PL162961B1

PL162961B1 - Sposób wytwarzania koncentratu IX czynnika krzepnięcia krwi

Info

Publication number: PL162961B1
Application number: PL28316690A
Authority: PL
Inventors: Jerzy Witwicki; Zofia Lis; Elzbieta Teisseyre; Halina Goch; Malgorzata Hay; Witold Kocinski; Jolanta Tyll
Original assignee: Ts Lab Surowic I Szczepionek
Priority date: 1990-01-03
Filing date: 1990-01-03
Publication date: 1994-01-31
Also published as: PL283166A1

Abstract

Sposób wytwarzania koncentratu IX czynnika krzepnięcia krwi, polegający na wyodrębnieniu go z osocza i dodaniu do roztworu koncentratu IX czynnika chlorku sodowego w ilości nie wyższej niż 30 mmoli/lOOcm3, cytrynianu sodowego w ilości nie wyższej niż 3 mmole/100cm3 oraz heparyny w ilości nie wyższej niż 500j. m./100cm3, a następnie poddaniu roztworu procesowi liofilizacji, znamienny tym, ze do roztworu koncentratu IX czynnika przed liofilizacją dodaje się sacharozę w ilości od 2 g do 4 g na 100 cm3 i przeprowadza się liofilizację oraz ogrzewanie preparatu w temperaturze nie niższej niz 80°C przez czas nie krótszy niż 72 h.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania koncentratu IX czynnika krzepnięcia krwi do stosowania w lecznictwie. Sposób ten umożliwia ogrzewanie liofilizowanego preparatu w temperaturze od 80°C do 95°C celem termicznej inaktywacji wirusów, przy jednoczesnym zachowaniu biologicznej aktywności czynnika IX.

Preparat jest stosowany leczniczo i profilaktycznie w przypadkach wrodzonego lub nabytego niedoboru czynnika IX (hemofilia B). Osobom chorym na hemofilię B preparaty koncentratu IX czynnika krzepnięcia krwi muszą być podawane przez całe życie, zarówno profilaktycznie jak i leczniczo.

Terapia preparatami krwiopochodnymi związana jest z ryzykiem zachorowania na choroby wirusowe (np. wirusowe zapalenie wątroby typu B, wirusowe zapalenie wątroby nie-A, nie-B, AIDS-zespół nabytego niedoboru immunologicznego). Obecnie ocenia się, że na początku lat osiemdziesiątych zachorowalność na AIDS u chorych na hemofilię, leczonych preparatami czynników krzepnięcia krwi, wynosiło około 80% (Haimburger N., Virus safety of pasteurized factor VIII and factor IX concentrates: Study in virgin patients, Develop. biol. Standard., 1987, 67, 303).

Niebezpieczeństwo występowania infekcji wirusowych (szczególnie zapalenia wątroby typu B, zapalenia wątroby nie-A nie-B oraz AIDS) po podaniu preparatów czynnika IX krzepnięcia krwi jest poważnym problemem związanym z produkcją tego preparatu. W literaturze istnieje szereg doniesień, w których opisano sposoby inaktywacji wirusów w otrzymanych z osocza preparatach do stosowania terapeutycznego i profilaktycznego (International Forum, Ways to reduce the risk of transmission of viral infections by plasma products. Vox Song., 1988, 54, 228). Dane te dotyczą zarówno preparatów produkowanych w postaci roztworów, jak i w postaci liofilizowanej.

Z obserwacji klinicznych wynika, że tylko dwa sposoby inaktywacji wirusów pozwalają na otrzymanie bezpiecznych preparatów tj. takich, których podanie nie wiąze się z ryzykiem wywołania u pacjentów chorób wirusowych. Są to:

1) inkubacja roztworu koncentratu IX czynnika krzepnięcia krwi z detergentem (Tween 80) i fosforanem trójbutylu (Michalski C. i in., Large-scale production and properties of a solventdetergent-treated factor IX concentrate from human plasma. Vox Sang., 1988, 55, 202).

2) ogrzewanie liofilizowanego preparatu w temperaturze 80°C przez okres nie krótszy niż 72 godziny (Horowitz B., Ways to reduce the risk of transmission of viral infections by plasma and plasma products. Vox Sang., 1988, 54, 235).

Zastosowanie pierwszej z wymienionych metod jest kosztowne i pracochłonne, gdyż wymaga wprowadzenia do procesu produkcyjnego dodatkowego etapu usuwania z roztworu Tweenu 80 i fosforanu trójbutylu przy użyciu metod chromatograficznych. Wiąże się to także z obniżeniem wydajności otrzymywania preparatu.

