CN101340934B - 免疫rna构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题是由以下部分组成的化合物：特异性结合与疾病相关的细胞表面标志物的靶向部分、特异性诱导细胞死亡的核酸以及将靶向部分与核酸共价连接的接头。本发明的主题还包括包含该化合物的药物，及其作为治疗疾病(包括增生性疾病)的药物的用途。

Description

免疫RNA构建体
本发明的主题是由以下部分组成的化合物：特异性结合与疾病相关的细胞表面标志物的靶向部分、特异性诱导细胞死亡的核酸部分以及将靶向部分与核酸部分共价连接的接头。本发明的主题还包括所述化合物的治疗用途、包含所述化合物的药物、其相关DNA和细胞。
目前可用的治疗增生性疾病的药物(例如化学治疗剂)具有由于其相对非特异性而诱发可观的副作用的缺点。已经尝试通过多种治疗观念来减轻这些副作用。一种可能的方法是使用免疫治疗剂来提高药物的特异性。这种方法已在肿瘤治疗中特别有用。
一种类型的免疫治疗剂是免疫毒素(immunotoxin，IT)。免疫毒素包括对患病靶细胞的表面标志物具有特异性的单克隆抗体(moAb)或重组抗体片段，所述抗体或片段与细胞毒剂偶联。另一种类型的免疫治疗剂是抗免疫缀合物。它们包含作为自身免疫病、组织反应和变态反应发病机制的致病剂(causative agent)的多肽结构，所述多肽结构也与具催化活性的细胞毒素偶联。细胞毒剂目前选自毒素或放射性元素。其中细胞毒剂为放射性元素的免疫治疗剂被称作放射性免疫缀合物。免疫毒素和免疫缀合物均已被开发并用于治疗不同的恶性肿瘤。将放射性标记的抗B细胞moAb应用于患有B细胞淋巴瘤的患者导致肿瘤消退甚至完全消除(1)。相反，moAb针对实体瘤的结果相当令人失望。
这些临床研究中使用的IT尺寸相对较大，这似乎干扰了其穿透肿瘤的能力。对血管化较差的肿瘤而言，低肿瘤穿透率产生了特别具有挑战性的问题。为了获得更好的组织和肿瘤穿透以及普遍改善的扩散特性，将IT小型化。推测更小的IT由于减小的抗原决定簇尺寸(2)而免疫原性更低。因此，首先将蛋白质水解切割的抗体片段与上述效应子功能(放射性标记的元件或毒素)缀合。
改进的克隆技术允许制备完全重组的IT。通过合成接头(例如(Gly4Ser)3)将通过聚合酶链式反应扩增的免疫球蛋白轻链和重链可变区的编码区接合在一起。将得到的可变区基因单链片段(scFv)与催化活性酶的编码区遗传融合，所述催化活性酶包括有细胞毒素活性的蛋白质或多肽(3)。
迄今为止主要使用的肽类(peptidic)细胞毒素是细菌毒素白喉毒素(DT)、假单胞菌外毒素A(PE)和来自植物的蓖麻毒素A(Ricin-A，RA)(4)。细胞毒活性的机制在所有这些毒素中基本相同，尽管它们有不同的进化背景。所述酶通过抑制真核延伸因子(eEF2)插入其在核糖体中的结合沟来敲低(knock down)蛋白质的生物合成，eEF2是RNA翻译为蛋白质的关键元件。这通过a)直接修饰eEF2(DT、PE)或通过失活核糖体28S-rRNA亚基(RA)中的eEF2结合位点来完成。
作为肽类细胞毒素的备选试剂，可以使用核酸如小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)、反义DNA或RNA、双链RNA(dsRNA)或小RNA(miRNA)来下调细胞调节途径中特定的关键元件。另外，可以通过抑制性适体(aptamer)来实现引发疾病的蛋白质的进一步下调。靶蛋白质的生物学功能被抑制性适体的结合所抑制，从而该类分子也可以用于实现疗效。
Song等，2002公开了通过鱼精蛋白-抗体融合蛋白将小干扰RNA(siRNAs)递送进入HIV感染的或被膜转染的细胞中。该融合蛋白对核酸具有高亲和力并装有siRNA。在得到的复合体中，RNA非共价结合。然而，通过使用靶向不同蛋白质的不同siRNA的混合物仅轻微地实现靶细胞中凋亡。
根据Khaled等，使用RNA适配体将siRNA分子在复合体中递送给靶细胞，其中所述适配体部分非共价地附着在siRNA部分上。该复合体为三聚体，其中一部分含有适配体部分，另一部分含有siRNA。两种单体均通过环对环的相互作用装配。
WO 2005/059135公开了通过仅应用srRNA分子或与用于递送进靶细胞的递送试剂(例如脂质体)复合的siRNA分子来将siRNA分子递送进哺乳动物神经细胞。
US 2003/0166512A1公开了反义寡核苷酸和siRNA，其与移动蛋白(血清蛋白)如白蛋白共价偶联，从而提高血清半衰期并降低未缀合核酸的免疫原性。蛋白质缀合物不具有用于细胞特异性递送治疗性寡核苷酸或siRNA的靶向功能。
CA 2447161公开了缀合物、可降解的接头和由叶酸盐、半乳糖等组成的组合物，并表征了生物活性化合物。使用抗体或适配体，但是不具有靶向功能并替代siRNA。
US 2004/0204377公开了通过与树状体或肽偶联而将siRNA递送进细胞中的方法。所述肽是非特异性的细胞穿透肽。偶联siRNA的细胞摄入与游离siRNA相比有所增强，但是没有用于特异性递送治疗性siRNA的靶向功能。
最近公开了关于siRNA治疗性应用的若干报道和专利。在这方面最有前途的方法是沉默疾病相关基因。US2005/0159381A1要求保护靶向基因的siRNA序列，所述基因为例如与染色体转运和癌症发展相关的BCR-ABL和ERG。US2005/0176025描述了通过敲低Bcl-2家族蛋白而在靶细胞中诱导凋亡的siRNA。在WO 2005/040379中，可以通过靶向Ras家族蛋白的siRNA来诱导肿瘤细胞的生长抑制，Ras家族是已知在多种癌症中过表达的一个常见的癌基因蛋白家族。专利WO 98/41648公开了对细胞生存力很重要的siRNA。所要求保护的大部分基因属于调节细胞歧异(deviation)过程的基因。除了直接沉默疾病相关蛋白质以外，还可以使用siRNA来使得细胞对某种其他操作敏感。在专利WO2005/042558A1中，描述了靶向属于IAP(凋亡蛋白抑制剂)家族的多种蛋白质的siRNA。敲低这些蛋白质会导致针对小分子毒素如紫杉醇的敏感性更高。
另外，在文献(5，6)中公开了关于siRNA治疗潜力的若干综述文章。所有这些综述中的常识是除了鉴定高度有效的siRNA以外，必须开发用于体内施用活性siRNA的有效、安全且为细胞类型特异性的递送策略。在WO 2004/044141A2中，要求保护siRNA与可能提供靶向功能的分子的缀合物。这些分子是细胞表面受体的小分子配体，如维生素和肽。US 2003/0104985A1描述了将生物活性化合物与可介导特异性结合细胞表面蛋白的分子(如叶酸盐、人血清白蛋白或N-乙酰半乳糖胺)缀合。关于成功地体内施用经化学修饰的siRNA的第一篇报导由Soutchek等发表。在该研究中，与胆固醇缀合的siRNA在注射进小鼠尾静脉时显示沉默活性。另外，siRNA的细胞穿透可由Rana和同事实现，他们使用细胞穿透肽TAT使siRNA穿过细胞膜(7)。
所有这些有价值的专利或科学报道均有助于开发基于siRNA的药物。但是上述研究或专利中均未通过将siRNA部分与适配体或全长抗体共价缀合来解决siRNA递送的问题。本发明的内在问题是提供避免上述问题的基于治疗性RNA的药物。特别地，本发明的药物应当是高度特异性的，而不引起严重的副作用。它们应当在靶细胞中高度有效，而不显著影响其它细胞。
令人惊奇的是，权利要求1到24中任一项的化合物、DNA、药物、其用途和方法解决了上述问题。根据本发明，适配体siRNA缀合物在与高分子量复合体(如适配体或多肽)共价连接时具有组成型活性，而不需要进一步加工(例如切割接头序列)来实现完全的生物活性。如果所述核酸部分是抑制性适配体，则两个部分的结合活性(例如细胞表面结合活性和抑制性适配体的结合活性)均保持不受影响。另外令人惊奇的是，提高靶向部分(例如适配体)的亲合力会得到远优于本领域目前用于细胞类型特异递送siRNA的递送载体的组合物。
令人惊奇的是，权利要求1到21中任一项的化合物、DNA、药物、其用途和方法解决了上文提到的问题。根据本专利申请，适配体siRNA缀合物在与高分子量复合体(如适配体或多肽)共价连接时具有组成型活性，而不需要进一步加工(例如切割接头序列)来实现完全的生物活性。如果所述核酸部分是抑制性适配体，则两个部分的结合活性(例如细胞表面结合活性和抑制性适配体的结合活性)均保持不受影响。与靶向细胞表面抗原的基于蛋白质的免疫疗法(例如重组免疫毒素)相比，结合价的提高不必然与显著但轻微的活性改变相关，因此无法预测。本专利申请所述的基于这类核酸的构建体的数据目前还没有。因此，令人非常惊讶的是提高靶向部分(例如适配体)的亲合力得到了远优于一价构建体的组合物。提高多种适配体亲合力的一种一般方式是通过足够长的双链接头序列将两个适配体部分分开。该接头序列提供了高水平的刚性，这确保了所掺入适配体部分的独立折叠。本发明解决了非特异性副作用以及免疫原性的问题，这是通过不将siRNA与作为特异性配体的蛋白质偶联而是与核酸偶联来实现的，后者的免疫原性通常较弱或没有，并诱导序列特异性mRNA降解。
