CN101353368A - 一种治疗肿瘤的孕甾药物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，特别涉及式(I)化合物及其合成方法。本发明也涉及该化合物在药物上的用途和药用制剂，特别是针对肿瘤、眼部血管新生的治疗。
Description
技术领域：
本发明属于医药领域，特别涉及式(I)化合物及其合成方法。本发明也涉及该化合物在药物上的用途和药用制剂，特别是针对肿瘤、眼部血管新生的治疗。
背景技术：
血管新生包括两个概念：胚胎期的血管发生(vasculogenesis，VG)和出生后的血管生成(angiogenesis，AG)。VG指的是在没有血管系统的情况下，由血管内皮祖细胞(endothelialprogenitor，cells，EPCs)或成血管细胞(angioblasts)分化成内皮细胞，并形成血管网。AG指的是在成体血管，由已经存在的成熟内皮细胞冲破管壁基质迁移，增殖和重构，以发芽方式使血管树枝持续延长。本发明中的血管新生是指出生后的血管生成(angiogenesis，AG)。血管新生(angiogenesis)不但是正常生理变化中(如生长、伤口愈合)所必需有的过程，近年来科学家们也发现它和肿瘤、老年性黄斑变性、恶性血液病等许多疾病的发展有密切的关系。抑制病理性的血管新生，可以治疗或减缓肿瘤、老年性黄斑变性、恶性血液病等许多疾病。
目前临床治疗肿瘤的方法大多是针对不同肿瘤采用不同的方法，并且绝大部分是针对肿瘤细胞进行治疗。而肿瘤生长是一个复杂的过程，它受到多种因素的影响，其中包括肿瘤血管网的建立。许多研究已经证明肿瘤生长必须依赖血管生成，通过抑制血管生成的某些环节或整个过程，进而控制肿瘤的生长，对肿瘤治疗和防止肿瘤远处转移有重要意义。70年代初随着肿瘤生长依赖于血管形成概念的提出，也相应提出了抗血管形成治疗的概念，即通过阻止新生血管的发生和/或新生血管网的扩展和/或破坏新生血管来阻止小的实体瘤的产生或建立，以阻止肿瘤生长、发展和转移。国外报道较多的肝素加氢化可的松.被公认为能有效地抑制血管生成。实验证实，其二者联合应用能抑制鸡胚绒毛尿囊膜上血管的生成，井能使肿瘤消退和阻止转移，还可抑制肿瘤引起的兔角膜血管新生。
而血管内皮生长因子(VEGF)是一类多功能的生长因子，具有促进内皮细胞增殖、诱导血管形成的作用，一般认为抑制血管内皮生长因子(VEGF)可以治疗或减缓病理性血管新生。
血管内皮生长因子(VEGF)与新生血管有关的疾病如肿瘤、眼部新生血管疾病、恶性血液病、支气管哮喘等疾病有密切关系，通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)，可以治疗或减缓这些疾病，大量文献均有这方面的报道如《综述VEGF的结构特征及生物学功能》(中华临床医学研究杂志，2007年13卷3期，388)、《血管内皮生长因子及其受体在妇科疾病中的研究进展》(河北医药2006年28卷12期，1192-1194)、《血管内皮生长因子与肿瘤关系研究进展》(广西医科大学学报，2006年23卷2期，333-335)、《VEGF相关抗肿瘤治疗的研究现状》(吉林医学，2006年27卷5期，454-457)、《靶向VEGF治疗恶性肿瘤的研究进展》(现代肿瘤医学，2006年14卷3期，370-372)、《VEGF和PEDF对眼底新生血管的共同调节作用》(国外医学：临床生物化学与检验学分册，2005年26卷11期，819-821)、《眼底新生血管防治的研究进展》(眼科新进展，2000年20卷6期，449-451)、《血管内皮生长因子及其受体与眼内新生血管性疾病》(眼科研究，2003年21卷1期，103-106)、《VEGF与恶性血液病的关系》(国外医学：生理病理科学与临床分册，2004年24卷2期，183-185)、《脑白质疏松患者血清VEGF水平的研究》(疑难病杂志，2007年6卷1期，10-11)、《血管内皮生长因子与支气管哮喘》(实用医学杂志，2007年第23卷第3期，433)。
已知有多种药物可抑制新血管的形成(血管生成或新生血管形成)。例如，在Crum等人的“一类新的类固醇在肝素或肝素片段的存在下抑制血管生成”(A New Class of steroidsInhibits Angiogenesis in the Presence Of Heparin or a Heparin Fragment，Science，Vol.230：1375-1378，1985年12月20日)一文中，公开了可在肝素或特定肝素片段的存在下抑制血管生成的类固醇。作者将所述类固醇称为“血管抑制(angiostatic)”类固醇。此类被发现具有血管抑制作用的类固醇中所包括的有可的松和去氧可的松的二氢和四氢代谢物。在测试有关所述机理的假说的后续研究中证明：肝素/血管抑制类固醇组合物导致基底膜支架溶解，在所述支架上连接有贴壁依赖性内皮，从而导致毛细管萎缩(involution)；其中所述机制是类固醇通过其来抑制血管生成的机制；参见Ingber等人的“通过血管抑制类固醇来抑制血管生成的可能机理：毛细管基底膜溶解的诱导”(A Possible Mechanism forInhibition of Angiogenesis by Angiostatic Steroids：Induction of Capillary BasementMembrane Dissolution，Endocrinology Vol.119：1768-1775，1986)。
在Aristoff等人的美国专利US 4,975,537中公开了一组可用于抑制血管生成的四氢类固醇.该专利公开所述化合物可用于治疗头部创伤、脊柱创伤、败血症性休克或创伤性休克、中风和出血性休克。此外，该专利还讨论了这些化合物在胚胎植入以及在治疗癌症、关节炎和动脉硬化中的作用。在美国专利us4771,042中公开了Aristoff等人的专利中所公开的某些类固醇与肝素或肝素片段组合来抑制温血动物的血管生成。Li等人，“通过硫酸化环糊精而增强效力的血管抑制类固醇抑制角膜新生血管形成”(Angiostatic SteroidsPotentiated by Sulphated Cyclodextrin Inhibit Corneal Neovascularization，Investigative ophthalmology and Visual Science，Vol 32(11)：2898-2905，1991年10月)。类固醇单独使用可使新生血管形成多少减轻一些，但是仅单独使用不能有效消退新生血管形成。
四氢可的松已经作为血管抑制类固醇，在Folkman等人的“血管抑制类固醇”(Angiostatic steroids，Ann.Surg，Vol.206(3)，1987)一文中公开，其中该文献提出血管抑制类固醇可能可用于治疗由新生血管形成异常所控制的疾病，包括糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼以及晶状体后纤维组织形成。
CN03818826中介绍了乙酸阿奈可他是一种开发用于抑制眼睛新血管生成的血管抑制剂。该发明涉及用于预防AMD相关性视力丧失、维持AMD患者的视力以及抑制AMD相关性损害发展的制剂和方法。该制剂和方法涉及巩膜旁施用3-30mg的乙酸阿奈可他或其相应的醇以提供经巩膜的药物释放。
发明内容：
在本发明的一个方面，提供了式(I)化合物，其中1，2位
表示为1，2位可以是双键或单键。
R1＝H、OH或OCOR5 R5是十个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或是COR6 R6是十个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化合物
R3＝五个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的五个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α卤素或α甲基
式(I)化合物的盐是指R1＝OH时与之相连接形成的药用盐，药用盐优选磷酸、琥珀酸、马来酸、硫酸的盐，更优选指磷酸、琥珀酸、马来酸、硫酸的钠、钾、镁、钙盐。
优选：
