CN101342173A - 洛贝林在制备治疗神经元凋亡疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供洛贝林作为制备治疗神经元凋亡疾病药物中的应用，还涉及洛贝林在制备治疗中枢神经系统退行性疾病药物中的应用。洛贝林可通过抑制多巴胺转运蛋白的转运功能而上调突触间歇多巴胺的浓度，能够阻止或减缓神经细胞凋亡速度，而且副作用小。本发明首次提出并证明了洛贝林保护多巴胺能神经元，为临床上治疗中枢神经系统退行性疾病提供了新的药物。

Description

洛贝林在制备治疗神经元凋亡疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及洛贝林在制备治疗神经元凋亡疾病的药物中的应用。

背景技术

神经元也叫神经细胞，是构成神经系统结构的基本单位。神经元是具有长突起的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。细胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中。神经元与体内的其他细胞迥然不同：成熟的神经元既不会移动，也不会聚在一起和发生正常的分裂。如果一个成熟的神经元死后，(除极少外)它不会由新的神经元代替。

神经系统是机体内起主导作用的系统。内、外环境的各种信息，由感受器接受后，通过周围神经传递到脑和脊髓的各级中枢进行整合，再经周围神经控制和调节机体各系统器官的活动，以维持机体与内、外界环境的相对平衡。神经系统是由神经细胞(神经元)和神经胶质所组成。脊椎动物的神经系统分为中枢神经系统和外周神经系统两大部分。

中枢神经系统退行性疾病对全球人口存在越来越大的威胁，世界卫生组织预测，到2040年中枢神经退行性疾病将超过癌症成为人类的第二大死因。2002年，中枢神经系统退行性疾病导致的全球人口死亡总数是50万人。该病主要发生在老年人，但也有一些早发病例。同时，随着人们生活水平的提高，人类生存寿命逐渐延长，从而使中枢神经系统退行性疾病的高危人群数量进一步增加。目前，随着社会的进步、老年人口的比例和数量不断增加，这类疾病已经成为影响人类健康水平和生活质量的重大社会问题。

中枢神经系统退行性疾病是可表现为多种临床症状和结果的一类疾病的总称。中枢神经系统退行性疾病大多呈进行性发展，是一类病因学和发病机制尚不清楚的疾病。它的发病机制是通过具有特定功能的神经核团发生萎缩和神经元死亡，从而引起脑损害或躯体功能障碍。

目前已发现的中枢神经系统退行性疾病：阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(parkinson’s disease，PD)、亨廷顿病(Huntington disease，HD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、Lewy体痴呆(dementia withlewy body，DL B)、多发梗死灶性痴呆(multi-infarct dementi2 a，MID)、Pick小体病(Pick body disease)、大脑前叶退行性变(frontal lobe degeneration，FLD)、皮层基底节退行性变(corticobasal degeneration，CBD)、多系统萎缩症(multiple systematrophy，MSA)、渐进性上运动核瘫痪(progressive supranuclear palsy，PSP)、新变异型Creutzfeldt-Jakob病(new variant Creutzfeldt-Jakob disease，nvCJD)等，目前临床上对于这类疾病尚无有效控制病程进展的措施，患者最终将丧失生活能力甚至死亡。

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)AD的发病率在多种退行性疾病中位居首位，是一种渐进性的神经系统退行性疾病，为老年性痴呆中最常见的病因。临床表现为：进行性认知功能下降，记忆和日常生活能力的丧失；晚期患者甚至不能识别家庭成员。病变最易累及的区域是与高级认知功能相关的脑区，特别是新皮层和海马。脑组织病理检查可见到相关脑区(基底前脑、海马和新皮层等)内神经突触和锥体神经元消失等。(De Strooper B，.J Cell Sci，2000，113：1857-1870；Zhang X.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord，2004，3：137-152；MuirJL.Pharmacol Biochem Behav，1997，56：687-696.)。