Di uga z wymienionych metod, polegająca na termicznej inaktywacji wirusów w temperaturze

80°C, nie wymaga stosowania toksycznych substancji i jest korzystna z ekonomicznego punktu widzenia. Do jej przeprowadzenia potrzebna jest aparatura prosta w obsłudze i mniej kosztowna

162 961 (suszarka z wymuszonym obiegiem powietrza). Jednakże zastosowanie tej prostej metody inaktywacji wirusów wiąże się z dużymi trudnościami, gdyż czynniki krzepnięcia są białkami termolabilnymi. Liofilizacja roztworu czynnika IX w pewnym tylko stopniu zwiększa jego termostabilność. W połowie lat 80 stwierdzono, że aktywność liofilizowanego czynnika IX spada o 50% juz po 5 dniach przechowywania w temperaturze 56°C (Hoffman S., Bykowska K., Łukasiak S., Łopaciuk S., „Ocena trwałości liofilizowanego koncentratu czynnika IX“, Acta Haemat. Pol., 1985, 16, 135-138), przy czym w temperaturze tej nie następuje jeszcze inaktywacja wirusów.

W badaniach własnych stwierdzono, że ogrzewanie liofilizowanego preparatu w temperaturze 68°C przez 72 h (sposób inaktywacji wirusów stosowany przez niektórych producentów) prowadzi do znacznego spadku aktywności czynnika IX (Tab. 1, ροζ. 1 i 2). Podobne obniżenie aktywności obserwuje się po ogrzewaniu preparatu w temperaturze 80°C (Tab. 1, poz. 8 i 9).

Dodanie do roztworu preparatu przed liofilizacją znanych stabilizatorów białek, takich jak glicyna lub kaprylan sodowy nie dało zadawalających rezultatów. Zaobserwowano nawet całkowity spadek aktywności biologicznej czynnika IX liofilizowanego w obecności kaprylanu i ogrzewanego w temperaturze 68°C(Tab. Ι,ροζ. 4). Dodanie sacharozy do preparatu w ilości 1 g/100cm3 roztworu zmniejszało jedynie w niewielkim stopniu spadek aktywności biologicznej czynnika IX.

Analiza danych zawartych w tabeli 1 wykazuje, że pełne zachowanie aktywności czynnika IX po ogrzaniu w temperaturze 68°C, 80°C i 95°C obserwuje się jedynie w tych preparatach, które zawierają sacharozę dodaną do roztworu koncentratu czynnika IX przed liofilizacją w ilości nie mniejszej niż 2g/100cm3. Inne zastosowane substancje drobnocząsteczkowe nie zapobiegają termicznej denaturacji czynnika IX.

Sposób według wynalazku polega na dodaniu sacharozy w ilości od 2 g do 49 g na 100 cm3 do roztworu koncentratu czynnika IX otrzymanego w znany sposób. Następnie przeprowadza się liofilizację i ogrzewanie preparatu w temperaturze od 80°C do 95°C celem termicznej inaktywacji wirusów przez czas nie krótszy niż 72 godziny.

Przykład I. Koncentrat IX czynnika krzepnięcia krwi otrzymano z mrożonego osocza ludzkiego. Po rozmrożeniu osocza usunięto krioprecypitat przez wirowanie i następnie uzyskano koncentrat IX czynnika przy użyciu DEAE Sefadeksu A 50 według metody Haysteka i współpracowników (Haystek J. i in., Contributione to the optimal use of human blood. II. The large-scale preparation of prothrombin complex. A companson between two methods using the anion exchangers DEAE-cellulose DE-62and DEAE-Sephadex A-50, VoxSang., 1973, 25,113). 7,4 dm3 eluatu z DEAE Sefadeksu poddano ultrafiltracji i diafiltracji posługując się aparatem do diafiltracji firmy Millipore wyposażonym w 3 kasety o sumarycznej powierzchni membrany 1,84 m². Uzyskano 2,ldm³ roztworu o aktywności 30,7j czynnika IX w 1cm³ oraz stężeniu białka 2,34%, chlorku sodowego 0,08 mola/dm³, cytrynianu sodowego 18 mmola/dm³ i pH 6,9. Do uzyskanego roztworu dodano 42 g sacharozy oraz 3,7 g chlorku sodowego i 4820j. m. heparyny. Roztwór poddano filtracji jałowiącej przy użyciu filtrów membranowych o gęstości 0,22/ym firmy Millipore i rozporcjowano po 20 cm³ do wyjałowionych butelek o pojemności 100 m³. Następnie preparat liofilizowano w produkcyjnym aparacie TG-50 firmy Hochvakuum. Po zakończeniu liofilizacji butelki zamykano w atmosferze azotu korkami gumowymi i kapslami. Otrzymany preparat ogrzewano przez 72 godziny w temperaturze 80°C w termostacie z wymuszonym obiegiem powietrza. Zawartość butelki z preparatem rozpuszczono w 20 cm³ wody do wstrzykiwań i oznaczono aktywność IX czynnika, która wynosiła 30,6j/cm³.