R1＝H、OH或OCOR5 R5是十个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或COR6 R6是十个碳以内的碳氢化合物
R3是五个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α卤素或α甲基
再优选：
R1＝H、OH或OCOR5 R5是五个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或COR6 R6是十个碳以内的碳氢化合物
R3是五个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α卤素或α甲基
更优选：
R1＝H、OH或OCOR5 R5是两个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或COR6 R6是两个碳以内的碳氢化合物
R3是两个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α-F或α甲基
特优选：
R1＝H、OH或OCOCH3
R2＝H
R3是两个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α-F或α甲基
在本发明中提及本发明化合物是均包括其中式(I)化合物及其盐、酯和溶剂合物。
溶剂合物包括水合物。
应该注意，本发明在其范围内包括式(I)化合物所有的立体异构体和它们的混合物。
优选的化合物包括：
1.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-2-甲氧基
2.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基
3.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯-2-甲氧基
4.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基
5.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-2-甲氧基
6.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基
7.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯-2-甲氧基
8.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基
9.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-乙氧基
10.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯2-乙氧基
11.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯-2-甲氧基
更优选
1.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基
2.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基
3.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基
4.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基
5.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯-2-甲氧基
上述式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物在抑制哺乳类动物血管内皮生长因子的药物中的应用，哺乳类动物优选人类。
上述式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物在治疗哺乳类动物血管新生性疾病的药物中的应用，哺乳类动物优选人类。。
血管新生性疾病，主要涉及肿瘤、眼部新生血管、恶性血液病、支气管哮喘、脑白质疏松疾病。
肿瘤主要是各种实体肿瘤如胃部肿瘤、肺部肿瘤、肝部肿瘤、各种腺体肿瘤、鼻部肿瘤、眼部肿瘤、咽部肿瘤、喉部肿瘤等；恶性血液病是指血液系统的恶性肿瘤，主要包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤及恶性组织细胞病等。
本化合物还可在眼部新生血管生成造成的疾病中应用：
眼部新生血管生成造成的疾病涉及角膜、虹膜、脉络膜及视网膜等，其造成的渗出、出血和增生等病理改变对眼部结构和功能的损害，是引起视力障碍的重要原因。大部分眼疾病均存在炎症、缺血、缺氧等病理过程；因此，眼病与眼部新生血管形成有密切的关系。其中眼部新生血管生成造成的疾病包括：
角膜新生血管性眼病：在与角膜新生血管相关的眼部疾病中，最常见的是配戴角膜接触镜所致的角膜新生血管性疾病，其他引起角膜新生血管的眼部疾病有角膜外伤，碱及其他化学物质烧伤，角膜手术，各种感染包括细菌感染、衣原体感染、病毒感染(单疱病毒和带状疱疹病毒等)、原虫感染(利什曼原虫)等。
虹膜新生血管性眼病：常见有新生血管性青光眼，而视网膜脱离、创伤、糖尿病视网膜病变、肿瘤(视网膜母细胞瘤)、视网膜中央静脉栓塞等是其常见的诱因。
视网膜新生血管性眼病：糖尿病、肿瘤、视网膜脱离、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病、Coat病、Takavas病等均可引起。
脉络膜新生血管性眼病：老年性黄斑变性、高度近视、中心性渗出性视网膜脉络膜炎、创伤、肿瘤、眼组织胞浆菌病综合征、匍行性脉络膜病变等均可引起该种眼病。
本领域的技术人员可以认为，本文所涉及的“治疗”可以延伸为疾病的预防和以确定疾病的治疗。
式(I)化合物作为治疗上述疾病时，其活性成分的用量为0.01mg-20mg/Kg/天，优选0.1mg-10mg/Kg/天，更优选0.1mg-2mg/Kg/天。作为治疗人的疾病时，人的体重一般按照50Kg计算，所以本发明中所述人用剂量可以按照人的实际体重计算，也可以按照上述剂量X 50计算。
本发明化合物可配制成任何便于用药的制剂，因此本发明在其范围内也包含本发明化合物，可与一种或多种生理学上可接受的稀释剂或载体混合的药物组合物。
本发明化合物可配制成任何便于人用药的制剂，该制剂治疗疾病中其活性成分的用量为0.01mg-20mg/Kg/天，优选0.1mg-10mg/Kg/天，更优选0.1mg-2mg/Kg/天。作为治疗人的疾病时，人的体重一般按照50Kg计算，所以本发明中所述人用量可以按照人的实际体重计算，也可以按照上述用量X 50计算。
一种药物组合物，由活性成分和一种或几种药用辅料组成，而活性成分是上述任一项式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物。
本发明进一步提供制备这样的药物组合物的方法，该方法包括将各种组分混合。
本发明化合物可安常规方法(例如)配制成口服、口腔、舌下、非肠道、注射、埋植、局部用药或直肠给药的制剂，尤其是口服或注射的制剂。其中口服制剂包括而不仅限于片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等口服的固体及口服液等可口服的液体；注射剂包括而不仅限于针剂、混悬剂、输液剂等可注射的液体或粉针剂等可用于注射的固体。
口服制剂中的非活性成分含有淀粉、乳糖、水中的一种或几种。
注射制剂中的非活性成分含有注射用水或注射用油。
本发明的化合物和药物制剂可以与一种或多种选自以下的其他治疗剂联合使用或是包含一种或几种这样的治疗剂：抑制肿瘤的药物、治疗眼部新生血管生成造成的疾病的药物、治疗哮喘的药物。
抑制肿瘤的药物包括而不限于作用于DNA化学结构的药物(包括烷化剂、蒽环类和铂类化合物)；影响核酸合成的药物(主要是抗代谢物)；作用于DNA模板影响DNA转录或抑制DNA依赖RNA聚合酶而抑制RNA合成的药物；影响蛋白质合成的药物(如高三尖杉酯碱、紫杉类、长春花碱和鬼臼碱类等)；紫杉醇类化合物；其他类型的药物(如激素、门冬酰胺酶、维甲类化合物等)。
抑制肿瘤的药物优选顺铂。