本发明解决了非特异性副作用以及免疫原性的问题，这是通过不将siRNA与作为特异性配体的蛋白质偶联而是与核酸偶联来实现的，后者的免疫原性通常较弱或没有，并诱导序列特异性mRNA降解。
在本发明的化合物中，核酸部分优选是小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义DNA或RNA、双链RNA(dsRNA)或小RNA(miRNA)或抑制性适配体。在本发明中，将核酸(如siRNA)与靶向部分共价偶联，这使得这些复合体更加稳定，因为siRNA部分不易从所述靶向部分上解离。如果所述siRNA仅通过复合体形成进行结合，则该复合体可能在体内递送时解离，导致疗效降低，因为siRNA有效载荷降低了，另外，游离siRNA分子可在非靶向组织或细胞中引起副作用。对于siRNA适配体缀合物的情况，人们也能对化学计量有充分的控制，因为siRNA和适配体部分是从一条DNA链转录而来。
在一个优选的实施方案中，在本发明的化合物中一个或多个靶向部分与一个或多个核酸部分连接。在该实施方案中，因为两个部分均以定点方式共价附着，所以两个部分的比例总是清楚的，并且所述化合物不是这两个部分的随机X连接聚集体。这意味着本发明的构建体能够包含多个靶向部分(这导致提高的亲合力)和多个核酸部分(这提高了生物学效率，例如每个分子的siRNA有效负荷)。
本文使用的“细胞死亡”是指凋亡和坏死。本发明化合物的核酸部分优选地诱导凋亡。
本发明的“接头”是在引入化合物中特定位置的分子。优选地，所述化合物包含一个或多个接头分子。
在一个优选的实施方案中，本发明使用或组合两种机制来特异性调节基因表达：反义技术和RNA干扰(RNAi)(8)。反义技术利用寡核苷酸或其类似物，所述寡核苷酸或其类似物通过Watson-Crick杂交与靶RNA结合(9)。一旦结合后，反义试剂通过RNAse H诱导靶mRNA降解，从而防止产生不期望的蛋白质。
RNA干扰是是一种基因沉默现象，其中双链RNA触发同源mRNA的特异性降解(10)。特异性dsRNA被加工为小干扰RNA(siRNA)，其作为在RNA诱导的沉默复合体(RISC)中切割同源mRNA的指导(11)。RNAi是于大部分原始单细胞生物中即已存在的提供对病毒(病毒RNA)的保护的机制，这一发现预示着重大的科学突破，并代表了当前生物学和药物发现中最有前途和迅速发展的前沿之一。RNAi是发生在从植物到哺乳动物的生物中的天然基因沉默过程。已经显示，RNAi选择性关闭小鼠模型中的疾病基因(12)。通过利用发生在细胞中的RNAi的天然生物学过程，产生了称为RNAi疗法的一类重要的新药物。RNAi疗法通过有效沉默特异性信使RNA来靶向疾病的“根源”遗传因素，由此阻止产生引起疾病的蛋白质。RNAi疗法具有治疗恶性疾病并以全新的方式帮助患者的潜力(13)。
尽管反义技术和RNAi在体外有着很有前途的结果，但本领域的关键问题是将活性RNA特异性递送进入靶细胞。RNA本身不能穿透进入靶细胞。在体外，通过脂转染或电穿孔将RNA转染进细胞的胞质溶胶中。对体内实验而言，这些方法是不适用的。
根据本发明，通过将核酸部分与介导特异性细胞摄入的靶向部分缀合而解决了所述核酸部分的细胞通透能力弱的问题。这可通过将核酸部分与细胞表面特定配体共价缀合来实现，所述细胞表面特异配体例如诱导受体介导的胞吞作用。本发明允许在体内细胞特异性地递送生物活性RNA。
在一个优选的实施方案中，配体可以是抗体、其衍生物或片段，双抗体或适配体或多聚适配体及其组合。优选地，所述抗体是单克隆抗体或全长抗体。抗体的片段和衍生物是保留了对抗原的特异性结合特性的抗体片段和衍生物。抗体片段可以是融合蛋白的一部分。
适配体是能采取高度特异性三维构象的寡核苷酸(DNA或RNA)链(通常是短链)。特异性结合的适配体已经基于其对核酸、蛋白质、小有机化合物和甚至完整生物的结合能力而从随机库中进行选择(14)。适配体被设计为对某些靶分子(例如MCF-7细胞上的Her3、LNCaP细胞上的PSMA)具有适当的亲合力和特异性(15)。由于其高度特异性的结合活性，这些分子可用于医药和生物技术中的许多潜在应用(16)。在一些情况下，观察到适配体与其细胞表面特异性抗原(例如LNCaP细胞上的PSMA)结合后诱导受体介导的胞吞作用。特别地，本发明的靶向部分由至少一个、优选至少两个适配体来代表。
因此，根据本发明，特异性诱导mRNA降解的核酸部分可一方面与蛋白质共价连接，或另一方面与适配体共价连接。在例如受体介导的胞吞作用后，该化合物被转运到胞质溶胶中，在此处该化合物的RNA部分能够诱导序列特异性mRNA降解。
令人惊奇的是，根据本发明，所述核酸部分(例如siRNA)与靶向部分(例如与蛋白质或适配体)共价偶联，而不降低核酸的降解活性和靶向部分的结合活性。产生其中例如siRNA仍然能够触发RNAi级联的化合物。
优选地，在siRNA与基于蛋白质的结合配体缀合的情况下，使用异双功能接头实现偶联，由此通过在RNA和蛋白质之间形成二硫桥来使RNA与蛋白质交联。在适配体作为特异性结合配体的情况下，siRNA优选与适配体遗传融合。
本发明涉及由至少一个靶向部分和至少一个核酸部分形成的合成化合物，其中所述靶向部分包含针对胞外表面结构的结合结构域，所述结合结构域在与该化合物的靶向部分结合后被内化。核酸部分由至少一个核酸分子和/或修饰核酸分子组成，其在内化后诱导序列特异性mRNA降解或序列特异性翻译抑制。这导致由相应mRNA编码的蛋白质的合成降低，并因此调控蛋白质功能，导致细胞死亡。
本发明的化合物选择性地结合与疾病相关的细胞表面标志物。结合特异性是由靶向部分介导的。与其正常对应物相比，患病细胞经常在其细胞表面组成中发生显著的差异：这主要包括细胞表面蛋白质/抗原的不同的表达模式或提高的表达水平，或者改变的细胞表面糖基化状态。这些形态学差异可以用于产生靶向部分，所述靶向部分选择性地结合这些疾病特异性细胞表面抗原或这些抗原上相应的独特表位。化合物与细胞结合后，所述化合物被细胞内化。
因此，本发明的化合物清除患病细胞，而不显著影响其正常对应物或未患病细胞(甚至是在相同组织中或来源于相同组织的)。本发明的靶向部分就治疗应用进行选择。例如，如果要破坏特定类型的肿瘤细胞，则选择靶向部分以使其与已知的肿瘤细胞表面标志物特异性结合。
本文使用的“与疾病相关的细胞表面标志物”指细胞表面结构，通常是蛋白质或糖或糖基化的蛋白质，其以提高的量或优选以显著高于正常细胞的量存在于患病细胞的细胞表面。
优选地，所述标记以未患病的相应细胞上2、5、10或100倍的水平存在于患病细胞的细胞表面上。“特异性地”表示靶向部分是针对细胞表面标记的选择性结合配偶体。
在一个优选的实施方案中，靶向部分是活性结合结构，如抗体。在一个本发明优选的实施方案中，靶向部分选自抗体或其衍生物或片段和/或非蛋白质类分子如核酸，特别是适配体，适配体是与存在于细胞表面的结构特异性结合的DNA或RNA分子或经修饰的DNA或RNA分子。
在其它一些优选的实施方案中，靶向部分是具有特异性受体结合活性的分子，其选自碳水化合物、脂质、维生素、小受体配体、细胞表面碳水化合物结合蛋白及其配体(如凝集素、r型凝集素、半乳凝素及其衍生物)、受体结合分子如分化簇(CD)抗原(如CD30、CD40等)的天然配体、细胞因子(如趋化因子、集落刺激因子、1型细胞因子、2型细胞因子、干扰素、白介素、淋巴因子、单核因子等)和/或粘附分子(包括其衍生物和突变体)和/或任何上文所列的活性结合结构的衍生物或组合。
优选地，靶向部分特异性结合CD抗原、细胞因子受体、激素受体、生长因子受体、离子泵、多聚体的细胞外基质蛋白、金属蛋白酶或通道形成蛋白。
靶向部分也可以选自由变应原(优选肽变应原或重组变应原)、变应原独特型抗体、激发自身免疫的结构、诱导组织排斥的结构、免疫球蛋白恒定区及其衍生物、突变体或其组合组成的被动结合结构。本发明的化合物受其针对靶细胞表面的靶向部分指导，所述靶细胞表面包含针对上述优选的靶向部分之一的结合配偶体。在另一实施方案中，化合物的靶向部分通过包含两个或更多个相同和/或不同的结合结构而具有更高的价。
本发明的化合物包含核酸部分，其在内化进靶细胞后诱导细胞死亡。优选地，核酸部分诱导序列特异性mRNA降解或序列特异性翻译抑制。核酸部分可进行化学修饰，例如通过修饰核糖部分的2’位置，这导致核酸酶抗性提高。核酸部分可以由单链DNA和/或化学修饰的单链DNA或者单链RNA和/或化学修饰的单链RNA或者双链RNA和/或化学修饰的双链RNA组成。如果核酸部分是双链RNA，则两条RNA链可以通过发夹环共价连接。如果靶向部分是蛋白质，则优选用反应性化学基团修饰核酸来产生化合物，所述化学基团被诱导为与靶向部分形成共价键。如果靶向部分带有由其氨基酸序列编码的标签，则核酸部分可以以定点方式与靶向部分共价缀合。在一个优选的实施方案中，进入靶细胞后共价键被切开，这导致给定化合物的靶向部分与核酸部分解离。如果靶向部分是核酸，则核酸部分优选通过糖磷酸主链中的磷酸二酯键与靶向部分融合。在另一优选的实施方案中，两种官能团通过接头序列被分开，从而维持正确折叠并具有活性的化合物。如果靶向部分、接头和核酸部分是RNA，则它们可以遗传融合。这意味着该化合物可以通过体外或体内转录来获得。
