CN101351444B - 具有组蛋白脱乙酰基酶抑制活性的吡咯衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了衍生自通式I的吡咯的新颖的化合物、获得它们的方法以及因其对某些组蛋白脱乙酰基酶的抑制作用而以药物组合物的形式作为治疗癌症的药物的应用。
Description
发明领域
本发明涉及衍生自吡咯的新颖的化合物及其制备方法，还涉及该化合物由于其对某些组蛋白脱乙酰基酶的抑制作用而以药物组合物形式作为治疗癌症的药物的用途。
发明背景
三取代和四取代的吡咯环的化学合成能够使用线性或汇集合成工艺方法以多种方式进行(Sundberg，Comprehensive Heterocyclic Chemistry(杂环化学大全)；Katrizki，A.and Rees，C.W.Eds.；Pergamon：Oxford，1984；Vol.4，p.313)。一个非常常用的制备方法包括取代的吡咯烷的芳构化(Fejes等人，Tetrahedron 2000，56，8545；Gupta等人，Synth.Commun.1998，28，3151)。因此，能够使用烯烃和甲亚胺叶立德之间的环加成、以汇集形式制备四取代的吡咯环的杂环化合物(Ayerbe等人，J.Org.Chem.1998，63，1795；Vivanco等人，J.Am.Chem.Soc.2000，122，6078)。还已知羧酸衍生物与羟胺的偶联反应导致异羟肟酸的形成(Reddy等人，TetrahedronLett.2000，41，6285)，还导致取代的胺与光气和硫光气衍生物之间的反应，其通过形成异氰酸酯和硫氰酸酯中间体产生相应的N-羟基脲、N-羟基硫脲、N-(烷基)氨基脲和N-(烷基)氨基硫脲(Jain等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2003，13，4223)。
另一方面，已知组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂代表通过阻断某些肿瘤生长机制来治疗癌症的有前途的方法(McLaughin等人，Biochem.Pharm.2004，68，1139. 
等人，Trends Endocrin.Met.2001，12，294.Archer等人，Curr.Opin.Genet.Dev.1999，9，171)。虽然前述抑制剂治疗作用的详细机理还不是众所周知的，但普遍的意见认为对HDAC活性中心的抑制促进特定基因通过组蛋白的乙酰化与转录因子结合，所述组蛋白位于编码细胞周期控制蛋白(如p21细胞周期素依赖性蛋白激酶)的 DNA的特定区域(Archer等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 1998，95，6791)。该治疗靶标的另一优势在于，据估计仅有约2％的DNA至mRNA的转录是由HDAC抑制剂调整的(McLaughi等人，Biochem.Pharm.2004，68，1139)，这对这些抑制剂的低毒性肯定有影响，并已在临床试验中观察到(Van Lint等人，Gen.Express 1996，5，245；Glaser等人，Mol.Cancer Ther.2003，2，151)。同样地，据估计，通过改善使其不易发展为耐药性的基因转录模式，HDAC抑制剂的临床应用能够增强与其它治疗的协同联合(Keen等人，Cancer Res.Treat.2003，81，177.Egger等人，Nature 2004，429，457)。
已知不同类的HDAC抑制剂，可在不同综述中找到其通性(Villar-Garea and Esteller Int.J.Cancer 2004，112，171和Curr.Drug Metab.2003，4，11；Grozinger等人，Chem.Biol.2002，9，3；McLaughlin等人，Drug Discov.Today 2003，8，793；Monneret Eur.J.Med.Chem.2005，40，1；Biel等人，Angew.Chem.Int.Ed.2005，44，3186)。大体上，最有活性的抑制剂的结构特征为具有通过碳间隔基链与能够和所述HDAC活性中心的金属离子配位的单元结合的显著疏水性的环状或多环部分。具体地，3-(4-芳酰基-1-甲基-1H-2-吡咯基)-N-羟基-2-丙烯酰胺的合成已作为HDAC的抑制剂而被描述(cf.Mai等人，J.Med.Chem.2004，47，1098)。在这种情况下，间隔基链是不饱和的并且吡咯环的3位和5位是未取代的，得到线性分子几何结构。
无论由合成获得的抑制剂的质量如何，其治疗应用均会存在问题，其中必须提到的是对不同HDAC的抑制选择性，其中某些HDAC不能在肿瘤学、毒性和化学不稳定性中构成有用的治疗靶标。在本文中，本发明描述了合成新的HDAC抑制剂的通用方法，该方法带来了产生很多种类官能团的可能性，其导致在化学上稳定的分子，并且具有不同的多环体系、间隔基大小和对要抑制的酶的金属原子的配位单元。
因此本发明所提出的问题在于提供对与肿瘤形成过程的出现和发展有关的不同HDAC的抑制具有高选择性的化合物和组合物，该化合物和组合物具有高化学稳定性和低毒性。本发明所提出的溶液包括使用通式I的吡咯衍生物。这些化合物在3位和5位具有芳基或杂芳基取代基，还 在4位具有诸如硝酸根基团的吸电子基团，以及在2位具有由不同性质的间隔基组成的不同种类的基团，并且使用N-羟基脲、N-烷基氨基(芳基)脲、N-羟基硫脲和N-烷基氨基(芳基)硫脲基团与HDAC的金属离子配位。这些吡咯衍生物表现出很强的抑制细胞增殖和肿瘤生长的能力。
简言之，本发明旨在解决当前对具有以下优点的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的需求：如良好的药理学性能、固相和溶液中的稳定性、简单且高效的化学合成以及起始化合物的可达性与可变性。
附图的简要说明
图1表示与用作正控制的TSA(曲古抑菌素A(tricostatin A)的首字母缩写)与SAHA(辛二酰苯胺异羟肟酸的首字母缩写)相比较，本发明的某些化合物对HCT116细胞系(人结肠癌)的组蛋白的脱乙酰基酶活性的体外测试结果。
图2表示与用作正控制的TSA与SAHA相比较，本发明的化合物的典型实例对MOLT4细胞系(人纤维型白血病)的组蛋白的脱乙酰基酶活性的体外测试结果。
图3表示使用HPCE(高效毛细管电泳法)、用本发明的某些化合物以10μM的浓度处理的Jurkat人早幼粒细胞白血病细胞系的H3和H4组蛋白的乙酰化水平的量化。
图4表示在不同浓度的SAHA和本发明的两种抑制剂存在下测量凋亡细胞和坏死细胞的百分比。该图还包含在对照样本上和用DMSO处理的样本上得到的数据。所示数据对应于人结肠癌模型HCT116。
图5表示在不同浓度的SAHA和本发明的两种抑制剂存在下测量凋亡细胞和坏死细胞的百分比。该图还包含在对照样本上和用DMSO处理的样本上得到的数据。所示数据对应于人急性髓细胞白血病模型HL60。
图6表示在无胸腺的裸鼠中对人结肠癌HCT116的肿瘤生长的抑制作用，所述抑制作用是通过本发明的某些化合物的腹膜内给药引起的。根据实施例18详述的方法，在脾脏内进行外来植入(xeno-implants)并在腹膜内注射所述抑制剂。
图7表示在人纤维型白血病模型MOLT4中本发明的某些化合物在无 胸腺的裸鼠中的体内抗肿瘤活性。根据实施例17详述的方法在脾脏内进行外来植入。
