KR101511183B1 - ｓｉＲＮＡ의 타겟된 운반 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질-이중 가닥 RNA 복합체를 세포와 접촉하는 단계를 포함하는 RNA 간섭 분자를 세포 또는 환자의 세포로 운반하는 방법으로, 상기 복합체는 이중 가닥의 목적 RNA를 포함하는 이중 가닥 RNA 절편, 및 (i) 타겟 세포 상의 특정 위치에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티 및 (ii) 이중 가닥 RNA에 결합하는, 타겟팅 모이어티와 연관된 결합 모이어티를 포함하는 단백질을 포함하며, 상기 이중 가닥 RNA 절편이 세포로 운반되어 세포 내 타겟 RNA의 RNA 간섭에 영향을 미치는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
siRNA, 타겟팅 모이어티, 결합 모이어티, 단백질-이중 가닥 RNA 복합체

Description

ｓｉＲＮＡ의 타겟된 운반{Targeted Delivery of siRNA}
본 발명은 RNA 간섭 방법들, 특히 CD7을 발현하는 타겟 세포 내로 작은 간섭 RNA들(small interfering siRNAs)의 운반에 관한 것이다.
최근에 큰 관심을 받고 있는 RNA 간섭(RNAi)은 외인성 이중 가닥 RNA(dsRNAs)를 세포 내로 도입하여 특정 mRNA를 특이적으로 파괴하거나 또는 그 발현을 차단함으로써 유전자 발현을 감소시키거나 또는 억제(abolish)시키는 기술이다(A. Fire et al., "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans," Nature, 391 :806-l1(1998)). 작은 간섭 RNA들(siRNAs) 및 마이크로 간섭 RNA들(miRNAs) 같은 특이적 형태의 RNA가 많은 특이 유전자들의 발현을 효과적으로 억제시키는 것으로 알려져 있으며, 상기 기술은 초파리, 꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 및 식물에서 효과적이고 최근에는 포유동물 세포 배양에서도 유효한 것으로 증명되었다(S.M. Elbashir et al., "Duplexes of 2 1-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells," Nature, 411: 494-8(2001)). 작은 간섭 RNA 분자들이 특이적 타겟으로 지정되어 특정 유전자를 사일런싱하기 때문에, 신규한 약물(pharmaceuticals)의 스크리닝 뿐 아니라 질병의 치료, 그리고 약제학적 타겟의 결정을 위한 질병 기작에 작은 간섭 RNA 분자들이 유용한 것으로 고려되고 있다. 하지만, 치료 방법 및 스크리닝 방법에서 많은 응용들이 제시되고 있는 중에, 세포 내로 siRNAs 및 miRNAs를 포함하는 RNA 간섭 인자들(RNA interfering agents)의 운반이 장애 요인(bottleneck)임이 증명되었다.
RNA 간섭 인자를 세포로 운반하기 위한 최근에 알려진 방법들은 지질-기반, 아민-기반 및 폴리머-기반 기술, 그리고 이들의 조합을 이용한 화학적 트랜스펙션(참조: 예를 들어, Ambion Inc.(Austin, TX), Novagen, EMD Biosciences, Inc., Merck KGaA 자회사(Darmstadt, Germany)의 생산물들)을 포함한다. 불행하게도, 화학적 트랜스펙션을 이용한 일차 세포로 siRNA의 전이를 포함하는 RNA 간섭 인자의 효율적인 전이는 몇몇 형태의 세포들로 제한되는 것처럼 보인다(Ovcharenko D, "Efficient delivery of siRNAs to human primary cells." Ambion TechNotes, 10(5): 15-16(2003)).
siRNA를 운반하는 다른 방법들은 렌티바이러스 컨스트럭트 같은 벡터로부터 짧은 헤어핀 RNA 분자들을 발현하고 전기천공법(electroporation)을 이용하여 세포 내로 siRNA 분자를 도입하는 것을 포함한다. 하지만, 이러한 방법들과 함께 펠린 면역결핍 바이러스(FIV) 레트로바이러스에 기반한 펠린 FIV 렌티바이러스 벡터들 및 후천성 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)에 기초한 HIV 렌티바이러스 벡터 시스템은 영구적인 통합에 관련된 문제들을 해결한다. 전기천 공법은 매우 거친 처리이므로 인 비보 세포 내로 siRNA의 운반에 일반적으로 이용할 수 없다.
RNA 간섭 인자를 운반하는 용도로 상기 논의된 종래의 유전자 운반 방법들의 또 다른 문제는 모든 세포를 비-특이적으로 타겟팅한다는 것이다. 따라서, 목적(of interest) 세포들로 타겟팅함으로써 비-타겟 세포로의 RNA 간섭 인자의 운반에 의해 야기될 수 있는 잠재적인 부작용(side effects)을 최소화 또는 피할 수 있는 유전자 운반 방법을 개발하는 것이 유용할 것이다. 또한, 바이러스 벡터를 피할 수 있으며 siRNA를 포함하는 RNA　간섭 인자의 인 비보 및 인 비트로 운반에 이용될 수 있는 효과적인 간섭 RNA 운반 방법들이 바람직할 것이다.
더욱이, 바이러스 벡터, 리포좀 및 이의 유사체들을 포함하는 전통적인 벡터들을 이용하여 siRNA를 운반하는(transduce) 것이 여러 형태의 세포들에서 매우 어려운 것으로 증명되어 졌다. 상술한 세포들은 림프구 및 수지상세포 같은 면역 시스템 세포들 및 줄기 세포들을 포함한다.
이와 같은 세포 형태로 T 세포가 있다. 따라서 HIV 감염에 대한 siRNA의 치료 효능에 대한 평가는 T 세포로의 운반의 어려움(challenges) 및 작은 동물 모델의 부재로 인해 최근까지 어려운 실정이다. HAART와 관련된 독성 및 빈번한 치료 실패로 인해 HIV 감염에 대한 또 다른 치료 전략으로서 RNAi의 강력한 유전자 사일런싱 기작에 대한 관심이 커지고 있다1-4. 여러 가지 인 비트로 연구들은 RNAi가 HIV의 주요한 타겟인 세포주, 일차 인간 T 세포 및 대식세포에서 HIV 감염 의 효과적인 억제능을 가진다는 것을 보여 왔다5-9. 하지만, 실질적인 치료 용도로서 감염되기 쉬운 세포로 효과적인 siRNA의 운반, 항-바이러스 효능 및 독성 같은 많은 변수들이 인 비보에서 테스트될 필요가 있다. 최근에 보고된 면역결핍 마우스의 IL-2 수용체의 일반 감마 체인 부재(IL2 receptor common gamma chain null, IL2rγ-/-) 스트레인은 인간 면역세포의 효과적인 재건(reconstruction)을 통해 마우스에 HIV 감염을 가능하도록 만들었지만10-13, 일차 인간 T 세포로 siRNA 운반은 아직까지 장벽(hurdle)으로 남아 있다. 따라서 이제까지 어떠한 연구들도 인 비보에서 HIV 감염을 억제하는 siRNA의 치료능을 실질적으로 테스트하지 못 했다.
그러므로, 치료 및 약물 스크리닝에서 siRNA를 포함한 발견된 RNA 간섭 인자의 능력을 완전하게 이용하기 위해, 인 비트로 및 인 비보에서 세포 내로 siRNA를 운반하는 방법을 개발하는 것이 필요하다.
본 발명은 RNA 간섭 분자를 세포 또는 환자의 세포로 운반하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체 같은 RNAi-복합체에 관한 것으로, 상기 복합체는 타겟팅 모이어티가 프로타민 단편 또는 이의 상동물(homologue) 같은 단백질, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인 같은 결합 모이어티와 결합되어(associated) 있고, 상기 결합 모이어티는 siRNA 또는 miRNA 같은 RNA 간섭 분자와 결합하면 세포 표면 항원(예를 들어, 타겟팅 모이어티가 T 세포에 존재하는 CD7 수용체에 결합하면 내재화(internalization)되는 T-세포의 세포 표면 항원)을 타겟팅하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 같은 타겟팅 모이어티를 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 RNAi 분자의 세포 내 운반에 유용하다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 질병 및 질환(disease and disorder)의 치료 및/또는 예방(예방 치료), 예를 들어 T-세포 관련 질병 및 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하며, 보다 상세하게는 건강한 정상인과 비교하여 T 세포-결핍 또는 감소된 T 세포 레벨을 가지는 환자의 질병 또는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 조성물은 건강한 정상인과 비교하여 T 세포-증식 및/또는 증가된 T 세포 레벨을 가지는 환자의 질병 또는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 HIV 감염의 예방 또는 HIV에 감염된 환자의 치료에 유용하다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 암의 예방 및/또는 치료에 유용하며, 예를 들어 T-세포 림프종 및 기타 같은 종류의 종양을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태는 융합 단백질-이중 가닥 RNA 복합체를 세포와 접촉하는 단계를 포함하는 RNA 간섭-유도 분자를 세포로 운반하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 복합체는 a) 하나의 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA에 상보적이며 다른 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA와 동일한 것으로 이루어진 이중 가닥 RNA 절편(segment)을 포함하는 RNA 분자; 및 b) (i) 타겟 세포의 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)로, 상기 타겟팅 모이어티가 세포 표면 항원에 결합하면 세포 표면 항원이 내재화(internalization) 되고, 그리고 (ii) 이중 가닥 RNA 절편에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 단백질을 포함하며, 상기 이중 가닥 RNA 절편은 상기 세포로 운반되어 세포 내 타겟 유전자의 RNA 간섭에 영향을 미친다.
본 발명의 다른 양태는 RNAi-복합체를 세포와 접촉하는 단계를 포함하는 RNA 간섭-유도 분자를 세포로 운반하는 방법으로, 본 발명의 RNAi-복합체는 결합 모이어티와 결합된 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티와 결합된 이중 가닥 RNA 절편으로 필수적으로 구성되어 있고, (a) 하나의 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA에 상보적이며 다른 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA와 동일한 것으로 이루어진 상기 이중 가닥 RNA 절편을 포함하는 RNA 분자; 및 (b) 타겟 세포의 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 상기 타겟팅 모이어티, 및; (c) 상기 이중 가닥 RNA 절편에 결합하는 상기 결합 모이어티를 포함하며, 상기 이중 가닥 RNA 절편은 상기 세포로 운반되어 세포 내 타겟 유전자의 RNA 간섭에 영향을 미친다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 표면 항원은 T-세포의 세포 표면 항원이며, 예를 들어 CD7 수용체 또는 이의 상동물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 이중 가닥 RNA는 siRNA이다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟팅 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 예를 들어 단일쇄 항체, 항체의 Fab 부위 또는 항원에 결합하는 (Fab')2 절편을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 단백질 또는 단백질의 핵산 결합 도메인이며 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 상기 타겟팅 모이어티와 연결되어 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티는 펩타이드 결합에 의해 결합되어 있으며, 예를 들어 상기 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티가 융합 단백질로서 포함되고 상기 결합 모이어티는 타겟팅 모이어티의 카르복시 부위에 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
예를 들어, 단백질의 핵산 결합 도메인으로 이루어진 결합 모이어티의 예는 GCN4, Fos, Jun, TFIIS, FMRI, 효모 단백질 HX, 비길린(Vigillin), Merl, 박테리아 폴리뉴클레오타이드 포스포릴라제, 리보좀 단백질 S3 및 열충격 단백질, 또는 이들의 핵산 결합 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 단백질들 내에 존재하는 핵산 결합 도메인들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 프로타민 또는 이의 핵산 결합 단편(fragment)이며, 예를 들어 본 발명의 결합 모이어티는 프로타민의 RNA 간섭-유도 분자-결합 단편일 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 이중 가닥 RNA 절편은 c-myc, VEGF, CD4, CCR5, gag, MDM2, Apex, Ku70 또는 ErbB2을 인코딩하는 mRNA의 유전자 사일런싱을 타겟팅한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 이중 가닥 RNA 절편은 종양 유전자 또는 원형종양 유전자(oncogene or proto-oncogene)를 인코딩하는 mRNA의 유전자 사일런싱을 타겟팅한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 이중 가닥 RNA 절편은 바이러스 유전자, 예를 들어 tat 또는 vif 유전자 같은 HIV 유전자의 유전자 사일런싱을 타겟팅하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, RNA 분자를 운반하는 본 발명의 방법은 세포로의 운반이고, 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 배양 세포이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 기관(organ)의 일부분이거나 또는 대상 동물(subject animal) 또는 인간의 일부분(즉, 대상 동물 또는 인간에 존재하는 일부분)이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 배아줄기세포이다.
본 발명의 다른 양태는 결합 모이어티와 연관된 타겟팅 모이어티를 포함하는 조성물로서, 이중 가닥 RNA 절편이 상기 결합 모이어티와 결합되어 있으며 상기 타겟팅 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고 상기 결합 모이어티는 프로타민 또는 이의 핵산 결합 단편, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인인 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는 결합 모이어티와 결합된 타겟팅 모이어티 및 이중 가닥 RNA 절편으로 필수적으로 구성된 조성물로서, 상기 타겟팅 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고 상기 결합 모이어티는 프로타민 또는 이의 핵산 결합 단편, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인인 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 결합 모이어티와 결합된 타겟팅 모이어티 및 이중 가닥 RNA 절편으로 이루어져 있으며, 상기 타겟팅 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고 상기 결합 모이어티는 프로타민 또는 이의 핵산 결합 단편, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인이다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 타겟 세포의 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티를 포함하며, 상기 타겟팅 모이어티가 세포 표면 항원에 결합하면 세포 표면 항원이 내재화된다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 세포는 T-세포이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 표면 항원은 CD7 또는 이의 상동물이다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 타겟팅 모이어티는, 예를 들어 단일쇄 항체, 항체 또는 (Fab')2 절편의 Fab 부위 및 이의 항원 결합 단편을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 결합 모이어티는, 예를 들어 단백질 또는 단백질의 핵산 결합 도메인을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 결합 모이어티는 상기 타겟팅 모이어티와 결합(associate)되어 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 결합 모이어티는, 예를 들어 GCN4, Fos, Jun, TFIIS, FMRI, 효모 단백질 HX, 비길린, Merl, 박테리아 폴리뉴클레오타이드 포스포릴라제, 리보좀 단백질 S3 및 열충격 단백질, 또는 이의 핵산 결합 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 단백질의 핵산 결합 도메인을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 결합 모이어티는, 예를 들어 프로타민 또는 이의 핵산 결합 단편이며, 보다 바람직하게는 프로타민의 RNA 간섭-유도 분자-결합 단편을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티는 당업자들에게 잘 알려진 방법에 따라 서로 결합되거나 또는 연결되어 있다. 예를 들어, 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티는 융합 단백질의 형태로 연결될 수 있으며, 이때 상기 결합 모이어티는 상기 타겟팅 모이어티의 카르복시 부위와 융합된다. 또한, 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티로 이루어진 융합 단백질의 다른 배치, 예를 들어 상기 결합 모이어티가 상기 타겟팅 모이어티의 N-말단 부위와 융합되는 경우도 본 발명의 방법 및 조성물에 유용하다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 이중 가닥 RNA 절편은 c-myc, VEGF, CD4, CCR5, gag, MDM2, Apex, Ku70 또는 ErbB2, 또는 이들의 상동물을 인코딩하는 mRNA의 유전자 사일런싱을 타겟팅한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 이중 가닥 RNA 절편은 종양 유전자 또는 원형종양 유전자를 인코딩하는 mRNA의 유전자 사일런싱을 타겟팅한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 이중 가닥 RNA 절편은 바이러스 유전자, 예를 들어 tat 또는 vif 유전자 같은 HIV 유전자의 유전자 사일런싱을 타겟팅하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 RNAi 분자를 세포로 운반하고, 본 발명의 어떤 구현예에 따르면 본 발명의 세포는 배양 세포이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 기관(organ)의 일부분이거나 또는 대상 동물(subject animal) 또는 인간의 일부분(즉, 대상 동물 또는 인간에 존재하는 일부분)이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 배아줄기세포이다.
본 발명의 다른 양태는 본 명세서에 개시된 조성물을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 RNA 간섭 분자를 환자의 세포로 운반하는 방법이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 대상은 인간이다.
따라서, 본 발명은 작은 간섭 RNA를 소망하는 세포로의 운반을 인 비트로 및 인 비보 타겟팅하는 신규한 방법을 제공함으로써 의도된 타겟 세포 이외의 세포로의 siRNA 운반(entry)을 피할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 특정 세포에 RNA 간섭 인자를 처리할 수 있게 함으로써 RNA 간섭 인자의 비-특이적 타겟팅에 의해 유도되는 RNA 간섭의 가능한 부작용을 제한한다. 더욱이, 이러한 특이적 타겟팅은 치료가 요구되는 환자에 투여되는 RNA 간섭 인자의 양을 최소화시킬 수 있는데, 이는 RNA 간섭 인자의 효과를 특이적 타겟 세포에 집중시킬 수 있기 때문이다. 특이적 타겟 세포는 CD7을 발현하는 세포들을 포함한다. CD7은 면역글로불린 수퍼패밀리에 존재하는 40kDa 세포 표면 당단백질이다. CD7은 대부분의 인간 흉선 세포 및 일단(85%)의 말초 혈액 T 세포에서 발현한다. 치료용 적용에 있어서 CD7의 중요한 특징은 항체와의 결합 후 빠르게 내재화되는 것이며, 심지어 일가항체 단편과의 결합 후에도 내재화된다.
인간화(humanized) 마우스 모델에서 신규한 운반 방법을 이용하여, 본 발명자들은 siRNA 처리가 인 비보에서 HIV 감염을 현저하게 억제할 수 있음을 보인다. 인간 말초 혈액 백혈구(Hu-PBL) 또는 조혈모세포(Hu-HSC)로 재건된 NOD/SCIDIL2rγc-/- 마우스에서 T 세포-특이적 siRNA 운반을 위해 판(pan) T 세포 표면 항원 CD7에 대한 단일쇄 항체가 올리고-9-아르기닌 펩타이드(scFvCD7-9R)에 컨쥬게이션되었다. T 세포-특이적 유전자-사일런싱은 scFvCD7-9R/CD4 siRNA 복합체의 정맥 내 주입을 통해 처음으로 확인되었다. HIV-감염된 Hu-PBL 마우스에서, 세포 내 CCR5를 타겟팅하는 siRNA 및 scFvCD7-9R과 복합된 바이러스 유전자의 조합 처리는 바이러스 복제를 조절하였으며 관찰한 4주 기간 동안 CD4 T 세포 손실을 억제하였다. 놀랍게도, 이러한 접근 방식(approach)은 HIV+ PBMC로 재건된 마우스에서 내인성 바이러스를 억제하여 CD4 T 세포 수의 회복을 초래하였다. 더욱이, scFvCD7-9R은 Hu-HSC 마우스에서 siRNA를 천연 T 세포로 운반하여 생체 외 HIV 도전에 저항성을 가지도록 하였다. 그러므로, 본 발명자들은 전임상 동물 모델에서 HIV 감염에 대한 siRNA 치료법의 실행가능성을 발견하고 직접적으로 증명하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 융합 단백질-이중 가닥 RNA 복합체를 세포와 접촉하는 단계를 포함하는 RNA 간섭-유도 분자를 세포로 운반하는 방법으로, 상기 복합체는 하나의 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA에 상보적이며 다른 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA와 동일한 것으로 이루어진 이중 가닥 RNA 절편을 포함하는 RNA 분자; 및 (i) 타겟 세포 상의 특정 위치에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티로, 상기 타겟팅 모이어티가 세포 표면 항원에 결합하면 세포 표면 항원이 내재화되고, 그리고 (ii) 이중 가닥 RNA 절편에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 단백질을 포함하며, 상기 이중 가닥 RNA 절편은 상기 세포로 운반되어 세포 내 타겟 유전자의 RNA 간섭에 영향을 미친다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 이중 가닥 RNA는 siRNA이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 모이어티는 scFv이다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명은 결합 모이어티와 결합된 타겟 모이어티를 포함하는 작은 간섭 RNA(siRNA)-복합체 또는 마이크로 간섭 RNA(miRNA)-복합체에 관한 것으로, 상기 결합 모이어티는 siRNA 같은 RNA 간섭 인자와 결합한다. 예를 들어, 본 발명은 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체 같은 RNAi-복합체에 관한 것으로, 상기 복합체는 타겟팅 모이어티가 프로타민 단편 또는 이의 상동물 같은 단백질, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인 같은 결합 모이어티와 결합되어 있거나 또는 상기 결합 모이어티는 siRNA 또는 miRNA 같은 RNA 간섭 분자와 결합하면 T 세포를 타겟팅하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 같은 타겟팅 모이어티를 포함한다.
본 발명의 특별한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체는 반드시 siRNA 또는 miRNA, siRNA 또는 miRNA와 결합하는 결합 모이어티 및 타겟팅 모이어티로 이루어져 있다.