靶向部分与靶细胞的细胞表面受体结合并介导化合物随后转运进入靶细胞的胞质溶胶。靶细胞通过靶向部分结合其细胞表面上存在的至少一个结构的能力来定义。
优选核酸部分能够诱导序列特异性地抑制靶细胞中任何mRNA的翻译。作为本发明另一实施方案，所述核酸部分诱导基因的翻译抑制，所述基因通过如改变靶细胞的功能、基因表达或生存力来影响细胞调节途径。在一个优选的实施方案中，核酸部分诱导基因的翻译抑制，这导致靶细胞的凋亡。例如，这些基因是编码直接参与蛋白质合成的蛋白质(例如真核延伸因子2(eEF-2))的基因，或已知负调节凋亡途径，意味着这些蛋白质的敲低可在靶细胞中诱导凋亡。相关的蛋白质为例如Bcl2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1、Ced9、E1B19K或BHRF1。一些Bcl-2结合蛋白还包括抗凋亡效应，如Bag-1、Raf-1、钙依赖磷酸酶、Smn、Beclin、ANT和VDAC。另外，IAP-1、IAP-2、存活素和x-IAP的敲低能够诱导凋亡。另一些抗凋亡蛋白为IKK-α、IκB或NF-κB、FLIP、Akt、PI3K或PDK1。
本发明的另一实施方案是包含至少一个其它部分的化合物，所述其它部分使得能够纯化和/或检测该化合物或其部分，和/或便于至少一个核酸部分转运进入靶细胞及其在细胞内的分离和/或活化该核酸部分。
本发明的具体实施方案是名为ki4-siEEF2的化学偶联化合物。该分子由作为靶向部分的蛋白质和作为基因沉默部分的化学修饰siRNA组成。SiRNA部分的化学修饰使得能够与蛋白质配体(ki4抗体)共价缀合，另外，化学修饰导致核酸酶稳定性提高。
本发明另一具体实施方案是基于RNA的靶向构建体xPSM-A-3、A30-siEEF2、PSMB1-siEEF2、PSMB2-siEEF2和PSMA bivanneal-siEEF2。构建体A30-siEEF2由RNA组成。构建体xPSM-A-3、PSMB1-siEEF2、PSMB2-siEEF2和PSMA biv anneal-siEEF2由化学修饰的RNA组成。A30-siEEF2的siRNA部分由RNA组成，所有其它构建体的siRNA部分均由化学修饰的RNA组成。除了PSMA bivanneal-siEEF2以外，siRNA部分一般与靶向部分遗传融合，这意味着这些分子可由单个DNA模板获得。
合理地设计构建体PSMB1-siEEF2和PSMB2-siEEF2的序列，以使得根据RNA二级结构预测算法Mfold 3.2(http://molbio.info.nih.gov/molbio-nih/mfold.html)，它们组成两个独立折叠的功能性适配体单元。这两个适配体单元被帮助正确折叠的短双链间隔区序列分开。对于PSMA biv anneal-siEEF2的情况，通过引入在独立的反应中退火的互补性3’突出端序列而将两个适配体部分非共价接合。这些修饰导致这些RNA构建体的亲合力提高。因为间隔区序列必须是双链的，所以这些构建体的基因沉默部分可见于间隔区序列内部。根据所使用的间隔区序列数，可以增加功能性基因沉默部分的数目(PSMAB1-siEEF2带有一个siRNA部分，PSMAB2-siEEF2显示两个siRNA部分)。
令人惊奇的是，根据本发明，一个递送单元内结合部分的增加和功能性siRNA序列的增加导致更高的生物效力。
优选地，本发明允许将确定的凋亡诱导核酸细胞类型特异地递送进入靶细胞中。
本发明的另一实施方案是包含靶向部分、接头和用于诱导细胞死亡的部分的RNA。所述RNA可以通过转录各自的DNA来获得。
本发明还包括细胞、器官和非人动物，它们在用编码所述本发明化合物的核酸转染后合成完整的化合物或其个体组分。
对于核酸部分抑制翻译参与调控细胞信号转导途径的基因的情况，本发明包括器官和/或组织和/或用于将有生物活性的核酸转运至靶细胞的细胞特异性递送载体。
优选地，所述核酸部分抑制细胞生存力重要基因的翻译。本发明的化合物可用作多种疾病的药物，例如癌性或非癌性增生疾病、变态反应、自身免疫病和/或慢性炎症。
本发明的化合物是异源缀合物，其包含至少两个结构域，即一个效应子结构域和至少一个细胞特异性结合结构域。本发明的化合物可用于疾病的诊断和治疗。上文或下文引用的出版物、专利和专利申请通过参考并入本文。
本发明的化合物是嵌合分子，其中靶向部分是细胞结合分子，可以是适配体(特异性结合的DNA或RNA分子)，或者是与核酸部分化学偶联或遗传融合的单克隆抗体或其片段，所述核酸部分由反义寡核苷酸、siRNA或小RNA组成。术语“免疫RNA构建体”是本发明的同义词。
本文使用术语的“靶向部分”代表本发明化合物的主动结合结构，其介导对疾病相关细胞表面标志物的特异性结合。靶向部分选自以下主动结合结构：抗体或其衍生物或其片段、合成肽如scFv、minitope，或者化学分子如一价、二价或多价DNA或RNA适配体(特异性结合的核酸分子或其衍生物)、碳水化合物、脂质、肽、维生素等，和/或具有多至100个原子的具有受体结合活性的小分子如配体(尤其是单原子的)，肽分子、非肽分子等，和/或细胞表面碳水化合物结合蛋白及其配体(如凝集素、r型凝集素、半乳凝素及其衍生物)、基质蛋白、金属蛋白酶和/或受体结合分子如分化簇(CD)抗原(如CD30、CD40等)的天然配体，细胞因子如趋化因子、集落刺激因子、1型细胞因子、2型细胞因子、干扰素、白介素、淋巴因子、单核因子等，和/或粘附分子(包括其突变体和/或其衍生物)，或者任何上文列出的主动结合结构的组合，所述主动结合结构结合CD抗原、细胞因子受体、激素受体、生长因子受体、离子泵、通道形成蛋白。靶向部分也可选自以下被动结合结构：变应原、肽变应原、重组变应原、变应原独特型抗体、激发自身免疫的结构、诱导组织排斥的结构、免疫球蛋白恒定区及其衍生物、突变体或其组合。可以通过组合选自上述组中的至少两个相同或不同的结合结构来产生具有更高价的靶向部分。
本文使用的术语“抗体”指多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体及其片段如Fab、F(ab’)2、Fv以及保留亲本抗体结合功能和特异性的其它片段。本文使用的术语“单克隆抗体”指具有均质抗体群的抗体组合物。该术语不受限于抗体的物种或来源，也不旨在受其产生方式的限制。该术语涵盖完整的免疫球蛋白以及片段如Fab、F(ab’)2、Fv和保留抗体结合功能和特异性的其它片段。任何哺乳动物物种的单克隆抗体均可用于本发明。然而在实践中，抗体一般是大鼠或小鼠细胞系的抗体，所述细胞系用于产生所需的杂交细胞系或杂交瘤以生产单克隆抗体。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述抗体是人抗体。本文使用的术语“人抗体”指免疫球蛋白的构架区来自人免疫球蛋白序列。本文使用的术语“单链抗体片段”(scFv)指如下制备的抗体：确定结合抗体的结合结构域(重链和轻链二者)，并提供允许保留结合功能的连接部分。这事实上形成了显著截短的抗体，所述抗体仅具有与抗原结合所必需的可变结构域部分。单链抗体的测定和构建由Ladner等描述于U.S.Pat.No.4,946,778中。
本文使用的术语“适配体”指与靶细胞的细胞表面上的结构特异性结合的核酸分子，优选地，适配体与细胞表面受体结合，所述受体在结合后被内化，从而介导本发明复合体的细胞类型特异性摄入。适配体可以由DNA、RNA或化学修饰的DNA或RNA组成。适配体可以通过被称作“通过指数式富集进行的配体选择性进化(selective evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)”的方法获得。从核苷酸序列的多样库开始，通过反复多轮次的选择和扩增来分离对其靶标具有高亲和力的分子。