发明目的
本发明的目的在于通式I的吡咯衍生物：
同样地，本发明的另一目的在于制备通式I的这些化合物的方法。
本发明的另一目的在于这些衍生物在治疗不同形式的癌症中的用途，所述治疗是通过抑制某些组蛋白脱乙酰基酶的作用来限制肿瘤生长的。
最后，本发明的目的在于可以包括通式I的任一吡咯衍生物和至少一药物可接受的赋形剂的药物组合物的制备。
发明详述
首先，本发明提供具有以下通式I的、衍生自吡咯的某些化合物：
其中：
R1和R3独立表示苯基自由基；环上不同位置的单取代或多取代的苯基；或含有O、N或S中至少一个杂原子的C5-C10杂芳基基团；
R2表示氢原子或吸电子基团，例如硝基基团；或者胺或酰胺基团；
R4表示氢原子或线性、支链或环状的C1-C6烷基基团；
n表示亚甲基基团的数目为1至8，包含端点；
X表示仲胺基团、氧原子或硫原子；
Y表示选自亚甲基、取代的亚甲基或仲胺的基团；
Z表示氧原子或硫原子；以及
W表示选自羟基、羟基胺、肼、烷基肼、芳基肼或杂芳基肼的基团。
在一优选的实施方案中，通式I的化合物为：
●具有以下结构式的6-(3，5-二苯基-1H-吡咯-2-酰胺)己酸：
●具有以下结构式的6-(4-硝基-3，5-二苯基-1H-吡咯-2-酰胺)己酸：
●具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基)-3-苯基-5-(4-甲氧苯基)-1H-吡咯-2-酰胺：
●具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基)-5-苯基-3-(4-甲氧苯基)-1H-吡咯-2-酰胺：
●具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基)-3-苯基-5-(4-甲氧苯基)-4-硝基-1H-吡咯-2-酰胺：
●具有以下结构式的1-(4-(3，5-双(3，5-二甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-羟基脲：
●具有以下结构式的1-(4-(5-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-3-(噻吩-2-基)-1H-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-(2-甲氨基)脲：
本发明的另一方面提到获得通式I的化合物的不同方法。正如我们下面将看到的，以下方法A至方法E描述了获得通式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的方法。(Ia)至(Id)的这些化合物的通式落在通式I内。
方法A
方法A表示通式(Ia)的化合物的制备方法：
其中R1、R2、R3、R4、X和n具有以上给出的含义，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应：
a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，
b)通式III的化合物，
HX-(CH2)n-R5
(III)
其中R5是烷氧羰基，
c)活化所述羧基基团的试剂，以及
d)叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
以及使所获得的产物与氢氧化锂或氢氧化钠、二甲氧基乙烷和水的混合物发生反应。
出于本发明的目的，由a)至d)阶段的四类化合物组成的反应混合物能够通过在-85℃至+25℃、优选接近0℃的温度下，在其它三种组分加入有机溶剂前先将一组分加入混合物中而制成。然后将其放置一段时间至达到环境温度以完成反应。该偶合反应一旦完成，将按照通常方法所获得的酯与氢氧化锂或氢氧化钠、二甲氧基乙烷和水的混合物反应，由此在相应的处理后得到通式(Ia)的化合物。
方法B
方法B表示通式(Ib)的化合物的制备方法：
其中，R1、R2、R3、R4、X和n具有以上给出的含义，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应：
a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，
b)通式III的化合物，
HX-(CH2)n-CH2-R5
(III)
其中R5是烷氧羰基，
c)活化所述羧基基团的试剂，以及
d)叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
以及在甲醇中过量甲醇钠的存在下，将所得产物加入盐酸羟胺与酚酞的混合物中。
出于本发明的目的，由a)至d)阶段的四类化合物组成的反应混合物能够通过在-85℃至+25℃、优选接近0℃的温度下，在其它三种组分加入有机溶剂前先将一组分加入混合物中而制成。然后将其放置一段时间至达到环境温度以完成反应。该偶合反应一旦完成，在甲醇中过量甲醇钠的存在下，将获得的酯加入盐酸羟胺与酚酞的混合物中。一旦反应完成，在相应处理以后可获得通式(Ib)的化合物。
方法C
方法C表示通式(Ic)的化合物的制备方法：
其中，R1、R2、R3、R4、X、Z和n具有以上给出的含义，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应：
a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，
b)通式III的化合物，
HX-(CH2)n-R5
(III)
其中R5是叔丁氧基氨基甲酰基(NHBoc)或苄氧基氨基甲酰基(NHCBz)，
c)活化所述羧基基团的试剂，以及
d)叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
用酸处理或水解的方式对所得产物脱保护以及使其与光气或其类似物(例 如双光气、三光气或硫光气)进行反应，获得异氰酸酯或硫代异氰酸酯，所述异氰酸酯或硫代异氰酸酯用羟胺处理。
出于本发明的目的，由a)至d)阶段的四类化合物形成的反应混合物能够通过在-85℃至+25℃、优选接近0℃的温度下，在其它三种组分加入有机溶剂前先将一组分加入混合物中而制成。然后将其放置一段时间至达到环境温度以完成反应。取决于R5在化合物III中所代表的含义，即取决于R5是表示叔丁氧基氨基甲酰基(NHBoc)还是苄氧基氨基甲酰基(NHCBz)，随后的处理将是不同的。在R5表示NHBoc的情况下，所得产物必须经过酸处理，优选在环境温度下与卤化溶剂中的三氟乙酸反应。当R5表示NHCBz时，所得产物进行氢解，优选通过在钯多相催化剂存在下、与氢气或短链醇作为溶剂的甲酸铵反应。在两种情况下，脱保护后获得伯胺，其用光气或其衍生物之一进行处理，所述光气衍生物例如双光气或三光气或硫光气。当与光气、双光气或三光气反应时，最终化合物(Ic)在Z处具有氧原子。另一方面，如果是用硫光气处理，Z将是硫原子。
与光气(双光气、三光气)或硫光气反应后，获得相应的异氰酸酯或硫代异氰酸酯，用羟胺对其进行原位处理以获得通式(Ic)的化合物。
方法D
方法D表示通式(Id)的化合物的制备方法：
其中，R1、R2、R3、R4、X、Z和n具有以上给出的含义，并且R6是H、C1-C6烷基、芳基或具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的5元或6元的杂芳基，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应：
