CN100431539C - 乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备治疗帕金森病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备治疗帕金森病药物中的应用。所述的抑制剂包括所有能抑制乙酰胆碱酯酶活性具有治疗帕金森病作用的化合物。本发明实验结果表明，这类抑制剂能够改善帕金森病的运动缺陷和保护多巴胺能神经元免受损伤，具有标本兼治的作用，可有效地治疗或改善帕金森病症状。

Description

乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备治疗帕金森病药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及乙酰胆碱酯酶抑制剂在治疗帕金森病中的应用。
背景技术
帕金森病(parkinson’s disease，PD)是以中脑黑质中多巴胺能神经元为主受到损伤的老年性退行性神经疾病，呈进行性发展。临床早期以锥体外系运动受损为主：运动迟缓、静止性震颤、肌强直及姿势反射障碍为临床特征，随着疾病进展，可出现认知障碍，包括痴呆、抑郁和焦虑等症状，其中对于帕金森病伴随有痴呆的病人能够占到30-60％不等，甚至有调查显示可达到93％的病人有痴呆表现；多巴胺替代治疗有效；临床发病年龄一般在60岁左右，早到40岁就可出现症状，在55岁以上有1％的罹患该病，66岁以上可达2％以上。
PD病因尚不清楚，发病机理复杂；病理特征为选择性黑质多巴胺能神经元变性丢失、残余多巴胺能神经元出现嗜酸性包涵体(lewy小体)，导致黑质纹状体系统多巴胺递质减少的生化改变。对于多巴胺能神经元选择性丢失的认识，以氧化应激反应、线粒体功能缺陷和细胞凋亡机制为基础的解释得到了大家的认可，在此认识基础上的药物治疗包括：
1)多巴胺替代治疗，如左旋多巴；
2)多巴胺受体激动剂，如溴隐亭、麦角乙脲等；
3)抗胆碱能制剂，如本海索；
4)多巴胺释放促进剂，如金刚烷胺；
4)单胺氧化酶抑制剂，如丙炔苯丙胺等；
5)儿茶酚胺氧位甲基转移酶抑制剂，如硝替卡明；
6)其它，如谷氨酸拮抗剂、抗组胺药、心得胺等；
此外，阿朴吗啡、卡麦角林、罗皮尼罗、普拉克索也有报道用于PD治疗。由于现有药物主要以改善症状为目的，难以达到阻止或减少用药过程中多巴胺能神经元继续丢失，不能有效改变病程进展，甚至有加速多巴胺能神经细胞丢失的毒副作用，如左旋多巴。
作为中枢老年退行性疾病，PD和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)在病理和临床症状上具有许多类似的重叠，如PD患者可以有痴呆症状及出现淀粉样斑块和纤维丝缠结的AD病理特征(Aarsland et al.，Aech.Neruol，1996，53：538-542)。同样，在AD患者中也可出现PD样的运动障碍及lewy小体病理现象(Hulette et al.，Neurology，1995，45：1991-1995)。
乙酰胆碱酯酶抑制剂作为AD患者的首选药已经在临床中得到了认可和使用，如Huperzine A(石杉碱甲)、Tacrine(他克林)等。由于历来认为PD发病的机理之一是神经中枢多巴胺和乙酰胆碱之间的浓度平衡失调造成的，所以临床上只应用抗胆碱能药物而不是应用乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂来治疗PD患者，这种治疗方案效果不十分明显，而且对于有痴呆症状及老年患者还不能使用。
综上所述，本领域迫切需要开发可有效治疗帕金森病的药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效治疗帕金森病的药物。
在本发明的第一方面，提供了乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备治疗帕金森病药物中的用途。
在另一优选例中，所述药物含有0.005-99重量百分比的乙酰胆碱酯酶抑制剂和药学上可接受的载体，更佳地，所述药物含有0.01-90重量百分比的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂选自下组：
(±)-2-[(1-苯甲基-4-哌啶基)甲基]-5，6-二甲氧基-茚-1-酮；
3-[1-(苯甲基)-4-哌啶基]-1-(2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂卓-8-基)-1-丙酮；
(S)-N-乙基-N-甲基-3-[(1-二甲基-氨基)乙基]苯基氨基甲酸酯；
1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-酚甲基氨基甲酸酯；
9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶；
11-甲基-3-甲氧基-4a，5，9，10，11，12-六氢-6H-苯并呋喃[3a，2-ef][2]苯并氮杂-6-醇；
(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮；
O，O-二甲基-(2，2，2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯；
四异丙基焦磷酰胺；
Fasciculin-I、或Fasciculin-II；
以及药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：
1，5-二[4-烯丙基二甲基铵苯基戊-3-酮]，十烃季铵，N，N，N-三甲基-邻羟基苯胺，加拉碘铵，3，8-二氨基-5-[3-(二乙基甲基铵)丙基]-6-苯基菲啶，(±)-2-[(1-苯甲基-4-哌啶基)甲基]-5，6-二甲氧基-茚-1-酮，3-[1-(苯甲基)-4-哌啶基]-1-(2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂卓-8-基)-1-丙酮，伊立替康，(S)-N-乙基-N-甲基-3-[(1-二甲基-氨基)乙基]苯基氨基甲酸酯，1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-酚甲基氨基甲酸酯，1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-酚-N-苯基氨基甲酸酯，1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4′-异丙基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-3a，8-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4′-异丙基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-1-苯乙基-3a，8-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4′-异丙基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-8-苄基-1，3a-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4′-异丙基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