本发明化合物的“核酸部分”代表核酸，所述核酸在该化合物进入细胞后在细胞的胞质溶胶中具有活性。本发明的这些核酸部分可以选自其序列特异性地阻断选定靶蛋白的蛋白质合成的任何核酸分子类别。优选地，核酸部分选自两个主要的核酸分子类别：1.反义寡核苷酸(ODN)2.短干扰RNA(siRNA)。如果核酸部分选择为反义寡核苷酸，则它可由单链DNA或RNA组成，所述单链DNA或RNA可以在其糖磷酸主链上或在核碱基上被化学修饰。修饰可以是将磷酸二酯主链中非桥接的氧原子替换为硫原子，以产生硫代磷酸酯键。反义寡核苷酸与靶蛋白mRNA上的互补区退火，并通过RNase H介导的RNA/DNA双链体切割或通过位阻来阻断翻译。优选地，反义寡核苷酸包含10到40个、更优选15-30个或17到25个碱基。另外，核酸部分也可以由肽核酸组成，肽核酸是一类反义分子，其中糖磷酸主链被N-(2-氨乙基)-甘氨酸主链代替。如果核酸部分选自siRNA类别，则它可由双链RNA或化学修饰的双链RNA组成。为了提高核酸酶稳定性，可以将化学修饰插入糖磷酸主链中。修饰可以是将磷酸二酯键中的非桥接氧原子替换为硫原子，以产生硫代磷酸酯键。核糖单元的2’-羟基可以替换成2’-氟原子或2’-甲氧基或2’-乙氧基或2’-甲氧基乙基。RNA也可含有所谓的锁核酸(lockednucleic acid)，其含有2’-O，4’-C-亚甲基-α-D-呋喃核糖基核苷酸(2’-O，4’-C-methylene-α-D-ribofuranosyl nucleotide)。
带有这些修饰的核苷酸在RNA序列两条链中的任何位置均可插入。优选地，双链RNA具有17至40个核苷酸的长度。
本文使用的术语“共价连接”指在靶向部分所包含反应基团与核酸部分所包含反应基团之间的化学反应中获得的化学缀合，所述化学反应后两个部分通过共价键连接。
共价键合可以用二硫键、胺键、酰胺键、磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、醚键、硫醚键、碳碳键、酯键、腙键、卡巴肼键(carbazide linkage)或氨基甲酸酯键来实现。
核酸部分可在两条链中任一个的3’或5’端包含反应基团。它可包含可通过标准或非标准固相合成技术插入DNA或RNA链中的任何反应基团。
如果靶向部分是蛋白质，则其包含可用于偶联或用接头分子进行修饰的氨基、巯基、羟基、羧基或糖部分。如果靶向部分是重组表达的蛋白质，则可以通过将人工氨基酸插入一级氨基酸序列来插入与上述不同的反应基团。这将导致核酸部分与靶向部分的定点缀合。
本文使用的接头分子指合成分子，其与靶向部分或核酸部分反应，从而引入可用于共价偶联这两个部分的特殊反应基团。
在交联操作之前，可以用接头分子在独立的反应中对靶向部分、核酸部分或二者进行修饰。用于修饰靶向部分或核酸部分的接头分子的选择取决于所使用的偶联策略。
通过形成酰胺键而得到的缀合可以通过活化羧基并随后与伯胺反应来介导。活化剂可以是多种碳二亚胺，如EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸化物)、EDAC(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸化物)、DCC(二环己基碳二亚胺)、CMC(1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺)、DIC(二异丙基碳二亚胺)或Woodward’s试剂K(N-乙基-3-苯基异噁唑鎓-3’-磺酸盐)。
活化的NHS-酯与伯胺的反应也引起酰胺键的形成。
通过形成仲胺进行缀合可以通过胺与醛基反应随后用H-供体(如氰基硼氢化钠)还原来实现。
可以例如通过氧化糖部分或通过与SFB(琥珀酰亚胺基-对甲酰苯甲酸酯)或SFPA(琥珀酰亚胺基-对甲酰苯氧基乙酸酯)反应来引入醛。
通过形成二硫键进行缀合可以通过二硫化吡啶(pyridyldisulfide)介导的巯基-二硫化物交换来完成。巯基的引入例如由Traut’s试剂(2-亚氨基硫醇(2-Iminothiolane))SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯)、SATP(琥珀酰亚胺基乙酰硫代丙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SMPT(琥珀酰亚胺基氧代羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)、N-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯、SAMSA(S-乙酰基巯基琥珀酸酐)、AMBH(2-乙酰胺-4-巯基丁酸酰肼)、胱胺(2，2’-二硫代双(乙胺)来介导。
通过形成硫醚键进行缀合可以通过含巯基的组分与含马来酰亚胺或碘代乙酰基的分子的特定反应来进行，或者通过环氧化物活化的靶向部分或核酸部分的反应来进行。马来酰亚胺基团可以通过以下化合物引入靶向部分或核酸部分中：SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)、磺基(sulfo)SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯)、MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、磺基MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-磺基羟基琥珀酰亚胺酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基)苯基)丁酸酯)、磺基SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、GMBS(N-α-马来酰亚胺基丁酰基-氧代琥珀酰亚胺酯)、磺基GMBS(N-α-马来酰亚胺基丁基-氧代磺基琥珀酰亚胺酯)。
碘代乙酰基可以使用以下化合物插入：SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯)、磺基SIAB(磺基-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯)、SIAX(琥珀酰亚胺基6-[(碘代乙酰基-氨基)己酸酯]、SIAXX(琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘代乙酰基)氨基)-己酰基)氨基]己酸酯)、SIAC(琥珀酰亚胺基4-(((碘代乙酰基)氨基)甲基)-环己烷-1-羧酸酯)、SIACX(琥珀酰亚胺基6-((((4-(碘代乙酰基)氨基)甲基)-环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯)、NPIA(对硝基苯基碘代乙酸酯)。
通过形成氨基甲酸酯键得到的缀合可按以下进行：将靶向部分或核酸部分的羟基残基与CDI(N，N’-羰基二咪唑)或DSC(N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)或N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯反应，随后与存在于靶向部分或核酸部分中的胺反应。
靶向部分与核酸部分的交联也可以通过向一个部分中引入光反应基团来实现。光反应基团为芳基叠氮化物、卤代芳基叠氮化物、二苯甲酮、某些重氮化合物和diazirine衍生物。它们与氨基或活化的氢键反应。
通过醚键进行缀合可以通过含环氧化物的分子与靶向部分或核酸部分中羟基的反应来介导。
如果靶向部分是一价、二价或多价适配体，则RNA的两条链通过有义链3’末端的发夹环共价连接。如果靶向部分是适配体，则核酸部分通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接。
选定的基因沉默核酸的序列由靶蛋白的mRNA序列确定。原则上讲，基因沉默核酸可以针对在细胞中表达的任何蛋白质。本发明的一个目标是靶向细胞生存力必需蛋白质的mRNA序列的基因沉默核酸。这些蛋白质的敲低会引起凋亡。与细胞结合部分组合，将有可能选择性地在多细胞生物的某些细胞中诱导凋亡。
凋亡可通过敲低编码翻译机器中重要因子的基因来诱导，所述因子例如为人延伸因子2、核糖体或tRNA中发挥重要的催化功能的核糖体RNA。蛋白质合成水平的降低导致凋亡途径的触发，从而导致细胞死亡。
用于在靶细胞中诱导凋亡的第二种方法是敲低下调或抑制凋亡途径的蛋白质，即所谓的抗凋亡蛋白。这些蛋白质可以是内部途径(其通过线粒体释放细胞色素c和其后活化半胱天冬酶家族蛋白酶来传导)或外部途径的部分。外部途径由胞外死亡信号触发，并通过直接活化多种半胱天冬酶来传导，而不涉及线粒体的酶。内部途径的潜在靶标是属于Bcl2家族的蛋白质，如Bcl2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1、Ced9、E1B19K或BHRF1。一些Bcl-2结合蛋白也通过增强Bcl-2的效应而包含抗凋亡效应，如Bag-1、Raf-1、钙依赖磷酸酶、Smn、Beclin、ANT和VDAC。外部途径受凋亡抑制剂(IAP)蛋白家族成员如IAP-1、IAP-2、存活素和x-IAP的负调节。这些蛋白质抑制TNFα和CD-95所介导的凋亡，并且也是半胱天冬酶活化的抑制剂。还可通过对破坏NF-κB信号转导的蛋白质进行敲低来诱导凋亡，所述蛋白质为IKK-α、IκB或NF-κB自身。FLIP蛋白通过在CD95触发的死亡信号转导中阻止半胱天冬酶8释放而发挥凋亡抑制剂作用。