또 다른 대안으로서, 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체는 siRNA 또는 miRNA, siRNA 또는 miRNA와 결합하는 결합 모이어티 및 타겟팅 모이어티로 이루어져 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, T 세포를 타겟팅하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 같은 타겟팅 모이어티는 T-세포의 세포 표면 항원에 결합하는데, 상기 T-세포의 세포 표면 항원은 상기 타겟팅 모이어티가 세포 표면 항원에 결합하면 내재화된다(결합된 타겟팅 모이어티 및 결합된 복합체와 함께). 예를 들어, 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 T 세포에 존재하는 그 같은 세포-표면 항원은 T 세포에 존재하는 CD7 수용체이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체 같은 RNAi-복합체에 관한 것으로, 상기 복합체는 상기 타겟팅 모이어티가 프로타민 단편 또는 이의 상동물 같은 단백질, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인 같은 결합 모이어티와 결합되어 있거나 또는 상기 결합 모이어티가 siRNA 또는 miRNA 같은 RNA 간섭 분자와 결합하면 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 T-세포의 세포 표면 항원(예: T 세포에 존재하는 CD7 수용체)을 타겟팅하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 같은 타겟팅 모이어티를 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명은 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체 같은 RNAi-복합체에 관한 것으로, 상기 복합체는 반드시 siRNA 또는 miRNA 같은 RNA 간섭-유도 분자와 결합된 결합 모이어티(예를 들어, 프로타민 단편 또는 이의 상동물 같은 단백질, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인)와 결합된 타겟팅 모이어티(예컨대, 상기 타겟팅 모이어티가 결합 모이어티와 결합하면 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 T-세포의 세포 표면 항원을 타겟팅하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편)로 이루어져 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체 같은 RNAi-복합체에 관한 것으로, 상기 복합체는 siRNA 또는 miRNA 같은 RNA 간섭-유도 분자와 결합된 결합 모이어티(예를 들어, 프로타민 단편 또는 이의 상동물 같은 단백질, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인)와 결합된 타겟팅 모이어티(예컨대, 상기 타겟팅 모이어티가 결합 모이어티와 결합하면 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 T-세포의 세포 표면 항원을 타겟팅하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편)로 이루어져 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 모이어티는 항체이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 단일쇄 항체, 항체 또는 (Fab')2 절편의 Fab 부위, scFv 또는 항체의 다른 항원 결합 단편이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 단백질 또는 단백질의 핵산 결합 도메인이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 타겟 모이어티의 카르복시 부위와 융합되어 있다. 본 발명의 타겟 모이어티의 부위(location)는 컨스트럭트의 카르복시-말단 또는 아미노-말단이거나 또는 융합 단백질의 중간일 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 siRNA 결합 모이어티 및 하나 이상의 타겟 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 프로타민, GCN4, Fos, Jun, TFIIS, FMRI, 효모 단백질 HX, 비길린, Merl, 박테리아 폴리뉴클레오타이드 포스포릴라제, 리보좀 단백질 S3 및 열충격 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질들 내에 존재하는 핵산 결합 도메인들로 구성된 군으로부터 선택된 단백질의 핵산 결합 도메인이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 프로타민 단백질 또는 프로타민의 RNA 간섭-유도 분자-결합 단편이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 9 아르기닌으로 이루어진 펩타이드이며, 이는 본 명세서에서 "9R"로 명시(refer)된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 c-myc, VEGF, CD4, CCR5, gag, MDM2, Apex, Ku70 또는 ErbB2를 인코딩하는 mRNA를 타겟팅한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 배양 세포이다. 선택적으로, 본 발명의 세포는 기관의 일부분이다. 또 다른 대안으로, 본 발명의 세포는 대상 동물이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 줄기세포, 예를 들어 성인 줄기세포 또는 배아줄기세포이다.
RNA 간섭-유도 분자들
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 융합 단백질-이중 가닥 RNA 복합체를 세포와 접촉하는 단계를 포함하는 RNA 간섭 인자를 세포로 운반하는 방법을 제공하며, 상기 복합체는 하나의 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA에 상보적이며 다른 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA와 동일한 것으로 이루어진 이중 가닥 RNA 절편을 포함하는 RNA 분자; 및 (i) 타겟 세포의 CD7에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티 및 (ii) 이중 가닥 RNA 절편에 결합하는 결합 모이어티를 포함하며, 상기 이중 가닥 RNA 절편은 세포에서 RNA 간섭을 일으킨다. 바람직하게는, 상기 이중 가닥 RNA 절편은 siRNA이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “이중 가닥(double stranded) RNA” 또는 “dsRNA”는 이중 가닥으로 구성된 RNA 분자를 의미한다. 이중-가닥 분자는 두-가닥(two-stranded) 구조를 형성하기 위해 그 자체로 이중 골격을 형성하는 단일 RNA 분자로 이루어진 분자를 포함한다. 예를 들어, 단일-가닥 miRNA를 만드는 선구 분자(pre-miRNA; Barrel et al., Cell, 116: 281-297(2004))의 스템-루프 구조는 dsRNA 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “RNA 간섭-유도 분자(RNA interference inducing molecule)” 또는 “RNAi 분자” 또는 “RNAi 인자”는 RNA-매개된 타겟 전사체 분해 또는 RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 유전자 발현을 억제하는 기능을 하는 이중 가닥 RNA 같은 RNA 분자를 의미한다는 점에서 상호 교환되어 사용된다. 다른 방식에 따른 기술에서, RNA 간섭-유도 분자는 타겟 유전자의 유전자 사일런싱을 유도한다. RNA 간섭-유도 분자의 전체적인 효능은 타겟 유전자의 유전자 사일런싱이다. siRNA에서 이용되는 RNA 간섭-유도 분자 같은 이중-가닥 RNA는 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 DNA 또는 단일-가닥 DNA와는 다른 특징을 가진다. 대부분 각 핵산들은 세포에서 중첩되지 않은(non-overlapping) 결합 단백질들에 의해 결합되고 중첩되지 않은 뉴클레아제에 의해 분해된다. 모든 세포의 핵 게놈은 DNA-기반이며 자가면역 질환을 제외하고는 그 자체로 면역 반응을 유발하지 않는 것 같다(Pisetsky. Clin Diagn Lab Immunol. 51: 1-6(1998)). 단일-가닥 RNA(ssRNA)는 DNA 전사의 산물로서 진핵세포 내에서 발견되는 형태이다. 세포 내 ssRNA 분자는 메신저 RNAs(및 선구 분자인 프리-메신저 RNAs), 작은 핵 RNAs, 작은 뉴클리어 RNAs, 작은 뉴클레올라 RNAs, 운반 RNAs(transfer RNAs) 및 리보좀 RNAs을 포함한다. 단일-가닥 RNA는 TLR7 및 TLR8 수용체를 통해 인터페론 및 염증성 면역 반응을 유도할 수 있다(Proc Natl Acad Sci. 101: 5598-603(2004); Science, 303: 1526-9(2004); Science, 303: 1529-3(2004)). 이중-가닥 RNA는 크기-의존적으로 면역 반응을 유발하는데, 30 bp보다 더 큰 dsRNA는 인터페론 반응을 활성화시키는 반면에, 그보다 작은 dsRNA는 다이서 효소의 다운스트림에 존재하는 세포의 내인성 RNA 간섭 기작(machinery)으로 들어간다(feed into). 짧은 일시적 RNAs 및 작은 조절성(modulatory) RNAs 같은 마이크로 RNAs(miRNAs)는 포유류에서 유일하게 알려진 세포 내 dsRNA 분자이며 2001까지는 발견되지 않았다(Kim. MoI Cells. 19: 1-15(2005)). 혈류 내에 존재하는 세포 외 RNA에 대한 반응으로, 그 길이에 관계없이 이중-가닥 또는 단일-가닥 RNA는 신장에 의해 빠르게 배출되고 효소에 의해 빠르게 분해된다(PLOS Biol, 2: 18-20(2004)).
본 명세서에서 사용되는 용어 “RNA 간섭에 영향을 미친다(effects RNA interference)”는 RNAi-매개된 유전자 사일런싱의 개시 또는 야기, 또는 RNAi-매개된 유전자 사일런싱을 초래하는 상태(conditions)를 의미한다.
유전자 발현을 억제하는 것으로 밝혀진 다수의 특이적 siRNA 분자가 디자인되어 왔다(Ratcliff et al., Science, 276: 1558-1560(1997); Waterhouse et al., Nature, 411: 834-842(2001)). 한편, 특이적 siRNA 분자는, 예를 들어 타겟 세포에서 CD4 단백질 발현을 타겟팅하여 CD4를 발현하는 세포를 타겟팅하는 HIV-1의 진입 위치를 감소시킴으로써 세포로의 HIV-1 진입(entry)을 억제하는 것으로 보여 졌다(Novina et al., Nature Medicine, 8: 681-686(2002)). 짧은 간섭 RNA가 추가적으로 디자인되어 인 비보 Fas-매개된 아팝토시스를 감소시키기 위해 Fas의 발현을 성공적으로 사일런싱하는 데 이용되었다(Song et al., Nature Medicine, 9: 347-351(2003)).
식물에서는 좀더 긴 siRNA(약 24-26 nt)가 상동 DNA의 전신성(systemic) 사일런싱 및 메틸레이션에 관여하는 것으로 알려졌다. 반대로, 짧은 siRNA 클레스(약 21-22 nt)는 전신성(systemic) 사일런싱 및 메틸레이션이 아니라 mRNA 분해에 관여한다(Hamilton et al., EMBO J., 21(17): 4671-9(2002)). 이러한 발견들은 식물에 존재하는 RNA 사일런싱 경로의 예상치 못한 수준의 복잡성을 나타내며, 이것은 동물에도 적용할 수 있다. 고등 진핵생물 목에서 DNA는 CpG 다이뉴클레오타이드에 구아노신의 5'에 위치한 사이토신에 메틸레이션되어 있다. 특히 이러한 변형(modification)이 많은 유전자의 프로모터 부위에 위치한 CpG 아일랜드로 알려진 CpG-풍부 구역에서 일어났을 경우, 유전자 발현 상에 중요한 조절 효과를 가진다. 거의 모든 유전자-관련 아일랜드는 상동염색체(autosomal chromosomes)의 메틸레이션으로부터 보호되는 동안에, CpG 아일랜드의 광범위한 메틸레이션은 선택적으로 임프린트된 유전자 및 여성의 비활성화된 X-염색체의 유전자의 전사적 비활성화와 관련되어 있다. 정상적으로는 메틸레이션 되지 않는 CpG 아일랜드의 비정상적(aberrant) 메틸레이션은 불멸화된 및 형질전환된 세포에서 상대적으로 빈번하게 발생하는 이벤트로 알려져 왔으며, 인간의 암에서 제한된 종양 억제 유전자(tumor suppression gene)의 전사적 비활성화와 관련되어 있다. 인간의 암에서 종양 억제 유전자(tumor suppression gene)의 전사적 비활성화와 관련해서, 프로모터 부위의 과메틸레이션(hypermethylation)이 종양 억제 유전자 기능을 제거하기 위한 코딩 부위 돌연변이에 대한 대안이다(Herman, et al.). 타켓 유전자의 메틸레이션을 지시하는 siRNA 분자의 용도는 미국 특허출원 공개번호 제20040091918호에 언급된 2003년 2월 13일에 출원된 미국 가출원(Provisional Application) 번호 제60/447,013호에 기재되어 있다.
또한, RNA 간섭이 타겟 서열과 완벽하게 일치해야만 일어나는 것은 아니라는 것이 잘 알려져 있다. 하지만, siRNA의 안티센스(가이드) 가닥의 5' 및 중간 부분이 타겟 핵산 서열과 완전히 상보적인 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 RNA 간섭-유도 분자는 천연(natural) 또는 변형된 뉴클레오타이드, 천연 리보오스 당 또는 변형된 당, 및 천연 또는 변형된 포스페이트 골격(backbone)을 가지는 RNA 분자를 포함한다.
따라서, 본 명세서에서 언급된 본 발명의 RNA 간섭-유도 분자는 짧은-일과성 RNA(short-temporal RNA, stRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 또는 이중-가닥 RNA(dsRNA)을 포함하는 변형되지 않은 이중 가닥 RNA 분자 및 변형된 이중 가닥 RNA 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다(참조: Baulcombe, Science, 297: 2002-2003(2002)). 또한, dsRNA 분자(예: siRNA)는 3'-오버행을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3'UU- 또는 3'TT-오버행을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 약 30-40 염기보다 큰 ssRNA, 약 40-50 염기보다 큰 ssRNA 또는 50 염기보다 큰 ssRNA를 포함하는 RNA 분자를 포함하지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 이중 가닥 구조를 가진다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 분자 길이의 약 25% 이상의 부위, 약 50% 이상의 부위, 약 60% 이상의 부위, 약 70% 이상의 부위, 약 80% 이상의 부위 또는 약 90% 이상의 부위가 이중 가닥이다.
본 명세서에서 RNA 간섭에 의해 유발되어 사용되는 용어 “유전자 사일런싱”은 세포 내에서 타겟 유전자의 mRNA 수준이 RNA 간섭의 도입이 없는 세포에서 발견되는 mRNA 수준의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100% 수준으로 감소하는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 mRNA 수준은 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100% 수준으로 감소한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “감소된(reduced)” 또는 “감소하다(reduce)”는 레퍼런스 수준과 비교하여 적어도 10% 이상 감소하는 것을 의미하며, 예를 들어 레퍼런스 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 그 이상, 및 100%를 포함하는 감소, 또는 10-100% 사이의 어떠한 정수적 감소(integer decrease)를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “증가된(increased)” 또는 “증가하다(increase)”는 레퍼런스 수준과 비교하여 적어도 10% 이상 증가하는 것을 의미하며, 예를 들어 레퍼런스 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 그 이상, 및 100%를 포함하는 증가, 또는 10-100% 사이의 어떠한 정수적 증가, 또는 레퍼런스 수준과 비교하여 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배 또는 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배의 증가 또는 그 이상의 증가를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 기술한 바와 같이 본 발명의 RNA 간섭은 하나 이상의 비-천연(non-natural) 뉴클레오타이드(즉 아데노신 "A", 구아닌 "G", 우라실 "U" 또는 사이토신 "C"를 제외한 뉴클레오타이드), 변형된 뉴클레오타이드 잔기 또는 천연 뉴클레오타이드의 유도체 또는 유사체를 가지는 RNA 분자를 포함한다. diRNA의 RNAi 활성을 (적어도 50% 이상) 제거하지 않거나 또는 실질적으로(substantially) 감소시키는 범위에서 어떠한 변형된 잔기, 유도체 또는 유사체가 이용될 수 있다. 따라서, 이러한 형태는 아미노알릴 UTP, 슈도-UTP, 5-I-UTP, 5-I-CTP, 5-Br-UTP, 알파-S ATP, 알파-S CTP, 알파-S GTP, 알파-S UTP, 4-티오 UTP, 2-티오-CTP, 2'NH2 UTP, 2 NH2 CTP 및 2'F UTP를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 모든 다른 유용한 형태의 뉴클레오타이드 뿐 아니라 프리 포(NTP) RNA 분자를 포함하여, 그러한 변형된 뉴클레오타이드는 아미노알릴 우리딘, 슈도 우리딘, 5-I-우리딘, 5-I-사이티딘(cytidine), 5-Br-우리딘, 알파-S 아데노신, 알파-S 사이티딘, 알파-S 구아노신, 알파-S 우리딘, 4-티오 우리딘, 2-티오-사이티딘, 2'NH2 우리딘, 2'NH2 사이티딘 및 2' F 우리딘을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 언급되는 RNA 간섭 인자는 뉴클레오타이드 체인의 “포스페이트 골격(phosphate backbone)” 상의 변형 뿐 아니라, 리보오스 당의 변형을 포함하는 RNA 분자를 추가적으로 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따르면 RNA에서 발견되는 자연적으로-발생하는(naturally-occurring) α-D-리보뉴클레오사이드를 대신해서 α-아라비노퓨라노실 구조를 포함하는 siRNA 또는 miRNA 분자가 RNA 간섭에 이용될 수 있다(미국 특허번호 제5,177,196호). 또 다른 예는 뉴클레아제 저항성을 수여하는 뉴클레오사이드의 당 및 헤테로사이클릭 염기 간의 o-결합(o-linkage), 및 2'-O-메틸 리보오스, 아라비노오스 및 특히 α-아라비노오스를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 유사한 올리고뉴클레오타이드 분자에 강하게 결합하는 상보적인 가닥을 포함하는 RNA 분자를 포함한다(본 명세서에 전문이 참조로서 삽입된 미국 특허번호 제5,177,196호). 또한, siRNA 및 miRNA 분자를 안정화시키기 위해 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate linkages)이 이용될 수 있다(미국 특허번호 제5,177,196호). 3'- 또는 5'-말단, 또는 양 말단에 공유결합으로 접합(attach)된 다양한 “꼬리(tails)”를 가지는 siRNA 및 miRNA 분자들도 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 방법을 이용하여 운반된 siRNA 및 miRNA 분자를 안정화시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, RNA 분자의 3'- 또는 5'-말단에 접합된 인터칼레이팅군(intercalating groups), 다양한 리포터군 및 친유성군(lipophilic groups)은 당업자에게 잘 알려져 있으며 본 발명의 방법에 따라 유용하다. 본 발명에 따라 변형된 RNA 분자의 제조에 유용하게 적용할 수 있는 3'-콜레스테롤 또는 3'-아크리딘 올리고뉴클레오타이드의 합성에 대한 기술은 다음 논문에서 발견할 수 있다: Gamper, H. B., Reed, M. W., Cox, T., Virosco, J. S., Adams, A. D., Gall, A., Scholler, J. K., and Meyer, R. B. Facile Preparation and Exonuclease Stability of 3'-Modified Oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 21: 145-150(1993); 및 Reed, M. W., Adams, A. D., Nelson, J. S., and Meyer, R. B.,Jr. Acridine and Cholesterol-Dcrivatized Solid Supports for Improved Synthesis of 3'-Modified Oligonucleotides. Bioconjugate Chem., 2: 217-225(1991).
다양한 특이적 siRNA 및 miRNA 분자들이 기술되어 왔으며 당업자는 추가적인 분자를 용이하게 디자인할 수 있다. 예를 들어, 전세계-웹 주소(sanger.ac.uk 내의 /Software/Rfam/mirna/index)에 존재하는 miRNA 데이터베이스는 본 발명에 따라 유용한 miRNAs를 추가적으로 동정하기 위한 유용한 소스를 제공한다(Griffiths-Jones S. NAR, 32, Database Issue, D109-Dl1l(2004); Ambros V, Bartel B, Barrel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T. RNA, 9(3): 277-279(2003)).
본 명세서에서 사용되는 용어 “siRNA”는 이중 가닥 RNA를 형성하는 핵산에 관한 것으로, siRNA가 유전자 또는 타겟 유전자로서 동일한 세포에서 발현되었을 경우 상술한 이중 가닥 RNA는 유전자 또는 타겟 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 억제할 수 있는 능력을 가진다. 그러므로, “siRNA”는 상보적인 가닥들에 의해 형성되는 이중 가닥 RNA를 의미한다. 전형적으로, 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 혼성화하는 siRNA의 상보적인 부위는 실질적인 또는 완전한 동일성(identity)을 가진다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, siRNA는 타겟 유전자에 대해 실질적인 또는 완전한 동일성을 가져 이중 가닥 siRNA를 형성하는 핵산을 의미한다. 본 발명의 siRNA의 서열은 타겟 유전자의 전장 또는 이의 일부 서열(subsequence)에 상응할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 siRNA는 적어도 약 15-50 뉴클레오타이드의 길이를 가진다. 예를 들어, 본 발명의 이중 가닥 siRNA의 각 상보적인 서열은 약 15-50 뉴클레오타이드의 길이이고 본 발명의 이중 가닥 siRNA는 약 15-50개의 염기쌍, 바람직하게는 약 19-30 염기 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 20-25 염기 뉴클레오타이드의 길이(예: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오타이드)이다.
또한, siRNA는 스템-루프라 불리는 작은 헤어핀 RNA(shRNAs)를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 이들 shRNA는 짧은 안티센스 가닥(예: 약 19-25 뉴클레오타이드) 및 이후에 약 5-9개의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 루프 및 유사(analogous) 센스 가닥이 위치하는 구조로 이루어져 있다. 선택적으로, 본 발명의 센스 가닥이 뉴클레오타이드 루프보다 먼저 위치할 수 있으며 안티센스 가닥이 뒤따를 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있는 siRNAs는 WO 05/042719, WO 05/013886, WO 04/039957 및 미국 특허출원 번호 제20040248296호에 기재되어 있으며, 본 명세서에 전문이 참조로서 삽입된다. 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있는 다른 유용한 siRNA는 미국 특허출원 번호 제20050176666호, 제20050176665호, 제20050176664호, 제20050176663호, 제20050176025호, 제20050176024호, 제20050171040호, 제20050171039호, 제20050164970호, 제20050164968호, 제20050164967호, 제20050164966호, 제20050164224호, 제20050159382호, 제20050159381호, 제20050159380호, 제20050159379호, 제20050159378호, 제20050159376호, 제20050158735호, 제20050153916호, 제20050153915호, 제20050153914호, 제20050148530호, 제20050143333호, 제20050137155호, 제20050137153호, 제20050137151호, 제20050136436호, 제20050130181호, 제20050124569호, 제20050124568호, 제20050124567호, 제20050124566호, 제20050119212호, 제20050106726호, 제20050096284호, 제20050080031호, 제20050079610호, 제20050075306호, 제20050075304호, 제20050070497호, 제20050054598호, 제20050054596호, 제20050053583호, 제20050048529호, 제20040248174호, 제20050043266호, 제20050043257호, 제20050042646호, 제20040242518호, 제20040241854호, 제20040235775호, 제20040220129호, 제20040220128호, 제20040219671호, 제20040209832호, 제20040209831호, 제20040198682호, 제20040191905호, 제20040180357호, 제20040152651호, 제20040138163호, 제20040121353호, 제20040102389호, 제20040077574호, 제20040019001호, 제20040018176호, 제20040009946호, 제20040006035호, 제20030206887호, 제20030190635호, 제20030175950호, 제20030170891호, 제20030148507호, 제20030143732호 및 WO 05/060721, WO 05/060721, WO 05/045039, WO 05/059134, WO 05/045041, WO 05/045040, WO 05/045039, WO 05/027980, WO 05/014837, WO 05/002594, WO 04/085645, WO 04/078181, WO 04/076623 및 WO 04/04635에 기재된 siRNAs를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 명세서에 전문이 참조로서 삽입된다.