-1，3a-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4′-异丙基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-1，8-二苄基-3a-甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4′-异丙基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-3a-甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4′-异丙基苯基氨基甲酸酯，1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-酚-N-2′-甲基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-3a，8-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2′-甲基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-1-苯乙基-3a，8-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2′-甲基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-8-苄基-1，3a-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2′-甲基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-1，3a-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2′-甲基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-1，8-二苄基-3a-甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2′-甲基苯基氨基甲酸酯，(-)-(3aS)-3a-甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2′-甲基苯基氨基甲酸酯，±-5-[2-叔丁氨基-1-羟基乙基]-间位-苯撑二-二甲基氨基甲酸酯，N，N，N-三甲基-3-[(二甲氨基)甲酰氧基]苯胺，安贝氯铵，1-甲基-3-羟基吡啶翁二甲氨基甲酸酯，1-萘基甲基氨基甲酸酯，2-异丙氧基苯-N-甲基氨基甲酸酯，2，3-二氢-2，2-二甲基苯并呋喃-7-酚甲基氨基甲酸酯，邻异丙苯基甲基氨基甲酸酯，间甲苯-N-甲基氨基甲酸酯，苯并咪唑-2-基氨基甲酸甲酯，9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶，7-甲氧基他克林，11-甲基-3-甲氧基-4a，5，9，10，11，12-六氢-6H-苯并呋喃[3a，2-ef][2]苯并氮杂-6-醇，(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮，7-甲基-5，6，9，10，11，12，13，14-八氢-5，11-四氢吡啶-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮，12-氨基-3-氯-9-乙基-6，7，10，11-四氢-7，11-甲桥环辛[b]喹啉，12-氨基-3-氯-9-甲基-6，7，10，11-四氢-7，11-甲桥环辛[b]喹啉，N-[2-羟基-3-甲氧基-5-氯-亚苄基]-石杉碱甲，12-(2′-羧基-5′-甲氧苯基)-2，12-二羟基-十二烷-4-酮，O，O-二异丙基氟代磷酸酯，N-(磷酸甲基)甘氨酸，O，O-二甲基-(2，2，2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯，O，O-二甲基-O-(2，2-二氯)乙烯基磷酸酯，O，O-二甲基-O-对硝基苯基硫代磷酸酯，O，O-二甲基-S-(N-甲基氨基甲酰甲基)二硫代磷酸酯，O，O-二甲基-S-(N-甲基氨基甲酰甲基)硫代磷酸酯，O，O-二甲基-S-[2-(1，4-丁二酸二乙酯)基]二硫代磷酸酯，苯甲基磺酰氟，甲基磺酰氟，四异丙基焦磷酰胺，Fasciculin-I，Fasciculin-II或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的抑制剂是(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮。
在另一优选例中，所述的药物为片剂、颗粒剂、针剂、粉剂或胶囊。
在另一优选例中，所述的药物用于治疗同时患有老年痴呆病和帕金森病的病人。
在本发明的第二方面，本发明特别提供了(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮的用途，它被用于制备治疗帕金森病药物。
在本发明的第三方面，提供了一种治疗帕金森病的方法，给予需要治疗的病人安全有效量的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
附图说明
图1乙酰胆碱酯酶抑制剂化合物的化学结构图。
1：1，5-二(4-烯丙基二甲基铵苯基)戊-3-酮
1，5-bis(4-allyldimethylammoniumphenyl]-pentan-3-one，BW284c51，C25H38N2O
2：十烃季铵(decamethonium，C16H38N2)
3：N，N，N-三甲基-邻羟基苯胺
N，N，N-trimethyl-O-hydroxyaniline，Edrophone，C9H14NO
4：加拉碘铵(gallamine，C30H60N3O3)
5：3，8-二氨基-5-[3-(二乙基甲基铵)丙基]-6-苯基菲啶
3，8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium Propidium，C27H34N4
6：(±)-2-[(1-苯甲基-4-哌啶基)甲基]-5，6-二甲氧基-茚-1-酮
(±)-2-[(1-benzylpiperidin-4-yl)methyl]-5，6-dimethoxy-indan-1-one，donepezil，C24H29NO3
7：3-[1-(苯甲基)-4-哌啶基]-1-(2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂卓-8-基)-1-丙酮
3-[1-(Phenylmethyl)-4-Piperidinyl]-1-(2，3，4，5-Tetrahydro-1H-1-Benzazepin-8-yl)-1-Propanone，TAK-147，C25H32N2O
8：伊立替康(Irinotecan，CPT11，C33H39N4O6)
9：(S)-N-乙基-N-甲基-3-[(1-二甲基-氨基)乙基]苯基氨基甲酸酯
(S)-N-ethyl-N-methyl-3-[(1-dimethyl-amino)ethyl]phenylcarbamate，rivastigmine，C14H22N2O2
10：1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-酚甲基氨基甲酸酯