治疗眼部新生血管生成造成的疾病的药物包括而不限于内皮抑素(Endostatin)、血管生成抑制因子、阿奈可他等。
治疗哮喘的药物包括而不仅限于糖皮质激素，白三烯抑制剂、β2-受体激动剂、黄嘌呤类药物、抗胆碱药、抗过敏药。
本发明的再一方面提供了制备式(I)化合物方法，其中1，2位
表示为1，2位可以是双键或单键。
以式(II)化合物为原料，通过以下方法合成式(I)化合物。
R1＝H、OH或OCOR5 R5是十个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或是COR6 R6是十个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化合物
R3＝五个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的五个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α卤素或α甲基
式(I)化合物的盐是指R1＝OH时与之相连接形成的药用盐，药用盐优选磷酸、琥珀酸、马来酸、硫酸的盐，更优选指磷酸、琥珀酸、马来酸、硫酸的钠、钾、镁、钙盐。
优选：
R1＝H、OH或OCOR5 R5是十个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或COR6 R6是十个碳以内的碳氢化合物
R3是五个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α卤素或α甲基
再优选：
R1＝H、OH或OCOR5R5是五个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或COR6 R6是十个碳以内的碳氢化合物
R3是五个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α卤素或α甲基
更优选：
R1＝H、OH或OCOR5 R5是两个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或COR6 R6是两个碳以内的碳氢化合物
R3是两个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α-F或α甲基
特优选：
R1＝H、OH或OCOCH3
R2＝H
R3是两个碳以内的碳氢化合物
R4＝H，α-F或α甲基
式(II)化合物 2-卤素-式(II)化合物 式(I)化合物
1.2-卤素-式(II)化合物的合成
将式(II)化合物全溶于有机溶媒中，加入卤化剂，反应得2-卤素-式(II)化合物。
其中有机溶媒是指为常规的有机溶剂，包括酮类，如丙酮；卤代烃，如氯仿；醚类，如四氢呋喃等中的一种或多种。优选氯仿、四氢呋喃，更优选氯仿、四氢呋喃的混合物。
2.式(I)化合物的合成
将R3ONa(或R3OK)和2-卤素-式(II)化合物投入有机溶媒中，加入催化剂，反应生成得式(I)化合物。
有机溶媒为常规的有机溶剂，包括低级脂肪醇，如甲醇或乙醇；酮类，如丙酮；卤代烃，如氯仿；醚类，如四氢呋喃；胺类，如二甲基甲酰胺(DMF)等中的一种或多种。优选醇、DMF，更优选DMF。
其中卤化剂是指可以缓慢释放卤离子的试剂，如N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)，其中优选溴化剂，催化剂是指一价Cu的盐，含磷脱水剂是指磷的氯化物，溴化剂优选2，4，4，6-四溴-2，5-二烯环己酮、二溴海因、N-溴代琥珀酰亚胺，一价Cu的盐优选CuCl、醋酸亚铜。
按照CN200510014479.5“Δ9(11)甾体类化合物的制备方法”专利申请中实施例7得到的孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17α-羟基-6α-甲基、实施例9得到的孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17α-羟基、实施例10得到的孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17α-羟基、实施例4得到的孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17α-羟基-6α-甲基。
上述化合物可以常规的方法合成，例如通过CN200510122249.0“糠酸莫美他松中间体21-羟的制备方法”的方法制备以上化合物的21-羟基物：孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17α，21-双羟基-6α-甲基、孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17α，21-双羟基、孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17α，21-双羟基、孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17α，21-双羟基-6α-甲基。式(II)化合物中的17，21位酯化物可以常规的方法合成，例如按照杨健等人报道(泼尼卡酯的合成，中国医药工业杂志，1999，30(11)，490，)的合成方法得到。
具体实施方式：
本发明中柱层析方法：
层析柱的长度最少70cm，内部装填254-硅胶，并将需要分离的有机物全溶于最少量的氯仿∶甲醇＝1∶1中，用最少量254-硅胶将该溶液吸收后置于层析柱内硅胶的上部，使用流动相洗脱，层析柱下用若干个10ml试管接经过柱层析得到的溶液，控制流速为10ml/3min，将每个试管的溶液用HPLC进行分析，将保留时间相同的试管溶液合并，取主点的化合物进行重结晶，得到相应的产物。
确定主点的方法：将需要分离的有机物用HPLC进行分析，峰面积最大的点确定为主点，其保留时间为主点的保留时间。
HPLC的条件：
设备：HP 1084B液相色谱仪，HP 79850BLC终端和UV检测器
柱材料：Hypersil C18，5um，125×4.6mm
检测波长：242nm
流动相：甲醇∶水＝5.5∶4.5
柱温：45℃
流速：约1.2ml/分
实施例1孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-2-甲氧基
1.2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基的合成
将8.5g孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基(式II化合物)投入300mL氯仿中，加入100mL THF，搅拌成清液。冰盐浴冷却至-5℃，滴加含9.84g溴化剂2，4，4，6-四溴-2，5-二烯环己酮的氯仿和THF溶液(氯仿240mL，THF 100mL)，80min滴加完毕。移去冰盐浴，室温搅拌1h，反应结束。向反应液中加入145mL 10％亚硫酸钠水溶液搅拌5min，取有机层水洗1次。合并水层，氯仿反抽1次。合并氯仿层水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩蒸干溶剂，得油状物。加入50mL无水乙醇，析出沉淀，过滤，滤液浓缩近干，柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基2.71g。
2.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-2-甲氧基的合成
将0.07mol的甲醇钠，搅拌溶解后加入50mlDMF，然后投入2.5g2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基，全溶，加入醋酸亚酮0.2g，搅拌回流22h。22h后补加0.2g醋酸亚酮，继续搅拌回流2h后结束反应。减压蒸干溶剂，加水稀释，盐酸酸化至pH 2，有沉淀，减压抽滤，水洗至中性。用氯仿全溶，氯仿液水洗2次，无水硫酸钠干燥，活性炭脱色，减压浓缩近干，得油状物。油状物柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-2-甲氧基746.2mg固体。
