸        5g/l
-盐酸精氨酸    40g/l
-白蛋白        10g/l
-vWF           100IU/ml
制品D的配方(6.8＜pH＜7.2)
-纤维蛋白原    11-20g/l
-盐酸精氨酸    40g/l
-异亮氨酸      10g/l
-甘氨酸        2g/l
-赖氨酸盐酸盐  2g/l
-柠檬酸三钠·2H2O    2.5g/l
制品C和D的Tg值分别为80℃和90℃。
在62℃和80℃加热12、24和72小时时测量噬菌体PR772的减少因子。
使用Spearman
Figure A20068004792000121
方程式计算病毒滴度，如Federal Gazette N°84，May 4 1994和Schmidt，N.J.&Emmons，R.W.(1989)在DiagnosticProcedures for Viral，Rickettsial and Chlamydial Infection(病毒、立克次氏体和衣原体感染的诊断方法)，6th Edition中描述的那样。
减少因子得自干法加热处理前每毫升病毒滴度与干法加热处理后每毫升病毒滴度的比值。
结果如图2和3的图表所示。
能够看出：
-对于在T＝80℃加热：
1.Tg＝62℃(T-Tg≈20℃)的制品A，灭活很快并且减少因子在24小时内达到4log10
2.Tg＝T的制品C，减少因子在72小时后达到4log10
3.Tg＝90℃的制品D，减少因子在72小时后达到4log10
-对于在T＝62℃加热：
1.Tg＝T的制品A，减少因子在72小时后达到4log10
2.Tg＝40℃(T-Tg≈20℃)的制品B，灭活动力学很快并且减少因子在少于24小时内达到4log10
实施例2：冻干粉中PPV的干法加热灭活
在Tg＝80℃或90℃的冻干粉中，在80℃加热12、24和72小时时测量PPV减少因子。
结果如图4的图表所示。
能够看出，对于在T＝80℃加热
-Tg＝T时，减少因子接近4log10
-T＜Tg时，减少因子较低，级别为2log10。
实施例3：T＝Tg时冻干粉中PPV、HAV、BVDV、PR772和Phi174的 干法加热灭活
在T＝Tg＝80℃(在Tg＝80℃的冻干粉中)或在T＝Tg＝62℃(在Tg＝62℃的冻干粉中)加热12、24和72小时时测量PPV、HAV、BVDV、PR772和噬菌体Phi174的减少因子。
结果如图5和6的图表所示。
能够看出，对于抵抗力较弱的病毒，即HAV、BVDV和Phi174，加热至T＝Tg自24小时开始减少因子就足够达到4 log10。
与之对照，对于抵抗力较强的病毒，即PPV和PR772，加热时间必须延长至72小时减少因子才能达到接近4 log10。
结果，对于这些抵抗力较强的病毒，由于目标是它们的灭活，所以能够通过使加热温度T升高或者通过使制品的Tg降低以增加T与Tg的差异来增加病毒减少因子和病毒灭活速率。
此外，会优选T-Tg的范围大于等于20℃以增加病毒灭活速率或者优选T-Tg的范围小于等于20℃以增加制品稳定性。
实施例4：在80℃加热72小时对vWF冻干粉的作为其玻璃化转变温度的 函数的物理化学性质的影响
将具有不同玻璃化转变温度的三个vWF冻干粉在80℃加热72小时。观察各种参数-冻干粉的外观、其融化时间和所得溶液的外观。
结果如表2所示。
表2
％RM 0.9  1.7  3.1
Tg(℃) 74  66  42
vWF：Rco(IU/ml) 140  120  105
冻干粉的外观 正常  稍微收缩  非常收缩
融化时间(s) 15  35  75
溶液外观 清澈  清澈  清澈
能够看出，T≥Tg和T-Tg≤20℃的加热温度允许保持令人满意的制品稳定性，即使所选温度引起从玻璃态到橡胶态的状态改变。
也能够看出，加热温度与Tg之间的差差异太大时，这里的38℃，对制品的稳定性不利。
因此，所选T越接近Tg，对制品的稳定性越有利。

Claims (15)

1.针对存在或者可能存在于干生物制品中的病毒进行干法加热的病毒灭活方法，其特征在于包括如下步骤：
a)确定待处理的干生物制品的玻璃化转变温度Tg，然后
b)在等于或大于步骤a)中确定的所述玻璃化转变温度Tg的干法加热温度T加热来自步骤a)的所述待处理的干生物制品。
2.如权利要求1的方法，其特征在于干法加热之前调节所述干生物制品的玻璃化转变温度Tg。
3.如权利要求1或2的方法，其特征在于所述干生物制品是冻干粉。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述干生物制品是含有一种或多种提取自血液-血浆的蛋白的组合物。
5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的方法，其特征在于选择所述干法加热温度T以使得灭活无包膜病毒。
6.如权利要求2-5中任一权利要求所述的方法，其特征在于通过向所述生物制品中加入高分子量赋形剂或减少所述生物制品的水分使所述玻璃化转变温度升高。
7.如权利要求2-5中任一权利要求所述的方法，其特征在于通过向所述生物制品中加入盐或低分子量赋形剂或通过增加该生物制品的水分含量使所述玻璃化转变温度降低。
8.如权利要求1-7中任一权利要求所述的方法，其特征在于使用差示扫描量热仪测量Tg。
9.如权利要求1-8中任一权利要求所述的方法，其特征在于T包括Tg至Tg+20℃。
10.如权利要求1-8中任一权利要求所述的方法，其特征在于选择所述干法加热温度T以获得大于等于3log10的病毒减少因子。
11.如权利要求1-9中任一权利要求所述的方法，其特征在于选择所述干法加热温度T以获得大于等于4log10的病毒减少因子。
12.如权利要求9-11中任一权利要求所述的方法，其特征在于选择T以便增加Tg与T(高达Tg+20℃)的差异以增加病毒减少因子和病毒灭活速率。
13.如权利要求9-11中任一权利要求所述的方法，其特征在于选择T以便减小Tg与T的差异以有利于制品稳定性。
14.如权利要求9-13中任一权利要求所述的方法，其特征在于：在最后的步骤中，测量所述处理过的干生物制品中的病毒灭活效力，并且如果认为所述效力不够，则在增加所述加热温度T和所述玻璃化转变温度Tg的差异后，如权利要求9-11中任一权利要求所述继续进行所述干生物制品的病毒灭活。
15.如权利要求9-13中任一权利要求所述的方法，其特征在于：在最后的步骤中，评价所述处理过的干生物制品的稳定性，并且如果认为所述稳定性不够，则在减小所述加热温度T和所述玻璃化转变温度Tg的差异后，如权利要求9-11中任一权利要求所述继续进行所述干生物制品的病毒灭活。
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