1，2，3，3a，8，8a-hexahydro-1，3a，8-trimethylpyrrolo[2，3-b]indol-5-ol methylcarbamate，Physostigmine，C15H21N3O2
11：1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-酚-N-苯基氨基甲酸酯
1，2，3，3a，8，8a-hexahydro-1，3a，8-trimethylpyrrolo[2，3-b]indol-5-ol-N-phenylcarbamate，Phenserine，C20H23N3O2
12：1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4’-异丙基苯基氨基甲酸酯
1，2，3，3a，8，8a-hexahydro-1，3a，8-trimethylpyrrolo[2，3-b]indol-5-yl-N-4’-isopropylphenylcarbamate，Cymserine，C23H29N3O2
13：(-)-(3aS)-3a，8-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4’-异丙基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-3a，8-dimethyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo[2，3-b]indol-5-yl N-4’-Isopropylphenylcarbamate，N1-norcymserine，C22H27N3O2
14：(-)-(3aS)-1-苯乙基-3a，8-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4’-异丙基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-1-phenethyl-3a，8-dimethyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo[2，3-b]indol-5-yl N-4’-Isopropylphenylcarbamate，N1-phenethylnorcymserine，C30H35N3O2
15：(-)-(3aS)-8-苄基-1，3a-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4’-异丙基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-8-Benzyl-1，3a-dimethyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo[2，3-b]indol-5-yl N-4’-Isopropylphenylcarbamate，C29H33N3O2
16：(-)-(3aS)-1，3a-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4’-异丙基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-1，3a-Dimethyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo-[2，3-b]indol-5-yl N-4’-Isopropylphenylcarbamate，C22H27N3O2
17：(-)-(3aS)-1，8-二苄基-3a-甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4’-异丙基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-1，8-Dibenzyl-3a-methyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo[2，3-b]indol-5-yl N-4’-Isopropylphenylcarbamate，C35H37N3O2
18：(-)-(3aS)-3a-甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-4’-异丙基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-3a-methyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo-[2，3-b]indol-5-yl N-4’-Isopropylphenylcarbamate，C21H25N3O2
19：1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-酚-N-2’-甲基苯基氨基甲酸酯
1，2，3，3a，8，8a-hexahydro-1，3a，8-trimethylpyrrolo[2，3-b]indol-5-ol-N-2’-Methylphenylcarbamate，Tolserine，C21H25N3O2
20：(-)-(3aS)-3a，8-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2’-甲基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-3a，8-dimethyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo[2，3-b]indol-5-yl N-2’-methylphenylcarbamate，N1-nortolserine，C20H23N3O2
21：(-)-(3aS)-1-苯乙基-3a，8-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2’-甲基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-1-phenethyl-3a，8-dimethyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo[2，3-b]indol-5-yl N-2’-methylphenylcarbamate，N1-phenethylnortolserine，C28H30N3O2
22：(-)-(3aS)-8-苄基-1，3a-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2’-甲基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-8-Benzyl-1，3a-dimethyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo[2，3-b]indol-5-yl N-2’-Methylphenylcarbamate，C27H29N3O2
23：(-)-(3aS)-1，3a-二甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2’-甲基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-1，3a-Dimethyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo-[2，3-b]indol-5-yl N-2’-Methylphenylcarbamate，C20H23N3O2
