CN101340919A - 治疗艰难梭菌相关的腹泻的方法 - Google Patents

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Abstract

一种治疗由细菌的存在导致的疾病或病症的方法，所述细菌选自由梭菌属物种，葡萄球菌属物种，肠球菌属物种及其组合组成的组，所述方法包括向需要的患者施用有效量的混合物，所述混合物包括台勾霉素B，闰年霉素A4和至少一种其它的大环化合物。

Description

治疗艰难梭菌相关的腹泻的方法
相关申请
本申请要求于2005年10月21日提交的美国临时专利申请系列号60/729,135，和于2005年12月12日提交的美国临时申请系列号60/749,641的权益。本申请是于2005年1月11日提交的美国专利申请系列号10/520,863的部分继续申请，其要求于2003年7月15日提交的国际申请号PCT/US2003/021977的权益，所述PCT/US2003/021977要求于2002年7月29日提交的美国临时申请系列号60/399,956的权益。本申请还是于2005年5月13日提交的国际申请号PCT/US05/16750的部分继续申请，所述PCT/US05/16750要求于2004年5月14日提交的美国临时申请系列号60/570,697的权益。本申请还是于2005年1月31日提交的国际申请号PCT/US05/02887的部分继续申请。
上述相关申请的公开内容通过引用完全结合于本文中。
发明背景
1.发明领域
本发明涉及治疗由选自由梭菌属(Clostridium)物种，葡萄球菌属(Staphylococcus)物种和肠球菌属(Enterococcus)物种及其组合组成的组的细菌的存在引起的疾病，特别是由选自由艰难梭菌(Clostridium difficile，″C.difficile″)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，″C.perfringens″)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，″S.aureus″)及它们的组合组成的组的细菌的存在引起的疾病，更具体地治疗由艰难梭菌的存在引起的疾病。所述疾病可以是结肠炎，假膜性结肠炎，或腹泻。
2.相关技术描述
抗生素相关的腹泻(AAD)由艰难梭菌，包括甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)的金黄色葡萄球菌，和产气荚膜梭菌(C.perfringens)的产生毒素的菌株导致。AAD是保健系统的主要的经济负担，据保守估计每年只在美国就产生30-60亿美元的额外的医院费用。
AAD是医院和长期护理机构以及团体中的严重的问题。艰难梭菌是医院设施中AAD的最常见原因，引起约20％的AAD病例和大部分的抗生素相关的结肠炎(AAC)病例。艰难梭菌相关的腹泻(CDAD)的增加的发生率归因于频繁地给住院患者开广谱抗生素的处方[Wilcox等，Lancet(柳叶刀)1996，348：767-8]。
所述疾病的最严重形式是假膜性的结肠炎(PMC)，其在组织学上的主要表现是具有粘膜斑的结肠炎，并且在临床上的主要表现是严重的腹泻，腹部绞痛，和全身毒性。来自CDAD的总的致死率是低的，但是在患有严重结肠炎或系统毒性的患者中却高得多。最近的研究显示，甚至当死亡不是直接归因于艰难梭菌时，与病例相配的对照相比，在CDAD患者中的死亡率也高得多。
腹泻和结肠炎由一种或多种艰难梭菌毒素的产生而导致。生物体在已经给药广谱抗生素的患者的结肠中增殖，或较不常见的在癌症化疗的患者的结肠中增殖。在用所述药剂治疗后，在约20％的患有腹泻的住院患者中诊断出CDAD。
对于AAD或CDAD的目前的治疗包括所涉及的抗微生物药剂或化疗剂的中止，非特异性支持性测量和用针对艰难梭菌的抗生素进行治疗。最常见的抗微生物治疗选择包括万古霉素和甲硝唑。用抗生素治疗CDAD与疾病的临床复发有关。据报道复发的频率是5-50％，其中20-30％的复发率是最常见的引用数字。不管药物，剂量，或用任何上述抗生素的最初治疗的延续时间如何，复发以几乎相等的频率发生。治疗中的主要挑战在具有多次复发的患者的治疗中，其中抗生素的控制是成问题的。