元素分析计算值：C22H30O5C 70.56％H 8.07％O 21.36％
元素分析实测值：C 70.42％H 8.11％
1H-NMR(CDCl3)：3.22(2-OCH3，H)，3.70(2位，H)，5.30(11位，H)，1.66，1.41(1位，H)，5.74(4位，H)，2.03，1.91(6位，H)1.95(17-OH，H)，4.61(21位，H)2.03(21-OH，H)
实施例2孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基
1.2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯的合成
将9.0g孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯(式II化合物)投入200mL氯仿中，加入50mL THF，搅拌成清液。冰盐浴冷却至-5℃，滴加含9.04g溴化剂2，4，4，6-四溴-2，5-二烯环己酮的氯仿和THF溶液(氯仿240mL，THF 100mL)，80min滴加完毕。移去冰盐浴，室温搅拌1h，反应结束。向反应液中加入135mL 10％亚硫酸钠水溶液搅拌5min，取有机层水洗1次。合并水层，氯仿反抽1次。合并氯仿层水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩蒸干溶剂，得油状物。加入50mL无水乙醇，析出沉淀，过滤，滤液浓缩近干，柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯2.38g。
2.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基的合成
将0.07mol的甲醇钠，搅拌溶解后加入50mlDMF，然后投入2.3g2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯，全溶，加入醋酸亚酮0.2g，搅拌回流22h。22h后补加0.2g醋酸亚酮，继续搅拌回流2h后结束反应。减压蒸干溶剂，加水稀释，盐酸酸化至pH 2，有沉淀，减压抽滤，水洗至中性。用氯仿全溶，氯仿液水洗2次，无水硫酸钠干燥，活性炭脱色，减压浓缩近干，得油状物。油状物柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基875.3mg固体。
元素分析计算值：C24H32O6C 69.21％H 7.74％O 23.05％
元素分析实测值：C 69.17％H 7.81％
1H-NMR(CDCl3)：3.23(2-OCH3，H)，3.70(2位，H)，5.30(11位，H)，1.66，1.41(1位，H)，5.74(4位，H)，2.03，1.91(6位，H)1.90(17-OH，H)，5.23(21位，H)2.03(21-OCOCH3，H)
实施例3孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯-2-甲氧基
1.2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯的合成
将10.0g孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯(式II化合物)投入200mL氯仿中，加入50mL THF，搅拌成清液。冰盐浴冷却至-5℃，滴加含9.00g溴化剂2，4，4，6-四溴-2，5-二烯环己酮的氯仿和THF溶液(氯仿240mL，THF 100mL)，80min滴加完毕。移去冰盐浴，室温搅拌1h，反应结束。向反应液中加入135mL 10％亚硫酸钠水溶液搅拌5min，取有机层水洗1次。合并水层，氯仿反抽1次。合并氯仿层水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩蒸干溶剂，得油状物。加入50mL无水乙醇，析出沉淀，过滤，滤液浓缩近干，柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯3.84g。
2.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯-2-甲氧基的合成
将0.07mol的甲醇钠，搅拌溶解后加入50mlDMF，然后投入2.3g2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯，全溶，加入醋酸亚酮0.2g，搅拌回流22h。22h后补加0.2g醋酸亚酮，继续搅拌回流2h后结束反应。减压蒸干溶剂，加水稀释，盐酸酸化至pH 2，有沉淀，减压抽滤，水洗至中性。用氯仿全溶，氯仿液水洗2次，无水硫酸钠干燥，活性炭脱色，减压浓缩近干，得油状物。柱层析，氯仿-丙酮(2∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯-2-甲氧基924.6mg固体。
元素分析计算值：C26H36O6C 70.24％H 8.16％O 21.59％
元素分析实测值：C 70.11％H 8.10％
1H-NMR(CDCl3)：3.23(2-OCH3，H)，3.70(2位，H)，5.30(11位，H)，1.66，1.41(1位，H)，5.74(4位，H)，2.03，1.91(6位，H)，1.89(17-OH，H)，5.20(21位，H)，2.27，1.73，0.99(21-OCOCH2CH2CH3，按照H的顺序得到的数据)
实施例4孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基
1.2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基的合成
将10.0g孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基(式II化合物)投入250mL氯仿中，加入80mL THF，搅拌成清液。冰盐浴冷却至-5℃，滴加含9.00g溴化剂2，4，4，6-四溴-2，5-二烯环己酮的氯仿和THF溶液(氯仿240mL，THF 100mL)，80min滴加完毕。移去冰盐浴，室温搅拌1h，反应结束。向反应液中加入140mL 10％亚硫酸钠水溶液搅拌5min，取有机层水洗1次。合并水层，氯仿反抽1次。合并氯仿层水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩蒸干溶剂，得油状物。加入50mL无水乙醇，析出沉淀，过滤，滤液浓缩近干，柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基3.96g。
2.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基--21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基的合成
将0.06mol的甲醇钠，搅拌溶解后加入50mlDMF，然后投入2.5g2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基，全溶，加入醋酸亚酮0.2g，搅拌回流22h。22h后补加0.2g醋酸亚酮，继续搅拌回流2h后结束反应。减压蒸干溶剂，加水稀释，盐酸酸化至pH 2，有沉淀，减压抽滤，水洗至中性。用氯仿全溶，氯仿液水洗2次，无水硫酸钠干燥，活性炭脱色，减压浓缩近干，得油状物。柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基984.2mg固体。
元素分析计算值：C25H34O6C 69.74％H 7.96％O 22.30％
元素分析实测值：C 69.59％H 8.01％
1H-NMR(CDCl3)：3.24(2-OCH3，H)，3.70(2位，H)，5.30(11位，H)，1.66，1.41(1位，H)，5.73(4位，H)，2.36(6位，H)，1.18(6-CH3，H)，1.89(17-OH，H)，5.21(21位，H)，2.05(21-OCOCH3，H)