24：(-)-(3aS)-1，8-二苄基-3a-甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2’-甲基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-1，8-Dibenzyl-3a-methyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo[2，3-b]indol-5-yl N-2’-Methylphenylcarbamate，C33H33N3O2
25：(-)-(3aS)-3a-甲基-1，2，3，3a，8，8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-5-基-N-2’-甲基苯基氨基甲酸酯
(-)-(3aS)-3a-methyl-1，2，3，3a，8，8a-hexahydropyrrolo-[2，3-b]indol-5-yl N-2’-Methylphenylcarbamate，C19H21N3O2
26：±-5-[2-叔丁氨基-1-羟基乙基]-间位-苯撑二-二甲基氨基甲酸酯±-5-[2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl]-m-phenylene bis-dimethylcarbamate，bambuterol，C18H29N3O5
27：N，N，N-三甲基-3-[(二甲氨基)甲酰氧基]苯胺
N，N，N-trimethyl-3-[(dimethyl-amino)formyloxy]aniline，neostogmine，C12H19N2O2
28：安贝氯铵(Ambenonium，C29H46Cl2N4O2)
29：1-甲基-3-羟基吡啶翁二甲氨基甲酸酯
1-methyl-3-hydroxy-pyridinium dimethylcarbamate，Pyridostigmine，C9H13N2O2
30：1-萘基甲基氨基甲酸酯
1-naphthyl methylcarbamate，sevin，carbaryl，C12H11NO2
31：2-异丙氧基苯-N-甲基氨基甲酸酯
2-isopropoxyphenyl-N-methylcarbamate，Propoxur，C11H15NO3
32：2，3-二氢-2，2-二甲基苯并呋喃-7-酚甲基氨基甲酸酯2，3-dihydro-2，2-dimethylbenzofuranol-7-ol methylcarbamate，C12H15NO3
33：邻异丙苯基甲基氨基甲酸酯
O-cumenyl methylcarbamate，isoprocarb，C11H15NO2
34：间甲苯-N-甲基氨基甲酸酯
meta-tolyl-N-methylcarbamate，C9H10NO2
35：苯并咪唑-2-基氨基甲酸甲酯
benzimidazole-2-yl-amino formic acid methyl ester，C9H9N3O2
36：9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶
9-amino-1，2，3，4-tetrahydroacridine，Tacrine，C13H14N2
37：7-甲氧基他克林(7-Methoxytacrine，C14H16N2O)
38：11-甲基-3-甲氧基-4a，5，9，10，11，12-六氢-6H-苯并呋喃[3a，2-ef][2]苯并氮杂-6-醇
11-methyl-3-methoxy-4a，5，9，10，11，12-hexahydro-6H-benzofuran[3a，2-ef][2]benzoaza-6-ol，Galanthamine，C17H21NO3
39：(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮或石杉碱甲
5R，9R，11E-5-amino-11-ethylidene-5，6，9，10-tetrahydro-7-methyl-5，9-methylenecycloocta-(b)pyridine-2(1H)-one，Huperzine A，C15H18N2O
40：7-甲基-5，6，9，10，11，12，13，14-八氢-5，11-四氢吡啶-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮
7-methyl-5，6，9，10，11，12，13，14-octahydro-5，11-tetrahydropyridine-5，9-methylenecycloocta-(b)pyridine-2(1H)-one，Huperzine B，C17H18N2O
41：12-氨基-3-氯-9-乙基-6，7，10，11-四氢-7，11-甲桥环辛[b]喹啉
12-Amino-3-chloro-9-ethyl-6，7，10，11-tetrahydro-7，11-methanocycloocta[b]quinoline，Huperzine X，C18H19ClN2)
42：12-氨基-3-氯-9-甲基-6，7，10，11-四氢-7，11-甲桥环辛[b]喹啉
12-Amino-3-chloro-9-methyl-6，7，10，11-tetrahydro-7，11-methanocycloocta[b]quinoline Huperzine Y，C17H17ClN2)
43：N-[2-羟基-3-甲氧基-5-氯-亚苄基]-石杉碱甲
N-[2-hydroxy-3-methoxy-5-chloro-benzilidene]-huperzine A，ZT-1，C23H23ClN2O3
44：12-(2’-羧基-5’-甲氧苯基)-2，12-二羟基-十二烷-4-酮
12-(2’-carboxy-5’-methoxyphenyl)-2，12-dihydroxy-dodeca-4-one，Sporotricolone，C20H31O6
45：O，O-二异丙基氟代磷酸酯
O，O-diisopropyl fluorophosphate，DFP，Isoflurophate，C6H14FO3P
46：N-(磷酸甲基)甘氨酸
N-(Phosphonomethyl)glycine，glyphosate，C3H8NPO5
47：O，O-二甲基-(2，2，2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯
O，O-dimethyl-(2，2，2-trichloro-1-hydroxyethyl)phosphate，Metrifonate，Trichlorfon，Totalene，Higalfon，Pronto，C4H8Cl3O4P
48：O，O-二甲基-O-(2，2-二氯)乙烯基磷酸酯
O，O-dimethyl-O-(2，2-dichlorovinyl)phosphate，DDVP，C4H7Cl2O4P
49：O，O-二甲基-O-对硝基苯基硫代磷酸酯
O，O-dimethyl-O-paranitrobenzylthiophosphate，Parathion-methyl，Dalf，Folidol-M，C8H10NO5PS
50：O，O-二甲基-S-(N-甲基氨基甲酰甲基)二硫代磷酸酯
O，O-dimethyl-S-(N-methylformamylmethyl)dithiophosphate，C5H12NO3PS2