a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，
b)通式III的化合物，
HX-(CH2)n-R5
(III)
其中R5是叔丁氧基氨基甲酰基(NHBoc)或苄氧基氨基甲酰基(NHCBz)，
c)活化所述羧基基团的试剂，以及
d)叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
用酸处理或水解的方式对所得产物脱保护以及使其与光气或其类似物(例如双光气、三光气或硫光气)进行反应，获得异氰酸酯或硫代异氰酸酯，所述异氰酸酯或硫代异氰酸酯用肼或烷基肼、芳基肼或杂芳基肼处理。
出于本发明的目的，由a)至d)阶段的四类化合物形成的反应混合物能够通过在-85℃至+25℃、优选接近0℃的温度下，在其它三种组分加入有机溶剂前先将一组分加入混合物中而制成。然后将其放置一段时间至达到环境温度以完成反应。取决于R5在化合物III中所代表的含义，即取决于R5是表示叔丁氧基氨基甲酰基(NHBoc)还是苄氧基氨基甲酰基(NHCBz)，随后的处理将是不同的。在R5表示NHBoc的情况下，所得产物必须经过酸处理，优选在环境温度下与卤化溶剂中的三氟乙酸反应。当R5表示NHCBz时，所得产物进行氢解，优选通过在钯多相催化剂存在下、与氢气或短链醇作为溶剂的甲酸铵反应。在两种情况下，脱保护后获得伯胺，其用光气或其衍生物之一进行处理，所述光气衍生物例如双光气或三光气或硫光气。当与光气、双光气或三光气反应时，最终化合物(Ic)在Z处具有氧原子。另一方面，如果是用硫光气处理，Z将是硫原子。
与光气(双光气、三光气)或硫光气反应后，获得相应的异氰酸酯或硫 代异氰酸酯，用肼或烷基肼对其进行原位处理以获得通式(Id)的化合物。
方法E
方法E表示通式(Id)的化合物另一的制备方法：
其中，R1、R2、R3、R4、X、Z和n具有以上给出的含义，并且R6是H、C1-C6烷基、芳基或具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的5元或6元的杂芳基，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应：
a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，
b)通式III的化合物，
HX-(CH2)n-R5
(III)
其中R5是3-苄氧基脲或3-烷基脲、3-芳基脲或3-杂芳基脲，
c)活化所述羧基基团的试剂，以及
d)叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
如果前述偶合反应是由N-苄氧基脲或硫脲进行的，则仅需要在合适的催化剂存在下通过氢解的方式释出相应的N-羟基脲或硫脲。在N-烷基(芳基、杂芳基)氨基脲或硫脲的情况下，如果所述自由基已被引入相应的 前体(III)，则所述偶合反应直接产生期望的最终分子。
作为方法A至方法E的共同成分，羧基基团活化试剂优选二氯磷酸苯酯、氰代膦酸二乙酯(DEPC)或由1-羟基苯并三唑和N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺形成的体系。
就叔胺而言，其是方法A和方法B中共同的试剂，选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物。所述叔胺优选选自N-甲基吡咯烷或N-甲基吗啡啉。
还优选使用微波照射进行方法A至方法E中各自成分a)至成分d)之间的反应。
前述通式II的化合物的制备在有机溶剂中进行或者在不存在有机溶剂时使用微波照射进行，使包含以下物质的混合物首先发生反应：
a)具有以下通式IV的(E)构型或(Z)构型的硝基烯，
O2N-CH＝CH-R3
(IV)
其中：
R3具有以上给出的含义；
b)具有以下通式V的(E)构型或(Z)构型的亚胺，
R1-CH＝N-CH2-COOR6
(V)
其中：
R1具有以上给出的含义，以及
R6表示C1-C6烷基或芳基基团；
c)金属盐，优选选自高氯酸锂、高氯酸银或醋酸银，以及
d)有机叔碱(tertiary organic base)，选自C3-C10碳的环状或非环状的脂肪族化合物或C9-C15碳的烷基芳香族化合物。
出于本发明的目的，由以上所示的四种组分构成的反应混合物能够使用微波照射或在-25℃至+25℃、优选接近+25℃的温度下，通过 将一组分先于其它三种组分加入有机溶剂中而制成。一旦该环加成反应结束，便可得到与为每个具体反应选择的取代基相应的2-烷氧羰基吡咯烷的混合物。将该混合物溶解在环醚(如四氢呋喃)中或高沸点的非环状醚(如双(2-甲氧基乙基)醚，还称为“二甘醇二甲醚”)中，并且加入氧化剂，例如二氧化锰、过氧化氢或2，3-二氯-5，6-二氰-1，4-苯醌。一定时间后，于+60℃至+250℃的温度下获得由2-烷氧羰基-NH-吡咯和相应的2-烷氧羰基-4-硝基-NH-吡咯组成的混合物，其组分能够通过分级结晶法或色谱法分离。通式II的酸是通过对前述酯的加碱水解而获得，优选通过用在水和二甲氧基乙烷的混合物中的氢氧化锂或氢氧化钠对其进行处理。
本发明的另一方面涉及通式I的这些化合物在治疗癌症中的用途。这些化合物的作用机理在于其对组蛋白脱乙酰基酶的抗性，该抗性包括阻断负责调节诸如细胞凋亡或生长以及细胞增殖等过程的蛋白的合成。这些性能预防或阻断所述脱乙酰基酶以及相关酶配合物结合至其天然基质上，例如组蛋白的末端赖氨酸的ε位上的N-乙酰化的赖氨酸的残基，因此这些保留了单乙酰化或多乙酰化的状态。
本发明最后一方面涉及由至少一种通式I的化合物与一种或多种药物可接受的赋形剂组成的组合物。虽然本发明通式I的化合物能够作为纯物质(pure substance)给药，也可以药物制剂的形式给药，但是优选该化合物以联合形式给药。所述药物的联合优选以下的制剂形式：
i)仅包含通式I的化合物；
ii)包含一种或多种赋形剂和/或载体物质(transporter substances)；以及
iii)可包含任一额外的治疗活性物质。
所述赋形剂、载体物质和辅助物质必须是药物和药理可接受的，这样的方式使得其可与制剂(formulation)或制剂(preparation)的其它组分联合并且在待治疗的有机体中不产生不良反应。
所述制剂包括适于口服给药或胃肠外给药的那些制剂(包括皮下给药、皮内给药、肌内给药和静脉内给药)，尽管如此，最佳的给药途径将取决于患者的状态。
所述制剂可以是简单剂型并且可根据药理学领域中的公知方法制备。活性物质的给药量可依据治疗特点而变化，尽管如此，一剂量或多剂量的活性物质的给药量通常在每天1mg至500mg间变化。
为了帮助更好地理解前述的方法，以下描述了本发明的某些具体实施例。这些实施例仅为示例性的。
实施例1
制备具有以下结构式的5-苯基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-羧酸：
和具有以下结构式的5-苯基-3-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-1H-吡咯-2-羧酸：