目前临床上，AD患者经常被给予一些辅助用药，如失禁药物，抗抑郁药或镇静药来控制某些特殊的症状，但一般有两种药物被用来控制AD的进展：胆碱脂酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂。目前尚无能够阻断AD进展的疫苗，疗法或药物。

帕金森病(parkinson’s disease，PD)是以中脑黑质中多巴胺能神经元为主受到损伤的老年性退行性神经系统疾病，呈进行性发展。临床早期以锥体外系运动受损为主：运动迟缓、静止性震颤、肌强直及姿势反射障碍为临床特征，随着疾病进展，可出现认知障碍，包括痴呆、抑郁和焦虑等症状，其中对于帕金森病伴随有痴呆的病人能够占到30-60％不等，甚至有调查显示可达到93％的病人有痴呆表现；多巴胺替代治疗有效；临床发病年龄一般在60岁左右，早到40岁就可出现症状，在55岁以上有1％的罹患该病，66岁以上可达2％以上。

PD病因尚不清楚，发病机理复杂；病理特征为选择性黑质多巴胺能神经元变性丢失、残余多巴胺能神经元出现嗜酸性包涵体(lewy小体)，导致黑质纹状体系统多巴胺递质减少的生化改变。对于多巴胺能神经元选择性丢失的认识，以氧化应激反应、线粒体功能缺陷和细胞凋亡机制为基础的解释得到了大家的认可，在此认识基础上的药物治疗包括：

1)多巴胺替代治疗，如左旋多巴；

2)多巴胺受体激动剂，如溴隐亭、麦角乙脲等；

3)抗胆碱能制剂，如本海索；

4)多巴胺释放促进剂，如金刚烷胺；

4)单胺氧化酶抑制剂，如丙炔苯丙胺等；

5)儿茶酚胺氧位甲基转移酶抑制剂，如硝替卡明；

6)其它，如谷氨酸拮抗剂、抗组胺药、心得胺等。

此外，阿朴吗啡、卡麦角林、罗皮尼罗、普拉克索也有报道用于PD治疗。由于现有药物主要以改善症状为目的，难以达到阻止或减少用药过程中多巴胺能神经元继续丢失，不能有效改变病程进展，甚至有加速多巴胺能神经细胞丢失的毒副作用，如左旋多巴。

因此，开发出效果显著且副作用小的治疗相关中枢神经系统退行性疾病的新型药物是保障人们健康的迫切需要。

洛贝林(lobeline)C22H27NO2，又称为祛痰碱、山梗菜碱、祛痰菜碱、北美山梗菜碱，为桔梗科植物山梗菜(Lobelia inflate L.)中提取的半边莲生物碱中的一种，在20多种的生物碱中，是最主要的生物碱。为白色或微黄色结晶粉末，无臭、无味。熔点62～64℃，微溶于水，溶于乙醇，遇光和热易分解。

式I

洛贝林，为2，6-二取代哌啶中的一种，为神经系统药物，中枢兴奋药。可刺激颈动脉窦和主动脉体化学感受器(均为N₁受体)，反射性地兴奋呼吸中枢而使呼吸加快，但对呼吸中枢并无直接兴奋作用。对迷走神经中枢和血管运动中枢也同时有反射性的兴奋作用；对植物神经节先兴奋而后阻断。临床主要用于新生儿窒息、一氧化碳中毒引起的窒息、吸入麻醉药及其它中枢抑制剂(如阿片、巴比妥类)的中毒，以及肺炎、白喉等传染病引起的呼吸衰竭，但尚未有报道洛贝林用于治疗中枢神经系统(CNS)的退行性疾病。

洛贝林现已化学合成，如盐酸洛贝林由2，6-二甲基吡啶经苯甲醛缩合、溴化、消除、甲基化、加成得1-甲基-2，6-二苯乙酮吡啶甲基硫酸盐与盐酸成盐制得。如美国专利US2006014791，公布了一种方法更为简便的合成洛贝林的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供洛贝林的新用途，即在制药中的新应用。