另外，也可以通过抑制原癌基因(如Akt或Akt活化蛋白如PI3K或PDK1)来诱导凋亡。
优选地，本发明的化合物是可溶的。术语“可溶的”指在重组表达时(尤其是将基因沉默核酸与目的蛋白偶联时所应用的蛋白质纯化和偶联步骤中)复合体在溶液中留存的能力。该术语也指从任何种类的掺入载体中释放后，该复合体在细胞中的状态。
术语合成的指自然界中不存在的人造复合体。该术语也包含重组的含义。
实施例
在第一种方法中，将化学修饰的siRNA与肿瘤细胞特异性抗体共价偶联，从而获得本发明的化合物(免疫RNA构建体)。
第二种方法是使用RNA适配体作为靶向部分实现细胞特异性。siRNA部分通过短接头序列与适配体遗传融合。另外，将使用其中存在两个特异性结合的适配体部分的二价适配体siRNA缀合物。
两个抗原结合位点的存在以及多于一个siRNA部分的存在将可能提高所得构建体的亲和力以及生物活性。
靶向部分与靶受体结合后，构建体被内化，siRNA转运至靶细胞的胞质溶胶，在此处其诱导序列特异性mRNA降解。该siRNA靶向作为翻译的重要组分的人延伸因子2。延伸因子2的“敲低”阻断了蛋白质合成，这继而引起细胞的凋亡。
材料和方法
序列：
使用以下序列：
SEQ ID NO 1：xPSM-A-3-siGFP：
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG
CGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUGAAGCUUGGAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG
SEQ ID NO 2：xPSM-A-3-siEEF2
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG
CAGCGCCAUCAUGGACAAGAAUUGAAGCUUCUUCUUGUCCAUGAUGGCGCGG
SEQ ID NO 3：siEEF2序列1
有义：r(AGG CCU AUC UGC CCG UCA A)dTdT
反义：r(UUG ACG GGC AGA UAG GCC U)dTdG
SEQ ID NO 4：siEEF2序列2
有义：r(GCG CCA UCA UGG ACA AGA A)dTdT
反义：r(UUC UUG UCC AUG AUG GCG C)dGdG
SEQ ID NO 5：A30siGFP
GGGAAUUCCGCGUGUGCCAGCGAAAGUUGCGUAUGGGUCACAUCGCAGGCACAU
GUCAUCUGGGCGGUCCGUUCGGGAUCCUCGGAAGCUUGCAAGCUGACCCUGAAG
UUCAUGAAGCUUGGAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG
SEQ ID NO 6：A30siEEF2
GGGAAUUCCGCGUGUGCCAGCGAAAGUUGCGUAUGGGUCACAUCGCAGGCACAU
GUCAUCUGGGCGGUCCGUUCGGGAUCCUCGAAGCUAGCGCCAUCAUGGACAAGAA
UU GAAGCUUCUUCUUGUCCAUGAUGGCGCGG
SEQ ID NO 7：siGFP
有义：5′-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT
反义：5′-GAACTTCAGGGTCAGCTTGCCG
SEQ ID NO 8：PSMB1-siEEF2
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG
CUAAAAAUUGCGCCAUCAUGGACAAGAAUUAAUUAAGGGAGGACGAUGCGGAUCA
GCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAAAAAUUCUUGUCCAUGA
UGGCGCGGGAGCTCGAATT
SEQ ID NO 9：PSMB2-siEEF2
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG
CUAAAAUUAGGCCUAUCUGCCCGUCAAUUAAAAAUUGGGAGGACGAUGCGGAUCA
GCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGCGCCAUCAUGGACAAG
AAUUGAAGCUUCUUCUUGUCCAUGAUGGCGCGGAAAAAAAUUGACGGGCAGAUAG
GCCUUU GAGCTCGAATT
SEQ ID NO 10：PSMA biv anneal siEEF2-1
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG
CUAAAAAUUGCGCCAUCAUGGACAAGAAUU
SEQ ID NO 11：PSMA biv anneal siEEF2-2
GGGAGGACGATGCGGATCAGCCATGTTTACGTCACTCCTTGTCAATCCTCATCGGCA
AAAATTCTTGTCCATGATGGCGCGG
抗体、适配体和小干扰RNA
全长抗体Ki-4特异性结合存在于L540细胞表面的CD30受体。适配体A30和xPSM-A-3显示对存在于MCF-7细胞上的抗原Her3和存在于LNCaP细胞上的PSMA(前列腺特异性膜抗原)的特异性结合。
对siRNA实验而言，使用三种不同的序列：针对EGFP的siRNA(SEQ ID NO 7)、针对EEF2的两种不同的siRNA序列(SEQ IDNO 3和4)。
为了将抗体与siRNA缀合，修饰siRNA以保护其不受RNAse消化(SEQ ID 3和4)。修饰siRNA的合成由Dharmacon(Chicago，USA)进行。
为了将适配体与shRNA序列遗传融合(装配PCR)至，设计DNA引物并由MWG-Biotech(Ebersberg，Germany)合成。
使用大肠杆菌XL1-blue(supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyr A46 thirelA1 lacF’[pro AB+lacIq lacZ ΔM15 Tn10(tetr)])来增殖质粒。真核表达载体psecTag2B-GFP来自psecTag质粒(Invitrogen，Carlsberg，USA)并来自pmaxGFP质粒(Amaxa，，Germany)。在XhoI/NheI激酶结构域中切出PmaxGFP质粒的GFP编码序列，并粘贴进psecTag质粒的相同结构域中。通过碱裂解法制备质粒，并使用来自Qiagen，Hilden，Germany的质粒制备试剂盒进行纯化。通过水平琼脂糖凝胶电泳分离限制性片段并用QIAquick(Qiagen)提取。所有的标准克隆操作均如Sambrook，J等，1989所述进行。
细胞培养
在补充有10％(体积/体积)热灭活胎牛血清、50μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的复合培养基(RPMI 1640)中培养所有的细胞系，包括CD30阳性细胞系L540Cy(Kapp，U.等，1992)和CD30阴性细胞系MCF-7(ATCC，VA，USA)、LNCaP(DSMZ，Germany)和293T(ATCC)。所有的细胞均在37℃下在空气气氛中的5％CO2中培养。细胞系L540、MCF-7和LNCaP也以含有载体psecTag2B-GFP的转染形式使用，所述载体非常强烈地表达GFP蛋白。为了选择转染细胞，添加Zeocin(Invitrogen，Carlsbad，USA)至100μg/ml的终浓度。
免疫RNA构建体的构建和合成
psecTag2B-GFP的克隆和表达
为了构建载体，通过限制性位点XhoI/NheI切出GFP编码序列。XhoI/NheI消化后，将经限制性处理的片段分别克隆进经相同限制性酶消化的真核表达载体psecTag2B。通过序列分析确认所得到的编码GFP的重组构建体psecTag2B-GFP。GFP在使用核转染(nucleofection)(Amaxa)转化进L540、MCF-7和LNCaP细胞后强烈表达。简言之，根据生产商的方案，对6孔细胞培养板使用2μg质粒DNA和100μl核转染液。