본 발명에 따른 RNA 간섭은 직접 화학적 합성법 같은 알려진 기술들을 이용하여 긴 이중 가닥 RNA를 재조합 다이서 단백질 또는 초파리 배아 용해물(lysates)과 반응(exposure)시켜 프로세싱하거나 또는 파아지 RNA 폴리머라제, RNA-의존 RNA 폴리머라제 및 DNA-기반 벡터를 이용하는 S2 세포로부터 유래된 인 비트로 시스템을 통해 생산될 수 있다. 세포 용해물 또는 인 비트로 프로세싱의 이용은 용해물 등으로부터 짧은 siRNA, 예를 들어 약 21-23 뉴클레오타이드 siRNA의 분리 과정을 추가적으로 포함한다. 일반적으로, 화학적 합성법은 두 개의 단일 가닥 RNA-올리고머를 제조하여 두 개의 단일 가닥 올리고머들을 하나의 이중 가닥 RNA로 어닐링하여 진행된다. 다른 예들은 siRNA의 화학적 및 효소적 합성을 기술하고 있는 WO 99/32619 및 WO 01/68836에 개시된 방법들을 포함한다. 더욱이, 특이적 siRNAs를 디자인하고 제작하기 위해 수많은 상업적 서비스가 이용될 수 있다(참조: QIAGEN Inc., Valencia, CA 및 AMBION Inc., Austin, TX).
본 발명의 방법에서 유용한 RNA 간섭은 진핵 세포 내에서 인코딩되는 단백질의 유전자 발현을 타겟팅하는 siRNAs를 포함한다. 이러한 단백질의 예는 포유동물의 내인성 단백질, 기생 단백질 또는 바이러스가 세포 내로 침입(entry)한 후에 진핵 세포에 의해 인코딩되는 바이러스 단백질을 포함한다. 예를 들어, 상술한 RNA 간섭 인자를 제조하는 방법의 예는 국제 특허출원 번호 PCT/US03/34424, PCT/US03/34686 및 미국 특허 가출원 번호 제60/488,501호, 제60/488,155호 및 제60/516,172호에 보여지며, 이들 특허출원의 모든 내용 및 참조가 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
당업계에 종래에 알려진 siRNA 운반 방법과는 달리, 본 발명의 방법은 siRNA 치료법의 소망하지 않는 잠재적 부작용을 최소화하거나 또는 완전하게 회피하기 위한 특정 세포로의 타겟팅이 가능하다.
타겟팅 모이어티
타겟 모이어티는 운반 시스템을 타겟 세포로 특이적으로 운반한다. siRNA를 포함하는 간섭 RNA(또는 RNAi)를 운반하는 특정 타겟 모이어티는 본 발명의 개시 내용 및 타겟 세포에 기반하여 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 혈관 내 타겟, 면역세포 타겟 또는 이와 유사한 타겟 같은 이미 접근가능한 세포 또는 조직에서 인 비보 체세포 치료에 있어서, 타겟 모이어티의 중요한 특질은 친화성 및 선택성이다.
예를 들어, 본 발명의 방법은 siRNA를 제한된 수의 세포로 운반하는 방법을 제공하여 siRNA를 이용하는 치료법의 잠재적 부작용을 제한한다. 타겟팅 모이어티로 선택된 특정 세포 표면 타겟은 타겟 세포에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 세포는 세포 표면에 존재하는 특정 단백질, 지질 또는 카보하이드레이트 같은 세포 표면 항원에 대한 항체를 이용함에 따라 특이적으로 타겟될 수 있다. 당업자는 당업계에 알려진 통상적인 지식에 기반하여 그러한 분자들을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 모이어티는 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 단일쇄 항체, 항체 또는 (Fab')2 절편의 Fab 부위 또는 scFv이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 세포(target cell)”는 세포 표면 항원을 포함하는 세포를 의미하며, 예를 들어 본 명세서에 개시된 타겟팅 모이어티가 인지하여 그에 결합할 수 있는 세포 표면 수용체 또는 당단백질, 또는 다른 세포 표면 마커를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟팅 모이어티(targeting moiety)” 또는 “타겟 모이어티(target moiety)”는 상호 교환되어 사용될 수 있으며, 타겟 세포의 표면에 존재하는 분자에 친화성을 가지거나 또는 결합할 수 있는 분자를 의미하며, 예를 들어 타겟팅 모이어티는 목적한 인자 또는 다른 부위를 감염하는 특정 조직, 세포 형태 또는 수용체로 나아가거나(homes in on) 또는 우선적으로 연관되거나 또는 결합할 수 있는 인자로서 기능한다. 타겟팅 모이어티의 예는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 항원, 리간드, 수용체, 특이 결합쌍의 한 멤버, 생물학적 수용체, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체에 대해 친화성을 가지는 펩타이드를 포함하는 폴리아미드, 호르몬(예: 에스트라디올 또는 히스타민), 호르몬-미미킹 물질(예: 몰핀) 또는 세포 내 타겟에 대해 결합 특이성을 가지는 다른 화합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에서, 본 발명의 타겟팅 모이어티는 타겟 세포, 예를 들어 T-세포 타겟 세포로 RNAi 분자의 운반 또는 차별화된 한정(preferential localization)을 촉진한다.
상술한 바와 같은 컨스트럭트를 제조하기 위해, 알려진 서열을 가지는 어떠한 항체도 본 명세서에 개시된 방법에 따라 타겟팅 모이어티로서 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “항체” 또는 항체의 “기능적 단편”은 본 발명의 항체 분자에 대한 면역학적 결합능을 보이고/보이거나 세포 표면 항원에 결합하는 인간화 항체, 변형된 항체, F(ab')2 단편, F(ab) 단편, Fv 단편, 단일쇄 항체, 이중 및 삼중 항체 단편 컨스트럭트, 미니소체(minibodies), 및 이의 기능성 단편 같은 잡종항체(hybrid antibodies) 또는 복합항체(chimeric antibodies)를 포함하는 제조 과정 뿐 아니라, 다클론 및 단일클론 항체 준비 과정을 포함한다.
상술한 바와 같이, 단백질의 두 번째 부위는 결합 모이어티이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티를 모두 발현하는 유전자 절편을 포함하는 단일 벡터를 이용한다. 하지만, 본 발명의 방법은 최소 두 개의 벡터로 세포를 동시에 형질전환(co-transfect)시키며 상기 융합 단백질을 발현하는 세포를 동정(select)할 수 있는 벡터 시스템을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 단일 벡터를 이용한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 표준 방법에 의해 유전자 또는 유전자 절편, 예를 들어 인간 프로타민 유전자에 타겟 모이어티를 인코딩하는 서열을 접합한다(Balhorn, J. Cell. Biol., 93: 298-305(1982)).
항체가 타겟팅 모이어티로 이용되는 경우, 타겟팅 모이어티로 단일쇄 항체의 이용이 바람직하다. 하지만, 낮은 혈액 공급 및 높은 간질압을 가진 거대 고형 종양 질량의 일 부분인 세포에서 처럼 타겟 세포가 쉽사리 접근할 수 없는 경우, 혈청 반감기를 고려하는 것이 중요하다. 상술한 예에서는 전형적으로 전 항체 및 (Fab')2 절편이 바람직하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 결합 모이어티를 IgGi 같은 천연(intact) 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 카르복시-말단에 접합시키기 위해 융합 단백질을 합성할 수 있다.
항원성 반응을 제한하기 위해, 본 발명의 타겟팅 모이어티는 세포가 타겟될 숙주 동물을 고려하여 선택되는 것이 바람직하다. 그러므로, 타겟 동물이 마우스인 경우에 본 발명의 방법은 마우스 항체를 이용하는 것이 바람직하지만, 타겟 동물이 인간일 경우는 본 발명의 방법은 인간 항체 또는 인간화 항체를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, siRNA를 인코딩하는 벡터는 특정 타겟 세포로 운반된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “벡터”는 DNA 절편(들)을 한 세포로부터 다른 세포로 전이할 수 있는 핵산 분자를 언급하면서 이용된다. 벡터는 종종 플라스미드, 박테리오파아지 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 유래한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “발현 벡터(expression vector)”는 특정 숙주 생물체(organism)에서 소망하는 siRNA-코딩 서열 및 작동적으로 연결된(operably linked) 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 적절한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 통상적으로 원핵생물에서 발현을 위해 필요한 핵산 서열은 다른 서열과 함께 프로모터, 오퍼레이터(선택적) 및 리보좀 결합 위치를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 증강인자(enhancers) 및 터미네이터 및 폴리아데닐화 시그널을 이용한다는 것이 알려져 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 방출된 RNA 간섭-유발 분자를 목적 세포의 구획(compartment)으로 세포 내 운반할 수 있는 위치 서열(localization sequences)을 이용할 수도 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 본 발명의 RNAi-운반 시스템은 내재화 시스템을 이용한다. 예를 들어, 타겟팅 모이어티가 특정 세포 표면 항원(예: 세포 표면의 수용체)에 먼저 결합한 후에 타겟된 세포가 세포에 결합된 (RNAi 물질을 포함하는) RNAi-운반 시스템을 내재화한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 타겟팅 모이어티는 수용체 또는 항체에 대한 리간드와의 반응 후에 수용체-매개된 내포 작용(endocytosis)에 의해 내재화될 수 있는 수용체 및 항원을 포함하는 세포 표면의 막단백질에 결합한다(Dautry-Varsat, A., et al., Sci. Am., 250: 52-58(1984)). 이러한 내포 과정은 본 명세서에 개시된 본 발명의 운반 시스템에 의해 활용(exploit)된다. 본 발명의 RNA 간섭-유발 분자가 내재화됨에 따라 내포 과정이 RNA 간섭-유발 분자를 손상시킬 수 있기 때문에, 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 목적 RNA 간섭-유발 분자의 많은 반복(repeats)을 포함하는 절편을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 또한 엔도좀 및 라이소좀을 파괴하는 서열 또는 모이어티를 포함할 수도 있다(참조, Cristiano, R. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11548-11552(1993); Wagner, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6099-6103(1992); Cotten, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6094-6098(1992)).
본 명세서에서 언급된 바와 같이, 짧은 간섭 RNA(siRNA)-복합체 또는 마이크로 간섭 RNA(miRNA)-복합체는 타겟 모이어티가 siRNA 같은 RNA 간섭 인자와 연관되거나 또는 복합되거나 또는 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 복합체이다. 적절한 siRNA 복합 인자(siRNA complexing agents)는 폴리-아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세인(polyoxethanes), 폴리알킬사이아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 녹말, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글라이콜(PEG) 및 녹말; 폴리알킬사이아노아크릴레이트; DEAE-유도된(derivatized) 폴리이민, 폴루란(pollulans), 셀룰로오스 및 녹말을 포함한다. 보다 바람직한 복합 인자는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-라이신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스퍼민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예를 들어, p-아미노), 폴리(메틸사이아노아크릴레이트), 폴리(에틸사이아노아크릴레이트), 폴리(뷰틸사이아노아크릴레이트), 폴리(이소뷰틸사이아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실사이아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민, DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-유산), 폴리(DL-락틱-코-글라이콜릭산(poly(DL-lactic-co-glycolic acid(PLGA)), 알기네이트, 폴리에틸렌글라이콜(PEG) 및 폴리에틸레이민을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 간섭 RNA-결합 도메인은 GCN4, Fos, Jun, TFIIS, FMRI, 효모 단백질 HX, 비길린, Merl, 박테리아 폴리뉴클레오타이드 포스포릴라제, 리보좀 단백질 S3 및 열충격 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질들에 존재하는 핵산 결합 도메인으로부터 선택된다.
세포 표면 항원은 타겟팅 모이어티를 타겟한다
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 세포-표면 항원과 결합하는 타겟팅 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 세포-표면 항원은 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 T 세포에 존재하는 수용체(예: T 세포에 존재하는 CD7 수용체)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체 같은 RNAi-복합체에 관한 것으로, 상기 RNAi-복합체는 상기 타겟팅 모이어티가 프로타민 단편 또는 이의 상동물 같은 단백질, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인 같은 결합 모이어티와 결합되어 있거나 또는 상기 결합 모이어티가 siRNA 또는 miRNA 같은 RNA 간섭 분자와 결합하면 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 T-세포의 세포 표면 항원(예: T 세포에 존재하는 CD7 수용체)을 타겟팅하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 같은 타겟팅 모이어티를 포함한다.
선택적으로, 본 발명은 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체 같은 RNAi-복합체에 관한 것으로, 상기 RNAi-복합체는 상기 타겟팅 모이어티가 프로타민 단편 또는 이의 상동물 같은 단백질, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인 같은 결합 모이어티와 결합되어 있거나 또는 상기 결합 모이어티가 siRNA 또는 miRNA 같은 RNA 간섭 분자와 결합하면 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 T-세포의 세포 표면 항원(예: T 세포에 존재하는 CD7 수용체)을 타겟팅하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 같은 타겟팅 모이어티를 반드시 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 타겟팅 모이어티, 결합 모이어티 및 RNAi 분자로 이루어진 siRNA-복합체 또는 miRNA-복합체 같은 RNAi-복합체에 관한 것이다.
세포-표면 항원에 결합하여 내재화되는 타겟팅 모이어티인 경우, 본 명세서에 개시된 본 발명의 방법 및 조성물에서 타겟팅 모이어티로 이용할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟팅 모이어티에 의해 타겟되는 세포 표면 항원은 T-세포에 존재하는 막단백질, 예를 들어 CD7, LAM-I, CD28 및 T 세포 수용체(TCR), CD3- 및 ζ-체인, CD4 및 CD8 및 상동물, 및 이의 변이체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 타겟팅 모이어티는 세포-표면 항원 또는 종양 세포에 존재하는 단백질과 결합한다. 타겟팅 모이어티의 예는 종양-관련 항원(TAAs), HLA-DR 항원, c-erbB-2 원형종양 유전자, MUCl, MAG-I, VEGFR2, 프로-바소프레신(pro-VP), TAG-72(시알릴 Tn 또는 STn), STn-KLH, GD3, 암항원 125(CA 125, 인간 난소암 세포 표면 항원(OCCSA)), 알파 페토단백질(AFP) 및 본 명세서에 참조로서 삽입된 US 20030143237A1에 개시된 다른 암세포 표면 항원을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
CD7 수용체에 결합하는 항체 또는 단편 같은, T-세포에 존재하는 세포 표면 항원에 반응하거나 또는 특이적으로 결합하는 항체는 항원으로 면역화함으로써 토끼 또는 마우스 같은 동물에서 쉽게 제조할 수 있다. 특히, 면역화된 마우스가 과량의 단일클론 항체를 생산하기 위해 순차적으로 배양되는 하이브리도마 제조용 B 세포의 소스를 제공하는 데 매우 유용하다.
항체는 넓은 범위의 타겟 항원 및 합텐(haptens)에 대한 높은 결합 친화능(binding avidity) 및 고유의 특이성을 제공한다. 본 발명의 실시예에서 타겟팅 모이어티로서 이용되는 단일클론 항체는 전 항체 및 이의 단편을 포함하며 하이브리도마 합성, 재조합 DNA 기술 및 단백질 합성 같은 종래의 방법에 따라서 생산할 수 있다.
유용한 단일클론 항체 및 단편은 (인간을 포함한) 모든 종으로부터 유래할 수 있으며, 또는 하나 이상의 종으로부터 유래한 서열을 포함하는 복합 단백질로서 제조할 수 있다. 또한, 인간 단일클론 항체 또는 “인간화된(humanized)” 마우스 항체가 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있다. 예를 들어, 마우스 단일클론 항체는 마우스 Fv 부위를 인코딩하는(즉, 항원 결합 위치를 포함하는) 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 가변부위(complementarily determining regions)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 유전학적으로 인간 불변부위 도메인 및 Fc 부위를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 재조합함으로써 “인간화(humanized)”될 수 있다. 인간화된 타겟팅 모이어티는 숙주에서 항체 또는 폴리펩타이드의 면역반응성(immunoreactivity)을 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 전문이 삽입된 유럽 특허출원 번호 제0,411,893 A2호에 개시된 내용과 유사한 방식으로 반감기의 증가 및 해로운 면역 반응 가능성의 감소를 가능하게 한다. 바람직하게는, 마우스 단일클론 항체가 인간화된 형태로 이용될 수 있다. 항원 결합 활성(antigen binding activity)은 항체의 가변 부위(variable portion, Fv)의 경쇄 및 중쇄에 위치하는(각각 세 개) 여섯 개의 가변부위(CDRs)의 아미노산 서열 또는 구조(conformation)로 결정될 수 있다. 25-kDa 단일-쇄 Fv(scFv) 분자는 짧은 펩타이드 스페이서 서열을 통해 연결된 경쇄의 가변 부위(VL) 및 중쇄의 가변 부위(VH)로 이루어져 있다. scFv에 대한 유전자를 포함하는 필라멘트성 파아지의 표면에 scFv 분자를 노출하기 위한 많은 기술들이 개발되었다. 넓은 범위의 항원-특이성을 가지는 scFv 분자는 큰 단일 풀의 scFv-파아지 라이브러리에 존재할 수 있다. 본 발명의 방법에서 이용할 수 있는 높은 친화성 단일클론 항체 및 이의 복합 유도체의 예들은 유럽 특허출원 번호 EP 186,833; PCT 특허출원 번호 WO 92/16553; 및 US 특허 번호 제6,090,923호에 개시되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 전문이 삽입된다.
복합 항체는 서로 다른 동물 종으로부터 유래한 두 개 이상의 절편 또는 부위에 의해 특징화되는 면역글로불린 분자이다. 일반적으로, 복합 항체의 가변 부위는 마우스 단일클론 항체 같은 비-인간 포유동물의 항체로부터 유래하며 면역글로불린의 불변 부위는 인간 면역글로불린 분자로부터 유래한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 두 부위 및 둘 간의 조합은 용이하게(routinely) 결정될 만큼 낮은 면역원성(immunogenicity)을 가진다.
scFv 분자의 한 가지 제한점은 타겟 항원과의 일가성 상호작용이다. scFv 분자와 타겟 항원 간의 결합을 개선하기 위한 가장 용이한 방법들 중의 하나는 멀티머의 형성을 통한 기능적 친화성을 높이는 것이다. 이가 항체(diabodies), 3가 항체 및 4가 항체를 형성하기 위한 동일 scFv 분자 간의 결합(association)은 많은 동일한 Fv 모듈을 포함하는 분자를 제공할 수 있다. 따라서, 이러한 반응물(reagents)은 다가성이지만 단특이성(monospecific)이다. 다른 부모 Ig로부터 유래한 VH 도메인 및 VL 도메인을 각각 포함하는 두 개의 다른 scFv 분자 간의 결합은 기능적 이중특이성(bispecific) 이가 항체를 완전하게 형성할 것이다. 이중특이성 이가 항체의 유일한 적용은 두 개의(인접한) 표면 에피토프를 통해 동일한 타겟 분자의 두 개의 부위와 동시에 결합하는 것이다. 이러한 반응물은 단일 scFv 또는 Fab 단편보다 현저하게 뛰어난 친화능(avidity)을 가진다. 예를 들어, 소항체(miniantibodies), 이중 소항체, 미니바디, (ScFv)2, 이가 항체 및 3가 항체를 포함하는 많은 다가성 scFv-기반 구조체들이 고안되어 졌다. 이들 분자들은 결합가(두 개 내지 네 개의 결합 부위), 크기(50 kDa 내지 120 kDa), 구조적 유연성(flexibility) 및 제조의 용이성 같은 범위를 고려하여 고안하였다. 단일쇄 Fv 항체 단편(scFvs)의 VH 도메인 및 VL 도메인이 적어도 12개의 잔기로 이루어진 폴리펩타이드 링커에 의해 연결되었을 때, scFvs는 주로 모노머 형태를 가진다. 12개 내지 25개의 아미노산 링커를 가진 모노머 scFv는 모든 조건 하에서 열역학적으로 안정하다. 비공유결합된 이가 항체 및 3가 항체 분자는 다루기 용이하며 단일 scFv 분자의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 연결하는 펩타이드 링커를 짧게 함으로써 생산될 수 있다. 상술한 scFv 다이머는 높은 유연성을 제공하는 양친매성 헬릭스에 의해 연결되며 소항체 구조체는 이중 헬릭스를 통해 연결된 두 개의 소항체(네 개의 scFv 분자)를 포함하는 이중특이성 다이머(DiBi) 소항체를 제조하기 위해 변형될 수 있다. 유전자-융합된 또는 S-S 결합된(disulfide bonded) scFv 다이머는 중간 정도의 유연성을 제공하며 C-말단 Gly4Cys 서열을 첨가하는 직접(straightforward) 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. scFv-CH3 미니바디는 IgG CH3 도메인에 직접적으로 연결되거나(LD minibody) 또는 매우 유연한 경첩 부위(hinge region)를 통해 IgG CH3 도메인에 연결된(Flex minibody) 두 개의 scFv 분자로 구성되어 있다. 약 80 kDa의 분자량을 가지는 이러한 이가 컨스트럭트는 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. 마우스에서, 상술한 Flex minibody는 종양 위치에서 뚜렷하게 관찰할 수 있다. 이중- 및 삼중-특이성 멀티머는 다른 scFV 분자의 연결을 통해 형성될 수 있다. Fab 또는 단일쇄 Fv 항체 단편(scFv)이 다이머, 트리머 또는 더 큰 응집체로 복합체를 구성할 때, 기능적 친화성의 증가를 달성할 수 있다. 일가성 scFv 및 Fab 단편보다 우수한 다가성 scFvs의 가장 중요한 이점은 타겟 항원에 대한 기능적 결합 친화성(avidity)의 획득이다. 높은 기능적 결합 친화성은 타겟 항원을 분리하기 위해 scFv 멀티머가 동시에 결합할 수 있도록 하는데 필요하다. scFv 모노머와 비교하여 scFv 이가 항체에 대한 기능적 결합 친화성의 획득이 중요하며 두 개 이상의 타겟 항원에 복합적인(multiple) 결합 및 하나의 Fv가 분리되는 경우 재결합에 의해 초래되는 감소된 오프-레이트(off-rates)에서 일차적으로 보여 진다. 이러한 scFv 분자들이 멀티머와 결합할 때, scFv 분자들은 단일 타겟 항원에 대한 높은 결합 친화성을 가지거나 또는 다른 타겟 항원에 대해 복합적인 특이성을 가지도록 디자인될 수 있다. 항원에 대한 복합적인 결합은 Fv 모듈에서 올바른 정렬(alignment) 및 배향성에 따라 의존적이다. 다가성 scFvs 타겟에서 완전한 기능적 결합 친화성을 위해, 항원 결합 부위들이 같은 방향으로 위치해야 한다. 복합적인 결합이 입체적으로 불가능한 경우라면, 기능적 친화성의 획득은 확산율(diffusion rates) 및 항원 농도에 의존하는 증가된 재결합의 효과에 의해서 야기되기 쉽다. 또한, 본 발명은 특성을 개선하는 모이어티와 컨쥬게이션된 항체도 고려한다. 예를 들어, 인 비보에서 반감기를 증가시키는 PEG와 컨쥬게이션된 항체는 본 발명의 방법에 따라 타겟팅 모이어티로 이용될 수 있다. 천연 또는 면역화된 동물 또는 환자의 B 임파구로부터 유래한 가변 항체 단편을 인코딩하는 유전자를 PCR 증폭시킴으로써 면역 라이브러리가 제조된다. 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자 패밀리에 특이적인 올리고뉴클레오타이드의 조합이 이용된다. 퇴행성 프라이머(degenerate primers)를 이용한 PCR로 증폭된 가변 단편의 가변부위(CDR)를 가지는 반합성 항체 레퍼토리를 제조하기 위해 재배열되기 전의 면역글로불린 유전자가 이용될 수 있다. 이러한 단일식(single-pot) 라이브러리는 많은 수의 항원에 대한 항체 단편이 하나의 단일 라이브러리로부터 분리될 수 있다는 장점을 가진다. 항체 단편의 친화성을 증가시키기 위해 임의적인 코돈-기반 또는 위치-지정된 돌연변이법(site-directed mutagenesis), 천연 레퍼토리로부터 항체 단편들의 체인과 개개 도메인들의 체인을 혼합(shuffle)하거나 또는 박테리아 돌연변이 스트레인을 이용하여 이미 존재하는 항체 단편들로부터 제조되는 신규 라이브러리와 함께 파아지-디스플레이 기술이 이용될 수 있다.