具体的说，本发明涉及洛贝林作为制备治疗神经元凋亡疾病药物中的应用，特别涉及洛贝林作为制备治疗中枢神经系统退行性疾病药物中的应用。

上述应用所涉及的中枢神经系统退行性疾病，包含但不限于，阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)、帕金森病(parkinson’s disease，PD)、亨廷顿病(Huntington disease，HD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、Lewy体痴呆(dementia with lewy body，DLB)、多发梗死灶性痴呆(multi-infarct dementi2a，MID)、Pick小体病(Pick body disease)、大脑前叶退行性变(frontal lobe degeneration，FLD)、皮层基底节退行性变(corticobasal degeneration，CBD)、多系统萎缩症(multiple systematrophy，MSA)、渐进性上运动核瘫痪(progressive supranuclear palsy，PSP)、新变异型Creutzfeldt-Jakob病(new variant Creutzfeldt-Jakob diseas，nvCJD)。

优选地，本发明涉及洛贝林作为制备治疗帕金森病(parkinson’s disease，PD)药物中的应用。

本发明涉及的洛贝林，包含但不限于消旋洛贝林、左旋洛贝林。

本发明涉及的洛贝林，包含化学式I及药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式，包括但不限于与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；以及与有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸；其它的盐包括与碱金属或碱土金属，如钠、钾、钙或镁形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。

本发明涉及的洛贝林作为制备治疗中枢神经系统退行性疾病药物中的应用，还可以用来制备治疗中枢神经系统退行性疾病的药物组合物。

所述的药物组合物含有洛贝林或其衍生物5-10重量份；药学上可接受的载体80-150重量份；其中，洛贝林的总含量为药物总重量的优选为0.1-20wt％。

另一方面，根据不同的需要，本发明涉及的含洛贝林的药物或药物组合物还可与其它疗中枢神经系统退行性疾病的药物联合应用，来治疗中枢神经系统退行性疾病。

本发明涉及的洛贝林，包含用生化方法从各种植物中提取，人工合成的方法取得，采用基因工程的方法制取而成。

除了作为活性成份的洛贝林，所述的药物还可含有药学上可接受的载体，包括但不限于填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓/控释剂等。根据不同的给药方式，所述的组合物可以制备成固体或凝胶等形式，如丸剂、片剂、胶囊等；或者是液体形式，如注射剂、悬浮液。它们适合口服给药、直肠给药、局部给药或肠胃外给药、或者静脉内给药等。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将所述的洛贝林传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

本发明的经口给药的固体组合物可采用片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、滴剂等形式。这些固体组合物中混合了1种或1种以上的活性物质和至少1种惰性稀释剂，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、果胶、硅铝酸镁、铝酸镁。还可按照常用方法使组合物中含有除了惰性稀释剂之外的添加剂，例如，硬脂酸镁等润滑剂、纤维素乙醇酸钙等崩解剂、乳糖等稳定剂、谷氨酸或天一氨酸等助溶剂。如是片剂或丸剂，还可根据需要，在其外部包裹上蔗糖、明胶、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸酯等糖衣或胃溶性、肠溶性薄膜。

经口给药的液体组合物包括药剂上允许的乳浊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等，通常使用的惰性稀释剂包括精制水、乙醇。该组合物中除了惰性稀释剂之外，还可包含湿润剂、悬浮剂等助剂，甜味剂、矫味剂、芳香剂和防腐剂。

非经口给药的注射剂包括无菌水性或非水性溶液剂、悬浮剂和乳浊剂。还可以各种注射药物递送剂型，包括但不限于，注射用微球，静脉注射用脂质体等各种给药递送系统。水性溶液剂和悬浮剂中包含注射剂用蒸馏水及生理盐水。非水溶性溶液剂和悬浮剂中包含两二醇，聚乙二醇，可可脂、橄揽油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇类，阿拉伯胶、吐温80等。这些组合物中还可包含等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如，乳糖)、助溶剂(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用过滤除菌上述组合物，再配合使用灭菌剂就可达到无菌的目的。然后，利用上述组合物制得无菌的固体组合物，在使用前用水或无菌注射用溶剂溶解就可加以利用。