通过计数绿色荧光细胞测定转染效率在33-90％之间。然后将转染细胞转移进中等大小的细胞培养瓶(Nunc；85m2)中，并在补充有100μg/ml Zeocin的RPMI复合培养基中培养。一到两周后，有效转染的克隆发出绿色荧光。通过转种这些克隆来建立转染细胞群。
全长抗体Ki4与针对GFP的siRNA(SEQ ID NO 1)以及针对EEF2的 siRNA(SEQ ID NO 4)缀合
对于抗体与siRNA序列之一的偶联而言，RNA与蛋白质共价连接。通过Trauts试剂(2-Iminothiolane)活化抗体，从而在蛋白质中引入游离的巯基。通过使用nanosep 10k离心柱(Pall biosciences)进行脱盐来去除过量的Trauts试剂。通过与SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)反应进行siRNA的活化。使用centrispin 10k离心柱(EMPbiotech，Berlin)通过凝胶过滤去除未反应的SPDP。对于交联反应而言，以10倍过量的摩尔数向硫醇化抗体中添加活化的siRNA。在室温下过夜进行交联。为了去除未缀合的siRNA，将溶液离心通过nanosep 100k离心柱(Pall biosciences，East Hills NY，USA)。在将该构建体用于体外毒性测定之前，将所有的样品进行无菌过滤。
适配体A30和xPSM-A-3与针对GFP的siRNA(SEO ID NO 5和1)和针 对EEF2的siRNA(SEQ ID NO 6和2)遗传融合
为了合成适配体-间隔区-siRNA构建体，通过基于网络的设计算法来设计特异性DNA引物，并由MWG-Biotech合成，所述算法称为装配PCR寡聚标记(assembly PCR oligo maker)。使用所有四种引物的初始装配PCR后，使用两种侧翼引物扩增全长DNA。最后通过体外转录产生RNA序列。将反应物在8％的尿素PAGE凝胶上纯化，通过UV造影(UV shadowing)使RNA条带可见并切下。之后从凝胶条中抽提RNA。
因为适配体的正确折叠对其结合是很重要的，所以将构建体在95℃加热3分钟，最后在37℃孵育30分钟。计算一个转录反应的产率，之后通过260nm处的UV吸光度来测定浓度。
二价适配体构建体PSMB1-siEEF2、PSMB2-siEEF2与PSMA biv1 anneal 1和PSMA biv anneal 2(SEQ ID NO 8、9和10和11)遗传融合
由GENEART AG(Regensburg)合成PSMB1和PSMB2的DNA序列，并使用5’KpnI 3’SacI限制性位点克隆进pUC19载体中。使用Durascribe T7转录试剂盒，通过run off体外转录由EcoRI消化的质粒DNA作为模板获得RNA序列。如上所述纯化RNA，得到如下的RNA序列，其中由间隔区序列分隔的两个适配体官能度与针对EEF2的siRNA融合。
DNA模板PSMA biv anneal 1和2均使用互补性退火寡聚物通过装配PCR产生。使用Durascribe T7转录试剂盒进行体外转录。纯化两种RNA片段后在退火反应中使其彼此融合，所述退火反应中互补的3’突出端退火，从而形成二价的退火适配体。就退火而言，以等摩尔比合并两种单体并在95℃加热3分钟，然后缓慢冷却至37℃。
流式细胞术分析
使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest软件(BectonDickinson，Heidelberg，Germany)来评价免疫RNA构建体的细胞结合活性。用结果中所述的FITC标记构建体染色细胞(25)。简言之，对每个样品收集一万个事件，并使用适当的散射门控(scatter gate)进行完整细胞分析，以排除细胞碎片和聚集体。将2-5×105个细胞与10μl浓度为10-100nM的蛋白质-RNA构建体或RNA-RNA构建体一起在冰上孵育30分钟。用含有0.2％(重量/体积)BSA和0.05％(重量/体积)叠氮化钠(PBA)的1×PBS缓冲液将细胞洗涤两次。最后一次洗涤后，在FACScalibur(Becton Dickison，Heidelberg，Germany)上分析细胞。
通过流式细胞术进行的亲和力分析
使用基于流式细胞术的平衡结合测定来测定所产生构建体的结合亲和力。对恒定量的细胞使用浓度递增的Fluoresceine标记适配体构建体。对于流式细胞术分析而言，将细胞在冰上暗中孵育20分钟。用1×PBS将细胞洗涤两次并重悬于500μL 1×PBS中用于FACS分析。收集一万个事件并使用适当的散射门控进行分析，以排除聚集体和细胞碎片。通过用Fl1方向的平均荧光迁移对对数适配体浓度作图来产生结合曲线。
比色法细胞增殖测定
首先用来自BD Biosciences(Franklin Lakes，USA)的Annexin V凋亡试剂盒进行凋亡分析，其中可记录特定siRNA的轻微影响(数据未显示)。通过某些形态学特征来表征凋亡途径，包括质膜不对称性和附着的丧失、细胞质和细胞核的凝聚以及DNA的核小体间切割。Annexin V-FITC是用于鉴定凋亡细胞的灵敏探针。其以高于多数其它磷脂的磷脂酰丝氨酸(PS)特异性结合带负电的磷脂表面。如AnnexinV-FITC染色方案中所述，Annexin V-FITC结合需要确定的钙和盐浓度。纯化的重组Annexin V在最适条件下与FITC缀合。使用被诱导为发生凋亡性细胞死亡的原代细胞或细胞系来常规地测试AnnexinV-FITC。对600μl完全培养基等分试样中的2-4×104个靶细胞应用确定浓度的免疫RNA构建体，并将板在37℃孵育48小时。之后根据制造商的说明进行分析。
如Barth，S.等2000所公开的，通过测量黄色四唑盐(XTT)到水溶性橙色甲月替染料的代谢来测定免疫RNA构建体对靶细胞的细胞毒效应。向96孔板中100μL完全培养基中的2-4×104个靶细胞添加100μL完全培养基中不同稀释度的蛋白质-RNA构建体和RNA-RNA构建体，使得最终测试体积为200μL。随后将平板在37℃下孵育48小时。之后用100μl补充有XTT/PMS(终浓度分别为0.3mg/mL和0.383ng)的新鲜培养基将细胞培养物脉冲处理24小时。用ELISA读数计(MWGBiotech)在450nm和650nm(参照波长)处测量样品的分光光度吸收。测定达到相对于未处理的对照细胞而言蛋白质合成降低50％(IC50)所需的浓度。所有的测量一式三份进行。
还通过OPERA Sytem(Evotec technologies)证实免疫RNA构建体的效果。OPERA是一种新型共聚焦微孔板成像读数器，其提供用于全自动高速高分辨率筛选的溶液。高分辨率的关键是严格地共聚焦成像和水浸透镜的使用。实验的过程与上述XTT-生存力测定之一相同。将2-4×104个靶细胞以100μl的等分试样分散在96孔板中。添加完全培养基中Ki-4RNA构建体的100μl等分试样，并将板在37℃孵育96小时。将免疫RNA构建体Ki-4-siRNA应用于靶细胞之后，就细胞形态的改变和偶联siRNA(在该情况下为针对EEF2和GFP的siRNA)的沉默效果来分析细胞。对于最终的测量而言，将细胞与DRUG 5(根据制造商方案使用)一起孵育以显示细胞增殖。所有的测量一式三份进行。
结果
评价RNAi对真核延伸因子2的毒性
评价核酸部分(siRNA)
敲低绿色荧光蛋白(EGFP)
为了建立用于一般性评价siRNA沉默活性的参考体系，将不同浓度的siEGFP转染进用eGFP(293-LGFP-KMH)转化的293T细胞中。48小时后通过流式细胞术分析细胞，检测到eGFP信号被敲低至约60％。
敲低真核延伸因子2(EEF2)
对应于上述的结果，使用相同浓度的针对EEF2的siRNA转染293T、MCF-7、LNCaP和L540细胞。所有的转染实验均使用一种用于siRNA转染的特殊脂转染溶液--由Qiagen
Figure S2006800479378D00241
提供的RNAifect
Figure S2006800479378D00242
因为延伸因子2的敲低会抑制蛋白质合成并会导致细胞死亡，所以通过体外细胞毒性测试(XTT生存力测定)来评价siRNA的效力。siRNA转染后48小时，在ELISA-读数器上通过测量450nm(L1)和650nm(L2)处的吸光度(减少L1-L2)来分析细胞的生存力。所有的实验一式三份进行。
在所有四种靶细胞系中均观察到，计算出的50％细胞生存力时的中位数抑制浓度(IC50)均为0.9和1.1μg/ml之间(图1-4)。
免疫RNA构建体的设计
蛋白质-siRNA构建体
将靶向淋巴瘤细胞上CD30的全长抗体Ki-4与针对EGFP或真核延伸因子2(EEF2)的siRNA共价偶联。