선택적으로, Genpharm에 의해 개발된 모델의 예로 SCID-hu 마우스가 항체 또는 이의 단편을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 다가성 상호작용의 효과를 이용하여 만들어진 펩타바디(peptabody)로 불리는 새로운 높은 기능적 결합 친화성-결합 분자를 고려한다. 짧은 펩타이드 리간드가 연골 올리고머 매트릭스 단백질의 코일-코일(coiled-coil) 조립 도메인을 가지는 반고정(semirigid) 경첩 부위를 통해 융합되어 펩타머 다가성 결합 분자를 생산하였다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 단백질-결합 인자는 이중특이성 항체, 예를 들어 항-리간드 항체(Ab) 및 특정 타겟으로 지시된 Ab의 화학적 결합으로 생산된 이중특이성 항체를 이용하여 조직-또는 종양-특이적 타겟으로 타겟팅될 수 있다. 화학적 컨쥬게이트의 한계를 극복하기 위해, 항체의 분자적 컨쥬게이트가 세포 표면 분자에 리간드 및/또는 복합 억제제를 지정하는 재조한 이중특이성 단일-쇄 Abs의 생산에 이용될 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 두 개 이상의 단백질-결합 분자가 선택적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 어떤 구현예에 따르면 단백질-결합 분자가 또 다른 항체와 컨쥬게이션된 항체일 수 있다. 각 항체는 (같은 또는 다른 타겟 사이트 항원과 연관된) 다른 타겟 부위의 에피토프와 반응한다. 결합 모이어티 및 이와 접합된 RNAi 분자와 결합된 다른 항체 또는 항체 단편이 추가적으로 소망하는 타겟 부위에 축적된다. 항체- 또는 비-항체-기반된 타겟팅 모이어티는 결합된 결합 모이어티 및 이에 결합된 RNAi 분자를 타겟 세포 또는 타겟 부위로 운반할 수 있도록 한다.
결합 모이어티
본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법 및 조성물에서 이용되는 결합 모이어티는 RNA 간섭-유발 분자, 예를 들어 siRNA 또는 miRNA에 결합한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 결합 모이어티는 단백질 또는 단백질의 핵산 결합 도메인이며 결합 모이어티는 타겟팅 모이어티의 카르복시 부위와 융합되어 있다. 타겟팅 모이어티의 위치는 컨스트럭트의 카르복시-말단 또는 아미노-말단 또는 융합 단백질의 중간 부위일 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 siRNA 결합 모이어티 및 하나 이상의 타겟팅 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 GCN4, Fos, Jun, TFIIS, FMRI, 효모 단백질 HX, 비길린, Merl, 박테리아 폴리뉴클레오타이드 포스포릴라제, 리보좀 단백질 S3 및 열충격 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질들 내에 존재하는 핵산 결합 도메인들로 구성된 군으로부터 선택된 단백질의 핵산 결합 도메인이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 프로타민 단백질 또는 프로타민의 RNA 간섭-유도 분자-결합 단편이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 9 아르기닌으로 이루어진 펩타이드이며, 이는 본 명세서에서 "9R"로 명시된다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA-복합 인자는 프로타민 또는 프로타민의 siRNA-결합 단편 같은 RNA-결합 도메인이다. 프로타민은 약 4000-4500 Da의 분자량을 가지는 다양가성 펩타이드이다. 프로타민은 동물의 전체 DNA를 정자 머리의 제한적 용적 안으로 패킹하기 위해 전체 DNA를 농축시키는데 기능하는 작은 염기성 핵산 결합 단백질이다(Warrant, R. W., et al., Nature, 271: 130-135(1978); Krawetz, S. A., et al., Genomics, 5: 639-645(1989)). 프로타민의 양성 전하는 RNA 같은 핵산의 포스페이트 골격의 음성 전하와 강하게 상호작용하여 본 발명에서 보여지는 바와 같이 중성 및 안정적인 간섭 RNA 프로타민 복합체를 이룬다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 이용할 수 있는 프로타민 단편은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제1서열과 동일한 아미노산을 인코딩할 수 있는 이의 상동물에 의해 인코딩된다: GCGGCCGCACGCACGCAGCCAGAGCCGGAGCAGATATTACCGCCAGAGACAAAGAAGTCGCAGACGAAGGAGGCGGAGCTGCCAGACACGGAGGAGAGCCATGAGATCTCATCATCACCACCACCATTAA(서열목록 제1서열).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 이용할 수 있는 프로타민 단편은 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제2서열과 동일한 아미노산을 인코딩할 수 있는 이의 상동물에 의해 인코딩된다: GCGGCCGCAATGGCCAGGTACAGATGCTGTCGCAGCCAGAGCCGGAGCAGATATTACCGCCAGAGACAAAGAAGTCGCAGACGAAGGAGGCGGAGCTGCCAGACACGGAGGAGAGCCATGAGATCTCATCATCACCACCACCATTAA(서열목록 제2서열).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 이용할 수 있는 프로타민 단편은 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제3서열과 동일한 아미노산을 인코딩할 수 있는 이의 상동물에 의해 인코딩된다: GCGGCCGCACGCAGCCAGAGCCGGAGCAGATATTACCGCCAGAGACAAAGAAGTCGCAGACGAAGGAGGCGGAGCTGCCAGACACGGAGGAGAGCCATGAGGTGTTGTCGCCCCAGGTACAGACCGAGATGTAGAAGACACAGATCTCATCATCACCACC ACCATTAA(서열목록 제3서열).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 이용할 수 있는 프로타민 단편은 서열목록 제4서열 또는 서열목록 제4서열과 동일한 아미노산을 인코딩할 수 있는 이의 상동물에 의해 인코딩된다: GCGGCCGCACGCAGCCAGAGCCGGAGCAGATATTACCGCCAGAGACAAAGAAGTCGCAGACGAAGGAGGCGGAGCAGATCTCATCATCACCACCACCATTAA(서열목록 제4서열).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 이용할 수 있는 프로타민 단편은 서열목록 제5서열 또는 서열목록 제5서열과 동일한 아미노산을 인코딩할 수 있는 이의 상동물에 의해 인코딩된다: GCGGCCGCCGGCGGAGGAGGATCTCATCATCACCACCATTAA(서열목록 제5서열).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 이용할 수 있는 프로타민 단편은 서열목록 제6서열 또는 서열목록 제6서열과 동일한 아미노산을 인코딩할 수 있는 이의 상동물에 의해 인코딩된다: GCGGCCGCAATGGCCAGGTACAGATGCTGTCGCAGCCAGAGCCGGAGCAGATATTACCGCCAGAGACAAAGAAGTCGCAGACGAAGGAGGCGGAGCAGATCTCATCATCACCACCACCATTAA(서열목록 제6서열).
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 모이어티는 gp160 항체 또는 gp160 결합 항체 단편과 컨쥬게이션되거나 또는 결합된 전장 프로타민이다.
결합 모이어티와 타겟 모이어티의 컨쥬게이션
본 명세서에서 사용되는 용어 “와 결합된(associated with)”은 한 물질이 다른 물질과 물리적인 결합(association) 또는 접촉(contact)되어 있는 것을 의미한다. 따라서, 결합 모이어티“와 결합된(associated with)” 타겟팅 모이어티는 운반 파티클에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연결(joint)되어 있다. 상술한 결합(특히 결합이 공유결합인 경우)은 링커 모이어티에 의해 매개될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “결합(association)” 또는 “상호작용(interaction)” 또는 “와 결합된(associated with)”은 상호 교환되어 사용될 수 있으며 결합 모이어티, 예를 들어 프로타민과 타겟팅 모이어티, 예를 들어 항체 또는 이의 단편의 결합 또는 상호작용의 면에서 이용되는 것처럼, 직접 연결(linkage) 또는 간접 연결에 의한 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티 간의 모든 결합(예: 항체)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “연결된(linked)”은 당업자에게 알려진 수단에 의해 연결된 두 개 이상의 실체(entities)를 의미하며, 예를 들어 하나의 항체 또는 이의 단편이 다른 펩타이드(예: 프로타민 같은 결합 모이어티)와 연결될 수 있다. 링커는 공유결합 링커 또는 비-공유결합 링커일 수 있다. 공유결합 링커의 예는 공유결합 또는 하나 이상의 단백질에 공유결합으로 접합된 연결될 링커 모이어티를 포함한다. 또한, 링커는 비-공유결합, 예를 들어 백금 원자 같은 중심 금속을 통한 유기 금속 결합일 수 있다. 공유결합 연결을 위해, 탄산 유도체를 포함하는 아미드 군, 에테르, 유기 에스테르 및 무기 에스테르를 포함하는 에스테르, 아미노, 우레탄, 우레아 및 이와 유사한 물질 같은 다양한 기능성 물질(functionalities)이 이용될 수 있다. 연결(linking)을 제공하기 위해, 본 발명의 타겟팅 모이어티 및/또는 결합 모이어티는 산화, 수산화, 치환, 환원 등에 의해 변형되어 커플링을 위한 부위를 제공한다. 타겟 모이어티(예를 들어, 항체, 항체 단편, 인테그린) 및/또는 결합 모이어티의 기능을 뚜렷하게 감소시키지 않는 변형이 바람직하다는 것은 당연할 것이다.
선택적으로, 연결된 두 개 이상의 물질이 간접 연결(indirect linkage)에 의해 연결될 수 있다. 간접 연결은 타겟팅 모이어티(예: 항체 또는 이의 단편) 및 결합 모이어티 간의 연결(association)을 포함하며, 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티는 “링커 모이어티(linker moiety)”를 통해 접합된다(예를 들어, 서로 직접적이지 않게 연결된다). 링커 모이어티는 화학적 링커 모이어티 또는 펩타이드 링커 모이어티를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티 간의 링커는 p-니트로페닐 클로로포르메이트, 카르보닐디이미다졸(CDI), N,N'-다이석시니미딜 카르보네이트(DSC), cis-아코니틴 산무수물 및 이들 화합물의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 링커 및 폴리머를 반응시킴으로써 형성된다.
직접 연결(direct linkage)은 링커 모이어티가 필요하지 않은 연결을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 직접 연결은 두 개의 모이어티, 즉 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티가 상호작용하여 서로를 잡아당기는 화학적 또는 물리적 상호작용을 포함한다. 직접 상호작용의 예는 공유 상호작용, 비-공유 상호작용, 하이드로포빅/친수성 결합, 이온 결합(예를 들어, 정전기적 인력, 쿨롱력(coulombic attraction), 이온-쌍극자, 전하-이동), 반 데르 발스 또는 수소 결합, 및 공유결합의 형성을 포함하는 화학적 결합을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체 또는 이의 단편 같은 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티는 링커를 통해 연결되지 않으며, 예를 들어, 서로 직접적으로 연결된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티는 정전기적 인력으로 서로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “컨쥬게이트(conjugate)” 또는 “컨쥬게이션(conjugation)”은 하나의 실체(entity)를 형성하기 위해 두 개 이상의 실체들 간의 결합을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 다른 실체, 예를 들어 결합 모이어티(예: 프로타민)와 결합된 본 발명의 타겟팅 모이어티의 컨쥬게이션을 제공한다. 링커, 화학적 변형, 펩타이드 링커, 화학적 링커, 공유 또는 비-공유 결합, 또는 단백질 융합, 또는 당업자에게 알려진 방법들에 의해 접합(attachment)이 이루어질 수 있다. 결합(joining)은 영구적일 수 있거나 가역적일 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 컨쥬게이트에서 링커 및 단백질의 각각 소망하는 특성을 얻기 위해 여러 가지 링커를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 유연성 링커(flexible linkers) 및 컨쥬게이트의 용해성을 증가시키는 링커가 단독으로 또는 다른 링커와 함께 이용되는 것이 고려된다. 컨쥬게이트에서 링커를 인코딩하는 DNA를 하나 이상의 단백질에 발현시키기 위해 펩타이드 링커가 연결될 수 있다. 링커는 산-분해성(cleavable), 광-분해성 및 열-민감성 링커일 수 있다. 컨쥬게이션에 대한 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 본 발명에서의 용도를 위해 포함된다.
본 발명에 따르면, 항체 또는 항원 결합 항체 단편 같은 본 발명의 타겟팅 모이어티는 당업계에 잘 알려진 적절한 수단들(참조: 본 명세서에 참조로서 전문이 삽입된 미국 특허 번호 제4,625,014호, 제5,057,301호 및 제5,514,363호)을 통해 결합 모이어티 실체에 연결될 수 있다.
결합 모이어티와 타겟팅 모이어티의 컨쥬게이션에 대한 많은 방법들이 당업계에 알려져 있다. 그런 방법들은 본 명세서에 참조로서 전문이 삽입된 미국 특허 번호 제6,180,084호 및 제6,264,914호에서 Hermanson(1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press)에 의해 기재된 방법을 포함하며, 응용면역학에서 용이하게 이용되는 것처럼(참조: Harlow and Lane, 1988, "Antibodies: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 합텐을 운반 단백질에 연결하는데 이용되는 방법을 포함한다. 어떤 경우에서, 타게팅 모이어티 또는 결합 모이어티가, 예를 들어 컨쥬게이션 과정 또는 이에 이용되는 화학 군에 의존하는 컨쥬게이션에 따라 효율 또는 기능성을 상실할 수 있다는 것이 알려져 있다. 하지만, 당업자는 컨쥬게이션에 대한 많은 방법들을 고려하여 컨쥬게이션된 실체의 효율 또는 기능성에 영향을 미치지 않거나 또는 최소한으로 영향을 미치는 컨쥬게이션 방법을 찾을 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 항체 또는 이의 변이체, 유도체 또는 단편 같은 타겟팅 모이어티는 교차-연결(cross-linking)에 의해 컨쥬게이션될 수 있다. 교차연결 시약은 글루타르알데하이드(GAD), 이중기능성 옥시란(bifunctional oxirane, OXR), 에틸렌 글라이콜 다이글라이시딜 에테르(EGDE), N-하이드록시석시니미드(NHS) 및 수용성 카보다이이미드를 포함하며, 바람직하게는 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드(EDC)를 포함한다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 모든 교차연결-관련 화학이 이용될 수 있으며, 이는 티오에테르, 티오에스테르, 말이미드 및 티올, 아민-카르복시, 아민-아민 및 유기화학 매뉴얼(참조: Elements of Organic Chemistry, Isaak and Henry Zimmerman Macmillan Publishing Co., Inc. 866 Third Avenue, New York, N.Y. 10022)에 나열될 다른 물질들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
타겟팅 모이어티(예: 항체 또는 항체 단편)을 결합 모이어티에 컨쥬게이션시키는 연결에 대한 다른 접근 방식은 아미노카프론산 호스 래뒤시 퍼록시다제(HRP) 또는 헤테로이중기능성(heterobiofunctional) 교차-연결자, 예를 들어 카르보닐- 및 설프하이드릴-반응성 교차-연결자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 헤테로이중기능성 교차 연결 시약은 두-단계 또는 세-단계 과정을 통해 단백질 및 다른 거대분자 상에 두 개의 다른 기능 타겟으로 커플링될 수 있는 두 개의 반응군을 포함하며, 이러한 과정은 종종 호모-이중기능성(homo-biofunctional)을 이용하여 결합된 중합반응(polymerization)의 정도를 제한할 수 있다. 그러한 다단계(multistep) 프로토콜은 컨쥬게이트 크기 및 구성성분의 몰비를 크게 조절할 수 있다.
핵산-프로타민 복합체의 제조를 자세히 기술한 방법, 시약 및 참조 문헌은 미국 특허출원 공개번호 제US2002/0132990호 및 제US2004/0023902호에 개시되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 전문이 삽입된다. 특히, 결합 모이어티가 프로타민 또는 프로타민-유사 인자라면, 타겟팅 모이어티와 결합된 프로타민의 제조를 기술한 방법, 시약 및 참조 문헌은 미국 가출원 번호 제60/957,023호 및 국제 특허출원 번호 제US2007/012152호에 개시되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 전문이 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “상동(homologous)” 또는 “상동물(homologues)”은 상호 교환되어 사용되며 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 기술하는 경우, 두 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 정렬을 위해 변수들을 디폴트한 BLAST, version 2.2.14를 이용하여 최적으로 정렬하여 비교된 이의 고안된 서열들이 적절한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 삽입 또는 결실에 있어서 최소 70%, 일반적으로 약 75% 내지 99%의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 최소 약 98% 내지 99%의 뉴클레오타이드에서 동일하다는 것을 지시한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 “상동(homolog)” 또는 “상동적(homologous)”은 구조 및/또는 기능 면에서 상동성(homology)을 가진다는 것을 의미한다. 서열 상동성에 있어서, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 97% 또는 최소 99%가 동일하다면 그 서열들은 상동(homologs)이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “실질적으로 상동인(substantially homologous)”은 최소 90%, 최소 95%, 최소 97% 또는 최소 99%가 동일한 서열을 의미한다. 상동 서열은 다른 종에서 동일한 기능을 하는 유전자일 수 있다.
본 발명의 유전자 또는 펩타이드의 상동물의 결정은 당업자에 의해 용이하게 판단될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “상동성(homology)”, “동일성(identity)” 및 “유사성(similarity)”은 최적으로 정렬된 두 개의 펩타이드 또는 두 개의 핵산 분자 간의 서열 유사성의 정도를 의미한다. 상동성 및 동일성은 서로 비교를 위해 정렬된 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서 동일한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산이라면, 상기 분자는 그 위치에서 동일하다; 동일한 위치가 유사한 아미노산 잔기, 예를 들어 보존성 아미노산 치환 같은 입체적 및/또는 전기적 특성에서 유사한 아미노산 잔기라면, 상기 분자는 그 위치에서 상동(유사)하다는 것을 의미할 수 있다. 상동성/유사성 또는 동일성의 백분율로 표시되는 표현은 비교된 서열에 의해 공유되는 위치에서 각각 유사한 또는 동일한 아미노산들의 기능을 의미한다. “연관되지 않은(unrelated)” 또는 “비-상동적(non-homologous)”인 서열은 바람직하게는 본 출원의 서열에서 25% 이하의 동일성에서 사용될 지라도, 40% 이하의 동일성을 공유하는 서열을 의미한다.