可用于配制本发明口服剂型的、具体的药学上可接受的载体和赋形剂例子，在美国专利No 3,903,297(1975年9月2日授予Robert)中有描述。用于制造本发明的有用剂型的技术和组合物，在下列文献中有描述：7种现代制剂(7Modern Pharmaceutics)第9和10章(Banker&Rhodes编辑，1979)：Lieberman等人，药物剂型：片剂(Pharmaceutical DosageForms：Tablets)(1981)；和Ansel，药物剂型导论(Introduction to Pharmaceutical DosageForms)2版(1976)。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

本发明人经过深入研究认为，选择有效药物能够减轻PD病人的综合征，并且能够阻止或减缓多巴胺能神经元凋亡速度，对于改变PD疾病病程发展以及阻止症状恶化具有重要的现实应用价值，是帕金森病药物治疗的最佳选择。

本发明的体内研究结果显示，在MPTP诱导的动物模型行为学实验中洛贝林可以有效地改善动物的运动障碍，且该改善作用与L-Dopa治疗组的改善作用相比更为显著。此外，病理检测中发现洛贝林治疗组可以有效地减少中脑黑质多巴胺能神经细胞丢失，相比L-Dopa治疗组在神经细胞的存活数量上具有更可喜的疗效。

这些结果表明，无论是体外还是体内，洛贝林可以有效地改善PD的运动障碍，并且可以有效地阻止多巴胺能神经细胞丢失。因此，洛贝林可以安全有效地治疗PD患者的锥体外系运动功能障碍。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

附图说明

图1洛贝林对表达有大鼠多巴胺转运蛋白(DAT)的CHO细胞(D8细胞)摄取多巴胺的影响。

图2洛贝林抑制大鼠纹状体突触体对多巴胺的摄取。

图3洛贝林对DAT的反向转运能力的影响。

图4MTT实验显示不同浓度的洛贝林对MPP+诱导的D8细胞的保护作用。

图5滚筒实验评价结果。*表示与成模后生理盐水治疗对照组相比较p＜0.05，#表示与成模后左旋多巴治疗组相比较p＜0.05。其中Control示生理盐水处理组(n＝10)；Saline示MPTP成模+生理盐水治疗组(n＝10)；L-DA示MPTP成模+左旋多巴(80mg/kg)治疗组(n＝10)；lobeline示MPTP成模+洛贝林不同剂量治疗组(n＝10)；GBR12935示MPTP成模+GBR12，935(10mg/kg)治疗组(n＝10)(two-way AVONA)。

图6游泳实验评价结果。*表示与成模后生理盐水治疗对照组相比较p＜0.05，#表示与成模后左旋多巴治疗组相比较p＜0.05。(two-way AVONA)。

图7黑质TH免疫组化染色的定量分析。*表示与成模后生理盐水治疗对照组相比较p＜0.05，#表示与生理盐水组相比较p＜0.05。

图8纹状体TH免疫组化染色的定量分析。*表示与成模后生理盐水治疗对照组相比较p＜0.05，#表示与生理盐水组相比较p＜0.05。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的功效和方法，现用具体的实施方式来加以说明。应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料

以下实验所用主要药品来源：洛贝林注射液购自上海禾丰制药有限公司；氚标记的多巴胺购自Amersham Pharmacia Biotech公司；TH抗体购自Vector Laboratories公司；GBR12935购自Sigma公司；实验用SD大鼠、C57BL/6J小鼠购自上海实验动物中心。