通过形成二硫桥将RNA与抗体缀合：在缀合反应前，用异双功能接头SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)修饰在其3’末端含有反应性氨基的合成siRNA。通过与Trauts试剂(2-Iminotholane)的反应将游离的巯基插入抗体中。最后简单地混合两种活化部分，通过吡啶基二硫化物交换反应实现共价缀合。
全RNA构建体
评价针对EEF2的siRNA之后，通过使用短接头序列的装配PCR将其与适配体部分(靶向HER3的A30和靶向PSMA的xPSM-A-3)遗传融合。用短发夹环连接siRNA的有义和反义链，从而允许从单个DNA链合成适配体shRNA构建体。
构建体设计中最重要的一点是确保适配体区域的正确折叠(作为结合的必要条件)和siRNA的正确折叠(作为诱导特异性mRNA降解的必要条件)。最终的构建体由独立地折叠成其天然构象而不受shRNA部分影响的适配体区域组成。这可通过在适配体序列的3’末端插入短接头序列来实现(图5和图6)。
成功的PCR装配后，通过DNA序列分析确认DNA序列。
为了获得相应的RNA序列，进行体外转录并随后通过凝胶电泳(8％尿素PAGE凝胶)纯化产物。一次体外转录的产率通常在约15μgRNA的范围内。因为适配体的正确折叠是其结合活性所必需的，所以在所有的实验前将RNA在95℃加热5分钟并最后在37℃孵育15分钟，以允许形成正确的三级结构。
二价适配体siRNA构建体
为了提高适配体siRNA融合构建体的价，以两个适配体官能度均最有可能折叠成其天然构象的方式插入第二个适配体寡核苷酸序列。使用MFold 3.2(http://molbio.info.nih.gov/molbio-nih/mfold.html)RNA折叠算法对所设计的二价RNA构建体进行的二级结构分析显示，在两种构建体(PSMB1-siEEF2以及PSMB2-siEEF2)中，两个适配体部分均采取与单体适配体x-PSM-A-3相同的二级结构。另外，这些结构是两种构建体均具有最低的计算自由能(ΔG)的结构(图7和图8)。
除了PSMB1-siEEF2和PSMB2-siEEF2外，设计了第三种构建体，其中使用与siRNA部分相似的互补性3’突出端，通过Watson Crick碱基配对将两个适配体部分融合(图9)。
测试全RNA构建体的特异性沉默效果
为了测试适配体-shRNA构建体的特异基因沉默功能，通过脂转染法将三种不同的RNA构建体(两种针对GFP，一种针对EEF2)转染进293-LGFP-KMH细胞中。使用针对GFP和EEF2的siRNA作为阳性对照。
令人惊奇的是，尽管在适配体-shRNA构建体的情况中siRNA与适配体共价连接，但是适配体-shRNA构建体与未缀合siRNA的效果几乎相同。因此，共价附着的适配体不影响siRNA部分的基因沉默活性。
在图10中，显示了在转染针对GFP的适配体构建体和siRNA后，293-LGFP-KMH细胞中降低的GFP表达(约60％)。使用碘化丙锭染色来检测凋亡细胞的量。转染后48小时，通过流式细胞术分析用适配体-shRNA构建体以及siEEF2转染并用碘化丙锭染色的细胞(图11)。将细胞用冷的1×PBS洗涤两次并最终重悬于500μl 1×PBS的样品量中。与未转染细胞相反，在含siRNA的转染样品中检测到大量凋亡细胞。
抗体、适配体、蛋白质-RNA构建体和全RNA构建体的结合特性 适配体A30
分析适配体A30对MCF-7细胞上Her3的结合亲和力。使用细胞系L540(Her3阴性)作为阴性对照。RNA被3’氧化并用FITC标记，这使得可以通过流式细胞术分析与细胞的结合。我们使用不同浓度的FITC标记适配体A30，并平行使用抗体抗Her3(特异性结合Her3)，因为使用了GAM IgG PE(结合抗Her3抗体的fc部分)作为第二抗体。将细胞用冷的1×PBS洗涤两次，重悬于500μl 1×PBS中，并与不同浓度的FITC标记A30在暗中孵育30分钟，或与第一抗体抗Her3孵育。第一个孵育步骤后用冷的1×PBS洗涤细胞两次，并在与FITC标记的A30孵育后重悬于500μl 1×PBS中并通过流式细胞术分析(示于图12)，或者在与抗Her3孵育后重悬于500μl 1×PBS中并与第二抗体GAM IgG PE在暗中孵育30分钟。第二个孵育步骤后，用1×PBS再次洗涤细胞，重悬于500μl 1×PBS中，最后通过流式细胞术分析(示于图13)。
为了确保A30与MCF-7细胞上的抗原Her3特异性结合，测试适配体在L540细胞上的结合亲和力，其中检测不到结合(数据未显示)。
测试适配体的结合后，通过流式细胞术分析A30的适配体-shRNA融合构建体(示于图14)。对该实验而言，通过临进行FACS分析前滤过100μm筛目来分离细胞，这得到更均质的细胞群。
为了显示适配体-shRNA构建体的特异性，还在L540细胞上对其进行测试，其中看不到构建体的结合(示于图15)。
适配体xPSM-A-3
如文献中所述，适配体xPSM-A-3与LNCaP细胞表面上表达的抗原PSMA(前列腺特异性膜抗原)特异性结合。为了显示适配体即使与shRNA遗传融合仍以高特异性与抗原结合，对两种RNA(xPSM-A-3和xPSM-A-3-siGFP)均进行FITC标记，并分析其与LNCaP和MCF-7(PSMA阴性)细胞的结合(图16-17)。使用针对PSMA的特异性第一抗体(抗PSMA)作为阳性对照，用第二抗体GAM IgG FITC(结合抗PSMA抗体的fc部分)验证细胞膜上PSMA的表达(图18和19)。如上文所述制备和分离细胞。
由于流式细胞术分析的结果(其中在MCF-7细胞的直方图中也能看到FITC标记的适配体和适配体-shRNA构建体的小迁移)，在荧光显微镜下进一步分析细胞。
图20显示FITC标记的RNA-构建体对LNCaP细胞表面的显著染色，使得染色细胞的形状清晰可见。
相反，PSMA阴性细胞系MCF-7不被RNA-构建体结合。轻微的背景是由残余的游离荧光素引起的。
最后能够确定shRNA部分(核酸部分)与适配体xPSM-A-3或A30(复合体的靶向部分)的遗传融合不影响结合活性。在xPSM-A-3(其针对存在于LNCaP细胞的细胞表面上的前列腺特异膜抗原(PSMA))和A30(其针对MCF-7细胞表面上表达的抗原Her3)的情况下，两种复合体均显示结合特异性。
在基于流式细胞术的平衡结合测定中测定x-PSM-A3siEEF2的亲和力。在图21中用平均荧光强度(其在fl1方向上以任意的荧光单位测量)对荧光素标记适配体的浓度作图。对数据进行S形拟合后，可以测定在LNCaP细胞表面上观察到的解离常数(Kd)为26.7nM。
二价适配体构建体PSMB1-siEEF2、PSMB2-siEEF2和PSMA biv anneal
二价适配体siRNA构建体PSMB1-siEEF2和PSMB2-siEEF2的特异性结合也通过流式细胞术证明。将荧光素标记的适配体构建体与2＊105个细胞在300nM的浓度下孵育，然后通过流式细胞术分析样品。如图22所示，两种二价适配体构建体均显示了在fl1方向上的显著迁移，所述迁移与一价xPSM-A-3的迁移相当。这些结果清楚地表明，二价适配体的适配体部分折叠成引起特异性抗原识别的活性构象。
如上所述，二价适配体PSMA biv anneal是通过Watson crick碱基配对形成的。因此，两种单体在流式细胞术分析之前退火。以1∶1的比例将两种单体在1×PBS缓冲液中混合并在94℃加热4分钟，随后缓慢冷却至37℃。形成的复合体在尿素PAGE凝胶中以约200个碱基的预期大小电泳(数据未显示)。
为了证明二价适配体构建体的特异性结合，在FACS分析之前对形成二价构建体PSMA biv anneal的两种单体均进行荧光素标记，并在杂交反应中接合。如上所述制备细胞并使用300nM浓度的退火二价适配体。图23显示LNCaP细胞上FL1方向的显著迁移。这表明两种适配体官能度均折叠为其天然构象，使得二价适配体结合存在于LNCaP细胞的细胞表面上的PSMA抗原。
像一价适配体构建体x-PSM-A3一样，也在基于流式细胞术的平衡结合测定中测定该二价适配体构建体的亲和力。图24显示S形曲线，所述曲线得自用fl1方向观察到的平均荧光对荧光素标记PSMA的浓度作图。可测定该退火二价适配体对LNCaP细胞细胞表面的亲和力(Kd)为46.5nM。
全长抗体Ki-4
抗体Ki-4以高亲和力结合存在于例如L540细胞上的CD30受体。如文献中所述，该抗体与CD30结合后触发受体介导的胞吞作用。这是抗体有可能转移进胞质溶胶中的原因。为了评价Ki-4与siRNA偶联后的结合亲和力，将L540细胞与蛋白质-siRNA构建体Ki-4-siEEF2以及与未缀合的全长抗体Ki-4一起孵育(示于图25)。使用CD30阴性细胞系293T作为阴性对照，与相同量的Ki-4-siEEF2和Ki-4一起孵育(示于图26)。如上所述制备细胞并通过流式细胞术分析。最后，可观察到siRNA(核酸部分)与全长抗体(靶向部分)的共价偶联不影响所得构建体的结合活性。