폴리펩타이드를 기술하는 경우, 본 명세서에서 사용되는 용어 “보존성 치환(conservative substitution)”는 실질적으로 폴리펩타이드의 활성을 변형시키지 않는 폴리펩타이드의 아미노산 구성에서의 변화를 의미한다. 예를 들어, 보존성 치환은 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 보존성 아미노산 치환은 루이신을 이소루이신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 또는 트레오닌을 세린으로 치환하는 것을 포함한다. 그러므로, 특정 아미노산 서열의 “보존성 치환”는 폴리펩타이드 활성에 중요하지 않은 아미노산의 치환 또는 유사한 특성(예를 들어, 산성, 염기성, 양성 또는 음성 전하를 띤, 극성 또는 비극성, 등)을 지니는 다른 아미노산으로의 치환을 의미하며, 매우 중요한 아미노산의 치환이 펩타이드의 활성(즉, BBB를 통과할 수 있는 펩타이드의 활성)을 감소시키지는 않는다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 다음 여섯 군은 각각 서로에 대해 보존성 치환이 가능한 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파라긴산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W)(참조: Creighton, Proteins. W. H. Freeman and Company (1984)). 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 단일 아미노산 또는 작은 범위의 아미노산을 변형시키거나, 삽입하거나 또는 없애는 개개의 치환, 결실 또는 삽입이 펩타이드의 활성, 즉 핵산에 결합(bind or associate)하는 결합 모이어티의 능력을 감소시키지 않는다면 모두 “보존성 치환”로 고려될 수 있다. 전형적으로, 삽입 또는 결실은 약 1 내지 5 아미노산의 범위에서 이루어진다. 보존성 아미노산의 선택은 펩타이드 내에서 치환될 아미노산의 위치(예를 들어, 아미노산이 펩타이드의 외부에 존재하여 용매에 노출되거나 또는 아미노산이 펩타이드의 내부에 존재하여 용매에 노출되지 않는 경우)에 기반하여 선택될 수 있다. 예를 들어, Dordo et al., J. MoI Biol, 217: 721-739(1999); Taylor et al., J. Theor. Biol., 119; 205-218(1986); 및 S. French and B. Robson, J. MoI. Evol., 19:171(1983)에 개시된 바와 같이, 보존성 아미노산 치환은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법에서의 용도를 포함하는 보존성 아미노산은 단백질 또는 펩타이드의 외부에 위치하는 아미노산(즉, 용매에 노출된 아미노산)에 대해 적합한 보존성 치환을 포함한다. 예를 들어, 다음의 치환을 이용할 수 있다: F에 의한 Y의 치환, S 또는 K에 의한 T의 치환, A에 의한 P의 치환, D 또는 Q에 의한 E의 치환, D 또는 G에 의한 N의 치환, K에 의한 R의 치환, N 또는 A에 의한 G의 치환, S 또는 K에 의한 T의 치환, N 또는 E에 의한 D의 치환, L 또는 V에 의한 I의 치환, Y에 의한 F의 치환, T 또는 A에 의한 S의 치환, K에 의한 R의 치환, N 또는 A에 의한 G의 치환, R에 의한 K의 치환, 또는 S, K 또는 P에 의한 A의 치환.
본 명세서에서 사용되는 용어 “비-보존성”은 아미노산 잔기를 다른 화학적 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 비-보존성 치환은 아스파라긴산(D)을 치환하는 글라신(G); 아스파라긴(N)을 치환하는 라이신(K); 또는 알라닌(A)을 치환하는 아르기닌(R)을 포함하지만, 이에 한정하는 것은 아니다. “삽입(Insertions)” 또는 “결실(deletions)”은 전형적으로 약 1 내지 5 아미노산의 범위에서 이루어진다. 허용된 변이는 펩타이드를 합성하여 생산하는 동안에 재조합 DNA 기술을 이용하여 서열 내에 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환을 체계적으로 실시함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 명세서에서 사용되는 용어 “프로타민 상동(protamine homolog)”은 서열목록 제1서열의 프로타민 폴리펩타이드의 전장 아미노산 서열과 최소 40%의 상동성을 가지며 RNA에 결합하는 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 프로타민 단편 상동물은 서열목록 제1서열의 전장 아미노산 서열과 최소 40% 정도 상동적이고, 보다 바람직하게는 최소 약 50%, 최소 약 60%, 최소 약 70%, 최소 약 75%, 최소 약 80%, 최소 약 85%, 최소 약 90% 또는 최소 약 95% 정도 상동적이다. 상기 논의한 바와 같이, 상동성은 최소 약 40% 내지 99%이며 그 안의 모든 정수(즉, 45%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 등)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “서열 동일성(sequence identity)”은 두 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 비교창에서(즉, 뉴클레오타이드-대(by)-뉴클레오타이드 또는 잔기-대-잔기 기반해서) 동일하다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “서열 동일성의 백분율(percentage of sequence identity)”은 최적으로 정렬된 두 개의 서열을 비교창에서 비교하는 단계, 양 서열에서 동일한 핵산 염기(예: A, T, C, G, U 또는 I) 또는 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 얻는 단계, 비교창(즉, 윈도우 크기)에서 매칭된 위치의 수를 전체 위치의 수로 나누어주는 단계, 및 결과에 100을 곱하는 단계에 의해서 계산된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 명세서에서 사용되는 용어 “프로타민 상동(protamine homolog)”은 서열목록 제1서열의 프로타민 폴리펩타이드의 전장 아미노산 서열과 최소 40%의 동일성을 가지며 RNA에 결합하는 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 프로타민 단편 상동물은 서열목록 제1서열의 전장 아미노산 서열과 최소 40% 정도 동일하고, 보다 바람직하게는 최소 약 50%, 최소 약 60%, 최소 약 70%, 최소 약 75%, 최소 약 80%, 최소 약 85%, 최소 약 90% 또는 최소 약 95% 정도 동일하다. 상기 논의한 바와 같이, 동일성은 최소 약 40% 내지 99%이며 그 안의 모든 정수(즉, 45%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 등)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “실질적인 동일성(substantial identity)”은 비교창에서 최소 18 (개의) 뉴클레오타이드(6 아미노산) 위치, 종종 최소 24-48 (개의) 뉴클레오타이드(8-12 아미노산) 위치를 레퍼런스 서열과 비교하여 최소 85%의 서열 동일성을, 바람직하게는 최소 90% 내지 95%의 서열 동일성을, 보다 바람직하게는 최소 99%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 특징을 의미한다. 상술한 서열 동일성의 백분율은 레퍼런스 서열을 비교창에서 레퍼런스 서열의 20% 이하의 범위로 결실 또는 삽입을 포함하는 서열과 비교하여 계산된다. 레퍼런스 서열은 더 큰 서열일 수 있다. 본 명세서에서 폴리펩타이드를 기술하면서 사용되는 용어 “유사성(similarity)”은 첫 번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 보존적 아미노산 치환을 두 번째 폴리펩타이드의 서열과 비교하여 결정된다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 테스트 서열과 비교될 레퍼런스 서열로 기능한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 테스트 및 레퍼런스 서열을 컴퓨터에 입력하며, 필요하다면 서브서열 등가물(subsequence coordinate)이 지정되고 서열 알고리즘 프로그램 변수를 지정한다. 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 변수에 기반하여 레퍼런스 서열에 대해 상대적인 테스트 서열의 서열 상동성의 퍼센트를 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(local homology algorithm)(Adv. Appl. Math. 2: 482(1981); 본 명세서에 참조로서 삽입됨), Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(J. MoI. Biol. 48: 443-53(1970); 본 명세서에 참조로서 삽입됨), Pearson 및 Lipman의 유사성 방법에 대한 탐구(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-48(1988); 본 명세서에 참조로서 삽입됨), 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행(예를 들어, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 또는 시각 검사(visual inspection)(참조: 일반적으로, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999))를 이용하여 실행될 수 있다.
유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP이다. PILEUP은 서열 동일성의 퍼센트를 보여주기 위해 연속적인 쌍 정렬을 이용하여 관계된 서열들의 군으로부터 복합적인 서열 정렬을 창출한다. 또한, PILEUP은 정렬을 창출하는데 이용된 클러스터링 관계를 나타내는 트리 또는 계통수를 플롯화한다. PILEUP은 Feng 및 Doolittle의 연속적인 정렬 방법(J. MoI. Evol. 25: 351-60(1987); 본 명세서에 참조로서 삽입됨)을 간편하게 이용한다. 이용된 방법은 lliggins 및 Sharp에 의해 기술된 방법(Comput. Appl. Biosci. 5: 151-53(1989); 본 명세서에 참조로서 삽입됨)과 유사하다. PILEUP은 각각 5,000 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 길이로 구성된 300개의 서열까지 정렬할 수 있다. 복합적인 정렬 과정은 가장 유사한 두 개의 서열의 쌍 정렬로 시작하여 두 개의 정렬된 서열의 클러스터를 생산한다. 이후, 상술한 클러스터와 다음으로 가장 연관된 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터와 정렬된다. 두 개의 서열 클러스터가 두 개의 개개 서열의 쌍 정렬의 단순한 확대에 의해 정렬된다. 최종적인 정렬이 일련의 연속적인 쌍 정렬에 의해 달성된다. 프로그램은 특정 서열들 및 그들의 아미노산, 또는 비교 서열의 영역에 대한 뉴클레오타이드 등가물을 지정함에 의해 구동되며 프로그램 변수를 지정함에 따라 구동된다. 예를 들어, 레퍼런스 서열은 다음 변수를 이용하여 서열 동일성 관계의 퍼센트를 결정하기 위해 다른 테스트 서열과 비교될 수 있다: 디폴트 갭 웨이트(default gap weight)(3.00), 디폴트 갭 길이 웨이트(0.10) 및 웨이트된 말단 갭.
서열 동일성 및 서열 유사성의 퍼센트를 결정하기에 적합한 알고리즘 테스트의 다른 예는 Altschul et al.(J. MoI. Biol. 215: 403-410(1990); 본 명세서에 참조로서 삽입됨)에 의해 기술된 BLAST 알고리즘이다(참조: Zhang et al., Nucleic Acid Res. 26: 3986-90(1998); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25: 3389-402(1997); 본 명세서에 참조로서 삽입됨). BLAST 분석을 실시할 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 인터넷 웹 사이트를 통해 공개적으로 이용할 수 있다. 이 알고리즘은 탐색 서열(query sequence)에서 W 길이의 짧은 워드(word)를 동정함으로써 높은 스코어의 서열쌍(high scoring sequence pairs, HSPs)을 우선적으로 동정하는데, 이 HSP는 데이타 베이스 서열에서 같은 길이의 워드로 정렬될 때 양성-가치의 역치가(threshold score) T를 조화 또는 만족시킨다. T는 인근 워드의 역치가로서 언급된다(Altschul et al. (1990), 상기 참조). 이들 초기의 인근 워드 히트(hits)가 그들을 포함하는 더 긴 HSP를 발견하기 위한 탐색을 개시하는 시발점(seeds)으로 작용한다. 이후, 워드 히트는 누적성 정렬 스코어(cumulative alignment score)가 증가될 수 있는 한 각 서열의 양 방향으로 확대된다. 각 방향에서 워드 히트의 확대는 다음과 같은 경우에 정지된다: 1) 누적성 정렬 스코어가 최대 달성치(maximum achieved value)로부터 X 양까지 감소하는 경우, 2) 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 축적에 의해 누적성 스코어가 0 또는 그 이하가 되는 경우, 또는 3) 각 서열의 끝에 도달하는 경우. BLAST 알고리즘 변수인 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 11의 워드 길이(W), BLOSUM62 스코어링 매트릭스(참조: Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-9(1992); 본 명세서에 참조로서 삽입됨), 50의 배열(B), 10의 기대치(E), M = 5, N = -4 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 이용한다.
서열 동일성의 퍼센트를 계산하는 것 외에도, BLAST 알고리즘은 두 개의 서열 간의 유사성에 대한 통계적 분석을 실시한다(참조: Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77(1993); 본 명세서에 참조로서 삽입됨). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 측정은 두 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열간의 매치가 우연히 발생될 가능성의 지표를 제공하는 가장 작은 확률의 합(sum probability, P(N))이다. 예를 들어, 레퍼런스 핵산과 테스트 핵산의 비교에서 가장 작은 확률의 합이 약 0.1 보다, 보다 바람직하게는(typically) 0.01 보다 및 가장 바람직하게는 0.001 보다 작다면, 핵산은 레퍼런스 서열과 유사하다고 고려된다.
용도
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 명세서에서 개시된 siRNA 복합체는 T-세포 관련된 질병 또는 질환의 예방 치료를 포함하는 치료에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 개시된 바와 같이 항-HIV-1 siRNA 및 다른 치료용 siRNA를 포함하는 본 발명의 siRNA 복합체는 T-세포 생존을 유지하기 위해 HIV 감염을 억제하거나 또는 HIV-감염된 세포를 치료하는 데 이용할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명의 siRNA 복합체는 T-세포를 타겟하는 타겟팅 모이어티를 포함하며 이로 인해 T-세포 질병 또는 질환을 치료하기 위한 siRNA의 T 세포로의 운반에 유용하고, 이러한 운반은 하나 이상의 유전자의 발현의 타겟된 감소를 초래하여 치료학적 이점을 제공할 수 있다.
T-세포 질병 또는 질환의 일 예는 HIV(인간 면역결핍 바이러스) 같은 T-세포 면역 질환이며, 이 경우에 siRNA 복합체는 T-세포 생존을 유지하도록 지시된 RNAi 분자와 결합될 수 있다. 예시적인 예로서 본 발명의 그러한 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 본 발명의 siRNA-복합체는 BAX, Smac/DIABLO, Fas, FasL 등의 프로-아팝토틱(pro-apoptotic) 유전자를 유전자-사일런싱시키는 siRNA 분자 같은, 세포 사멸 또는 프로-아팝토틱 유전자를 억제시킬 목적의 siRNA를 포함한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 당업자에게 통상적으로 잘 알려진 다른 여러 가지 프로-아팝토틱 유전자들의 유전자 사일런싱을 디자인될 수 있는데, 이러한 유전자들은 Hsp90; TNF-α; DIABLO: BAX; Bcl-2 억제제; Bad; 폴리 ADP 리보오스 폴리머라제-1(PARP-1): 이차 마이토콘드리아-유래된 활성제 또는 카스파제(SMAC); 아팝토시스-유발 인자(AIF); Fas (Apo-1 또는 CD95으로도 알려짐); Fas 리간드(FasL) 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, T-세포 질병 또는 질환의 다른 예는 T-세포 림프종 같은 T-세포 증식 질병이며, 이 경우에 siRNA 복합체는 T-세포 사멸 또는 아팝토시스를 유발하는 곳으로 지시될 수 있다. 예시적인 예로서 본 발명의 그러한 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 siRNA-복합체는 Bcl-2, Hsp27, Hsp70, BcI-XL, 아팝토시스 억제 (IAP) 단백질 등의 프로-생존(pro-survival) 유전자를 유전자-사일런싱시키는 프로-아팝토틱 siRNA 분자 같은, 생존 유전자를 억제시킬 목적의 siRNA를 포함한다.
바이러스
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 siRNA-복합체는 바이러스-관련된 질병 또는 질환의 예방 치료를 포함하는 치료에 유용하다. 바이러스-관련된 질병 또는 질환의 예는 AIDS/HIV; 아비앙 플루; SARS; A형 간염; B형 간염; C형 간염; 인플루엔자; 수두; 아데노바이러스, HSV-2; HSV-II; 린더페스트 리노바이러스; 에크노바이러스; 로타바이러스; 호흡기 세포융합 바이러스(RSV); 파필로마 바이러스; 파포바 바이러스; 사이토메갈로바이러스; 에치노바이러스; 아보바이러스; 한타바이러스; 콕사키 바이러스; 홍역 바이러스; 볼거리 바이러스; 루벨라 바이러스; 폴리오 바이러스; HIV-I, HIV-II; 아비앙 및/또는 조류 플루 바이러스; 에볼라 바이러스; 및 다른 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상술한 다른 바이러스는 1형 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus type-1), 2형 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus type-2), 사이토메갈로바이러스, 엡스타이-바 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 7, 인간 헤르페스 바이러스 8, 바리올라 바이러스, 소수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오마바이러스, 인간 파필로마바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 콕사키 바이러스, 뎅기열 바이러스, 볼거리 바이러스, 폴리오바이러스, 라비에즈 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 황열바이러스, 에볼라 바이러스, 마버그 바이러스, 라사 열병 바이러스, 동부 마 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 계곡열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 리프트밸리 열바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스 B, 로타바이러스 C, 신드비스 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1형, 한타바이러스, 루벨라 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 및 인간 면역결핍 바이러스 2형(HIV-2)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 siRNA-복합체는 HIV에 감염된 환자의 예방 치료를 포함하는 치료에 유용하다. 또한, 바이러스-유도 종양의 예방이 본 명세서에 개시된 타겟된 복합체를 이용하여 고려된다. 예를 들어, 인간 파필리오마 바이러스(HPV)에 감염된 타겟팅 세포는 HIV 감염에 의해 야기된 자궁경부암의 진행(development)을 예방할 수 있다.
암
본 명세서에서 사용되는 용어 “종양(tumor)”은 혈관신생 맥관형성에 의해 적어도 부분적으로 특징화할 수 있는 형질전환된 세포 덩어리(mass)를 의미한다. 형질전환된 세포는 새로운 성장을 시작하는 자극이 없어진 후에도 빠르게 지속하는 조절되지 않는 신생혈관 세포 증식(cell multiplication)에 의해 특징화 된다. 용어 “종양(tumor)”은 종양 실질 세포 덩어리를 침입하는 혈관신생 혈관을 포함하는 종양 실질 세포 뿐 아니라 지지간질(supporting stroma)을 포함하는 넓은 의미로 이용된다. 비록 종양이 일반적으로 악성 종양, 즉 전이하는 능력을 가지는 암(즉, 전이암)일 지라도, 종양도 악성이 아닐 수 있다(즉, 비-전이 종양). 종양은 이의 자연스러운 진행이 치명적인 신생물 질환(neoplastic disease)으로 암의 특징(hallmark)이다. 암 세포는 침입 및 전이의 특질을 보이며 매우 악성(anaplastic)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “전이(metastases)” 또는 “전이성 종양(metastatic tumor)”은 고형암인 일차 종양으로부터 분리되어 몸의 다른 부분에서 자라며 떨어져서 운반된 세포로부터 야기되는 이차 종양을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 일차 종양은 존재하고 있던 위치 또는 기관에서 유래된 종양으로 원위치에서 다른 위치로 전이되지 않는 종양을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “악성 종양(malignant tumor)”은 침입 및 전이할 수 있는 능력을 가지며 퇴화(anaplasia)의 정도가 매우 높은 종양이다. 퇴화는 미숙한 또는 덜 분화된 형태로 세포가 전환(reversion)됨을 의미하며 대부분의 악성 종양에서 일어난다.
혈관은 몸의 다른 곳으로 전이하고 퍼져나가는 통로를 제공한다. 암 세포는 전이할 곳에 도착하여 새로운 혈액 공급 네트워크를 만들어낸다. 본 명세서에 개시된 복합체를 이용하여 암을 치료하는 접근 방식은 암 세포에서 발현되는 종양 항원을 이용하여 혈관신생 유발전구인자(pro-angiogenic factors) 또는 혈관신생 유발전구 유전자를 목표로 하는 RNA 간섭 인자를 암 세포로 타겟팅하는 것이다. 예를 들어, 특정 후보들은 종양 세포에 의해 생산되는 VEGF, bFGF 및 다른 혈관신생 유발전구인자를 발현하는 유전자를 포함한다.
이러한 접근 방식에서, 본 명세서에 개시된 본 발명의 조성물의 투여는 언제든지 이차 종양 부위를 가질 수 있는 일차 종양 부위를 가지는 암을 치료하는 데 유용하다. 본 발명의 접근 방식은 질병의 진행을 예방하고 제한하는 데 도움을 준다. 성장을 유지하기 위해 효율적인 혈액 공급을 필요로 하는 고형암은 후보 타겟이다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 치료를 위한 후보는 항문, 방광, 담관, 골, 뇌, 유방, 경부, 결장/직장, 자궁내막, 식도, 눈 담낭, 머리 및 목, 간, 신장, 후두, 폐, 종격(가슴), 구강, 난소, 췌장, 음경, 전립선, 피부, 소장, 위, 척수, 꼬리뼈, 고환, 갑상선 및 자궁에서 발견되는 암종 및 육종을 포함한다. 암종의 형태는 유두종/암종, 융모상피암, 내배엽동 종양, 기형종, 선종, 흑색종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 횡문근종, 중피종, 혈관종, 골종, 연골종, 신경교종, 림프종/백혈병, 편평상피세포암, 소세포암, 대세포 미분화암종(LCUC), 기저세포암 및 비강상악동 미분화암종(SNUC)을 포함한다. 육종의 형태는 포상연부육종, 혈관육종, 피부섬유육종, 체간부 유건종, 결합조직형성 소원형세포 종양, 외골격 연골육종, 외골결 골육종, 섬유육종, 혈관주위 세포종, 혈관육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 임파 육종, 악성 섬유성 조직구종, 신경섬유육종, 횡문근육종, 활액막 육종 및 아스킨 종양 같은 연조직 육종, 유잉육종(원시 신경외배엽 종양), 악성 혈관내피세포종, 악성 신경초종, 골육종 및 연골육종을 포함한다. 또한, 혈관종의 형태에서 피부 또는 내장 기관에 혈관의 비정상적 형성(build up) 및 성장은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 치료될 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 암의 치료 또는 예방을 위해 이용되는 경우, siRNA는 종양 유전자 또는 원형종양 유전자를 타겟팅하기 위해 선택적으로 이용될 수 있다. 예를 들어, siRNA는 v- fms; v-myc; v-src; v-abl; v-erb; v-erba; v-fos; Ml protein; 바이러스 유사 파티클(VPL) 같은 폴리뉴클레오타이드를 타겟팅하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “종양 유전자(oncogene)”는 우성일 경우(dominant fashion) 세포를 정상적인 성장의 제약으로부터 해방시키는 정상 유전자의 돌연변이된 및/또는 과발현된 변형(version)을 인코딩하는 핵산 서열 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 종양 유전자는 단독으로 또는 다른 변화 또는 유전자와 함께 작용하여 세포의 종양형성에 기여할 수 있다. 종양 유전자의 예는 gp40(v-fms); p21(ras); p55(v-myc); p65(gag-jun); pp60(v-src); v-abl; v-erb; v-erba; v-fos 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “원형종양 유전자(proto-oncogene)” 또는 “프로-종양 유전자(pro-oncogene)”는 종양 유전자의 정상적인 세포 내 등가물(equivalent)을 발현하는 핵산의 정상적인 발현을 의미하며, 일반적으로 세포 성장의 시그널링 또는 조절에 포함된다. 이들의 예는 c-myc, c-fos, c-jun 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “치료하다(treat)” 또는 “치료(treatment)”는 AIDS의 진행 또는 암의 확산 같은 질병의 발전을 예방하거나 또는 지연시키는 목적의 치료학적 치료 및 예방적인 조치(measures)를 모두 의미한다. 일반적으로, 본 명세서에 정의된 바와 같이 하나 이상의 증상 또는 임상적 마커들이 감소된다면 치료는 “효과적(effective)”이다. 또 다른 의미로, 질병의 진행을 감소시키거나 또는 멈추게 하면 치료는 “효과적(effective)”이다. 즉, “치료(treatment)”는 증후 또는 마커의 개선 뿐 아니라, 처리의 부재 하에서 나타날 수 있는 증후의 진행 또는 악화의 중단 또는 적어도 지체(slowing)를 포함한다. 유익한 또는 소망하는 임상적 결과는, 진단될 수 있거나 또는 진단될 수 없느냐에 무관하게, 하나 이상의 증후의 완화, 질병 정도의 감퇴, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 지체, 질병 상태의 개선 또는 경감 및 (부분적인 또는 전체적인) 차도를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, “치료(treatment)”는 치료를 받지 않은 경우에 기대되는 생존과 비교하여 더 연장된 생존을 의미한다. 치료가 필요한 환자들은 이미 HIV 감염 또는 본 발명의 어떤 구현예로 진단된 이들, 전이로 인해 이차 종양이 발생한 이들 및 이미 암으로 진단된 이들을 포함한다.