实施例5孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基2-甲氧基
1.2-溴-孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基的合成
将10.0g孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基(式II化合物)投入200mL氯仿中，加入100mL THF，搅拌成清液。冰盐浴冷却至-5℃，滴加含9.50g溴化剂2，4，4，6-四溴-2，5-二烯环己酮的氯仿和THF溶液(氯仿250mL，THF 100mL)，80min滴加完毕。移去冰盐浴，室温搅拌1h，反应结束。向反应液中加入140mL 10％亚硫酸钠水溶液搅拌5min，取有机层水洗1次。合并水层，氯仿反抽1次。合并氯仿层水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩蒸干溶剂，得油状物。油状物柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得2-溴-孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基4.57g。
2.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-2-甲氧基的合成
将0.06mol的甲醇钠，搅拌溶解后加入50mlDMF，然后投入2.5g2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基，全溶，加入醋酸亚酮0.2g，搅拌回流22h。22h后补加0.2g醋酸亚酮，继续搅拌回流2h后结束反应。减压蒸干溶剂，加水稀释，盐酸酸化至pH 2，有沉淀，减压抽滤，水洗至中性。用氯仿全溶，氯仿液水洗2次，无水硫酸钠干燥，活性炭脱色，减压浓缩近干，得油状物。柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-2-甲氧基1.002g固体。
元素分析计算值：C22H28O5C 70.94％H 7.58％O 21.48％
元素分析实测值：C 70.88％H 7.54％
1H-NMR(CDCl3)：3.55(2-OCH3，H)，5.13(1位，H)，5.34(11位，H)，6.14(4位，H)，2.01，1.82(6位，H)，1.92(17-OH，H)，4.73(21位，H)，2.00(21-OH，H)
实施例6孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基以孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯为原料按照实施例2的方法合成孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基。
元素分析计算值：C24H30O6C 69.54％H 7.30％O 23.16％
元素分析实测值：C 69.38％H 7.34％
1H-NMR(CDCl3)：3.55(2-OCH3，H)，5.13(1位，H)，5.34(11位，H)，6.14(4位，H)，2.01，1.82(6位，H)，1.90(17-OH，H)，5.22(21位，H)，2.05(21-OCOCH3，H)
实施例7孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-丁酸酯-2-甲氧基的合成
以孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-丁酸酯为原料按照实施例3的方法合成孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-丁酸酯-2-甲氧基。
元素分析计算值：C26H34O6C 70.56％H 7.74％O 21.69％
元素分析实测值：C 70.49％H 7.78％
1H-NMR(CDCl3)：3.55(2-OCH3，H)，5.13(1位，H)，5.34(11位，H)，6.14(4位，H)，2.01，1.82(6位，H)，1.92(17-OH，H)，5.24(21位，H)，2.31，1.75，0.99(21-OCOCH2CH2CH3，按照H的顺序得到的数据)
实施例8孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基
以孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-醋酸酯-6α-甲基为原料按照实施例4的方法合成孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基。
元素分析计算值：C25H32O6C 70.07％H 7.53％O 22.40％
元素分析实测值：C 70.04％H 7.56％
1H-NMR(CDCl3)：3.55(2-OCH3，H)，5.13(1位，H)，5.34(11位，H)，6.14(4位，H)，2.32(6位，H)，1.16(6-CH3，H)，1.89(17-OH，H)，5.22(21位，H)，2.05(21-OCOCH3，H)
实施例9孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-乙氧基
1.2-溴-孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯的合成
将10.0g孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯(式II化合物)投入200mL氯仿中，加入100mL THF，搅拌成清液。冰盐浴冷却至-5℃，滴加含9.50g溴化剂2，4，4，6-四溴-2，5-二烯环己酮的氯仿和THF溶液(氯仿250mL，THF 100mL)，80min滴加完毕。移去冰盐浴，室温搅拌1h，反应结束。向反应液中加入140mL 10％亚硫酸钠水溶液搅拌5min，取有机层水洗1次。合并水层，氯仿反抽1次。合并氯仿层水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩蒸干溶剂，得油状物。油状物柱层析，氯仿-丙酮(1∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得2-溴-孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯4.27g。
2.孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-乙氧基的合成
将0.06mol的乙醇钠，搅拌溶解后加入80mlDMF，然后投入4.00g2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯，全溶，加入醋酸亚酮0.25g，搅拌回流22h。22h后补加0.2g醋酸亚酮，继续搅拌回流2h后结束反应。减压蒸干溶剂，加水稀释，盐酸酸化至pH 2，有沉淀，减压抽滤，水洗至中性。用氯仿全溶，氯仿液水洗2次，无水硫酸钠干燥，活性炭脱色，减压浓缩近干，得油状物。柱层析，氯仿-丙酮(2∶5)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-乙氧基1.860g固体。
元素分析计算值：C25H32O6C 70.07％H 7.53％O 22.40％
元素分析实测值：C 69.98％H 7.58％
1H-NMR(CDCl3)：1.24，3.95(2-OCH2CH3，按照H的顺序得到的数据)，5.22(1位，H)，5.41(11位，H)，6.10(4位，H)，2.01，1.82(6位，H)，1.90(17-OH，H)，5.24(21位，H)，2.05(21-OCOCH3，H)
实施例10孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯-2-甲氧基1.2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯的合成