siRNA构建体(免疫RNA构建体)A30-siEEF2、xPSM-A-3-siEEF2和 Ki-4-siEEF2的毒性分析
对应于免疫RNA构建体被动转染进细胞后记录的RNAi效应以及特异性结合分析，必须分析构建体对其靶细胞的毒效应。为了在体外表征包含靶向区(作为靶向部分)和RNA(作为核酸部分)的免疫RNA构建体的细胞毒活性，在分别与不同浓度(0.2-0.3nmol)的免疫RNA构建体Ki-4-siGFP、Ki-4-siEEF2、xPSM-A-3-siGFP、xPSM-A-3-siEEF2、A30-siGFP和A30-siEEF2孵育后评价靶细胞的增殖。使用基于XTT的比色测定来记录细胞系MCF-7(HER3阳性)、L540(CD30阳性)和LNCaP(PSMA阳性)的生长抑制。XTT生存力测定提供了关于与免疫RNA构建体孵育一段时间后测试细胞生存力的信息。最后，将XTT-Phenancin溶液加入在接下来的96小时中进行分析的细胞中(图27、29和30)。
测定在96孔板中进行，并以ELISA读数器中在450nm(L1)和650nm(L2)波长处测量(减少L1-L2)。
如果将细胞与相同浓度的免疫RNA构建体A30-siEEF2或游离siEFF2一起孵育，则能观察到细胞生存力的显著差异(图27)。
另外，在显微镜下研究MCF-7细胞(图28)。与XTT-生存力测定的结果一致，在与A30-siEEF2孵育的细胞样品中可观察到颗粒细胞数目(细胞凋亡的指示剂)的增加。
在两种免疫RNA构建体Ki4-siEEF2和xPSM-A-3-siEEF2的情况下，可以以细胞类型选择性方式诱导增殖抑制。Ki4-siEEF2导致L540细胞的生存力降低多达70％(图30)，而xPSM-A-3-siEEF2使增殖降低多达50％(图29)。
CD30及PSMA为阴性的细胞系MCF-7在后两种情况下均不受免疫RNA构建体xPSM-A-3-siEEF2和Ki-4-siEEF2之一的影响(数据未显示)。使用多至10μg/ml的浓度。因此复合体的靶向部分(结合CD30的Ki-4和结合PSMA的抗PSMA)为完整的免疫RNA构建体赋予了特异性。
除了XTT生存力测定的结果外，在Opera System(EvotecTechnologies，Hamburg，Germany)中研究细胞。Opera是高通量成像系统，其能够详细显示应用Ki-4-RNA-构建体后细胞的形态改变。使用Drug5通过核染色来染色细胞，以显示整个细胞，最后在40.000倍分辨率下观察。与用Ki-4-siGFP或游离siEEF2孵育的细胞相反，用Ki-4-siEEF2处理的细胞显示提高的凋亡细胞数(图31，图片1至9)。在图片1中显示了正常生长条件下的L540-GFP细胞。图片2显示用1.5μl RNAiFect转染试剂(Qiagen GmbH)处理的L540-GFP细胞。在图片3中，用约3μg Ki-4-siEEF2处理细胞，并显示构建体对形状和生存力的显著影响。图片4显示与相同浓度的蛋白质构建体一起孵育的细胞，但是siRNA的沉默效应是针对GFP。这时看不到细胞形态学和生存力的改变，但是GFP表达似乎降低了。图片5和6显示用0.2nmol针对EFF2或GFP的siRNA以及1.5μl RNAiFect进行转染的细胞作为阳性对照。相应于转染的RNA量，图片7和8显示0.2nmol游离siRNA的效果。该RNA不以任何方式影响细胞。作为XTT-生存力测定的阳性对照，将细胞在添加了100μg/ml Zeocin的1640培养基中孵育。
基于RNA的siRNA构建体在LNCaP细胞上的定量增殖测定
为了进一步表征一价适配体siRNA构建体并将其与二价适配体siRNA构建体PSMA-B1和PSMA-B2进行比较，以定量方式进行上述增殖测定。因此，在从2μM下至0.0022μM浓度的范围内监测所有siRNA适配体融合物的浓度依赖性细胞毒性。所有的构建体均在三个独立的实验中一式三份进行测量。将得到的计量应答曲线就EC50值和获得的最大应答进行比较。
结果示于图32。与一价构建体x-PSM-A-3 siEEF2相比，两种二价适配体构建体PSMAB1和PSMAB2均显示显著更高的最大应答，表明细胞毒性显著提高。另外，两种二价构建体均显示显著更低的EC50(PSMB1-siEEF2：0.517μM，PSMB2-siEEF2：0.211μM，xPSM-A-3siEEF2：1.51μM)值，这是另一效率更高的参数。综上，这些结果清楚地表明，价的提高引起细胞毒效力的改进。
如果对PSMB1-siEEF2和PSMB2 siEEF2进行比较，必须声明两种构建体的最大应答是在相同的范围内，但是如果比较相应的EC50值，则可显示显著的差异(PSMB1-siEEF2：0.5174±0.1246μM；N＝3；PSMB2-siEEF2：0.2115±0.01282μM N＝4；p：0.0336＊)。因为两种构建体仅在于RNA中存在的siRNA序列数上有所不同(PSMB1-siEEF2＝一个siRNA部分，PSMB2-siEEF2＝两个siRNA部分)，所以该结果清楚地表明，这些构建体的整体效力取决于siRNA的化学计量。
所有的效应都是细胞类型选择性的，因为本文所示的免疫RNA构建体不在PSMA阴性MCF-7细胞中诱导任何细胞毒效应(图33)。
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Claims (18)

1.一种化合物，其包含：
-靶向部分，其特异性结合与疾病相关的细胞表面标志物，所述靶向部分是适配体；
-核酸部分，其特异性诱导细胞死亡并且是特异性地抑制真核延伸因子2(eEF-2)之活性的核酸部分；或者是特异性地抑制凋亡抑制剂活性的核酸部分；
-接头，其将所述靶向部分与所述核酸部分共价连接。
2.权利要求1的化合物，其中所述凋亡抑制剂包括Bcl2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1、Ced9、E1B19K或BHRF1、Bag-1、Raf-1、钙依赖磷酸酶、Smn、Beclin、ANT和VDAC、IAP-1、IAP-2、存活素、x-IAP、IKK-α、IκB或NF-κB、FLIP、PI3K或PDK1。
3.权利要求1的化合物，其中接头为二硫键、磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、胺键、硫醚键、醚键、酯键或碳-碳键。
4.权利要求1至3中任一项的化合物，其中所述靶向部分是至少一个适配体。
5.权利要求4的化合物，其中所述靶向部分由至少两个适配体代表。
6.权利要求1至5中任一项的化合物，其中所述与疾病相关的细胞表面标志物选自CD抗原、细胞因子受体、激素受体、离子泵、通道形成蛋白、多聚体的细胞外基质蛋白、金属蛋白酶、Her3或PSMA。
7.权利要求1至5中任一项的化合物，其中所述与疾病相关的细胞表面标志物是生长因子受体。
8.权利要求1至7中任一项的化合物，其中所述靶向部分与靶细胞的细胞表面受体结合，并介导其后该化合物转运进入靶细胞的胞质溶胶。
9.权利要求8的化合物，其中所述核酸部分在该化合物转运进入靶细胞后诱导靶细胞的细胞死亡。
10.权利要求1的化合物，其包含由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接的适配体和核酸。
11.权利要求10的化合物，其由RNA组成。
12.权利要求1的化合物，其中所述核酸部分不诱导细胞死亡，但是下调靶细胞调节途径中特定的关键元件。
13.编码权利要求11的RNA的DNA。
14.转染了权利要求11或13的RNA或DNA的细胞，其中所述细胞是L540、MCF-7、LNCaP或293T细胞。
15.权利要求1至12中任一项的化合物，其还包含允许纯化和/或检测该化合物、便于该化合物转运进入靶细胞和/或在其中进行胞内分离和/或活化所述核酸的部分。
16.药物，其包含权利要求1至11中任一项的化合物、权利要求13的DNA或权利要求14的细胞。
17.权利要求16的药物，其中所述药物局部给药或全身性给药，或者与其它增强疗效的化合物组合给药。
18.权利要求1至12中任一项的化合物、权利要求13的DNA或权利要求14的细胞用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌性或非癌性增生性疾病、变态反应、自身免疫病和/或慢性炎症或感染。
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