약제학적 조성물
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 siRNA 복합체는 환자에게 투여될 수 있으며, siRNA 복합체를, 예를 들어 뇌, 간, 심장 또는 신장 같은 특정 기관 또는 악성 증식 또는 바이러스 감염으로 영향 받은 특정 위치로 운반하기 위해 국소 투여, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 수강내 주입, 정맥내 주입 또는 카테터 같은 운반 시스템을 이용할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 바와 같이 타겟팅 모이어티 및 RNAi 분자와 결합된 프로타민 또는 이의 단편 같은 결합 모이어티를 포함하는 siRNA 복합체는 약제학적 조성물 같은 조성물로 환자에게 투여된다.
siRNA 복합체의 맥락에서 이용되는 경우, 본 명세서에서 사용되는 용어 “조성물(composition)” 또는 “약제학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 상호 교환되어 사용되며, 통상적으로 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 담체 같은 첨가제를 포함하며 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 인간 세포로의 투여에 적합한 조성물 또는 제제를 의미한다. 상술한 조성물은 하나 이상의 일반적인 경로를 통해 투여되도록 특이적으로 제제화될 수 있으며, 상기 일반적인 경로는 경구, 눈, 비경구, 정맥내, 동맥, 피하, 비내, 혀, 척수내, 뇌혈관내 및 이와 유사한 경로를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 당업계에 잘 알려진 것처럼 국소(예: 구강점막, 호흡점막) 및 구강 투여용 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방출형(sustained-release) 제제, 구강세정 또는 파우더의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예는 University of the Sciences in Philadelphia(2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons, 21st Ed.에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “약제학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)”는 타겟된 운반 조성물(예: 환자에게 타겟된 siRNA 복합체)를 혼합 및/또는 운반하는 약제학적으로 허용되는 모든 수단을 의미하며, 이러한 수단은 액체 또는 고형 필러, 희석액, 첨가제, 용매 또는 인캡슐레이션된 물질 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 전달 매체(vehicle)를 포함하고, 복합체의 활성을 유지하거나 또는 환자에게 운반하는 것을 촉진하거나 또는 본 명세서에 개시된 것처럼 siRNA 복합체를 몸의 기관 또는 부위로부터 다른 기관 또는 부위로 운반하거나 전달하는 과정에 포함된다. 각 담체는 제제의 다른 성분과 양립한다는 점에서 “허용되는(acceptable)”이고 환자, 예를 들어 인간에게 투여하기 용이해야만 한다. 본 발명의 방법의 임상적 용도에 있어서, 본 발명의 siRNA-복합체는 경구 투여, 직장 투여, 질내 투여, 비경구 투여, 국소 투여, 정맥내 투여 또는 다른 방식의 투여를 위해 약제학적 제제로 제제화된다. 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 포함한다. 담체는 고형, 반-고형 또는 액체 희석제, 크림 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 이들 약제학적 조성물의 제조는 본 발명의 또 다른 목적이다. 통상적으로 활성화합물의 양은 무게 당 제조물의 0.1-95%의 범위이며, 비경구의 경우, 바람직하게는 무게 당 제조물의 0.2-20%의 범위이고 경구 투여의 경우, 바람직하게는 무게 당 제조물의 1-50%의 범위이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “비경구 투여(parenteral administration)” 및 “비경구로 투여된(administered parenterally)”은 통상적으로 주사(injection)에 의한 소화관내 투여 및 국소 투여 외에 다른 방식의 투여를 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 뇌실내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하(subcutaneous), 피하내(subcuticular), 관절내, 피막학, 지주막하, 척수내, 뇌내 척수(intracerebro spinal) 및 흉골내 주사 및 주입(infusion)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “전신성 투여(systemic administration)”, “전신으로 투여된(administered systemically)”, “말초 투여(peripheral administration)” 및 “말초적으로 투여된(administered peripherally)”은 소망하는 기능 위치에 직접적으로 투여된 경우 외에 화합물, 약물 또는 다른 물질의 투여를 의미하며, 이러한 투여물은 동물의 시스템으로 유입됨에 따라 대사과정 및 다른 유사 과정에 영향을 받는다. 실질적인 예는 피하 주입 또는 정맥내 주입이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “투여하는(administering)” 및 “도입하는(introducing)”은 상호 교환되어 사용되며, 소망하는 위치에 적어도 인자의 부분적 위치를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 항체 같은 타겟팅 모이어티, 프로타민 같은 결합 모이어티 및 본 명세서에 개시된 RNAi 같은 결합 인자(associated agents)를 환자로 위치시키는 것을 의미한다. 본 명세서에 개시된 인자는 환자에서 효과적인 치료를 야기하는 적합한 모든 경로에 의해 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 1회 투여량(Dosage unit)의 형태로 본 발명의 siRNA-복합체를 포함하는 약제학적 제제의 제조에서, 선택된 화합물은 분해제 및 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 퓨마레이트 및 폴리에틸렌 글라이콜 왁스 같은 윤활제 뿐 아니라, 락토오스, 사카로오스, 소비톨, 마니톨, 녹말, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴 또는 다른 적절한 성분 같은 고형, 파우더형 성분과 혼합될 수 있다. 이후 혼합물은 과립으로 프로세싱되거나 또는 정제로 압축된다.
연한 젤라틴 캡슐은 식물성 오일, 지방 또는 다른 적합한 전달 매체 내에 본 발명의 활성 화합물의 혼합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 캡슐로 제조될 수 있다. 단단한 젤라틴 캡슐은 활성 화합물의 과립을 포함할 수 있다. 또한, 단단한 젤라틴 캡슐은 락토오스, 사카로오스, 소비톨, 마니톨, 감자 녹말, 옥수수 녹말, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 유도체 또는 젤라틴 같은 고형 파우더형 성분과 조합된 타겟 siRNA 뿐 아니라, 타겟 모이어티 및 RNA-결합 모이이어를 포함하는 siRNA-복합체를 포함할 수 있다.
직장 투여 또는 질내 투여를 위한 1회 투여량은 (i) 중성 지방 염기와 혼합된 활성 물질, 즉 siRNA-복합체를 포함하는 좌약의 형태로; (ii) 식물성 오일, 파라핀 오일 또는다른 적절한 전달 매체와 혼합된 활성 물질을 포함하는 젤라틴 직장 캡슐의 형태로; (iii) 기존의(ready-made) 마이크로 관장제의 형태로; 또는 (iv) 투여 전에 적절한 용매에서 재구성되는 건식 마이크로 관장제제의 형태로 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 제조는 시럽 또는 현탁액의 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어 시럽 또는 현탁액은 무게 당 0.2% 내지 20%의 활성 성분, 및 당 또는 당알코올 및 에탄올, 물, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜 및 폴리에틸렌 글라이콜의 혼합물을 나머지로 포함한다. 소망한다면, 액체 제조는 착색제, 향미제, 사카린 및 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 다른 후화제(thickening agents)를 포함할 수 있다. 또한, 경구 투여를 위한 액체 제조는 이용 전에 적절한 용매에서 재구성되는 건식 파우더의 형태로 제조될 수 있다.
비경구 투여를 위한 용액은 약제학적으로 허용되는 용매(바람직하게는, 무게 당 0.1-10%의 농도) 내에 본 발명의 화합물을 포함하는 용액으로 제조될 수 있다. 또한, 이들 용액은 안정화시키는 성분 및/또는 완충 성분을 포함하며, 앰플 또는 바이얼의 형태로 1회 투여량에 분산된다. 또한, 비경구 투여를 위한 용액은 이용 전에 바로(extemporaneously) 적절한 용매에서 재구성되는 건식 제제로 제조될 수 있다.
RNA 간섭 인자를 운반하는 본 발명의 방법은 마이크로 또는 나노파티클을 형성하기 위해 분산된 건조 파티클 또는 복합된 건조 파티클을 포함하는 과립 형태로 RNA 간섭 인자를 경구로 운반하기 위해 이용될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐서 언급된 바와 같이, 환자 또는 개인은 마우스, 특별한 마우스 및 래트, 또는 소 같은 포유류 및 인간 같은 영장류를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “인 비보 운반(in vivo delivery)”은 인간을 포함하는 살아있는 대상으로 siRNA를 운반하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “인 비트로 운반(in vitro delivery)”은 살아있는 대상 밖에서 세포 및 기관으로 siRNA를 운반하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “유효량(effective amount)”은 최소 하나 이상의 질병 또는 질환의 증후를 완화시키기 위한 약제학적 조성물의 치료제의 양을 의미하며 소망하는 효과를 제공하는 약리학적 조성물의 충분한 양에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 구 “치료학적 유효량(therapeutically effective amount)”(예: 본 명세서에 개시된 siRNA 복합체)은 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이득/위험 비(benefit/risk ratio) 내에서 질환을 치료하기 위한 조성물의 충분한 양을 의미한다. 따라서, 용어 “치료학적 유효량”은 T-세포 질병 또는 암을 가지는 전형적인 환자에게 투여된 경우, T-세포 질병 또는 암-매개된 상태(condition)와 관련된 증상 또는 임상적 마커 상에 치료학적으로 또는 예방적으로 현저한 감소를 유발하기에 충분한 본 발명의 조성물의 양을 의미한다.
증상에서 치료학적으로 또는 예방적으로 현저한 감소는 대조군 또는 처리하지 않은 환자와 비교하여 측정된 변수에서 최소 약 10%, 최소 약 20%, 최소 약 30%, 최소 약 40%, 최소 약 50%, 최소 약 60%, 최소 약 70%, 최소 약 80%, 최소 약 90%, 최소 약 100%, 최소 약 125%, 최소 약 150% 또는 그 이상을 의미한다. 즉정된 또는 측정할 수 있는 변수는 질병에 대해 임상적으로 검출가능한 마커(예를 들어, 생물학적 마커의 증가된 또는 감소된 레벨) 뿐 아니라, 임상적으로 허용된 범위에서 질병 또는 질환에 대한 증상 또는 마커와 관련된 변수를 포함한다. 하지만, 본 명세서에 개시된 조성물 및 제제의 하루 투여량은 정상적인 의학적 판단의 범위에서 사려깊은 의사에 의해 결정되는 것이 당연할 것이다. 필요한 정량은 치료될 질병의 형태 같은 요인들에 따라 다양할 것이다. 다른 T-세포 질병의 예는 환자가 T 세포 결핍이거나 또는 감소된 레벨의 T 세포를 가지는 경우(예를 들어, HIV 같은 T-세포 질병에 걸린 환자), 또는 환자가 T 세포의 증가된 증식을 보이거나 또는 증가된 레벨의 T 세포를 가지는 경우(예를 들어, T-세포 림프종)를 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 용어로서 치료학적 유효량은 질병을 박멸할 필요는 없는데, 예를 들어 HIV 바이러스를 박멸하거나 또는 본 발명의 다른 구현예에서는 종양 또는 신생물을 박멸할 필요는 없다.
HIV에 감염된 환자의 치료에 있어서, 용어 “치료학적 유효량”은 HIV-감염된 환자에서 T-세포에서의 감소 또는 후천성면역결핍증(AIDS)의 발전을 예방하거나 또는 지연시킬 수 있는 안전하고 충분한 양을 의미한다. 또한, 상술한 제제 또는 조성물의 효능은 본 명세서에 개시된 실시예에서 볼 수 있는 HIV의 실험적인 동물 모델, 예를 들어 HIV에 감염된 세포 또는 인간화된 마우스 모델을 이용하여 판단할 수 있는데, 이들 모델은 본질적으로 마우스에서 인간 면역 환경을 복제함으로써 그러한 결과를 통해서 인간 환자에서 유사한 결과의 예측을 기대할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 혈청반응 양성 HIV 환자로부터 유래한 혈액 같은 생물학적 시료 상에서 테스트될 수 있다. 실험적인 동물 모델을 이용하는 경우, 치료 효능은 HIV 감염의 증상이 완화되는, 예를 들어 처리되지 않은 동물과 비교하여 처리된 동물에서 T-세포 수의 증가 또는 T-세포 감소의 감소율의 지체 또는 중단이 더 빠르게 발생하는 경우에 증명된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “더 빠르게(earlier)”는 T-세포 레벨의 증가 또는 T-세포 감소율의 지체 또는 중단이 최소 5% 더 빠르게 일어나는 것을 의미하지만, 바람직하게는 하루, 이틀, 3일 또는 그 이상 더 빠르게 일어나는 것이다. 그러므로, HIV에 감염된 환자의 치료에 유용한 치료학적 유효량은 치료제를 처리하지 않은 환자의 T-세포 손실률과 비교하여 환자의 T-세포 손실률을 느리게 하고, 본 발명의 어떤 구현예에 따르면 건강한 환자에서 보여지는 레벨로 T-세포의 수를 증가시킨다.
암 환자의 치료에 있어서, 용어 “치료학적 유효량”은 암 환자에서 종양의 발전 및 추가적인 성장, 또는 전이의 확산(spread)을 예방하거나 또는 지연시킬 수 있는 안전하고 충분한 양을 의미한다. 그러므로, 치료학적 유효랑은 완화되는 암을 치료 또는 야기하거나, 암의 진행 과정을 지연시키거나, 종양 성장을 지연 또는 억제하거나, 종양 전이를 지연 또는 억제하거나, 전이 위치에서 이차 종양의 형성을 지연 또는 억제하거나, 또는 신규한 종양 전이의 형성을 억제할 수 있다. 암 치료를 위한 치료학적 유효랑은 치료된 종양, 종양의 심각성, 종양의 약물 저항성 정도, 치료될 종, 환자의 나이 및 일반적인 상태, 투여 방식 등에 따라 다양하다. 따라서, 정확하게 “유효량”을 명기하는 것은 불가능하다. 하지만, 경우에 따라 적절한 “유효량”이 용이한 실험을 통해 당업자에 의해 결정될 수 있다. 치료 효능은 당업계의 전문가(practitioner)에 의해 판단될 수 있는데, 예를 들어 효능은 암 및 종양의 동물 모델(예: 암을 가진 설치류의 치료)에서 평가될 수 있다. 최소 하나 이상의 암 증상을 완화시키는(예: 종양 크기의 감소, 종양 성장률의 지연 또는 중단) 본 발명의 조성물 또는 제제의 처리 또는 투여는 효과적인 치료를 나타낸다. 암 치료에 이용된 본 발명의 조성물을 포함하는 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 효능은 암의 실험적인 동물 모델, 예를 들어 야생형 마우스 또는 래트, 또는 바람직하게는 종양 세포의 이식을 이용하여 판단될 수 있다. 실험적인 동물 모델을 이용한 경우, 치료 효능은 암의 증상이 완화되는, 예를 들어 처리된 동물 대 처리되지 않은 동물에서 종양 크기의 감소, 종양 성장률의 지연 또는 중단이 더 빠르게 발생하는 경우에 증명된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “더 빠르게(earlier)”는 감소, 예를 들어 종양 크기의 감소가 최소 5% 더 빠르게 일어나는 것을 의미하지만, 바람직하게는 하루, 이틀, 3일 또는 그 이상 더 빠르게 일어나는 것이다.
암 치료를 언급하면서 사용되는 용어 치료는 암 증상 및/또는 암의 생화학적 마커의 감소를 의미한다. 예를 들어, 암에 대한 최소 하나의 생화학적 마커가 최소 10%까지 감소하는 것이 효과적인 치료로 간주된다. 암의 생화학적 마커의 예는 CD44, 텔로머라제, TGF-α, TGF-β, erbB-2, erbB-3, MUCl, MUC2, CK20, PSA, CA125 및 FOBT을 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 암의 증식률이 최소 10%까지 감소하는 것도 본 발명의 방법에 의한 효과적인 치료로 간주된다. 또 다른 예로서, 암 증상의 감소(예를 들어 암 성장률이 10%까지 느려지는 것, 종양 크기가 증가하는 것을 멈추는 것, 종양 크기가 10%까지 감소하는 것, 종양 확산(즉, 종양 전이)이 10%까지 감소하는 것)도 본 발명의 방법에 의한 효과적인 치료로 간주된다. 따라서, T-세포 림프종을 가진 환자의 치료를 위한 치료학적 유효량은 T-세포 증식 레벨을 감소시키고, 본 발명의 어떤 구현예 같이 환자에서 T-세포의 수를 감소시키는(예를 들어, 건강한 정상인 또는 영향받지 않은 환자에서 나타나는 레벨로 T-세포 레벨의 감소) 양을 의미한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 치료제가 실질적으로 종양을 죽이는 것이 바람직하지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
특정 환자에 대한 치료학적 유효한 투여량은 다음과 같은 다양한 요인에 따라 결정될 것이다: 치료될 질환 및 질환의 심각성; 운반될 RNAi 분자의 활성 및 특이성; 타겟 유전자에 의해 발현되는 단백질의 반감기 및 턴-오버; 타겟 유전자의 발현 레벨; 환자의 나이, 몸무게, 일반적인 건강, 성 및 식이요법(diet); 투여 시간, 투여 경로 및 이용된 특정 화합물의 배설 속도; 치료 기간; 본 발명의 조성물 및 제제의 조합 또는 부합하여 이용되는 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 요인들. 예를 들어, 개인 또는 환자의 치료에 적절하다면, 소망하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 레벨보다 더 낮은 레벨에서 화합물의 투여를 시작하여 소망하는 효과를 달성할 때까지 투여량을 점차적으로 증가시키거나 또는 높은 레벨로 화합물의 투여를 시작하여 소망하는 효과를 달성할 때까지 투여량을 점차적으로 감소시키는 것은 당업계에 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 예방적인 또는 치료학적 유효량에서 투여될 수 있다. 본 발명의 제제 및 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 예방적인 또는 치료학적 유효량은 소망하는 효과를 달성하기에 필요한 또는 치료될 특정 질병 또는 질환의 시작(onset)을 지연하거나, 또는 진행을 억제하거나, 또는 시작 및 진행을 중단시키기 위해 최소한 부분적으로 필요한 양을 의미한다. 물론, 이러한 양은 치료되는 특정 상태, 상태의 심각성 및 나이, 육체적 상태, 키, 몸무게 및 동시 치료를 포함하는 개개인의 환자 변수에 따라 다양한 것이다. 이러한 요인은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 추가적인 일상 실험 없이 소개될 수 있다. 일반적으로, 최대 투여량, 즉 건전한 의학적 판단에 따른 가장 높은 안전한 투여량이 사용되는 것이 바람직하다. 하지만, 더 낮은 투여량 또는 허용가능한(tolerable) 투여량이 의학적 이유, 심리학적 이유 또는 일반적인 다른 모든 이유를 고려해 투여될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
한편, 투여될 각 성분의 양은, 예를 들어 투여가 하루에 한번, 이틀에 한번, 하루에 3번 또는 4번, 한주에 한번; 또는 한주에 여러 번(예: 한주에 2번, 3번 또는 4번)인 투여 빈도에 따라 다양하다.
본 발명이 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고 여러 가지 변형도 포함한다는 것은 자명하다. 본 명세서에서 사용하는 용어는 특정 구현예를 기술하는 목적에 부합하며 오직 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시된 실시예 또는 그렇지 않으면 지시된 실시예 외에도, 본 명세서에서 사용하는 성분 또는 반응 상태의 양을 표현하는 모든 숫자는 용어 “약(about)”에 의해 모든 예에서 변형될 수 있는 것으로 간주한다. 본 명세서에서 백분율과 연결되어 사용되는 용어 “약”은 ?%를 의미한다. 본 발명은 추가적으로 다음 실시예에 의해 상세하게 설명되지만, 본 발명의 범위가 이로부터 제한되지 않는다.