将10.0g孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯(式II化合物)投入200mL氯仿中，加入50mL THF，搅拌成清液。冰盐浴冷却至-5℃，滴加含9.00g溴化剂2，4，4，6-四溴-2，5-二烯环己酮的氯仿和THF溶液(氯仿250mL，THF 100mL)，80min滴加完毕。移去冰盐浴，室温搅拌1h，反应结束。向反应液中加入140mL 10％亚硫酸钠水溶液搅拌5min，取有机层水洗1次。合并水层，氯仿反抽1次。合并氯仿层水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩蒸干溶剂，得油状物。油状物柱层析，氯仿-丙酮(1∶2)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯3.97g。
2.孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯-2-甲氧基的合成
将0.06mol的甲醇钠，搅拌溶解后加入80mlDMF，然后投入3.50g2-溴-孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯，全溶，加入醋酸亚酮0.25g，搅拌回流22h。22h后补加0.2g醋酸亚酮，继续搅拌回流2h后结束反应。减压蒸干溶剂，加水稀释，盐酸酸化至pH 2，有沉淀，减压抽滤，水洗至中性。用氯仿全溶，氯仿液水洗2次，无水硫酸钠干燥，活性炭脱色，减压浓缩近干，得油状物。柱层析，氯仿-丙酮(1∶2)展开，取主点用氯仿洗脱，将该氯仿减压浓缩，冲入两次甲醇重结晶，得孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯-2-甲氧基1.740g固体。
元素分析计算值：C26H34O7C 68.10％H 7.47％O 24.42％
元素分析实测值：C 67.99％H 7.51％
1H-NMR(CDCl3)：3.23(2-OCH3，H)，3.70(2位，H)，5.30(11位，H)，1.66，1.41(1位，H)，5.74(4位，H)，2.03，1.91(6位，H)1.90(17-OH，H)，5.23(21位，H)，2.03(21-OCOCH3，H)，2.00(17-OH3，H)
实施例11：
主药：
孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-醋酸酯-2-甲氧基 5g
辅料：
烟酰胺 70g
苯甲醇 7.5ml
注射用水 加至 1000ml
【制备】将孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基先用少量注射用水调匀待用，再将烟酰胺溶于适量注射用水中，加入活性炭0.1g，搅拌均匀后放置15min，粗滤脱碳，加注射用水至约900ml，水浴上加热至80~90℃，慢慢加入已用注射用水调好的孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基，保温20~30min，完全溶解后冷却至室温。加入苯甲醇，调节pH至5.5~6.0，调整体积至1000ml，然后在10℃以下放置8h，过滤至澄明、灌封，100℃流通蒸气灭菌15min即可。
实施例12：
用细碎的乳糖将20mg孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基稀释混合成200mg的药物组合物，装入4号硬胶囊中。
药理实施例1：体外实验
采用生长因子诱导的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管增生模型观察式(I)化合物对血管增生的影响，了解式(I)化合物对血管生成的作用。
实验材料：
受精3日龄鸡胚
玻璃纤维滤纸
血管内皮细胞生长因子(VEGF)Chemicon公司产品
将实施例1-10所制成的化合物先用DMSO溶解，再用PBS稀释至所需要的浓度(DMSO浓度＜0.1％)
实验方法
1.CAM模型的建立：
75％乙醇清洗鸡胚卵壳于超净台中吹干，水平放置5min后，在100mm培养皿边缘小心将卵壳敲碎，卵内容物置于培养皿中(培养皿中预先加有10ml DMEM培养基)。将此培养皿放入150mm大培养皿中(大培养皿中加少许水)，盖上皿盖，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
2.对CAM血管增生的影响
用打孔机将玻璃纤维滤纸制成直径3mm的小圆片，湿热灭菌，将试剂各10μl滴于玻璃纤维滤纸上，制成药膜，吹干备用。鸡胚培养3d后，随机分成13组，每组10个，将实施例1-11所得的化合物设为11个给药组(1g/L)，同时给予生长因子(2μg/L)，以及生长因子(VEGF)单独刺激组(阳性对照组)和PBS(磷酸盐缓冲液，PH 7.4)刺激组(阴性对照组)。将药膜贴于CAM和卵黄囊膜(yolk sacmembrane，YSM)外2/3处血管较少的部位。加药48h后，显微镜下观察，计数药膜周围5mm内大、中、小血管数。
表1对CAM血管增生的影响表(x±s，n＝10)
| 组名 | 大血管 | 中血管 | 小血管 | P(小血管中各组对VEGF组) |
| PBS | 1.00±1.08 | 2.50±0.29 | 8.34±0.35 | ＜0.01 |
| VEGF | 1.50±0.37 | 2.25±0.98 | 17.42±0.81 | |
| 实施例1 | 1.00±0.30 | 2.50±0.97 | 6.50±2.38 | ＜0.01 |
| 实施例2 | 1.00±0.32 | 2.50±1.01 | 6.25±1.98 | ＜0.01 |
| 实施例3 | 1.00±0.31 | 2.50±1.00 | 6.50±2.12 | ＜0.01 |
| 实施例4 | 1.00±0.31 | 2.50±1.11 | 6.50±2.61 | ＜0.01 |
| 实施例5 | 1.00±0.36 | 2.50±1.09 | 7.00±2.78 | ＜0.01 |
| 实施例6 | 1.00±0.31 | 2.50±0.97 | 6.50±2.03 | ＜0.01 |
| 实施例7 | 1.00±0.33 | 2.50±1.03 | 6.75±2.16 | ＜0.01 |
| 实施例8 | 1.00±0.32 | 2.50±1.06 | 6.75±2.78 | ＜0.01 |
| 实施例9 | 1.00±0.32 | 2.50±1.19 | 6.75±2.56 | ＜0.01 |
| 实施例10 | 1.00±0.28 | 2.50±0.91 | 6.00±1.42 | ＜0.01 |
注：统计学方法数据以x±s表示.组间比较应用t检验
3.结果
1式(I)化合物对VEGF诱导的CAM
血管增生的影响结果表1，PBS组血管生长良好.VEGF组小血管增生明显，式(I)化合物的各组血管增生明显受到抑制.小血管显著减少，基本回到正常水平。
CAM是经典的血管生成评价模型，具有方法简便、易观察、价廉等优点.是目前最常用的在体模型。VEGF是重要的促血管生成因子，能刺激内皮细胞的增生和迁移，促进血管生成，且在多种肿瘤组织中发现过度表达。本研究表明：式(I)化合物抑制VEGF诱导的CAM血管增生，表明式(I)化合物具有抑制VEGF的促血管生成作用。
式(I)化合物对血管生成有抑制作用，进一步证实了具有抑制肿瘤血管生成的潜力。
药理实施例2：体内实验
1.实验动物及瘤株
实验选用昆明种小鼠，雄性，170只，分17组。体重(20±2)g
小鼠肉瘤瘤株S180
2.药品
顺铂(DDP)注射液：20ml:20mg/支。
3.方法
3.1瘤鼠模型的建立：小鼠肉瘤S180瘤株，腹腔传代接种。待腹水生长良好时，抽出腹水，细胞计数，调整细胞浓度为2×107个细胞/ml，在小鼠腋下皮下注射S180肉瘤细胞，每只接种0.25ml，于第11天观察局部肿瘤生长情况。
3.2治疗及分组：170只小鼠于接种当天随机分为17组。按下列表格给与药物
试验分组情况表
| 组号 | 活性成分 | 给药方式 | 给药量 |
| 对照组 | 生理盐水 | 每日口服一次 | 0.4ml |
| DDP组 | 顺铂 | 隔日腹腔注射一次 | 0.5mg/kg |