实施例一  洛贝林对D8细胞摄取多巴胺的影响

1、体外筛选模型的建立

建立以多巴胺神经转运蛋白(DAT)为靶标的活性筛选细胞系的建立。通过将大鼠的DAT全长编码序列(GeneBank登录号：GI31000978)克隆于pCDNA3载体(美国invitrogen公司)的多克隆位点中，用电穿孔方法转染导入中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，48小时后用含G418的1640培养基培养。10天后对照组细胞全部死亡，而实验组形成许多细胞克隆。挑取克隆培养一周后，待细胞铺满孔底，吸去培养基，同上用胰酶消化。每孔中的细胞分别接种于两块96孔平板的相应的孔中。待细胞长满后，其中一块板用于同位素流量测定。将对应的另一块板中转运活性高的孔中的细胞逐级扩大培养，每一级都进行同位素流量测定后选取转运活力较高细胞株培养，最后选取转运活力最高的细胞克隆(分别命名为D8)保种。

2、多巴胺转运蛋白激动剂体外筛选及选择专一性的测定

培养D8细胞于48孔板(Costar)至平板铺满(大约每孔6万细胞)。弃培液。用PBS洗涤一次，吸去PBS溶液，每孔加入90ul HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，PH8.0)，25℃温育10分钟，每孔加入10ul HBS反应液。实验组及阳性对照药加入80ul HBS，10ul不同浓度的药物，及10ul ³H-DA(Amersham Pharmacia Biotech)，100μM维生素C和100μM帕吉林。25℃温育20分钟，用冰浴的PBS溶液洗涤三遍，用裂解液裂解60分钟，吸取各孔的裂解液加入到1.2ml的闪烁液中，放入液闪计数仪(Beckman LS 5000TA)中检测同位素的含量(DMP值)，以此来衡量药物对多巴胺转运蛋白的转运活性的影响。

结果：D8细胞有强烈的氚标记的多巴胺摄取，而CHO细胞则只有少量的摄取，说明本实验选用的细胞适合观察DAT介导的多巴胺摄取。洛贝林同样显示出浓度依赖地抑制DAT介导的多巴胺摄取，其IC50＝1±0.2μM，并且这种抑制显示出时间的依赖性(图1)。

实施例二  洛贝林抑制大鼠纹状体突触体对多巴胺的摄取

突触体制备：取成年雄性SD大鼠，脱颈处死并分离出纹状体，用冰冷的0.32M蔗糖(溶解在1M的磷酸盐缓冲液中)冲洗干净。4℃下在该溶液中用玻璃匀浆器匀浆10-12下，匀浆液在1100g，4℃离心10分钟，取上清在10,000g下4℃离心20分钟。沉淀重悬于人工脑脊液(103mM NaCl，1mM CaCl2，1mM KH2PO4，25mM HEPES，1mM MgCl2，27mM NaHCO3，5.4mM glucose，pH7.4，1mM ascorbic acid，0.01mM pargyline)中备用。

用突触体进行实验时，不同浓度的盐酸洛贝林及其他化合物先与等量的突触体混合5分钟后加入终浓度0.1μM氚标记的多巴胺，在37℃放置10分钟后通过用Whatman玻璃纤维滤纸过滤方法中止。滤纸上吸附有突触体，被放入预先装有1.5ml的闪烁液的管子中，在液闪计数仪计数。

结果：大鼠纹状体突触体也有强烈的氚标记的多巴胺摄取，该摄取同样能够被洛贝林浓度依赖地抑制，其IC50＝1±0.12μM(图2)。

实施例三  洛贝林对DAT的反向转运能力的影响

培养D8细胞于48孔板(Costar)至平板铺满(大约每孔6万细胞)。弃培液，用PBS洗涤一次，吸去PBS溶液，每孔加入90ul HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，PH8.0)，10ul³H-DA(Amersham Pharmacia Biotech)，100μM维生素C和100μM帕吉林，25℃温育10分钟；用PBS洗涤3次，每孔加入90ul HBS，10ul不同浓度的药物，25℃温育20分钟，吸取各孔的上清液加入到1.2ml的闪烁液中，放入液闪计数仪(Beckman LS 5000TA)中检测同位素的含量(DMP值)，以此来衡量药物对多巴胺转运蛋白的转运活性的影响。