도 1A-1E는 T 세포에서 인 비트로 및 인 비보에서 scFvCD7-9R-매개된 siRNA 흡수 및 유전자-사일런싱을 나타낸다. 도 1A는 200 pmol FITC-표지된 siRNA 단독으로 또는 지시된 시약과 혼합된 siRNA를 정제된 인간 CD3+ T 세포(위 패널), CD19+ B 세포 및 분화된 CD14+ T 세포-유래된 대식세포(아래 패널)에 처리한 결과(검은색 히스토그램)를 나타낸다. 회색으로 채워진 히스토그램은 목-형질전환된(mock- transfected) 세포를 나타낸다. 도 1B는 scFvCD7-9R과 복합된 항-huCD4 siRNA(400 pmole)를 PHA-활성화된 PBMC에 처리한 결과로 60시간 후에 CD3+ T 세포에서 CD4 및 CD8 발현 레벨을 모니터링한 결과를 나타낸다(검은색 히스토그램). 회색 히스토그램은 대조군으로서 scFvCD7-9R/siLuc을 처리한 세포를 나타낸다. 도 1C 및 도 1D는 도너로 건강한 PBMC가 복막 내로 주입된 NOD/SCIDIL2rγc-/- 마우스(Hu-PBL mice)에서의 결과를 나타낸다. 15일 후에 세 마리의 마우스 군에 scFvCD7-9R과 복합된 50 ㎍의 siLuc(대조군) 또는 siCD4(테스트) siRNA를 정맥 내로 16시간의 간격으로 두 번에 걸쳐 주입하고 60시간 후에 말초 혈액, 비장 및 간에서 인간 CD3+ T 세포에서 CD4 및 CD8 발현 레벨을 분석하였다. 도 1C 및 도 1D는 각각 한 마리의 마우스로부터 얻어진 대표적인 점도표(dot plot) 및 세 마리의 마우스로부터 얻어진 누적 결과를 나타낸다. 별표 및 ns는 각각 테스트 및 대조군 간의 차이가 유의한 결과 및 차이가 없는 결과를 나타낸다(P < 0.05). 도 1E는 도 1C와 동일한 방법으로 siRNA가 처리된 마우스의 세 차례 결과를 나타내며 최종 주입 후에 말초 혈액 T 세포에서 CD4 및 CD8 발현을 3일, 6일 및 9일 째에 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 2A-2D는 scFvCD7-9R과 복합된 siRNA의 정맥 내 처리가 Hu-PBL 마우스에서 HIV 감염을 억제한다는 것을 나타내는 결과이다. 도 2A는 scFvCD7-9R/siRNA 투여 프로토콜 및 HIVBaL로 감염된 Hu-PBL 마우스의 면역학적 모니터링 및 바이러스 모니 터링을 나타낸다. 도 2B, 도 2C 및 도 2D는 재건 후 14일 째에 50 ㎍의 siCCR5 또는 siLuc(대조군)을 정맥 내로 처리한 Hu-PBL 마우스의 결과를 나타낸다. 재건 후 2일 째에, 상술한 마우스에 10,000 TCID50의 HIVBaL을 복막 내로 감염시키고 도 1A에 기재된 바와 같이 목-처리(n = 2)되거나 또는 scFvCD7-9R과 복합된 50 ㎍의 siCCR5/vif/tat(테스트, n = 4) 또는 siLuc(대조군, n = 4)의 조합으로 처리되었다. 유세포 분석법을 이용하여 CD3/CD4/CD8 T 세포 레벨을 모니터링 하였다. 도 2B 및 도 2C는 각각 하나의 테스트 및 대조군 마우스로부터 얻어진 대표적인 점도표 및 누적 결과를 나타낸다. 상응하는 동형(isotype) 대조군과 비교하여 테스트를 각 시간 별로 4분면에 나타냈다. 도 2B에 표시된 숫자는 전체 CD3+ T 세포에서의 백분율을 나타낸다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 2D는 바이러스 감염(challenge) 후 지정된 시간에 ELISA에 의해 측정된 혈청 p24 레벨을 보여준다. 평행선은 중앙값(median value)을 나타낸다.
도 3A-3D는 siRNA/scFvCD7-9R 복합체의 정맥 내 처리가 HIV-혈청반응 양성(seropositive)의 도너인 PBMC로 재건된 마우스에서 CD4 T 세포 손실 및 HIV-1 증식을 억제한다는 것을 보여준다. 도 3A는 siRNA/scFvCD7-9R 투여 프로토콜 및 HIVBaL로 감염된 Hu-PBL 마우스의 면역학적 모니터링 및 바이러스 모니터링을 나타낸다. 도 3A, 3B 및 3D는 도 3A에 기재된 바와 같이 복합된 50 ㎍의 siLuc(대조군) 또는 siCCR5/vif/tat(테스트)와 복합된 scFvCD7-9R를 HIV-혈청 반응 양성의 도너인 PBMC가 이식된 마우스(군 당 4 마리)에 정맥 내 주입하여 유세포 분석법을 이 용해CD4 T 세포 레벨을 측정한 결과이다. 도 3B는 각 군에서 한 마리의 마우스로부터 얻어진 대표적인 점도표를 나타내며 도 3C는 네 마리의 마우스로부터 얻어진 누적 결과를 나타낸다. 도 3B에 표시된 숫자는 전체 CD3+ T 세포에서의 백분율을 나타낸다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 3D는 도너인 PBMC로 재건 후 17일 째에 Amplicor test를 이용하여 측정된 혈장 내 바이러스 카피 수를 나타낸다.
도 4A-4D는 Hu-HSC 마우스에서 scFvCD7-9R이 천연(na) T 세포 내로 siRNA 운반을 매개한다는 것을 보여준다. 도 4A는 재건 후 12주에 Hu-HSC 마우스로부터 채취한 말초 혈액에서 인간 CD4 및 CD8 T 세포의 존재에 대해 조사한 결과를 나타낸다. 도 4B 및 도 4C는 scFvCD7-9R과 복합된 siCD4 또는 siLuc(대조군)을 두 번에 걸쳐서 정맥 내 주입한 Hu-HSC 마우스 및 말초 혈액 T 세포에서 처리 전 및 처리 후 3일 째에 CD4 및 CD8 발현을 테스트한 결과이다. 도 4B는 각 군에서 한 마리의 마우스로부터 얻어진 대표적인 점도표를 나타내며 도 4C는 세 마리의 마우스로부터 얻어진 누적 결과를 나타낸다. 도 4B에 표시된 숫자는 전체 CD3+ T 세포에서의 백분율을 나타낸다. 도 4C는 표면 레벨에서의 감소를 siRNA 주입 전에 초기 발현 레벨에 대한 백분율로서 계산하여 나타냈다. 도 4D는 scFvCD7-9R/siLuc(대조군) 또는 siCCR5(테스트)로 하루 동안 처리한 Hu-HSC 마우스로부터 얻어진 비장세포를 PHA-자극하고 3 moi(multiplicities of infection)의 HIVBaL로 감염시켜 지시된 시간에 ELISA를 이용하여 배양 상층액에서 p24 항원 레벨을 3중으 로(triplicate) 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 5A-5F는 scFvCD7가 CD7에 결합하고 9R 컨쥬게이션은 siRNA 결합 및 인 비트로에서 독성 없이 T 세포로의 운반을 가능하게 한다는 것을 보여준다. 도 5A는 scFvCD7Cys를 처리하지 않거나 또는 처리한 후에 정제된 인간 CD3+ T 세포에서 CD3, CD4 및 CD7에 대해 형광-표지된 항체로 염색한 결과를 나타낸다. 도 5B는 scFvCD7Cys로 전처리한 후에 시간에 따라 측정된 CD7의 T 세포 표면 발현을 보여준다. 도 5C는 scFvCD7-9R 또는 컨쥬게이션되지 않은 scFvCD7Cys(대조군)와 전결정된 몰비로 15분 동안 배양하여 1% 아가로오스 젤에 전기영동된 100 pmole siRNA를 나타낸다. 비-결합된 siRNA의 위치가 표시되어 있다. 도 5D는 배양 후 아넥신-V로 염색된 스타우로스포린-처리된 PBMC 또는 scFvCD7-9R-처리된 PBMC를 나타낸 도면이다. 도 5E는 3일 동안 PHA 또는 antiCD3/CD28 비드로 자극하여 18시간 동안 3H-티미딘으로 펄스된 scFvCD7-9R/siLuc를 처리한 PBMC의 결과를 나타내는 그래프이다. 자극 인자(stimulating agent)의 존재 하에서 통합된 수를 자극 인자의 부재 하에서 통합된 수로 나누어서 자극 배수(fold stimulation)를 계산하였다. 도 5F는 PHA-자극하고 3 moi(multiplicities of infection)의 HIV IIIB로 감염된 Hu-HSC 마우스(도 2에서 기재한 방법에 따라)의 군들로부터 분리된 PBMC를 나타낸 그래프이다. p24 항원 레벨은 ELISA를 이용하여 감염 후 10일 째에 수득한 배양 상층액에서 3중으로 테스트하였다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6A-6C는 PBMC(Hu-PBL) 또는 CD34 HSC(IIu-HSC)가 주입(engraftment)된 NOD/SCID/IL2rγ-/- 마우스에서 인간 세포 재증식(repopulation)을 보여준다. 도 6A는 Hu-PBL 마우스에서 인간 백혈구 확장의 동력학을 보여주는 것으로 각 지시된 시간 별로 인간 CD45를 가지는 마우스 말초 혈액 세포를 염색하여 평가하였다(n = 3). 도 6B는 Hu-HSC 마우스에서 인간 백혈구들의 재건을 보여주는 것으로 CD34+ HSC 이식 후 12주에 말초 혈액 세포의 유세포 분석 방법을 통해 테스트하였다. 도 6C는 Hu-HSC 및 Hu-PBL 마우스로부터 얻어진 말초 혈액 세포에서 지정된 항체를 이용하여 천연(na) 및 활성화된 T 세포 마커들의 발현을 비교한 결과이다. CD45+- 또는 CD3+-게이트된 군집(populations)에 해당하는 백분율이 왼쪽 및 오른쪽 패널에 각각 표시되어 있다.
도 7A-7D는 9R과 컨쥬게이션된 CD7scFv이 siRNA와 결합할 수 있음을 보여준다. 도 7A는 인간 CD7에 특이적인 scFv 단편을 도식적으로 나타낸다. 도 7B는 인간 CD7에 특이적인 scFv 단편의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 도 7C는 scFvCD7-9R 또는 scFv-CD7의 다양한 농도(1 = 25 ㎍; 2 = 50 ㎍; 3 = 75 ㎍; 및 4 = 125 ㎍)에서 100 pmol의 siRNA 결합능(binding)에 대한 젤 지연 분석법(gel retardation assay)의 결과를 나타낸다. 도 7D는 scFvCD7-9R를 도식적으로 나타낸 것이며 도 7E는 scFv-CD7를 도식적으로 나타낸 것이다. 모든 siRNA는 75 ㎍ 및 125 ㎍에서 scFvCD7-9R에 결합하지만, 같은 농도의 scFv-CD7에는 결합하지 않는 다.
도 8A-8B는 CD7 scFv 및 scFv-9dR 모두가 Jurkat 세포에서 CD7 염색을 특이적으로 차단하는 것을 보여준다. 도 8A는 CD7 scFv 및 scFv-9dR이 Jurkat 세포에서 CD7 염색을 차단하지만, 도 8B에서 볼 수 있듯이 CD7 scFv 및 scFv-9dR이 Jurkat 세포에서 CD4 염색을 차단하지 않는다는 것을 보여준다.
도 9A-9C는 CD7 scFc/9R이 FITC siRNA를 Jurkat 세포로 운반할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 9A는 9R과 복합된 siFITC를 나타내며 도 9B는 CD7 scFv9R과 복합된 siFITC를 나타낸다. 도 9C는 PHA-활성화된 PBMC에서 CDCD7 scFv/9D-매개된 siRNA의 운반이 CD4 발현을 특이적으로 녹다운(knocks down)시킨다는 것을 보여준다.
도 10A-10B는 정맥 내 주입된 CD7 scFv/9R-복합 CD4 siRNA에 의해 SCID/NOD γc-/- Hu/PBMC 마우스에서 CD4 발현이 아래로 조절된다(down-modulated)는 것을 보여준다. 도 10A는 목 CD7 scFv/9R(siRNA가 결합되지 않음)(패널의 위쪽) 및 CD7 scFv/9R-복합 CD4 siRNA(패널의 아래쪽)이 정맥 내 주입된 마우스의 혈액, 비장 및 간 조직에서 CD4/CD3-양성 세포의 유세포 분석 결과이다. 도 10B는 도 10A의 정량적 분석의 결과를 나타내는 그래프로, 목 CD7 scFv/9R(siRNA가 결합되지 않음) 및 CD7 scFv/9R-복합 CD4 siRNA이 주입된 마우스의 혈액, 비장 및 간 조직에서 CD3/CD4 세포의 백분율(%)을 보여준다.
도 11A-11B는 SCID/NOD γc-/- Hu/PBMC 마우스에서 CD8 발현이 scFv/9R-복합 CD4 siRNA의 정맥 내 주입에 영향 받지 않는다는 것을 보여준다. 도 11A는 목 CD7 scFv/9R(siRNA가 결합되지 않음)(패널의 위쪽) 및 CD7 scFv/9R-복합 CD4 siRNA(패널의 아래쪽)이 주입된 마우스의 혈액, 비장 및 간 조직에서 CD8/CD3-양성 세포의 유세포 분석 결과이다. 도 11B는 도 11A의 정량적 분석의 결과를 나타내는 그래프로, 목 CD7 scFv/9R(siRNA가 결합되지 않음) 또는 CD7 scFv/9R-복합 CD4 siRNA이 주입된 마우스의 혈액, 비장 및 간 조직에서 CD8/CD4 세포의 백분율(%)을 보여준다.
본 출원 전반에 걸쳐서 다양한 공개 문헌이 참조된다. 본 발명이 속하는 당업계의 상태를 보다 더 완전하게 기재하기 위해 모든 공개 문헌의 개시 내용 및 그들의 인용 참조 문헌이 본 출원에 참조로서 전문으로 삽입된다. 하기의 실시예는 본 발명의 청구항의 범위를 제한하지 않고 오히려 본 발명의 어떤 구현예의 대표적인 예일 수 있다. 당업자에 의해 실시되는 예시적인 방법의 모든 변형은 본 발명의 범위 안에 포함된다. 본 명세서에서 제시되는 실시예들은 RNAi 분자를 타겟 세포로 운반하는 RNAi 복합체 운반 시스템의 방법, 조성물 및 제제에 관한 것으로, 상기 RNAi 복합체는 타겟팅 모이어티의 결합에 따라 내재화되는 세포 표면 항원을 타겟팅하는 항체 또는 항원 결합 항체 단편 같은 타겟팅 모이어티, RNIi 분자와 결합하는 프로타민 단편 같은 결합 모이어티, 및 RNAi 분자로 구성되어 있다.
방법들
siRNAs : 본 연구에서 이용된 siRNAs는 반딧불이 루시퍼라제(siLuc) 14, HIV 유전자(Vif5 및 Tat26), 공동 수용체 유전자 CCR57 및 인간 T 세포 수용체 CD46으로 지시되는 siRNA를 포함하였다. 모든 siRNAs는 Dharmacon, Inc.로부터 구입하였다.
scFvCD7 단일쇄 항체의 정제 및 올리고-9R과의 컨쥬게이션 : scFvCD7의 코딩서열을 George Fey 박사로부터 얻어진 pAK400scFvCD7-GFP 컨스트럭트17로부터 양전하 siRNA 결합 모이어티와 이후에 S-S(disulfide) 컨쥬게이션을 할 수 있도록 seFv 서열의 프레임에 맞게 C-말단 시스테인 잔기가 도입된 프라이머를 이용하여 PCR-증폭하였다. PCR-증폭된 scFvCD7Cys을 pET 26b(+) 벡터(Novagen Inc.)에 클로닝하였다. 재조합 단백질을 Bio Scale Mini Profinity-고정된 메탈 친화성 크로마토그래피(Bio-Rad)를 이용하여 FPLC에 의해 동질성(homogeneity)으로 정제한 후 상술한 대로 반드시(essentially) 재폴딩하였다. 세포 특이적 결합을 건강한 도너 PBMC(말초혈액 단핵세포)로부터 정제된 5 X 105의 CD3+ T 세포를 정제된 scFvCD7Cys (20 ㎍/ml)와 얼음에서 30분 동안 전-배양하여 확인하였다. 그 후, 세포를 세척하고 항-인간 CD7-PE, CD3-FITC 및 CD4-PECy5 항체(BD-Pharmingen)로 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 완전 배지에서 scFvCD7-Cys-처리된 세포를 37℃로 배양한 후 다른 시간에 항-CD7PECy5로 염색하여 표면 CD7 발현을 확인하였다.
재폴딩된 scFvCD7Cys를 1 mg/ml로 농축하고 같은 농도의 Cys(Npys)-(D-Arg)9 펩타이드(9R, Anaspec)와 10:1의 몰비로 0.1 M 포스페이트 완충액(pH 5.5)에서 혼합하였으며, 컨쥬게이션은 상온에서 4시간 동안 부드럽게 휘저으면서 실시하였다. 전형적으로, 티올 및 황화물 양자화 어세이 키트(Molecular probes)에 의한 측정을 통해 컨쥬게이션 효율이 75% 정도라는 것을 확인하였다(결과를 보이지 않음). 결합되지 않은 9R의 제거 및 이후의 실험에 사용하기 위해, 최종 반응물을 MWCO 10,000 막을 이용하여 PBS에서 투석하였다.
siRNA 결합 및 사일런싱 실험 : 겔시프트법(gel mobility shift assays)을 위해, 100 pmole의 siRNA를 CD7scFv/9R와 특정 농도에서 15분 동안 반응시키고 1% 아가로오스 젤에 전기영동한 후, EtBr(ethidium bromide)로 염색하였다. 항체-매개된 운반 및 사일런싱을 테스트하기 위해, 단핵구-유래된 거대세포로 인 비트로에서 분화된 PBMC-유래된 CD3+ T 세포, CD19+ B 세포, CD14+ 단핵 세포를 96-웰 플레이트에 2 X 105 세포/웰로 분주하고, 하루 후에 5:1의 몰비로 scFVCD7-9R-siFITC(100 pmol siRNA)와 4시간 동안 반응시켜 실험 상의 최적 조건을 결정하였다. 세척 후에, 세포를 37℃에서 16시간 동안 추가적으로 배양하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 또한, 사일런싱 실험에서 최소 5:1의 scFvCD7-9R/siRNA 몰비가 효과적이라는 것을 발견하였다. 인간 CD4를 타겟팅하는 400 pmole의 siRNA와 복합된 scFvCD7-9R를 5 X 105의 PHA-자극된 PBMC에 첨가하고 60시간 후에 표면 CD3, CD4 및 CD8 레벨을 유세포 분석법으로 평가하였다.
scFvCD7-9R 복합체의 세포 독성을 평가하기 위해, scFvCD7-9R/siLuc-처리된 PBMC 또는 대조군 PBMC를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 아넥신 V로 염색하였다. 스타우로스포린(1 μM)의 처리는 양성 대조군으로서 이용하였다. 또 다른 실험에서, 동일한 PBMC를 PHA 또는 다이나비드 CD3/CD28 T 세포 Expander(세포당 l 비드)를 가지는 세 개의 웰(triplicate wells)에 3일 동안 처리한 후, 웰당 1 μCi의 3H-티미딘으로 18시간 동안 펄스하였다. 그 후, 세포를 수득하여 삽입된 정도(counts)를 Beckman Coulter LS 6500 신틸레이션 카운터를 이용하여 측정하였다.
Hu-PBL 및 Hu-HSC 마우스의 제조 : 인간 세포 재건에 이용된 NOD.cg-PrkdcscidIL2rgtm/Wjl/Sz (Nod/SCID/IL2rγ-/-) 마우스는 Leonard Shultz 박사(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터 제공되었다. Hu-PBL 마우스는 상술한 바와 같이 제조되었다29, 30. 간략하게는, 건강한 HIV-혈청반응 양성 도너의 헤파린화된(heparinized) 혈액으로부터 피콜 농도구배 원심분리에 의해 얻어진 신선한 PBMC (107)를 0.5 ml의 RPMI에 현탁하여 4-6주령 마우스에 복강내 주입하였다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, HIV-혈청반응 양성 도너로부터 얻어진 5백만 개의 PBMC를 유사하게 사용하였다. 모든 마우스를 이식 후에 3-5일까지 양성 생 착(engraftment)에 대해 안와후출혈(retro-orbital bleeds)로부터 얻어진 PBMC를 판 백혈구 마커 CD45에 대해 염색하여 테스트하였다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “PBL”은 말초 혈액 백혈구를 의미하며, “HSC"는 조혈모세포를 의미하고, Hu-HSC 마우스는 인간 조혈모세포로 재건된 신규한 인간화 마우스 모델을 의미한다(Zhang et al., Blood, 109: 2978-2981(2007)).
상술한 바와 같이, 인간화 Hu-HSC가 기본적으로(essentially) 제조되었다10. 100 rads로 조사한 후, 마우스 당 3 X 10 CD34+ 세포를 포함하는 T-세포 결핍된 제대혈 세포를 1-2일 주령 신생아 마우스에 정맥내 주입하였다. 재건 후 12주에 상술한 바와 같이, 이식된 마우스를 양성 생착에 대해 테스트하였다. 모든 실험적인 프로토콜은 동물 실험에 대한 윤리심의위원회를 통해 승인받았다.
인간화 마우스에 scFvCD7/siRNA 복합체의 처리 : CD3, CD4 및 CD8 양성 T 세포에 대한 염색을 통해 T 세포 생착을 확인한 후에, 마우스에 전결정된(indicated) 시간에 5:1의 몰비로 구성된 scFvCD7/siRNA 복합체를 1회 주사 당 50 ㎍의 siRNA 투여량을 포함하는 200 ㎕의 5% 글루코오스 용액으로 정맥 주사하였다. 감염 실험에서, 이식 후 16일 째에 100 ㎕의 10000TCID50 HIVBaL을 Hu-PBL 마우스에 접종하였다. 각 실험에서 scFvCD7-9R/siRNA 투여에 따른 실험 처방 계획(regimen)이 상응하는 도에 예시되어 있다. 마우스로부터 회복된(recovered) Hu-PBMC를 hCD3-FITC, hCD4-PECy5 및 hCD8-PE 항체(Pharmingen)로 염색하여 유세포 분석법으로 분 석하였다. CD4 T 세포 비를 전체 CD3 군(population; CD4+CD3+:CD3+)에 대한 비로 계산하였다. p24 항원 ELlSA 키트(NEN, Perkin Elmer)를 이용하여 혈장 p24 레벨을 측정하였다. EDTA-처리된 혈장 시료에서 바이러스 로드(viral load)를 Amplicor 테스트(Roche diagnostics)를 이용하여 결정하였다.