Przykład II. Roztwór koncentratu czynnika IX przygotowano w sposób opisany w przykładzie I Aktywność czynnika IX w uzyskanym roztworze wynosiła 25 j/cm³. Do 50 cm³ roztworu o stężeniu chlorku sodowego 0,11 mola/dm³ i stężeniu cytrynianu 0,018 mola/dm³ dodano 50j. m. heparyny i 1 g sacharozy. Po filtracji wyjaławiającej roztwór rozporcjowano po 2 cm³ do buteleczek o pojemności 10 cm³ i zliofilizowano. Otrzymany preparat ogrzewano 6 godzin w temperaturze 95°C. Następnie zawartość buteleczki rozpuszczono w 2 cm³ wody do wstrzykiwań i oznaczono aktywność czynnika IX, która wynosiła 24,5j/cm3.

162 961

Tabela

Wpływ składu preparatu na aktywność biologiczną liofilizowanego koncentratu czynnika IX, ogrzewanego w temperaturze 68°C, 80^CC lub 95°C przez 72 godziny

Nr próby	Skład roztworu przed liofilizacją	Temperatura ogrzewania liofilizowanego preparatu °C	Aktywność czynnika IX w rozpuszczonym preparacie j/cm3	Spadek aktywności po ogrzewaniu _ %
przed ogrzewaniem po ogrzewaniu
1	0,01 mol cytrynian Na 0,15 mol NaCl	68	23	11	52
2	0,015 mol cytrynian Na 0,15 mol NaCl	68	14,2	6,4	55
3.	0,015 mol cytrynian Na 2% glicyna	68	II	4,6	58
4	0,015 mol cytrynian Na 0,015 mol kaprylan Na	68	11	0	100
5	0,02 mol cytryn Na 0,02 mol glicyna 0,06 mol NaCl 1% sacharoza	68	11	7,6	31
6	0,015 mol cytrynian Na 2% mannitol	68	14,2	13,0	8
7	0,015 mol cytrynian Na 2% sacharoza	68	14,2	3,7	4
8	0,010 mol cytrynian Na 0,15 mol NaCl	80	5,2	2,7	49
9	0,010 mol cytrynian Na 0,15 mol NaCl	80	6,7	3,6	46
10	0,01 mol cytrynian Na 0,15 mol NaCl 2% sacharoza	80	5,1	5,1	0
11	0,01 mol cytrynian Na 0,15 mol NaCl 2% sacharoza	80	8,4	8,3	1
12	0,01 mol cytryn Na 0,15 mol NaCl 2% sacharoza	80	17,2	17,2	0
13	0,01 mol cytryn Na 0,15 mol NaCl 2% sacharoza	80	11,6	11,8	0
14’	0,018 mol cytryn Na 0,11 mol NaCl 2% sacharoza	95	25,0	24,5	2

' - preparat ogrzewano przez 6 godzin

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania koncentratu IX czynnika krzepnięcia krwi, polegający na wyodrębnieniu go z osocza i dodaniu do roztworu koncentratu IX czynnika chlorku sodowego w ilości nie wyższej niż 30mmoli/100cm³, cytrynianu sodowego w ilości nie wyższej niż 3 mmole/lOOcm³ oraz heparyny w ilości nie wyższej niż 500j. m./100cm3, a następnie poddaniu roztworu procesowi liofilizacji, znamienny tym, że do roztworu koncentratu IX czynnika przed liofilizacją dodaje się sacharozę w ilości od 2 g do 4 g na 100 cm³ i przeprowadza się liofilizację oraz ogrzewanie preparatu w temperaturze nie niższej niż 80°C przez czas nie krótszy niż 72 h.