51：O，O-二甲基-S-(N-甲基氨基甲酰甲基)硫代磷酸酯，
O，O-dimethyl-S-(N-methylformamylmethyl)thiophosphate，Omethoate，Folemate，C5H12NO4PS
52：O，O-二甲基-S-[2-(1，4-丁二酸二乙酯)基]二硫代磷酸酯
O，O-dimethyl-S-[2-(1，4-diethyl succinate)]dithiophosphate
53：苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，C7H7FO2S)
54：甲基磺酰氟(methanesulfonyl fluoride，MSF，CH3FO2S)
55：四异丙基焦磷酰胺
tetraisopropylpyrophosphoramide，Iso-OMPA，C12H28N4O3P2S
图2多巴胺(200uM)诱导神经母细胞SH-SY5Y凋亡，凋亡细胞核表达乙酰胆碱酯酶。左图示乙酰胆碱酯酶染色(400倍)，右图为Hoechst 33258染色显示细胞凋亡(400倍)。
图36-羟基多巴胺(20ug/ml)诱导神经母细胞SH-SY5Y凋亡，左图示凋亡细胞核表达乙酰胆碱酯酶(200倍)，右图为Hoechst 33258染色显示细胞凋亡(200倍)。
图4MPP诱导神经母细胞SK-N-SH细胞凋亡，左图示凋亡细胞核表达乙酰胆碱酯酶(200倍)，右图为MPP诱导后显微镜观察(200倍)。
图5多巴胺(0.5mM)诱导表达有大鼠多巴胺转运蛋白的CHO细胞凋亡，左图示凋亡细胞核表达乙酰胆碱酯酶(100倍)，右图为吉姆萨染色显示凋亡细胞(100倍)。
图6RT-PCR检测多巴胺和6-羟基多巴胺诱导的神经母细胞SK-N-SH凋亡中乙酰胆碱酯酶的表达情况。显示乙酰胆碱酯酶只在经过多巴胺和6-羟基多巴胺诱导的细胞中表达。Con示正常对照即未诱导的细胞；M示Marker；DA示多巴胺诱导组；6-OHDA示6-羟基多巴胺诱导组；P示凋亡细胞阳性对照。
图7乙酰胆碱酯酶抑制剂Huperzine A对多巴胺诱导的细胞凋亡的抑制率，石杉碱甲(1μM和10μM)可以有效部分抑制细胞死亡，*表示p＜0.05，给药后细胞死亡率显著降低；#表示p＞0.05，显示乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲的抑制效率没有剂量依赖性(Fisher T-test)。
图8FACS检测多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率，石杉碱甲(10μM)可以使细胞凋亡率从70％下降到40％。其中A：正常细胞B：多巴胺诱导C：石杉碱甲(10uM)+多巴胺。
图9正常SD大鼠海马组织AChE组织化学染色作为阳性对照，显示海马胆碱能神经元胞质着色，非细胞核着色。其中，左图为放大20倍，右图为放大100倍。
图10多巴胺(1μM)MFB注射正常SD大鼠48小时后组织化学染色检测中脑黑质乙酰胆碱酯酶，显示注射48小时后中脑黑质有乙酰胆碱酯酶表达，染色位于细胞核，少部分位于细胞质。其中，左图为放大100倍，右图为放大200倍。
图11 6-羟基多巴胺(10μg)MFB注射正常SD大鼠2周后检测其中脑黑质乙酰胆碱酯酶，显示注射2周后中脑黑质有乙酰胆碱酯酶表达，着色位于细胞核。其中，左图为放大50倍，右图为放大100倍。
图12MPTP(30mg/kg/day)连续7天皮下注射C57BL/6J小鼠后，检测中脑黑质乙酰胆碱酯酶，显示中脑黑质部表达乙酰胆碱酯酶，着色位于细胞核。其中，左图为放大100倍，右图为放大200倍。
图13MPTP制作小鼠PD模型的行为学检测方法，A图示游泳检测(swimtest)；B图示滚筒检测(Rotarod test)。
图14示MPTP注射后小鼠出现行为改变，模型制作成功，A图示僵直状态；B图示后脚趾分开；C图示竖尾。
图15游泳实验评价结果。*表示p＜0.05，表明L-DA治疗有效；**表示p＜0.001，表明石杉碱甲治疗显著有效；#表示p＞0.05，表明石杉碱甲治疗组与正常组比较(运动缺陷)没有显著差异。其中Control示生理盐水处理组(n＝6)；Saline示MPTP+生理盐水治疗组(n＝6)；L-DA示MPTP+左旋多巴治疗组(n＝6)；Huperzine A示MPTP+石杉碱甲组(n＝6)(one-way AVONA)。
图16滚筒实验评价结果。*表示p＜0.05，表明L-DA有效改善运动障碍及石杉碱甲改善比L-DA效果显著；**表示p＜0.001，表明石杉碱甲改善运动障碍的效果(评分)显著高于未治疗组(Saline组)；而#表示p＞0.05，Huperzine组(评分)与正常组比较差异无显著性。Control示生理盐水处理组；Saline示MPTP+生理盐水；L-DA示MPTP+左旋多巴；Huperzine A示MPTP+石杉碱甲(one-way AVONA)。
图17显示了正常小鼠黑质和纹状体TH免疫组化染色和尼氏染色。其中A，C：黑质部；B：纹状体部；D尼氏染色。
图18显示了saline+MPTP注射组的黑质和纹状体TH免疫组化染色和尼氏染色，其中，A黑质；B纹状体；C黑质尼氏染色。
图19显示了MPTP+L-DA组的黑质和纹状体TH免疫组化染色和尼氏染色，其中，A黑质；B纹状体；C黑质尼氏染色。
图20显示了MPTP+石杉碱甲(0.1mg/kg)组的黑质和纹状体TH免疫组化染色和尼氏染色，其中，A黑质；B纹状体；C黑质尼氏染色。
图21示MPTP诱导的小鼠PD模型的各治疗组多巴胺能神经元丢失率。其中，Saline组：saline+MPTP；L-DA组：L-DA+MPTP；huperzine A组：石杉碱甲+MPTP。saline组丢失为67％；L-DA组为76％；huperzine A组为14.5％。
具体实施方式
本发明人经过深入研究认为，选择有效药物阻止或减缓多巴胺能神经元凋亡速度，对于改变PD疾病病程发展以及阻止症状恶化具有重要的现实应用价值，是帕金森病药物治疗的最佳选择。此外，本发明人发现乙酰胆碱酯酶抑制剂可非常有效地通过抑制乙酰胆碱酯酶达到阻止神经细胞凋亡的目的，从而保护了PD病人的多巴胺能神经元，提高了黑质纹状体多巴胺能神经系统的功能。同时，乙酰胆碱酯酶抑制剂还在抑制乙酰胆碱酯酶同时也可提高内源性乙酰胆碱浓度，从而通过烟碱样胆碱能β2受体调控纹状体多巴胺的释放。因此，乙酰胆碱酯酶抑制剂可有效地对帕金森病的进行标本兼治，特别对患有痴呆的PD患者更能提高疗效。在此基础上完成了本发明。
本发明的体外研究表明，乙酰胆碱酯酶在多巴胺能神经毒性药物诱导的神经母细胞中表达，而不在未诱导的细胞中出现；huperzine A可以有效地降低多巴胺能神经毒性诱导的细胞凋亡。
体内研究结果显示，在所有多巴胺神经毒性药物诱导的动物模型中，乙酰胆碱酯酶均有表达，且定位于细胞核；在MPTP诱导的动物模型行为学实验中huperzine A可以有效地改善动物的运动障碍，病理检测发现huperzine A应用组可以有效地防止中脑黑质多巴胺能神经细胞丢失。
这些结果表明，无论是体外还是体内，乙酰胆碱酯酶都参与到多巴胺能神经细胞的凋亡中；而其抑制剂可以有效地阻止细胞凋亡所造成的多巴胺能神经细胞丢失，有效改善PD的运动障碍。由于乙酰胆碱酯酶抑制剂本身具有改善患者认知障碍的作用，因此，乙酰胆碱酯酶抑制剂可以安全有效地治疗PD患者的锥体外系运动功能障碍及认知障碍。
在本发明中，使用如下定义：