将三乙胺(12ml，80.0mmol)，醋酸银(1.98g，11.9mmol)和(E)-2-(4-甲氧基苯基)-1-硝基乙烯(14.33g，80.0mmol)接连加入乙腈(800ml)中的N-苯亚甲基甘氨酸甲酯(14.17g，80.0mmol)的混合物中。通过薄层色谱监测反应进程。一旦反应完成，将该混合物通过硅藻土床(Celite bed)过滤并用饱和NH4Cl溶液(2×150ml)和水(2×150ml)洗涤。经MgSO4干燥后，减压蒸发该溶液，得到26.5g的5-苯基-3-(4-甲氧基苯基)-2-甲氧羰基-4-硝基吡咯烷的非对映异构体的混合物。使12.22g(34.27mmol)该混合物在惰性气氛下溶解在双(2-甲氧基乙基)醚(343ml)中并加入二氧化锰(29.8g，343mmol)。该反应混合物在搅拌下回流48h。然后使其回到环境温度并经硅藻土床过滤。将所得溶液减压浓缩，得到7.93g由5-苯基-3-(4-甲 氧基苯基)-2-甲氧羰基-4-硝基-1H-吡咯和5-苯基-3-(4-甲氧基苯基)-2-甲氧羰基-1H-吡咯组成的混合物。使用快速柱色谱分离该产物，每一产物分别水解，如下所示。将10％NaOH(40ml，水溶液)逐滴加入相应酯(4.0mmol)的乙醇(100ml)溶液中，然后在回流下搅拌该混合物。通过薄层色谱监测该反应进程。一旦反应完成，将该混合物冷却至0℃，用1N HCl中和并用二氯甲烷(3×50ml)萃取。合并的有机组分经MgSO4干燥并且减压蒸发，得到相应的羧酸。
5-苯基-3-(4-甲氧基苯基)-2-甲氧羰基-1H-吡咯-2-羧酸：
收率，41％；m.p.198℃(分解)；IR 3467，1643cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)11.72(s，1H)，7.88(d，2H，J＝7.7Hz)，7.51(d，2H，J＝8.4Hz)，7.38(t，2H，J＝7.6Hz)，7.26(t，1H，J＝7.2Hz)，6.91(d，2H，J＝8.4Hz)，6.69(s，1H)，3.78(s，3H)，3.34(b s，1H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)162.5，157.9，134.4，131.3，131.2，130.3，128.6，127.9，127.0，125.1，119.8，113.0，112.9，109.3，55.0，54.9；C18H15NO3的分析计算值：C，73.71；H，5.15；N，4.78。实测：C，73.56；H，5.08；N，4.81％。
5-苯基-3-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-1H-吡咯-2-羧酸：
收率，28％；m.p.190℃；IR 3437，1663，1493cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)7.57-7.52(m，2H)，7.48-7.43(m，3H)，7.24(d，2H，J＝8.4Hz)，6.90(d，2H，J＝8.4Hz)，3.79(s，3H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)13C-NMR(δppm，DMSO-d6)161.6，158.3，133.5，132.5，131.1，129.3，129.0，128.0，124.5，124.2，121.1，112.7，54.9；C18H14N2O5的分析计算值：C，63.90；H，4.17；N，8.28。实测：C，63.85；H，4.20；N，8.27％。
实施例2
制备具有以下结构式的3-苯基-5-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-羧酸：
和具有以下结构式的3-苯基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-1H-吡咯-2-羧酸：
使用与实施例1基本上相似的方法制备这些物质，得到呈黄色固体的标题化合物。
3-苯基-5-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-羧酸：收率，52％；m.p.251℃；IR 3457，3316，1618cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)10.67(b s，1H)，7.88(d，2H，J＝7.5Hz)，7.70(d，2H，J＝8.5Hz)，7.23(t，2H，J＝7.5Hz)，7.11(t，1H，J＝7.3Hz)，6.87(d，2H，J＝8.5Hz)，6.52(s，1H)，3.74(s，3H)，3.38(b s，1H)； 13C-NMR(δppm，DMSO-d6)166.1，157.5，137.1，129.7，128.9，127.9，126.9，125.3，125.2，124.7，113.9，106.4，54.9；C18H15NO3的分析计算值：C，73.71；H，5.15；N，4.78。实测：C，73.48；H，5.11；N，4.79％。
3-苯基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-1H-吡咯-2-羧酸：收率，35％；m.p.106-107℃；IR 3407，1668，1507，1351cm-1；1H-NMR(δppm，CDCl3)9.32(s，1H)，7.54(d，2H，J＝8.6Hz)，7.42-7.38(m，5H)，7.01(d，2H，J＝8.6Hz)，3.88(s，3H)；13C-NMR(δppm，CDCl3)163.4，161.1，135.2，133.2，130.8，130.3，129.7，128.7，128.2，127.8，127.6，120.6，114.3，114.2，55.4；C18H14N2O5的分析计算值：C，63.90；H，4.17；N，8.28。实测：C，63.77；H，4.19；N，8.30％。
实施例3
制备具有以下结构式的5-(4-甲氧基苯基)-3-(噻吩-2-基)-1H-吡咯-2-羧酸：
和具有以下结构式的5-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-3-(噻吩-2-基)-1H-吡咯-2-羧酸：
使用与实施例1基本上相似的方法制备这些物质，得到呈黄色固体的标题化合物。
5-(4-甲氧基苯基)-3-(噻吩-2-基)-1H-吡咯-2-羧酸：收率，54％；m.p.153-154℃；IR 3424，3112，2964，1610cm-1；1H-NMR(δppm，CDCl3)8.29(b s，1H)，7.41(d，2H，J＝8.6Hz)，7.10(d，1H，J＝5.0Hz)，7.07(d，1H，J＝3.1Hz)，7.02-6.98(m，2H)，6.92(d，2H，J＝8.6Hz)，6.58(s，1H)，3.82(s，3H)； 13C-NMR(δppm，CDCl3)158.6，139.2，133.0，127.4，125.3，121.8，121.2，120.4，114.9，114.4，103.5，71.9，70.5，59.0，55.3；C16H13NO3S的分析计算值：C，64.20；H，4.38；N，4.68。实测：C，64.11；H，4.35；N，4.70％。