结果：在所用的能够抑制DAT介导的多巴胺摄取功能的剂量下，洛贝林并没有对DAT介导的多巴胺的反向转运产生明显的影响(图3)。

实施例四  洛贝林对MPP+诱导的D8细胞的保护作用

D8细胞稀释到合适的浓度200μl体积接种到96孔板中。培养24小时后进行诱导处理。诱导完成后更换培养基，再在培养液中加入20μl(5mg/ml)的MTT，37℃继续培养4小时，去培养基，加二甲基亚砜150μl，振荡溶解15分钟，酶标仪590nm处测O.D.值，每组最少重复3次，取平均值。

结果：MPP+诱导后细胞大量死亡，并且出现明显的凋亡特征；这种细胞活性的减少与MPP+的浓度有线性关系；洛贝林不同浓度用药后细胞活性与诱导后不治疗组相比，细胞活性有明显的提高，与洛贝林的浓度有线性关系(图4)。因此，在体外实验中洛贝林可以浓度依赖地抑制多巴胺能神经毒所致的细胞死亡。

实施例四  行为学实验

滚筒实验：滚筒由两部分组成，一部分为控制器械，保证0-80cpm，另一部分为直径为7.2cm的滚动轴，分为5个单位，能够使5只小鼠可以同时受到检测。用药前首先在滚筒上训练小鼠3-5次；用药后第7，9和11天，检测小鼠在滚筒上的时间/20cpm，取平均值。

游泳实验：受试小鼠放入一个20×30×25cm规格的水箱中，水温为22℃-25℃。评分标准：受试时间内连续不断游泳者记3分；大部分时间游泳偶尔漂浮者记2.5分；飘浮时间占整个受试时间50％以上者记2分；偶尔游泳者记1.5分；偶尔用后肢游动并漂浮在一边者记1分。游泳实验计时5分钟。由于实验容易导致小鼠发展为抑郁症状，为了保证各个行为学实验的相互独立性，游泳实验在其它实验结束后进行。

结果：滚筒实验显示左旋多巴(80mg/kg)、洛贝林3mg/kg、GBR12，935 10mg/kg治疗有效；而且与左旋多巴(80mg/kg)治疗组相比，洛贝林3mg/kg、GBR12，935 10mg/kg治疗组效果更显著(图5)。

游泳实验结果显示显示左旋多巴(80mg/kg)、洛贝林3mg/kg、GBR12，93510mg/kg治疗有效；同样，与左旋多巴(80mg/kg)治疗组相比，洛贝林3mg/kg、GBR12，93510mg/kg治疗组效果更显著(图6)。

实施例五  TH免疫组化染色的定量分析

免疫组化、细胞计数检测：实验结束后，每组取三只小鼠，经10％水合氯醛麻醉后用4％多聚甲醛灌注，取脑组织后在4％多聚甲醛固定24小时，随后在25％蔗糖溶液中浸泡48小时，行连续冰冻切片(20μm)；TH免疫组化按试剂盒说明书操作(漂浮法)，最后DAB染色，显微镜下观察。取5个不同中脑视野(不包括VTA区计数TH阳性细胞)用Quantimet color500(Leica公司)计数黑质区以及纹状体的TH阳性细胞数。