本文中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的药物组合物。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本文中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。更佳地，“药学上可被接受”是指不影响中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂活性的无毒物质。
本文中，术语“安全有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的治疗反应而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“安全有效量”因各种因素而异，如受治疗的特殊病情、患者的身体条件、受治疗的哺乳动物的种类、疗程、同时进行的治疗的种类(如果有的话)、所应用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构。
本文中，“活性成分”包括乙酰胆碱酯酶抑制剂及其药学上可接受的盐。代表性的盐包括(但并不限于)：钠盐、钾盐、锌盐等。
在本文中，术语“乙酰胆碱酯酶抑制剂”包括乙酰胆碱酯酶抑制剂及其盐。
本文中，“药物载体”是用于将乙酰胆碱酯酶抑制剂传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，可根据给药方式而选择的。
活性化合物
本发明用于治疗帕金森病的活性化合物是乙酰胆碱酯酶抑制剂。乙酰胆碱酯酶抑制剂是一类抑制乙酰胆碱酯酶活性的化合物，代表性的抑制剂包括(但并不限于)：(±)-2-[(1-苯甲基-4-哌啶基)甲基]-5，6-二甲氧基-茚-1-酮、3-[1-(苯甲基)-4-哌啶基]-1-(2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂卓-8-基)-1-丙酮、(S)-N-乙基-N-甲基-3-[(1-二甲基-氨基)乙基]苯基氨基甲酸酯、1，2，3，3a，8，8a-六氢-1，3a，8-三甲基吡咯并[2，3-b]吲哚-5-酚甲基氨基甲酸酯、9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶、11-甲基-3-甲氧基-4a，5，9，10，11，12-六氢-6H-苯并呋喃[3a，2-ef][2]苯并氮杂-6-醇、(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮、O，O-二甲基-(2，2，2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯、四异丙基焦磷酰胺、Fasciculin-I和Fasciculin-II以及它们的衍生物等。列举化合物结构参见图1。这些化合物都是已知的，可按照常规方法(如文献和专利中报道的方法)合成或从市场上购买。
一种特别优选的抑制剂是(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮(huperzine A，石杉碱甲)
乙酰胆碱酯酶抑制剂可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。
剂量
在本发明中，对乙酰胆碱酯酶抑制剂的剂量没有特别限制，可用任何合适的剂量。帕金森病包括原发性和继发性，如外伤、肿瘤及寄生虫等所致的帕金森病综合症。在使用乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗PD时，药物的用量取决于疾病的性质、病程、轻重、药物反应情况以及病人接受治疗的情况等，最终由处方医生决定给予病人多少剂量，一般可参考应用于AD患者的用量。
一般，合适的含量是乙酰胆碱酯酶抑制剂占药物组合物总重量的0.01％-99％，较佳地0.1-90％。在治疗帕金森病时，乙酰胆碱酯酶抑制剂的有效剂量范围通常为0.005-50毫克/千克·天或更高，较佳地为0.01-5毫克/千克·天，更佳地为0.05-1毫克/千克·天。
剂量单元包括一种乙酰胆碱酯酶抑制剂化合物，或者多种乙酰胆碱酯酶抑制剂化合物所形成的混合物。剂量单元还可含有稀释剂、填充剂、载体等。剂量单位是固体或凝胶形式，如丸剂、片剂、胶囊等，或者是液体形式，它们适合口服给药、直肠给药、局部给药或肠胃外给药、或者静脉内给药。
剂型
本发明的经口给药的固体组合物可采用片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、滴剂等形式。这些固体组合物中混合了1种或1种以上的活性物质和至少1种惰性稀释剂，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、果胶、硅铝酸镁、铝酸镁。还可按照常用方法使组合物中含有除了惰性稀释剂之外的添加剂，例如，硬脂酸镁等润滑剂、纤维素乙醇酸钙等崩解剂、乳糖等稳定剂、谷氨酸或天冬氨酸等助溶剂。如是片剂或丸剂，还可根据需要，在其外部包裹上蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等糖衣或胃溶性、肠溶性薄膜。
经口给药的液体组合物包括药剂上允许的乳浊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等，通常使用的惰性稀释剂包括精制水、乙醇。该组合物中除了惰性稀释剂之外，还可包含湿润剂、悬浮剂等助剂，甜味剂、矫味剂、芳香剂和防腐剂。
非经口给药的注射剂包括无菌水性或非水性溶液剂、悬浮剂和乳浊剂。水性溶液剂和悬浮剂中包含注射剂用蒸馏水及生理盐水。非水溶性溶液剂和悬浮剂中包含丙二醇，聚乙二醇，可可脂、橄榄油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇类，阿拉伯胶、吐温80(商品名)等。这些组合物中还可包含等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如，乳糖)、助溶剂(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用滤菌膜过滤上述组合物，再配合使用灭菌剂就可达到无菌的目的。然后，利用上述组合物制得无菌的固体组合物，在使用前用水或无菌注射用溶剂溶解就可加以利用。
可用于配制本发明口服剂型的、具体的药学上可接受的载体和赋形剂例子，在美国专利No.3,903,297(1975年9月2日授予Robert)中有描述。用于制造本发明的有用剂型的技术和组合物，在下列文献中有描述：7种现代制剂(7ModernPharmaceutics).第9和10章(Banker&Rhodes编辑，1979)；Lieberman等人，药物剂型：片剂(Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets)(1981)；和Ansel，药物剂型导论(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)2版(1976)。
治疗方法
治疗方法可以是，治疗帕金森病的任何合适有效方法。治疗可以是口服给药、直肠给药、局部给药、肠胃外给药、静脉内给药。施用有效量药物的方法还取决于待治疗的帕金森病的症状和病情程度。据信，通过将乙酰胆碱酯酶抑制剂与合适的载体或稀释剂一起配制，并通过口服、静脉内、皮下或肌内给药的肠胃外治疗方法，是将化合物施用于温血动物的优选方法。
本发明的乙酰胆碱酯酶抑制剂还可与其他治疗和辅助治疗帕金森病的物质联用，以进一步提高治疗效果。