5-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-3-(噻吩-2-基)-1H-吡咯-2-羧酸：收率，28％；m.p.180-181℃；IR 3408，3120，1610，1511cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)7.54(da，1H，J＝3.4Hz)，7.49(d，2H，J＝8.3Hz)，7.03(b s，2H)，7.00(d，2H，J＝8.2Hz)，3.81(s，3H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)13C-NMR(δppm，DMSO-d6)161.1，135.1，133.7，130.1，129.3，127.3，126.8，120.1，114.3，65.9，55.4，15.2；C16H12N2O5S的分析计算值：C，55.81；H，3.51；N，8.14。实测：C，56.09；H，3.49；N，8.14％。
实施例4
制备具有以下结构式的6-(3，5-二苯基-1H-吡咯-2-酰胺)己酸：
将DMF(7.5ml)中的3，5-二苯基-1H-吡咯-2-羧酸(0.39g，1.5mmol)和6-氨基己酸的甲基酯的氢氯酸盐(0.25g，1.5mmol)的溶液冷却至0℃。接连加入三乙胺(1.15ml，8.25mol)、1-羟基苯并三唑(0.22g，1.65mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺的氢氯酸盐(0.32g，1.65mmol)以及N-甲基吗啡啉(0.165ml，1.5mmol)，将该混合物在0℃下搅拌2h，并在环境温度下再搅拌96小时。然后加入乙酸乙酯(300ml)，用水(90ml)、1N Na2S2O3(90ml，水溶液)、水(90ml)、NaHCO3(90ml，饱和水溶液)以及NaCl(90ml，饱和水溶液)洗涤所得溶液，MgSO4干燥并减压蒸发，获得0.47g(1.2mmol)的酯。
将所得甲基酯溶解在乙二醇二甲醚中(6ml)并将该溶液冷却至0℃。接着，逐滴加入1N LiOH(3.6ml)并于0℃下搅拌所得混合物。通过薄层色谱法监测反应进程。一旦反应完成，加入3.6ml、10％柠檬酸的水溶液(pH≈6)。用二氯甲烷萃取该溶液(3×5ml)，用MgSO4干燥合并的有机组分，减压蒸发。在二乙醚中研磨粗制的反应产物，得到0.42g的白色固体。
收率，74％；m.p.228-229℃；IR 3427，3246，1608cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)13.05(s，1H)，8.73(s，1H)，7.99(d，2H，J＝7.7Hz)，7.52(d，2H，J＝7.5Hz)，7.36-7.29(m，4H)，7.21(dd，2H，J＝12.5Hz，J’＝7.0Hz)，6.65(s，1H)，3.21(dd，2H，J＝11.3Hz，J’＝5.6Hz)，2.05(t，2H，J＝6.6Hz)，1.54-1.44(m，4H)，1.36-1.30(m，2H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)177.5，160.8，136.1，132.7，131.8，129.0，128.5，128.3，127.6，126.5，125.9，124.6123.3，108.3，37.3，28.8，26.6，25.5；C23H24N2O3的分析计算值：C，73.38；H，6.43；N，7.44。实测：C，73.45；H，6.41；N，7.44％。
实施例5
制备具有以下结构式的6-(4-硝基-3，5-二苯基-1H-吡咯-2-酰胺)己酸：
使用与实施例4基本上相似的方法制备该物质，得到呈黄色固体的标题化合物。
收率，71％；m.p.153-154℃；IR 3417，3155，1638，1492cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)7.58(d，2H，J＝7.2Hz)，7.36(t，2H，J＝7.2Hz)，7.32-7.23(m，7H)，4.87(b s，2H)，3.07(dd，2H，J＝12.9Hz，J’＝6.6Hz)，2.09(t，2H，J＝7.3Hz)，1.46-1.40(m，2H)，1.35-1.29(m，2H)，1.18-1.12(m，2H)； 13C-NMR(δppm，DMSO-d6)176.0，161.9，136.8，134.4，133.4，131.8，130.1129.0，127.5，127.4，127.3，126.3，122.8，71.0，64.8，57.9，38.2，35.0，28.8，26.0，24.7，15.1；C23H23N3O5的分析计算值：C，65.55；H，5.50；N，9.97。实测：C，65.37；H，5.44；N，10.01％。
实施例6
制备具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基-3-苯基-5-(4-甲氧羰基)-1H-吡咯-2-酰胺：
在惰性气氛下，将在甲醇中的甲醇钠的等分试样(取自惰性气氛下，在3.3ml甲醇中的0.65g、12.0mmol甲醇钠的溶液)逐滴加入在甲醇(1.25ml)中的羟胺氢氯酸盐(0.26g，3.75mmol)和酚酞(1mg)的溶液中，直到在该溶液中观察到持久的粉红色。接连加入根据实施例4的方法由3-苯基-5-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-羧酸与6-氨基己酸的甲基酯的氢氯酸盐制备的6-(3-苯基-5-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-甲氧羰基)己酸甲酯(0.53g，1.25mmol)和甲醇中的甲醇钠(5.0mmol，1.4ml的预制溶液)。将该混合物搅拌26h，观察到形成的致密沉淀物。然后，将水(3ml)加入该反应混合物中。用冰醋酸对该溶液进行酸化并用二氯甲烷萃取(3×10ml)。用MgSO4干燥合并的有机组分并减压蒸发，得到0.46g呈白色固体的标题 产物。
收率，87％；m.p.157-158℃；IR 3407，3226，1663，1608cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)11.44(s，1H)，10.34(s，1H)，8.66(s，1H)，7.73(d，2H，J＝7.8Hz)，7.49(d，2H，J＝7.7Hz)，7.36(t，2H，J＝7.3Hz)，7.30(ta，1H，J＝5.1Hz)，7.26(t，2H，J＝7.3Hz)，6.97(d，2H，J＝7.9Hz)，6.56(s，1H)，3.78(s，3H)，3.16(dd，2H，J＝12.0Hz，J’＝5.9Hz)，1.93(t，2H，J＝7.2Hz)，1.51-1.45(m，2H)，1.43-1.38(m，2H)，1.24-1.17(m，2H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)168.9，160.9，158.2，135.7，132.8，128.7，127.9，127.3，126.2，125.9，124.3，122.7，114.0，107.1，55.1，32.1，28.7，26.0，24.8；C24H27N3O4的分析计算值：C，68.39；H，6.46；N，9.97。实测：C，68.25；H，6.42；N，9.98％。