| 1 | 实施例1 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 2 | 实施例2 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 3 | 实施例3 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 4 | 实施例4 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 5 | 实施例5 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 6 | 实施例6 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 7 | 实施例7 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 8 | 实施例8 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 9 | 实施例9 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 10 | 实施例10 | 每日口服一次 | 1mg/kg |
| 11 | 实施例2 | 每日口服一次 | 0.01mg/kg |
| 12 | 实施例2 | 每日口服一次 | 0.1mg/kg |
| 13 | 实施例2 | 每日口服一次 | 10mg/kg |
| 14 | 实施例2 | 每日口服一次 | 20mg/kg |
| DDP联合组 | 实施例2和DDP | 实施例2每日口服一次，DDP隔日腹腔注射一次 | 实施例2，1mg/kgDDP，0.5mg/kg |
注：实施例试验组中给药量按活性成分计。
根据文献“顺铂对小鼠骨髓遗传毒性的研究”(《癌变.畸变.突变》，1996年8卷6期，362-365)中的介绍，对小鼠采用0.5mg/kg的给药量。
用药10d，末次灌胃后60min，处死各组小鼠，剥取瘤块、称重，瘤块作病理组织切片。按公式计算抑瘤率：抑瘤率＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。3.3微血管染色：免疫组化SABC法染色血管，即用型微血管染色试剂盒(CD31)为武汉博士德生物公司产品。各组瘤体剥离后，切取标本，固定，包埋，切片。经染色后的切片，内皮细胞褐染，血管呈黄褐色，易于辨认。
MVD的测定：MVD按照Weidner等人(Weidner N，Semple JP，Welch WR。et al.Tumor angiogenesisand Metastastasis correlation in invasive breast carcinonma，N Engl J Med，1991，324，1-8)的方法及判断标准进行，计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血管，即在低倍镜视野下扫视整个肿瘤组织切片，选择最密集的微血管标记区，凡呈现黄褐色标记清晰的单个内皮细胞或内皮细胞串均作为一个可计数的微血管，有较厚肌壁的大血管及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。计数方法：先在低倍镜(10×10)视野下扫视整个组织切片，在肿瘤浸润区选择最密集的3个微血管标记区视野，即所谓的“新生血管热点区”，然后在相同的背底、背体条件下，以高倍镜(20×20)视野(0.72mm2)为标准计数所有染色的微血管数，取其平均值作为该样本的测定值。
3.4VEGF免疫组化：VEGF免疫组化检测试剂盒(即用型)，光学显微镜下观察：VEGF阳性染色以肿瘤细胞及其附近的血管内皮细胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达。然后每张染色切片通过MPIAS一1000高清晰度彩色病理图像分析系统进行吸光度(面密度)和强度(灰度)测定。
3.5统计方法：运用SPSS统计软件，采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
4.结果
4.1S180各组小鼠移植瘤重变化比较
瘤重的变化：各治疗组瘤重均显著低于对照组，与对照组比较，差异均有统计学意义，实验结果表明各种式(I)化合物对S180移植瘤有明显抑制作用，与DDP合用具有增效作用，而不同剂量的式(I)化合物对S180移植瘤也具有剂量正相关的抑制作用，具体情况见表2。
表2式(I)化合物对S180移植瘤的抑制作用(x±s，％)
| 组别 | 鼠数(只) | 瘤重(克) | 抑瘤率(％) | P值 |
| 对照组 | 10 | 2.53±0.47 | ||
| DDP组 | 10 | 1.18±0.11 | 53.4 | ＜0.01 |
| 1 | 10 | 1.39±0.28 | 45.1 | ＜0.01 |
| 2 | 10 | 1.32±0.35 | 47.8 | ＜0.01 |
| 3 | 10 | 1.34±0.47 | 47.0 | ＜0.01 |
| 4 | 10 | 1.40±0.33 | 44.7 | ＜0.01 |
| 5 | 10 | 1.49±0.72 | 41.1 | ＜0.01 |
| 6 | 10 | 1.38±0.43 | 45.5 | ＜0.01 |
| 7 | 10 | 1.39±0.54 | 45.1 | ＜0.01 |
| 8 | 10 | 1.38±0.38 | 45.5 | ＜0.01 |
| 9 | 10 | 1.39±0.31 | 45.1 | ＜0.01 |
| 10 | 10 | 1.25±0.14 | 50.6 | ＜0.01 |
| 11 | 10 | 1.82±0.94 | 28.1 | ＜0.05 |
| 12 | 10 | 1.53±0.75 | 39.5 | ＜0.05 |
| 13 | 10 | 1.14±0.12 | 54.9 | ＜0.01 |
| 14 | 10 | 1.13±0.11 | 55.3 | ＜0.01 |
| DDP联合组 | 10 | 1.01±0.19 | 60.1 | ＜0.01 |
4.2式(I)化合物对S180瘤体微血管密度的影响
各组肿瘤病理标本经CD31染色，肿瘤组织间质血管均有着色，以内皮细胞被染成黄褐色为阳性表达，微血管的大小、形态差异较大，有的仅为单个内皮细胞和内皮细胞族，有的管腔不明显或形态不规则，肿瘤边缘组织的MVD高于中央。对照组肿瘤内见大量的新生毛细胞血管，阳性目标为位于肿瘤组织及间质成片状或团块状分布的黄褐色颗粒，各用药组阳性表达细胞颗粒减少，见表3。
表3S180瘤体平均微血管密度(x±s，％)
| 组别 | 鼠数(只) | 平均微血管密度 | P值(各组与对照组) |
| 对照组 | 10 | 127.4±38.4 | |
| DDP组 | 10 | 79.9±21.1 | ＜0.01 |
| 1 | 10 | 71.6±21.2 | ＜0.01 |
| 2 | 10 | 67.1±17.1 | ＜0.01 |
| 3 | 10 | 65.7±22.9 | ＜0.01 |
| 4 | 10 | 73.5±22.0 | ＜0.01 |
| 5 | 10 | 80.2±24.9 | ＜0.01 |
| 6 | 10 | 77.3±23.7 | ＜0.01 |
| 7 | 10 | 69.4±20.5 | ＜0.01 |
| 8 | 10 | 72.7±26.8 | ＜0.01 |
| 9 | 10 | 73.1±24.1 | ＜0.01 |
| 10 | 10 | 62.0±12.6 | ＜0.01 |
| 11 | 10 | 90.6±29.5 | ＜0.05 |
| 12 | 10 | 77.4±27.1 | ＜0.01 |
| 13 | 10 | 60.7±19.1 | ＜0.01 |
| 14 | 10 | 47.9±11.8 | ＜0.01 |
| DDP联合组 | 10 | 56.5±13.6 | ＜0.01 |
4.3式(I)化合物对小鼠S180肉瘤组织VEGF表达的影响