本发明的主要优点在于：乙酰胆碱酯酶抑制剂可非常有效地通过抑制乙酰胆碱酯酶达到阻止神经细胞凋亡的目的，从而保护了PD病人的多巴胺能神经元，提高了黑质纹状体多巴胺能神经系统的功能。同时，乙酰胆碱酯酶抑制剂还在抑制乙酰胆碱酯酶同时也可提高内源性乙酰胆碱浓度，从而通过烟碱样胆碱能β2受体调控纹状体多巴胺的释放。因此，乙酰胆碱酯酶抑制剂可有效地对帕金森病的进行标本兼治，特别对患有痴呆的PD患者更能提高疗效。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料
以下实验所用主要药品来源：huperzine A购自Sigma公司，左旋多巴胺购自Roche公司；TH抗体购自Vector Laboratories公司。实验用动物SD大鼠和C57BL/6J小鼠购自上海实验动物中心。实验用的药物注射液的配制：huperzineA溶于生理盐水0.1mg/ml；多巴胺辗碎溶于生理盐水按40mg/kg灌胃。
实施例1体外检测凋亡细胞表达乙酰胆碱酯酶(组织化学方法)
细胞培养：SK-N-SH细胞、CHO细胞：在37.5℃，5％CO2的湿润条件下，将细胞培养于10％小牛血清(华美)的RMBI-1640(Gibco)培养基中，添加HEPES和谷氨酰胺，100IU/ml氨苄青霉素，100μg/ml链霉素；细胞以每周1∶10的分裂比例传代，培养8-12天，传代约4-20代，提前2天接种于48孔培养板(Costar)长满备用。在CHO细胞系中永久表达大鼠多巴胺转运蛋白的DAT-CHO细胞系(命名为D8细胞系)。D8与CHO细胞培养相同，除了添加Geneticin(G418)400μg/ml(Gibco/BRL)；SH-SY5Y细胞培养用DMEM/F12(Gibco)取代RMBI-1640，其它条件不变。
多巴胺能神经细胞毒诱导：细胞爬片，多巴胺(200μM)和6-羟基多巴胺(20μg/ml)作用SH-S55Y24小时，多巴胺(500μM)作用D8细胞24小时和多巴胺(100μM)作用SK-N-SH细胞24小时。
AChE免疫组化染色：1)10％福尔马林固定20-26分钟；2)蒸馏水洗三次；3)入孵育液，室温或37℃，恒温孵育1-2小时；4)蒸馏水洗；5)甘油明胶封固。
孵育液：(临用前30分钟配制混匀至亮绿色)
乙酰硫胆碱碘盐        5mg
0.1M磷酸缓冲液pH 6.0  7.5ml
0.1M柠檬酸钠          0.5ml
30mMCuSO4             1.0ml
5mM铁氰化钾           1.0ml
                                     
pH5.5-6.5             10ml
Hoechst 33258染色和吉姆萨染色
Hoechst 33258染色：多巴胺能神经毒性物质加入诱导细胞加入10μl0.1mg/ml Hoechst 33258/ml培养基，培养12小时，PBS洗三次，在荧光显微镜(蓝光)观察、照相。
吉姆萨染色：诱导后细胞，PBS洗，凉干；甲醇固定1分钟，凉干；加吉姆萨工作液，5分钟；水洗，室温24小时，透明，封胶。
结果：
多巴胺、6-羟基多巴胺和MPP诱导细胞凋亡，凋亡细胞核内有乙酰胆碱酯酶出现(图2-5)，未经过诱导的细胞没有乙酰胆碱酯酶表达，说明乙酰胆碱酯酶参与多巴胺神经毒物质诱导的细胞凋亡，并且高表达。
实施例2从mRNA水平检测乙酰胆碱酯酶在多巴胺能神经毒诱导细胞中的表达
诱导方法同上，收集多巴胺和6-羟基多巴胺诱导的细胞，以取血清培养诱发凋亡的细胞作为阳性对照和未经诱导的正常细胞作为阴性对照；取7×106细胞用1ml Trizol裂解后，用氯仿、异丙醇、75％的乙醇提取总RNA；取2μg总RNA至20μl反应体系，用随机引物进行逆转录生成cDNA；依据乙酰胆碱酯酶cDNA序列设计上游引物和下游引物：5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3’和5’-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3’。
产物长度为：482bp。使用PE480型PCR仪，PCR反应条件：变性：94℃，60sec；退火60℃，70sec；延伸72℃，90sec；30个循环；β-actin作为内参。
结果：
在未经诱导的正常细胞中没有乙酰胆碱酯酶的表达，而在多巴胺和6-羟基多巴胺诱导的细胞中和阳性对照组均有乙酰胆碱酯酶的表达，呈强阳性(图6)，再次证明乙酰胆碱酯酶参与多巴胺能神经毒诱导的神经母细胞凋亡。
实施例3MTT法检测细胞生存活性
SH-SY5Y细胞稀释到合适的浓度200μl体积接种到96孔板中。培养24小时后诱导处理。多巴胺诱导完成后换培养基，加入20μl(5mg/ml)的MTT，37℃4小时，去培养基，加二甲基亚砜150μl，振荡溶解15分钟，酶标仪590nm处测O.D.值，每组最少重复3次，取平均值。
结果：
多巴胺(200μM)诱导细胞大量死亡，而加入石杉碱甲(1μM)后可以部分阻止细胞死亡，有显著性差异(p＜0.05)。用药后细胞活性与未处理组相比，细胞活性提高了52％(处理组O.D.值-未处理组O.D.值)/未处理组O.D.值×100％；而与对照组比较，细胞生存活性提高了23％(处理组O.D.值-未处理组O.D.值)/对照组O.D.值×100％。但是，当升高石杉碱甲的浓度(10μM)时并没有提高细胞生存活力(p＞0.05)，因此，体外乙酰胆碱酯酶抑制剂可以部分抑制多巴胺能神经毒所致的细胞死亡(图7)。
实施例4用FACS检测石杉碱甲抑制多巴胺诱导的细胞凋亡
收集待测细胞1×106，用预冷的柠檬酸(pH7.3-7.4)固定，室温放置30分钟；用Propidium iodide(25mg/ml)染色15分钟；随后用FACS calibur(BectonDickinson)检测至少10000个细胞，根据细胞的DNA含量计算凋亡细胞的比例。
结果：正常细胞凋亡率为4.3％；经多巴胺诱导后细胞凋亡率可达到72.1％；加入石杉碱甲(10μm)后，细胞凋亡率可降低到40.05％(图8)，表明乙酰胆碱酯酶抑制剂可以有效地抑制多巴胺诱导的细胞凋亡。
实施例5体内验证乙酰胆碱酯酶参与多巴胺能神经细胞凋亡
1、多巴胺和6-羟基多巴胺诱导的偏侧多巴胺模型
SD大鼠(210±20克)，雄性，用10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉完全后，固定于立体定向仪上(切牙杆置于内耳线下3.3mm)(David Kopf)，头部常规备皮消毒，按以下靶点做头皮切口、钻孔，前脑内侧束(MFB)：前囟后4.4mm、矢中线旁1.2mm、硬膜下7.8mm，注射含1μm的多巴胺或含6-羟基多巴胺10μg2μl，加维生素C至终浓度10μm，对照组注射PBS加维生素C 2μl，注射时间最少5分钟。术后一周平稳后行行为检测多巴胺能神经元损伤程度，其中Apomorphine(0.25mg/kg)(Sigma)皮下注射诱发旋转行为，360度对侧旋转＞7圈，表明手术成功，位置准确。
2、MPTP诱导的小鼠帕金森病模型
C57BL/6J小鼠，30mg/kg/day颈部皮下注射MPTP，连续7天。
检测乙酰胆碱酯酶：多巴胺组48小时后断颈处死，取出脑部，行冰冻切片；6-羟基多巴胺组2周后断颈处死，取出脑部，行冰冻切片；MPTP诱导组7天后，断颈处死，取出脑部，冰冻切片。切片用丙酮酸固定20分钟，水洗后入孵育液(同上)，37℃3小时，水洗后甘油明胶封固。
结果：
由于海马部细胞存在有较多量的胆碱能神经元，海马部神经元AChE染色位于胞质，未见到胞核着色。中脑黑质细胞核部至今尚未见到有表达AChE的报道。但是，多巴胺注射组、6-羟基多巴胺组和MPTP诱导组的中脑黑质部均出现乙酰胆碱酯酶染色阳性，且着色部位多位于细胞核(图9-12)，说明乙酰胆碱酯酶确实参与到多巴胺能神经元凋亡过程中。