实施例7
制备具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基-3-苯基-5-(4-甲氧苯基)-4-硝基-1H-吡咯-2-酰胺：
使用与实施例6基本上相似的方法制备该物质，得到呈黄色固体的标题化合物。
收率，84％；m.p.126-127℃；IR 3397，3185，1668，1628，1507，1356cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)12.59(b s，1H)，10.33(s，1H)，8.66(s，1H)，7.53(d，2H，J＝8.5Hz)，7.44-7.39(m，3H)，7.35(d，2H，J＝7.0Hz)，7.03(d，2H，J＝8.5Hz)，6.71(ta，1H，J＝4.4Hz)，3.82(s，3H)，3.03(dd，2H，J＝11.9Hz，J’＝6.0Hz)，1.88(t，2H，J＝7.3Hz)，1.40-1.34(m，2H)，1.24-1.18(m，2H)，1.03-0.96(m，2H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)168.9，159.9，159.4，133.3，132.0，131.1，130.9，129.9，128.0，127.6，123.3，121.4，121.1，113.5，55.2，32.0，28.4，25.7，24.7；C24H26N4O6的分析计算值：C，61.79；H，5.62；N，12.01。实测：C，61.71；H，5.59；N，12.04％。
为了使上述这些实施例中表达的内容更易于理解，产生前述实施例的化合物的不同合成阶段如下述方案1所示，
方案1
实施例8
制备具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基-3-(4-甲氧基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-2-酰胺：
使用与实施例6基本上相似的方法制备该物质，得到呈浅黄色固体的标题化合物。收率，80％；m.p.142℃；IR 3417，3256，1663，1613，1547，1306cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)12.59(b s，1H)，10.33(s，1H)，8.66(s，1H)，7.53(d，2H，J＝8.5Hz)，7.44-7.39(m，3H)，7.35(d，2H，J＝7.0Hz)，7.03(d，2H，J＝8.5Hz)，6.71(ta，1H，J＝4.4Hz)，3.82(s，3H)，3.03(dd，2H，J＝12.43Hz，J’＝6.35Hz)，1.94(t，2H，J＝7.3Hz)，1.54-1.45(m，2H)，1.45-1.37(m，2H)，1.28-1.16(m，2H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)169.0，161.0，158.0，132.6，131.6，129.9，128.6，127.8，127.2，126.6，124.5，123.1，113.4，108.1，55.0，32.2，28.8，26.1，24.9。C24H27N3O4的分析计算值：C，68.39；H，6.46；N9.97。实测：C，68.27；H，6.43；N，9.99％。
实施例9
制备具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基-3-(4-甲氧基苯基)-5-(4-甲氧苯基)-4-硝基-1H-吡咯-2-酰胺：
使用与实施例6基本上相似的方法制备该物质，得到呈浅黄色固体的标题化合物。收率，94％；m.p.155℃；IR 3397，3155，1638，1497，1356 cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)11.59(s，1H)，10.34(s，1H)，8.68(s，1H)，7.63-7.53(m，2H，)，7.52-7.41(m，3H)，7.29(d，2H，J＝8.5Hz)，6.99(d，2H，J＝8.5Hz)，6.72(ta，1H，J＝4.4Hz)，3.80(s，3H)，3.05(dd，2H，J＝12.02Hz，J’＝6.24Hz)，1.89(t，2H，J＝7.3Hz)，1.50-1.33(m，2H)，1.33-1.16(m，2H)，1.14-0.98(m，2H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)168.9，159.4，158.8，133.0，131.6，131.2，129.3，129.1，129.0，128.0，123.5，121.0，113.5，55.0，32.0，28.3，25.7，24.6。C24H26N4O6的分析计算值：C，61.79；H，5.62；N，12.01。实测：C，61.40；H，5.77；N，11.80％。
实施例10
制备具有以下结构式的4-(4-氨基丁基)-1-甲基氨基脲：
将甲醇(30ml)中的双碳酸二叔丁酯(10.9g，51mmol)的混合物逐滴加入到1，4-二氨基丁烷(11.12g，150mmol)在三乙胺(30ml，215mmol)和甲醇(300ml)中所形成的溶液。将所得混合物在环境温度下搅拌16h。然后，减压蒸发三乙胺和甲醇。将所得的油溶解在二氯甲烷(100ml)中并用10％碳酸钠洗涤(2×50ml，水溶液)。用MgSO4干燥有机相并减压蒸发。如此得到单保护的胺(7.8g，41.42mmol)。
在环境温度下，将碳酸氢钠(18.23g，63.72mmol)在水(438ml)中的溶液逐滴加入到所述单保护的胺(6g，31.86mmol)与三光气(3.48g，11.72mmol)在二氯甲烷(438ml)中所形成的溶液。将所得双相体系剧烈搅拌1.5h。然后，倾出有机相，用MgSO4干燥并减压蒸发。将所得油(4.3g，20mmol)溶解在甲醇(6.8ml)中并于0℃下缓慢地逐滴加入另一预制的甲肼(1.1ml，20.8mmol)和水(4.05ml)的溶液中。将该混合物于0℃下搅拌45分钟。然后过滤沉淀物并得到3.492g白色固体，其光谱特性鉴定为与4-(4-叔丁氧羰基氨基丁基)-1-甲基氨基脲一致。
将另一溶液，二氯甲烷(22ml)中的三氟乙酸(4.96ml，44mmol)，在0℃下经30分钟缓慢加入到前面所得到的沉淀物(0.500g，1.92mmol)在 二氯甲烷(27.5ml)中形成的溶液。将该混合物搅拌2小时。然后加入甲苯(50ml)并减压蒸发至原体积的1/2，该过程重复若干次。这样获得标题化合物的三氟乙酸铵盐(0.720g，2.63mmol)。
收率，68％；IR 3387，3115，1673cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)7.88(s，3H)，7.42-7.15(m，2H)，3.78-3.64(m，1H)，3.58(s，3H)，3.16-2.97(m，2H)，2.95-2.73(m，2H)，1.80-1.38(m，4H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)159.0，158.6，158.1，157.7，156.7，51.1，26.3，24.3。