结果：中脑黑质多巴胺能细胞呈阳性结果，胞质呈棕黄色着色(图11，12)。正常小鼠中脑黑质TH阳性细胞密集、均匀，相应纹状体染色密度深；MPTP成模+生理盐水组，中脑黑质TH阳性细胞数显著减少，而VTA区细胞较少受到损伤，纹状体区TH染色密度也显著降低；MPTP成模+左旋多巴(80mg/kg)组中脑黑质部TH细胞数量降低更多，纹状体TH染色更浅；MPTP成模+洛贝林(1mg/kg)组中脑黑质TH阳性细胞数也显著降低，与左旋多巴(80mg/kg)组相比为多，纹状体TH染色也比对照组更浅，但是与左旋多巴(80mg/kg)组相比显著为深；MPTP成模+洛贝林(3mg/kg)组中脑黑质TH阳性细胞数也显著降低，与左旋多巴(80mg/kg)组相比显著为多，纹状体TH染色也比对照组更浅，但是与左旋多巴(80mg/kg)组相比显著为深；MPTP成模+GBR12，935(10mg/kg)组中脑黑质TH阳性细胞数也显著降低，与左旋多巴(80mg/kg)组相比为多，纹状体TH染色也比对照组更浅，但是与左旋多巴(80mg/kg)组相比显著为深(图7、8)。

实施例六  洛贝林片剂的制备

取100g洛贝林、560g微晶纤维素、380g无水乳糖、200g硬脂酸镁、30g氧化硅，取上述配方中除硬脂酸镁外所有成分混合25-30分钟，再筛入硬脂酸镁，继续混匀，然后冲压成片。

Claims (22)

1、洛贝林作为制备治疗神经元凋亡疾病药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所涉及的洛贝林，包含但不限于消旋洛贝林、左旋洛贝林中的一种。

3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所涉及的洛贝林，包含洛贝林及药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的酸衍生的盐形式包括但不限于与无机酸形成的盐以及与有机酸形成的盐。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无机酸为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸中的一种，所述有机酸为乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸中的一种。

6、根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的碱衍生的盐形式包括但不限于与碱金属或碱土金属衍生的盐形式。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的碱金属为钠、钾中的一种；所述的碱土金属为钙或镁中的一种。

8、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，涉及的洛贝林作为用来制备治疗神经元凋亡疾病药物的组合物。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物含有洛贝林或其衍生物：5-10重量份；药学上可接受的载体：80-150重量份；其中，洛贝林的总含量为药物总重量的0.1-20％。

10、根据权利要求1或9所述的应用，其特征在于，所述的药物或药物组合物的剂型是片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒剂、乳液、糖浆、丸剂或注射液。

11、洛贝林在制备治疗中枢神经系统退行性疾病药物中的应用。

12、根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所涉及的中枢神经系统退行性疾病，包含但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、Lewy体痴呆、多发梗死灶性痴呆、Pick小体病、大脑前叶退行性变、皮层基底节退行性变、多系统萎缩症、渐进性上运动核瘫痪、新变异型Creutzfeldt-Jakob病。

13、根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所涉及的中枢神经系统退行性疾病为帕金森病。

14、根据权利要求12或13所述的应用，其特征在于，所涉及的洛贝林，包含但不限于消旋洛贝林、左旋洛贝林中的一种。

15、根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所涉及的洛贝林，包含洛贝林及药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

16、根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述的酸衍生的盐形式包括但不限于与无机酸形成的盐以及与有机酸形成的盐。

17、根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述无机酸为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸中的一种，所述有机酸为乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸中的一种。

18、根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述的碱衍生的盐形式包括但不限于与碱金属或碱土金属衍生的盐形式。

19、根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的碱金属为钠、钾中的一种，所述的碱土金属为钙或镁中的一种。

20、根据权利要求11所述的应用，其特征在于，涉及的洛贝林作为用来制备治疗中枢神经系统退行性疾病的药物组合物。

21、根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物含有洛贝林或其衍生物：5-10重量份；药学上可接受的载体：80-150重量份；其中，洛贝林的总含量为药物总重量的0.1-20％。

22、根据权利要求11或20所述的应用，其特征在于，所述的药物或药物组合物的剂型是片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒剂、乳液、糖浆、丸剂或注射液。

Images