免疫组化结果显示，光学显微镜下观察对照组肿瘤组织及其间质见大量呈片状或团块状分布的棕黄色颗粒，各用药组阳性表达细胞明显减少。对VEGF表达平均面积密度和平均灰度结果见表4。
表4S180肉瘤组织VEGF表达数据表(x±s，％)
| 组别 | 鼠数(只) | 平均面密度 | P(各组与对照组) | 平均灰度 | P(各组与对照组) |
| 对照组 | 10 | 39.20±3.39 | 157.3±32.84 | ||
| DDP组 | 10 | 18.63±3.74 | ＜0.01 | 81.4±24.65 | ＜0.01 |
| 1 | 10 | 8.96±3.42 | ＜0.01 | 74.4±25.56 | ＜0.01 |
| 2 | 10 | 7.99±2.98 | ＜0.01 | 64.2±22.17 | ＜0.01 |
| 3 | 10 | 7.83±3.12 | ＜0.01 | 65.8±21.84 | ＜0.01 |
| 4 | 10 | 8.79±3.22 | ＜0.01 | 76.7±23.5 | ＜0.01 |
| 5 | 10 | 9.87±3.45 | ＜0.01 | 79.2±24.3 | ＜0.01 |
| 6 | 10 | 8.31±3.35 | ＜0.01 | 75.8±22.4 | ＜0.01 |
| 7 | 10 | 8.40±3.17 | ＜0.01 | 73.8±24.2 | ＜0.01 |
| 8 | 10 | 9.04±3.26 | ＜0.01 | 75.7±29.7 | ＜0.01 |
| 9 | 10 | 8.78±3.07 | ＜0.01 | 73.4±25.2 | ＜0.01 |
| 10 | 10 | 7.21±2.34 | ＜0.01 | 54.3±15.6 | ＜0.01 |
| 11 | 10 | 12.51±3.89 | ＜0.01 | 97.0±30.67 | ＜0.05 |
| 12 | 10 | 10.26±3.87 | ＜0.01 | 85.36±26.78 | ＜0.05 |
| 13 | 10 | 7.09±2.96 | ＜0.01 | 61.25±21.45 | ＜0.01 |
| 14 | 10 | 6.41±2.04 | ＜0.01 | 50.14±7.89 | ＜0.01 |
| DDP联合组 | 10 | 7.78±2.69 | ＜0.01 | 50.7±6.84 | ＜0.01 |
5结论
侵袭性生长和转移潜能是恶性肿瘤的基本特征，也是恶性肿瘤患者致死的主要原因，有确切证据表明，90％以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移和复发，而且转移通常早期发生，在临床诊断出原发瘤时约50％的患者已产生远处转移。对于快速增殖、极少凋亡、多灶性分布、异质性生长的转移瘤，目前的手术、放疗、化疗等常规治疗手段常遭失败，最终患者死亡。转移实乃恶性肿瘤顽固性和难治性的根本原因。研究表明：在实体瘤的生长、浸润和转移中，持续的血管生成是一个关键因素。当瘤细胞分裂增值到一定的体积时(一般不超过1～2mm2)，如果仍无血管长入提供必须的营养物质和氧以及增殖所需要的各种因子，其死亡的细胞数和增生的细胞数大致相等，瘤细胞团停止扩张达到相对稳定的状态。当肿瘤诱发宿主为血管增殖，一些新生血管长入肿瘤组织后，肿瘤细胞群迅速增加，体积增大，向周围组织浸润，并具有转移倾向。药理实施例2体内实验结果表明，式(I)化合物组与对照组的MVD、VEGF比均明显降低，而且式(I)化合物与顺铂联合组MVD、VEGF值降低更明显，这表明式(I)化合物和顺铂联合治疗肿瘤，具有协同作用，减少血管新生，提高了抗癌效果。
通过药理实施例1和2中的数据可以证明，式(I)化合物对哺乳动物的血管新生和VEGF具有抑制作用，可以治疗或预防与此有关的疾病。
Claims (10)
1.一种式(I)化合物或盐或溶剂化合物
R1＝H、OH或OCOR5 R5是十个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或是COR6 R6是十个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化合物
R3＝五个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的五个碳以内的碳氢化合物R4＝H，α卤素或α甲基
1，2位
表示可以为单键或双键。
2.如权力要求1的化合物，其为
孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-2-甲氧基
孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基
孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯-2-甲氧基
孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基
孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基2-甲氧基
孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-2-甲氧基
孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21丁酸酯-2-甲氧基
孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-甲氧基
孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯-6α-甲基-2-乙氧基
孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21醋酸酯2-乙氧基
孕甾-4，9(11)-双烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯-2-甲氧基
或它们的任一种的盐或溶剂合物。
3.权利要求1中任一项式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物在抑制哺乳类动物血管内皮生长因子的药物中的应用。
4.权利要求1中任一项式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物在治疗哺乳类动物血管新生性疾病的药物中的应用。
5.如权力要求3或4所述的哺乳类动物，其特征在于是人类。
6.如权力要求3所述的抑制哺乳类动物血管内皮生长因子的药物，其特征在于治疗剂量为0.01mg-20mg/Kg/天。
7.如权力要求4所述的抑制哺乳类动物血管新生性疾病的药物，其特征在于治疗剂量为0.01mg-20mg/Kg/天。
8.一种药物组合物，由活性成分和一种或几种药用辅料组成，其特征在于活性成分是权利要求1中任一项式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物。
9.如权力要求8所述的药物组合物，其特征在于活性成分还可以包括抑制肿瘤的药物、治疗眼部新生血管生成造成的疾病的药物或治疗哮喘的药物。
10.一种制备权力要求1或2的式(I)化合物方法，其特征在于
式(II)化合物 2-卤素-式(II)化合物 式(I)化合物
2-卤素-式(II)化合物的合成
将式(II)化合物全溶于有机溶媒中，加入卤化剂，反应得2-卤素-式(II)化合物。
式(I)化合物的合成
将R3ONa(或R3OK)和2-卤素-式(II)化合物投入有机溶媒中，加入催化剂，反应生成得式(I)化合物。
R1＝H、OH或OCOR5 R5是十个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化合物
R2＝H或是COR6 R6是十个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化合物
R3＝五个碳以内的碳氢化合物或含有1-2个杂原子的五个碳以内的碳氢化合物R4＝H，α卤素或α甲基。
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