实施例11
具有以下结构式的1-(4-(5-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-3-(噻吩-2-基)-1H-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-(2-甲基胺)脲：
将5-(4-甲氧基苯基)-4-硝基-3-(噻吩-2-基)-1H-吡咯-2-羧酸(0.434g，1.25mmol)与4-(4-氨基丁基)-1-甲基氨基脲的三氟乙酸铵盐(0.345g，1.25mmol)在DMF(6.25ml)中形成的溶液冷却至0℃。然后接连加入三乙胺(0.98ml，7.04mmol)、1-羟基苯并三唑(0.210g，1.37mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺氢氯酸盐(0.263g，1.37mmol)以及N-甲基吗啡啉(0.14ml，1.25mmol)。将所得混合物于0℃下搅拌2h，并在环境温度下再搅拌96小时。然后加入乙酸乙酯(250ml)，用水(80ml)、1N的Na2S2O3(80ml，水溶液)、水(80m1)、NaHCO3(80ml，饱和水溶液)及NaCl(80ml，饱和水溶液)洗涤所得溶液，用MgSO4干燥并减压蒸发，得到0.400g(0.82mmol)的标题化合物。
收率，65.6％；m.p.185-187℃；IR 3408，3161，1639，1511cm-1； 1H-NMR(δppm，CDCl3)：10.4(s，1H)，7.56(dd，1H，J＝5.5Hz，J’＝0.8)，7.54(d，2H，J＝8.7Hz)，7.20-7.15(m，3H)，6.98(d，2H，J＝8.7Hz)，5.74(t，1H，J＝5.2Hz)，4.66(s，1H)，3.86(s，4H)，3.67(s，3H)，3.13-3.04(m，4H)，1.31-1.24(m，4H)；13C-NMR(δppm，CDCl3)：160.7，159.6，157.0，134.6， 132.9，131.5，130.9，129.5，128.7，127.6，123.2，121.1，113.9，113.7，55.4，52.1，40.5，38.7，27.0，26.2。计算出的C22H26N6O5S的分子离子(molecularion)：m/z 486.14。实测：471.1(M+-Me)。
实施例12
制备具有以下结构式的1-(4-氨基丁基)-3-(苄氧基)脲：
以苄氧基胺代替甲肼，使用与实施例10基本上相似的方法制备该物质。在前述的加成-脱保护步骤之后，得到标题化合物相应的三氟乙酸铵盐。
收率，68％；IR 3759，3356，1648cm-1；1H-NMR(δppm，DMSO-d6)7.82(s，3H)，7.52-7.28(m，7H)，5.00(s，2H)，3.09-2.92(m，2H)，2.90-2.68(m，2H)，1.68-1.32(m，4H)；13C-NMR(δppm，DMSO-d6)159.6，158.2，157.7，136.4，128.5，128.1，127.8，77.2，38.0，26.6，24.3，24.0。计算的C13H20N3O2的分子离子：m/z 237.32。实测：238.0。
实施例13
制备具有以下结构式的1-(4-(3，5-双(3，5-二甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-(苄氧基)脲：
使用与实施例11基本上相似的方法，由3，5-双(3，5-二甲氧基苯基)-1H-吡咯羧酸和1-(4-氨基丁基)-3-(苄氧基)脲的三氟乙酸铵盐制备该 物质。
收率，81％；IR 3407，3216，1688，1597cm-1；1H-NMR(δppm，CDCl3)9.87(s，1H)，7.44-7.32(m，5H)，7.13(s，1H)，6.77(d，2H，J＝2.0Hz)，6.62(d，2H，J＝2.2Hz)，6.50(d，2H，J＝2.6Hz)，6.43(t，1H，J＝2.0Hz)，6.03(t，1H，J＝5.5Hz)，5.62(t，1H，J＝5.3Hz)，4.80(s，2H)，3.85(s，6H)，3.82(s，6H)，3.28(dd，2H，J＝11.9Hz，J’＝5.9Hz)，3.15(dd，2H，J＝12.7Hz，J’＝6.5Hz)，1.41-1.29(m，4H)；13C-NMR(δppm，CDCl3)161.2，160.0，137.6，135.4，134.1，133.2，130.8，129.2，128.8，128.7，127.7，122.2，110.0，107.4，103.0，100.0，99.8，78.6，72.3，10.1，68.1，55.4，39.1，38.8，27.1，26.6。计算的C33H38N4O7的分子离子：m/z 602.68。实测：603.2。
实施例14
制备具有以下结构式的1-(4-(3，5-双(3，5-二甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-羟基脲：
制备1-(4-(3，5-双(3，5-二甲氧基苯基)-1H-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-(苄氧基)脲(0.200g，0.33mmol)在乙酸乙酯(66ml)与乙醇(16.5ml)中形成的溶液，向其中加入10％的Pd-C(0.116g，0.11mmol)催化剂。将该混合物在环境温度、氢气流下搅拌5小时。然后用硅藻土过滤所得悬浮液并减压蒸发滤液。这样获得无色油状的标题化合物。
收率，71％；IR 3416，3244，2948，1598cm-1；1H-NMR(δppm CDCl3)10.3(s，1H)，6.78(s，2H)，6.60(d，2H，J＝1.7Hz)，6.53-6.44(m，2H)，6.39(s，1H)，6.17-6.02(m，1H)，4.81(s，1H)，3.86-3.78(m，13H)，3.34-3.16(m，4H)，1.48-1.33(m，4H)；13C-NMR(δppm，CDCl3)161.2，137.6，134.6，134.5，133.3，128.3，128.2，122.1，122.0，109.7，107.5，103.3，99.9，99.6，55.6，55.5， 39.0，38.9，38.7，27.2，27.0，26.8。计算的C26H32N4O7的分子离子：m/z512.55。实测：513.2(M+)，497.1(M+-OH)。
为了使上述这些实施例中表达的内容更易于理解，在以下方案2中显示了产生实施例10、11、12、13和14中提及的化合物的不同合成阶段，
方案2
方案3.其抑制作用如图1、2、3、4、5、6和7所示的化合物的分子式。
实施例15
组蛋白脱乙酰基酶活性的抑制能力的体外测试
为了更好地说明本实施例和下一实施例所遵循的方法，给出方案3中所示的化合物(其中包括手性吡咯烷的衍生物)所得的结果，目的是比较该环状体系的活性与本发明的吡咯的活性。