일차 세포의 인 비트로 HIV 감염 : 3 moi(multiplicity of infection)의 HIV-1BaL 또는 HIV-1ⅢB로 감염시키기 3일 전에, 재건된 마우스로부터 분리된 인간 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 20만 개의 세포로 PHA(4 ㎍/ml)의 존재 하에서 20% 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 상등액을 전결정된 시간에 p24 ELISA 키트(NEN, Perkin Elmer)를 이용하여 분석하였다.
통계 분석 : 두 개의 군의 데이터를 비교하는 모든 통계적 분석을 Students t 테스트 뿐 아니라 Mann Whitney를 이용하여 실시하였다. 두 개의 군 이상일 경우, Kruskall-Wallis 테스트 이후 Dunn's post 테스트를 사용하였다. P < 0.05 값이 유의하게 받아들여졌다.
실시예 1
이전 연구에서, 본 발명자들은 신경원세포(neuronal cell)-타겟팅 펩타이드 내에 9개의 아르기닌 잔기의 포함이 siRNA 결합을 허용하여 신경원세포로 타겟된 운반을 할 수 있도록 한다는 것을 발견하였다14. 본 명세서에서, 본 발명자들은 인간 T 세포로 효율적 및 효과적으로 타겟된 siRNA의 운반을 증명한다. T 세포-특이적 표면 단백질 CD7에 대한 항체가 효율적으로 내재화되고 전-임상 연구 및 임상 실험에서 T 세포 림프종으로 독소를 운반하는 데 이용되어 왔으므로, 본 발명자들은 T 세포 타겟팅을 위해 CD7-특이적 단일쇄 항체를 이용하였다15-17. 본 발명의 항체(scFvCD7Cys)는 노나-d-아르기닌(9R) 펩타이드와 컨쥬게이션시키기 위해 C-말단에 추가적인 Cys 잔기를 포함하도록 변형되었다.
재조합 scFvCD7Cys를 박테리아 용해물로부터 정제하고 인간 PBMC로부터 정제된 Jurkat 세포(결과를 보이지 않음) 또는 CD3+ T 세포(도 5A)에 대한 PE-표지된 항-CD7 항체의 결합을 억제하는 능력을 테스트하여 재조합 scFvCD7Cys의 특이적 리간드 결합력을 확인하였다. 이러한 억제는 12시간에서야 호전되었으며(reversed), 이는 수용체의 빠른 내재화 및 턴-오버를 의미한다(도 5B). siRNA 결합이 가능하도록, 본 발명자들은 화학적으로 scFvCD7Cys의 C-말단에 9R 펩타이드를 컨쥬게이션(scFvCD7-9R) 시켰으며, 자유로운 티올 군을 양적으로 측정함으로써 컨쥬게이션을 확인하였다(결과를 보이지 않음). scFvCD7-9R의 투여량-의존적 siRNA 결합능을 EMSA(electrophoretic gel mobility-shift assay)로 확증하였다(도 5C). 초기 연구에서, 본 발명자들은 scFvCD7-9R이 CD7-음성 세포주가 아니라 CD7-양성 Jurkat T 세포로 FITC-siRNA의 운반을 매개하고 최소 1:5의 siRNA:항체 몰비가 효율적인 운반을 위해 필요하다는 것을 발견하였다(결과를 보이지 않음). 더 나아가, scFvCD7-9R이 FITC-siRNA를 테스트된 조건 하에서 뚜렷한 세포 독성을 보이지 않으면서 거의 95%의 트랜스펙션 효율로 정제된 인간 CD3+ T 세포로 매우 효과적으로 운반할 수 있었다(도 1A, 위 패널). 또한, 유사하게 처리된 CD7-음성 B 세포(CD19) 및 단핵세포-유래된 거대세포(CD14)에서 siRNA를 검출할 수 없는 것을 확인함으로써, 본 발명의 siRNA의 T 세포-특이적 운반을 확인하였다(도 1B, 아래 패널).
scFvCD7-9R-운반된 siRNA가 타겟 유전자 발현을 사일런싱하는 지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 PHA-활성화된 인간 PBMC에 scFvCD7-9R/siCD4 복합체를 처리하여 48시간 후 표면 CD4 발현을 조사하였다. CD4의 평균형광강도(MFI)가 CD3+ T 세포에서 거의 로그까지 감소하였다(도 1B). CD8 발현이 영향 받지 않은 상태였기 때문에, 상기 사일런싱은 특이적이었다. scFvCD7-9R/siLuc 및 siCD4가 단독으로, 또는 9R 또는 scFvCD7Cys와 함께 처리한 경우, CD4 발현의 감소가 관찰되지 않았다(결과를 보이지 않음). 항체 처리 후 PHA 또는 항-CD3/CD28 비드 자극에 대해 T 세포의 정상 증식 반응(도 5E)뿐 아니라 처리된 세포에서 아넥신-V 양성의 부재(도 5D)로 확인한 바와 같이, scFvCD7-9R/siRNA 처리가 독성을 유발하지 않았다. 따라서, scFvCD7-9R는 검출할 만한 해로운 효과 없이 일차 T 세포에서 siRNA 운반 및 특정 유전자 사일런싱에 이용될 수 있다.
높은 레벨로 인간 말초 혈액 백혈구를 생착하는 NOD/SCIDIL2rγc-/- Hu-PBL 마우스 모델18에서 siRNA를 T 세포로 인 비보 운반하는 scFvCD7-9R의 능력을 연구하였다(도 6A). PHA-활성화된 T 세포에서, scFvCD7을 처리하고 12시간 후에 표면 CD7 발현이 완전히 회복되었는데, 이는 scFvCD7-9R의 반복 투여가 가능하다는 것을 의미한다(도 5B). 이에, Hu-PBL 마우스에 scFvCD7-9R/siCD4 복합체를 2일 동안 연속적으로 정맥 내 주입하였고, 마지막 주사 후 60시간 째에 말초 혈액 T 세포 상의 CD4 발현을 유세포 분석법으로 조사하였다. CD4+ T 세포 레벨은 대조군인 siLuc-처리된 마우스에서는 변화가 없었으나, scFvCD7-9R/siCD4-처리된 마우스에서 현저하게 감소하였다(도 1C 및 도 1D). 하지만, CD8+ T 세포 레벨은 변화하지 않은 상태였느데, 이는 사일런싱이 타겟된 유전자에 국한된다는 것을 확증한다. 또한, 간 및 비장 같은 다른 기관으로부터 분리된 세포들이 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 분리된 세포에서와 유사한 넉다운 레벨을 나타냈다(도 1D). 치리된 마우스로부터 유래한 PBMC를 HIV ⅢB로 엑스 비보하게 감염시킨 경우, HIV-1 p24 레벨이 배양 상등액에서 현저하게 감소되었는데, 이는 CD4 발현의 넉다운 후에 바이러스 감염의 허용(permissibility)이 감소한다는 것을 의미한다(도 5F). 본 발명자들은 인 비보 유전자 사일런싱의 지속도 결정하였다. 이를 위해, 16시간 간격으로 세 번에 걸쳐 scFvCD7-9R/CD4siRNA를 마우스에 처리하여 말초 T 세포의 일련의 시료에서 CD4 발현 레벨을 유세포 분석법으로 분석하였다. 처음 3일 동안 사일런싱이 최고였으나, CD4 발현은 점진적으로 감퇴되어 9일 째에는 정상 레벨의 70%까지 회복되었다(도 1E).
실시예 2
본 발명자들은 HIV 감염에 대해 scFvCD7-9R-매개된 siRNA 운반의 치료능을 테스트하였다. Hu-PBL 마우스에서 인간 T 세포가 CCR5를 높은 레벨로 발현하고 인간 감염을 반복하는 CD4 T 세포의 진행성 손실을 야기하는20 HIV의 R5-성(tropic) 스트레인에 감염되기 쉽다18, 19. siRNA-타겟팅 세포 내 공동-수용체 CCR5 및 2-3개의 보존성 바이러스 유전자 서열의 조합은 회피돌연변이(escape mutants)21를 예방하기 위한 최적의 전략으로서 제안되어 졌다. 따라서, 재건 후 14일 째에, (HIV-천연 인간 PBL로 재건된) Hu-PBL 마우스에 바이러스 유입(entry)을 차단하기 위해 CCR5 siRNA를 처리하고 이틀 후에 HIVBaL과 반응시켰다. 추가적으로, (바이러스 확산을 예방하기 위한) siRNA-타겟팅 CCR5 및 (바이러스 복제를 차단하기 위한) 바이러스 vif 및 tat 유전자 내에 보존성 타겟 서열의 조합을 매주 처리하였다(도 2A). 모든 siRNA는 주입 전에 scFvCD7-9R과 복합되었다. 대조군 HIV-감염된 마우스에 scFvCD7-9R/siLuc 복합체를 처리하였다. 이미 감염 후 10일 째, 모든 목- 및 대조군 siLuc-처리된 마우스에서 CD4+CD3+ T 세포 백분율이 2%까지 감소하고 동시에 CD8+CD3+ T 세포 백분율이 95% 이상으로 증가할 정도로 CD4 T 세포 레벨이 빠르게(precipitously) 감소하였다(도 2B 및 도 2C). 보다 상세하게 비교하면, siRNA-처리된 마우스의 약 3/4에서 CD4 T 세포는 감염 후 4주까지도 정상적으로 남아있었다(도 2B 및 도 2C). CD4 T 세포 레벨에서의 변화와 일치하게도, (ELISA를 이용하여 혈청 p24 항원 레벨의 연속적인 측정을 통해 확인된 바와 같이) 바이러스 복제는 모든 목- 및 대조군 siLuc-처리된 마우스에서 높았지만, siRNA-처리된 마우스의 약 3/4에서 검출할 수 없었다(도 2D). 보호되지 않은 하나의 테스트 마우스에서, 말초 CD4 T 세포 손실이 더 낮은 동력학(10일 째에 대조군 마우스에서 CD4/CD3 비의 평균값이 0.016인데 반해 테스트 마우스에서는 0.6이었다)을 보였으며, 일치하게도 혈청 p24 레벨이 대조군 마우스에서 평균값과 비교하여 더 낮은 경향을 나타냈다. 상술한 바를 토대로(Taken together), 본 발명자들은 scFvCD7-9R/siRNA의 처리가 HIV 복제 및 결과적인 CD4 T 세포 손실을 인 비보에서 억제할 수 있다는 것을 증명하였다. 인간화 마우스 모델이 마우스에서 인간 면역 환경을 본질적으로 복제하기 때문에, 상술한 결과를 통해서 인간 환자에서 유사한 결과의 예측을 기대할 수 있다.
실시예 3
본 발명자들은 siRNA 처리가 이미 행해진(established) HIV 감염을 억제할 수 있는 지 여부를 평가하였다. 하지만, 상술한 모델에서 외인성 바이러스 침입 후에 최저 레벨로의 CD4 T 세포의 감소가 매우 빠르게 일어남으로 인해 감염후 siRNA 처리 효능을 평가하기가 어렵다. 따라서, 이미 행해진 감염을 흉내내기 위한 또 다른 전략으로서, 본 발명자들은 HIV-혈청반응 양성 도너로부터 얻어진 PBL로 마우스를 재건하였다. 또한, 본 발명자들은 이를 통해 이용된 HIV-1 스트레인을 보호할 수 있는 보존성 vif 및 tat 서열을 siRNA가 타겟팅하는 지를 평가할 수 있었을 뿐 아니라, siRNA가 감염된 개체에 존재할 것 같은 바이러스의 많은 유전적 다양성(quasispecies)에 대해 효과적인 지를 평가할 수 있었다. 검출 레벨 이하의 바이러스 로드 및 0.34의 CD4/CD3 비(도 3B, 입력)를 가진 4년 동안 HAART 처리 하에 있었던 도너로부터 얻어진 PBMC가 본 실험에서 이용되었다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, CCR5, vif 및 tat을 타겟팅하는 siRNA의 조합을 이용하고 siRNA 투여를 반복하였다. 실험적인 감염 모델에서 관찰된 바와 같이, HIV-감염된 PBMC로 재건된 마우스 및 대조군으로 Luc siRNA가 처리된 마우스에서, 심각한 CD4+ T 세포 결핍이 이미 생착 후 10일 째에 관찰되었다(평균적으로 0.14의 CD4/CD3 비)(도 3B 및 도 3C). 이와 대조적으로, 항바이러스 siRNA가 처리된 테스트 마우스에서 CD4+ T 세포 레벨이 감소되지 않았고, 대신에 이종 활성화(xenogenic activation)로 인해 확대되어 2주차 까지 수에서 끊임없는 증가를 초래하였다(CD4+ T 세포 백분율이 약 60%로 증가). 사실, CD4/CD3 비(평균 = 0.47)은 이식 후 3.5주에 입력비보다 더 높은 상태로, 이는 siRNA 처리가 HIV 질환에서 CD4 T 세포 손실을 역전시키는 능력(potential)을 가진다는 것을 나타낸다. 혈청 p24 ELISA 레벨에 의해 조사된 바이러스 로드가 대조군 마우스에서 조차 검출 레벨 이하였기 때문에(입력 CD4 T 세포의 낮은 수때문일 것으로 추정), 본 발명자들은 혈장 바이러스 RNA 카피 수를 측정하였다. 바이러스 RNA 카피 수는 대조군 마우스에 비해 scFvCD7-9R/항-바이러스 siRNA-처리된 마우스에서 현저하게 감소하였다(도 3D). 상술한 바를 토대로, 이러한 결과들은 복합성 siRNA가 임상 설정(setting)에서 항-레트로바이러스 치료법과 함께 유사한 항-바이러스 치료제로서 효과적으로 기능한다는 것을 증명한 다.
이종 자극에 의해 T 세포가 활성화되기 때문에, Hu-PBL 마우스는 항-바이러스 효능을 테스트하기 위한 적합한 급성 감염 모델을 제공하는 데 반해, 이 모델은 siRNA 천연(na) 및 정지(resting) T 세포로의 siRNA 운반을 테스트하는 것을 배제한다. 따라서, 본 발명자들은 Hu-HSC 모델에서 scFvCD7-9R이 siRNA를 천연 T 세포로 운반할 수 있는 지 여부도 테스트하였다. 상술한 모델에서, 말초 혈액에서 평균적으로 50% 레벨의 인간 CD45+ 백혈구로 HSC 이식 후 12주 째에 다계열(multilineage) 면역세포 재건이 일어났다(도 6B 및 도 4A). 또한, Hu-PBL 마우스의 T 세포가 활성화 표현형에 우선적으로 존재하는 데 반해, 이들 마우스의 T 세포는 천연 비활성화 세포들(CD45RAhi, CCR7hi, CD62Lhi , CD27hi 및 CR5lo)에 우선적으로 존재한다(도 6C). siRNA 운반을 테스트하기 위해, 마우스에 scFvCD7-9R/siCD4를 처리하고 상기한 대로 CD4 유전자 사일런싱을 조사하였다. 놀랍게도, CD4 발현의 실질적인 감소가 CD3-게이트된 T 세포에서 관찰되었는데, 이는 scFvCD7-9R인 천연 T 세포로 siRNA를 운반할 수 있다는 것을 의미한다(도 4B 및 도 4C). 또한, 본 발명자들은 천연 T 세포로 HIV 침입에 저항성을 부여하기 위한 scFvCD7-9R-매개된 siRNA 운반 능력을 테스트하였다. 24시간 이전에 siCCR 또는 대조군 siLuc을 단일 투여한 Hu-HSC 마우스로부터 수득된 비장세포를 PHA로 자극하고 HIVBaL(moi = 3)로 감염시켰다. 계대배양(serial culture) 상등액에서 p24 레벨은 대조군 siLuc-처리된 세포 배양과 비교하여 siCCR5-처리된 세포 배양에서 뚜 렷하게 더 낮았다(도 4D). 통합된 HIV 프로바이러스를 가지는 정지 T 세포가 HAART의 간섭 후에 다시 감염시킬 수 있는 중요한 잠재적 저장소이기 때문에, 이러한 결과는 치료학적 적용과 관련 된다22-24.
요약하면, 본 발명자들은 인간 HIV 감염을 밀접하게 반영하는 작은 동물 모델에서 T 세포로 항-HIV siRNA의 전신성 siRNA 운반에 대한 신규한 접근 방식을 발견하고 개발하였다. 본 발명에서, 본 발명자들은 바이러스 로드를 감소시키고 CD4 T 세포 손실을 예방하기 위한 siRNA-기반 치료법의 실제적인 이용 및 효과적인 방법을 증명하였다8, 14, 25. 본 명세서에 개시된 치료법에 의해, 상이한 siRNA의 조합들 역시 돌연변이 바이러스에 따라 변화시킬 수 있다. 본 발명자들에 의해 발견된 본 발명의 방법 및 조성물은, siRNA 서열이 고정되어 회피돌연변이가 발생하면 세포들이 더 이상 보호받지 못하는 경우, shRNA 인코딩 HIV 내성 T 세포(조혈모세포로부터 유래)를 생산하는 우수한 장점을 가진다. HIV 감염에 대한 치료에 있어서 또 다른 이슈는 거대세포 및 수지상세포를 타겟팅하는 능력이다. 이러한 맥락에서, LFA-1에 대한 항체가 거대세포 및 수지상세포를 포함하는 모든 백혈구를 타겟팅할 수 있다는 것이 최근에 보고되고 있다. 유사하게, 거대세포 운반용 다른 펩타이드- 또는 항체-매개된 타겟팅 접근 방식도 scFvCD7-9R와 함께 이용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, HIV에 대한 전임상적 동물 모델의 유용성은 HIV 치료제 같은 다른 치료법 뿐 아니라, 다른 RNAi 인자들을 운반하는 scFcCD7-9R 운반 시스템의 빠른 테스팅도 가능하게 하며, 임상 용도로 RNAi를 번역 하기 전에 바이러스 회피 및 독성 같은 이슈들과도 관련이 있다. 인간화 마우스 모델이 본질적으로 마우스에서 인간 면역 환경을 복제하기 때문에, 그러한 결과를 통해서 인간 환자에서 유사한 결과의 예측을 기대할 수 있다.
참조 문헌
본 명세서 전반에 걸쳐서 인용된 참조 문헌들이 본 명세서에 전문으로 삽입된다.
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Hanyang University <120> Targeted Delivery of siRNA <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protamine 1 <400> 1 gcggccgcac gcacgcagcc agagccggag cagatattac cgccagagac aaagaagtcg 60 cagacgaagg aggcggagct gccagacacg gaggagagcc atgagatctc atcatcacca 120 ccaccattaa 130 <210> 2 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protamine 2 <400> 2 gcggccgcaa tggccaggta cagatgctgt cgcagccaga gccggagcag atattaccgc 60 cagagacaaa gaagtcgcag acgaaggagg cggagctgcc agacacggag gagagccatg 120 agatctcatc atcaccacca ccattaa 147 <210> 3 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protamine 3 <400> 3 gcggccgcac gcagccagag ccggagcaga tattaccgcc agagacaaag aagtcgcaga 60 cgaaggaggc ggagctgcca gacacggagg agagccatga ggtgttgtcg ccccaggtac 120 agaccgagat gtagaagaca cagatctcat catcaccacc accattaa 168 <210> 4 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protamine 4 <400> 4 gcggccgcac gcagccagag ccggagcaga tattaccgcc agagacaaag aagtcgcaga 60 cgaaggaggc ggagcagatc tcatcatcac caccaccatt aa 102 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protamine 5 <400> 5 gcggccgccg gcggaggagg atctcatcat caccaccatt aa 42 <210> 6 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protamine 6 <400> 6 gcggccgcaa tggccaggta cagatgctgt cgcagccaga gccggagcag atattaccgc 60 cagagacaaa gaagtcgcag acgaaggagg cggagcagat ctcatcatca ccaccaccat 120 taa 123

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  19. (a) 하나의 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA에 상보적이며 다른 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA와 동일한 것으로 이루어진 이중 가닥 RNA 절편을 포함하는 RNA 분자; 그리고 (b) (i) CD7에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety) 및 (ii) 이중 가닥 RNA 절편에 결합하는 결합 모이어티로서의 올리고-9-아르기닌 펩타이드를 포함하는 단백질을 포함하는 RNA 간섭-유도 분자를 세포로 운반하기 위한 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 타겟팅 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고 상기 결합 모이어티는 프로타민 또는 이의 핵산 결합 단편, 또는 단백질의 핵산 결합 도메인인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 타겟팅 모이어티가 CD7에 결합하면 CD7이 내재화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 CD7은 T-세포의 CD7인 것을 특징으로 하는 조성물.
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  24. 제 19 항에 있어서, 상기 타겟팅 모이어티는 단일쇄 항체, 항체 또는 (Fab')2 절편의 Fab 부위 또는 이의 항원 결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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  26. 제 19 항에 있어서, 상기 타겟팅 모이어티 및 결합 모이어티가 융합 단백질로서 포함되고 상기 결합 모이어티는 상기 타겟팅 모이어티의 카르복시 부위에 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
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  30. 제 19 항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNA 절편은 c-myc, VEGF, CD4, CCR5, gag, MDM2, Apex, Ku70 또는 ErbB2을 인코딩하는 mRNA의 유전자 사일런싱을 타겟팅하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 19 항에 있어서, 상기 세포는 배양 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 19 항에 있어서, 상기 세포는 기관의 일부분인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 19 항에 있어서, 상기 세포는 대상 동물의 일부분인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 19 항에 있어서, 상기 세포는 배아줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
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