实施例6石杉碱甲保护多巴胺能神经元，有效治疗MPTP诱导的PD模型
小鼠(27±3g)24只，分为4组，其中一组给予生理盐水(I.P)作为对照，另外组分别给予：MPTP(30mg/kg/day)+生理盐水；MPTP(30mg/kg/day)+L-DA(40mg/kg/day)(P.O)；MPTP(30mg/kg/day)+石杉碱甲(0.2mg/kg/day)(I.P)。MPTP连续给予7天，药物连续给予11天。
行为学检测
游泳实验(图13A)：受试小鼠放入一个20×30×25cm规格的水箱中，水温为22℃-25℃。评分标准：受试时间内连续不断游泳者记3分；大部分时间游泳偶尔漂浮者记2.5分；飘浮时间占整个受试时间50％以上者记2分；偶尔游泳者记1.5分；偶尔用后肢游动并漂浮在一边者记1分。游泳实验计时5分钟。由于实验容易导致小鼠发展为抑郁症状，为了保证各个行为学实验的相互独立性，游泳实验在其它实验结束后进行。
滚筒实验(图13B)：滚筒由两部分组成，一部分为控制器械，保证0-80cmp，另一部分为直径为7.2cm的滚动轴，分为5个单位，能够使5只小鼠可以同时受到检测。用药前首先在滚筒上训练小鼠3-5次；用药后第7，9和11天，检测小鼠在滚筒上的时间/20cmp，取平均值。
免疫组化和尼氏染色：实验结束后，每组取三只小鼠，经10％水合氯醛麻醉后用4％多聚甲醛灌注，取脑组织后在4％多聚甲醛固定24小时，随后在25％蔗糖溶液中浸泡48小时，行连续冰冻切片(20μm)；TH免疫组化按试剂盒说明书操作(漂浮法)，最后DAB染色，显微镜下观察。尼氏染色：常规过二甲苯、梯度酒精和水化，在0.25％焦油紫兰溶液染色15分钟，水洗、脱水、透明和封片。取10个不同中脑黑质视野(不包括VTA区计数TH阳性细胞)计数TH阳性细胞数。
结果：
MPTP作为多巴胺能神经元选择性神经毒，能够选择性使多巴胺能神经元凋亡丢失，造成黑质纹状体多巴胺能系统损伤。当皮下注射MPTP后，小鼠出现一系列的典型症状，如僵直状态(图14A)、后脚趾分开(图14B)、竖尾(图14C)以及多动、嗜睡等，表明MPTP发挥作用。
行为学检验：游泳实验结果显示，左旋多巴组和石杉碱甲组评分与生理盐水治疗组有显著性差异(p＜0.05)，而与对照组无显著性差异(p＞0.05)，表明在用多巴胺替代治疗后，小鼠的运动缺损得到了有效改善，这与临床上早期应用多巴胺治疗帕金森病得到满意效果是相一致的；石杉碱甲用药组与对照组和左旋多巴组比较，显示石杉碱甲也可以有效地改善小鼠的运动协调性(图15)。滚筒实验试验结果显示：左旋多巴组虽然也能够有效地改善运动障碍，但是与石杉碱甲组比较，由于滚筒能全面检测小鼠的协调性，使多巴胺替代治疗部分改善运动缺陷的特征显露无疑，而石杉碱甲组效果显著好于左旋多巴组(p＜0.05)，可能与其保护细胞免受损伤有关系(图16)。
TH免疫组化和尼氏染色：结果如图17，18，19和20所示，中脑黑质多巴胺能细胞呈阳性结果，胞质呈棕黄色着色(图17C)。正常小鼠中脑黑质TH阳性细胞密集、均匀，相应纹状体染色密度深；MPTP+生理盐水组，中脑黑质TH阳性细胞数显著减少，而VTA区细胞较少受到损伤，纹状体区TH染色密度也显著降低(图18)；左旋多巴组中脑黑质部TH细胞数量降低更多，纹状体TH染色更浅(图19)；石杉碱甲组中脑黑质TH细胞数稍有损失。同样，纹状体TH染色密度与正常组比较变化不大(图20)。尼氏染色结果与TH免疫组化染色结果一致。计数TH阳性细胞数，结果显示细胞丢失量与正常组比较，石杉碱甲组细胞丢失细胞数约为14％，而左旋多巴组细胞数丢失达到76％，比生理盐水治疗组的68％还要多(图21)。结果表明：虽然多巴胺替代治疗可以有效地改善MPTP诱导的小鼠帕金森病模型，但是并不能使中脑黑质的多巴胺能神经元细胞损失量减少，并且具有加速损失的趋势，而石杉碱甲不仅可以有效地改善小鼠的运动缺陷，并且可以有效地保护多巴胺能神经细胞免受多巴胺能神经毒的损伤，减少或阻止细胞丢失。
实施例7治疗帕金森病的乙酰胆碱酯酶抑制剂注射液的制备
将0.1克、0.2克和0.5克乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲分别溶于1升水中，混合均匀后分别分装成0.1mg/2ml/支、0.2mg/2ml/支、0.5mg/2ml/支浓度的注射液，于安瓿瓶中密封，消毒杀菌，制成产品，避光保存。
实施例8治疗帕金森病的乙酰胆碱酯酶抑制剂片剂的制备
按常规的制片技术，取石杉碱甲1克，糊精130克，淀粉100克。羟甲基淀粉50克，一起放入粉碎机内充分混合25-30分钟，粉碎至约80-120目，再加入硬脂酸镁3克，均匀混合，经制片机制成1000片，每片重约0.28克，每片含石杉碱甲1mg。
讨论
AChE除了具有快速地水解乙酰胆碱，终止胆碱能神经信号传递的功能外，在神经细胞的分化、迁移、突触形成以及造血细胞和肿瘤细胞的增值与分化调控过程中具有重要作用(Small，DH.，Neurochem Int，1996，28：453-483)。最近发现AChE还参与细胞凋亡过程(Yang Lei et al.，Neuroscience Res，2002，42：261-268)。
以前曾有报道，在研究纹状体部烟碱样胆碱能活性与多巴胺递质释放的关系时，发现内源性乙酰胆碱可以通过烟碱样胆碱能β2受体调节多巴胺释放，增加纹状体内多巴胺浓度(Fuming et al.，Nature neuroscience，2001，4：1224-1229)。也就是说，纹状体内乙酰胆碱对多巴胺的浓度关系并非象原先认为的那样为拮抗关系，实际上乙酰胆碱对纹状体内多巴胺释放有促进作用。
本发明的研究证实了AChE为靶标的化合物(即乙酰胆碱酯酶抑制剂)对保护多巴胺能神经元和改善PD运动障碍具有良好的生理功能。乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗帕金森病的机理是通过抑制乙酰胆碱酯酶达到阻止神经细胞凋亡的目的，从而保护了PD病人的多巴胺能神经元，提高了黑质纹状体多巴胺能神经系统的功能；抑制乙酰胆碱酯酶同时也可提高内源性乙酰胆碱浓度，从而通过烟碱样胆碱能β2受体调控纹状体多巴胺的释放，达到对PD的标本兼治效果，特别对患有痴呆的PD患者更能提高疗效。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备治疗帕金森病药物中的用途，其中所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂选自下组化合物或药学上可接受的盐：
(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮；
7-甲基-5，6，9，10，11，12，13，14-八氢-5，11-四氢吡啶-5，9-甲撑环辛并(b)吡啶-2(1H)酮；
N-[2-羟基-3-甲氧基-5-氯-亚苄基]-石杉碱甲。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物含有0.005-99重量百分比的乙酰胆碱酯酶抑制剂和药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物含有0.01-90重量百分比的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物为片剂、颗粒剂、针剂、粉剂或胶囊。
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