为了测定合成化合物的组蛋白脱乙酰基酶的抑制能力，通过以不同浓度的合成化合物孵育细胞系HCT116与MOLT4的细胞核提取物以及氚标记的乙酰化的组蛋白，然后使用闪烁计数器测量释放出的乙酰基团的浓度来进行体外研究。
细胞核提取物的制备
将悬浮液中的细胞(8×106)以800rpm离心分离5分钟，用PBS洗涤并重新悬浮在2ml的缓冲液A(10mM Tris pH 7.5、15mM KCl、2mMMgCl2、0.1mM EDTA、2mM 2-巯基乙醇、每50ml缓冲液中1片不含 EDTA的蛋白酶抑制剂)中。加入135μl缓冲液B(50mM Tris、1M KCl、30mM MgCl2、0.1mM EDTA、2mM 2-巯基乙醇)，然后将其在4℃下以2.7×103rpm离心分离5分钟并除去上清液。该粒状沉淀物在2ml缓冲液A中重新悬浮并在2ml的匀化器中搅拌5次。在4℃下以7.8×103rpm再次离心分离8分钟，该粒状沉淀物在2ml缓冲液A中重新悬浮并在匀化器中搅拌5次。在其中加入200μl硫酸铵然后在4℃、回转式混合机中混合30分钟。在4℃下以12×103rpm将其离心分离10分钟，然后将上清液在4℃、200ml缓冲液C(20mM Tris pH 7.5、10％甘油、1mMEDTA、1mM 2-巯基乙醇、1.5mM MgCl2、每50ml缓冲液中1片不含EDTA的蛋白酶抑制剂)中的MWCO 3500膜中渗析2h。然后回收膜中的内容物并将其用于以下描述的研究中。
化合物抑制活性的体外测试
将55μl缓冲液C(同上)、5μl相应的抑制剂溶液和10μl氚标记的高度乙酰化的组蛋白加入使用所示方法得到的30μl细胞核提取物中，然后将所得混合物在37℃下孵育1h。
通过加入37.5μl的盐酸(最终浓度，1M)与乙酸(最终浓度，0.4M)的溶液而使孵育停止。将700μl的乙酸乙酯加入所得混合物中，以10,000rpm离心分离5分钟，最后，上层相(包含释放的含氚的乙酸)用于闪烁计数。通过将500μl的上层相与5ml的闪烁液混合来制备闪烁计数的样本。
根据上述方法获得的最具代表性的数据如图1和图2所示。图1中的结果对应于细胞系HCT116而图2的结果对应于细胞系MOLT4。
实施例16
组蛋白的总闪烁的测量
使用下述方法量化H3组蛋白和H4组蛋白乙酰化程度。
用不同浓度的本发明的HDAC抑制化合物对Jurkat人细胞系(早幼粒细胞白血病)处理24h。然后，通过将含有1％乙基苯基聚乙二醇(Nonidet-P40)和蛋白酶抑制剂的RSB缓冲液(Tris 10mM pH 7.5，10mM氯化钠以及3mM氯化镁)加入所述细胞来分离细胞核。将0.25M盐酸加 入细胞核并将该混合物在4℃下搅拌16h以提取组蛋白。接着，通过加入8倍体积的丙酮使组蛋白沉淀。使用反相高效液相色谱(HPLC)、用0.3％三氟乙酸中的具有乙腈梯度(20％至60％)的C18柱分离所得组蛋白混合物。
使用高效毛细管电泳法(HPCE)并使用石英毛细管(60.2cm×75μm，有效长度50cm)分离非乙酰化、单乙酰化、二乙酰化、三乙酰化和四乙酰化的H3组蛋白和H4组蛋白部分。使用的洗脱条件为：25℃，电压为12kV，在214nm处吸光检测，以及110mM磷酸盐(pH 2.0)与HPM纤维素(0.03％重量/体积)的洗脱缓冲液。
每一次注射前，用0.1M NaOH洗涤体系3分钟，接着用0.5M H2SO4 再洗涤2分钟，然后用洗脱缓冲液平衡3分钟。使用经0.45μm孔径过滤的超纯水(Milli-Q water)来制备洗涤缓冲液和溶液。在0.3psi的压力下、3秒钟内注射该样本。全部样本均被分析两次。
本发明的不同分子获得的某些具有代表性的数据如图3所示。
实施例17
诱导细胞凋亡测试
通过使用商用的 
试剂盒作为染色剂，使用流式细胞分析研究细胞质膜的渗透率变化来量化凋亡细胞数量。所遵循的方法在以下进行说明。用不同浓度的本发明的HDAC抑制剂化合物对人细胞系HCT116和HL60(每次处理106个细胞)的细胞处理24h。然后用冷PBS 1X对该细胞洗涤两次，使其在1ml PBS 1X中重新悬浮并加入1μl 
和1μl碘化丙啶。在冰中使该混合物避光孵育30分钟。使用流式细胞仪测量凋亡细胞的量。
最具代表性的数据如图4和图5所示。有关人结肠癌HCT116模型的数据在图4中表示。有关人急性髓性白血病HL60模型的数据在图5中表示。
实施例18
体内生物活性测试
为了观察就体内肿瘤生长所描述的某些化合物的效果，使用6周大的雌性无胸腺的裸鼠(Harlam Sprague Dawley，Indianapolis，IN，USA)进行研究。对于该研究，将2×106HCT116细胞系(人结肠癌)的细胞与107 MOLT4细胞(人T细胞急性淋巴母细胞白血病)以在PBS中重新悬浮的最终接种体积为200μl/动物的形式进行皮下接种。当肿瘤的平均体积达到100mm3时，通过腹膜内注射对每个小鼠给予日剂量为20μM的相应分子溶液(10mg/kg重量)，200μl。给予小鼠的对照组200μl的PBS以模拟接种的压力。每隔24h对小鼠称重，并使用校准的毫米测量设备测量肿瘤体积，假定肿瘤为几何学球体(体积＝d3×π/6)。当肿瘤的体积达到1cm3 至1.5cm3(人道主义伦理人类极限)时，将小鼠处死并将肿瘤取出并称重。
最具代表性的数据如图7和图8所示。有关人结肠癌HCT116模型的数据如图7所示。有关人纤维型白血病MOLT4模型的数据如图8所示。
Claims (5)
1.通式I的吡咯衍生物，
其中：
R1和R3独立表示苯基自由基或对甲氧基苯基；
R2表示氢原子或硝基基团；
R4表示氢原子；
n表示4；
X表示仲胺基团；
Y表示亚甲基；
Z表示氧；以及
W表示羟基氨基。
2.如权利要求1所述的通式I的吡咯衍生物，其选自：
[1]具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基)-5-苯基-3-(4-甲氧苯基)-1H-吡咯-2-酰胺：
[2]具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基)-3-苯基-5-(4-甲氧苯基)-1H-吡咯-2-酰胺：
[3]具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基)-3-苯基-5-(4-甲氧苯基)-4-硝基-1H-吡咯-2-酰胺：
[4]具有以下结构式的N-(5-(羟基氨基甲酰基)戊基)-3，5-二苯基-4-硝基-1H-吡咯-2-酰胺：
3.通式(Ib)的化合物的制备方法：
其中R1、R2、R3、R4、X和n具有如权利要求1给出的含义，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应：
a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，
b)通式III的化合物，
其中R5是-COOMe，
c)活化所述羧基基团的试剂，以及
d)叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
以及在甲醇中过量甲醇钠的存在下，将所得产物加入盐酸羟胺与酚酞的混合物中。
4.权利要求1或2所述的吡咯衍生物在生产用于治疗癌症的药物中的用途。
5.药物组合物，其包含权利要求1或2所述的化合物与至少一药物可接受的赋形剂。
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