两种最常使用的具体治疗是万古霉素和甲硝唑，尽管万古霉素是由FDA为此适应症批准的唯一的药物。然而，万古霉素不是对于CDAD的第一线治疗所推荐的，主要是因为其仅对一些严重的威胁生命的多抗药性细菌具有抗生素活性。因此，在使万古霉素抗性肠球菌(VRE)或万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(VRSA)的出现最小化的努力中，除非当绝对必需时，医药团体不鼓励使用该药物。
出于关于万古霉素抗性消化道菌群，尤其是肠球菌的促进和选择目的，推荐将甲硝唑用作起始治疗。尽管报道艰难梭菌抗性的频率在一些国家可以是＞6％，甲硝唑仍然是几乎如万古霉素一样有效，相当地更廉价并且可以用于口服或静脉内使用。甲硝唑与明显的副作用包括恶心，神经病，白细胞减少症，癫痫发作和对乙醇的毒性反应相关。此外，其用于儿童或怀孕妇女是不安全的。
尽管两种药剂在治疗感染中都是有效的，在约20％的开始反应的患者中治疗失败和腹泻复发的增加率是标准疗法的缺陷。已经报道用甲硝唑进行的治疗是对于VRE移植(colonization)和感染的重要的危险因子。此外，目前的治疗方案相当麻烦，在10-14天要求多到500mg一日四次(qid)。因此，存在对于CDAD病例以及其它AAD和AAC病例的更好的治疗方法的需求。
因此，需要开发抗菌药物，其具有低的产生抗性的倾向，具有对现存的抗微生物剂减少的没有交叉抗性和/或具有延长的抗生素后效应。
发明概述
本发明提供治疗由选自由梭菌属物种，葡萄球菌属物种，肠球菌属物种，及其组合组成的组的细菌的存在引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的患者施用有效量的混合物。所述混合物包括有效量的台勾霉素B和选自由下列各项组成的组的另外的大环化合物：
Figure A20068004798600131
III(OP-1416，RT比率0.71)，
Figure A20068004798600141
IV(OP-1415，RT比率0.81)，
Figure A20068004798600142
V(OP-1417，RT比率：0.84)，
Figure A20068004798600143
IX(OP-1435，RT比率：1.13)，
Figure A20068004798600144
X(OP-1437，RT比率：1.19)，
Figure A20068004798600151
XI(OP-1402，RT比率：1.24)，
XII(OP-1433，RT比率：1.39)，
Figure A20068004798600153
XIII(OP-1438，RT比率：1.48)，
Figure A20068004798600154
XIV(闰年霉素A4，OP-1405，RT比率：0.89)，及其组合。当存在式XIV的化合物时，所述混合物包括约0.1到约5％的式XIV的化合物。
优选地，所述混合物包括至少90重量％的台勾霉素B。更优选地，所述混合物包括至少95重量％的台勾霉素B。
优选地，所述混合物包括至少1重量％，更优选地约2重量％到约5重量％的另外的大环化合物。
优选地，所述混合物包括约0.1重量％到约5重量％，更优选地0.3重量％到3重量％，特别地0.3重量％到1.5重量％，尤其是约1重量％的闰年霉素A4。
优选地，当存在闰年霉素A4时，所述混合物还包含下列化合物的至少一种：
Figure A20068004798600161
VI(OP-1431，台勾霉素F，RT比率：0.92)，
VII(Op-1432，台勾霉素C，RT比率：0.95)，和
Figure A20068004798600163
VIII(OP-1434，台勾霉素A，RT比率：1.10)。
优选地，所述混合物显示基本在图5中描述的HPLC图谱。
优选地，根据本发明治疗的疾病或病症与艰难梭菌，产气荚膜梭菌，金黄色葡萄球菌及其组合相关。更优选地，根据本发明治疗的疾病或病症与艰难梭菌相关。
优选地，根据本发明治疗的疾病是腹泻或结肠炎，特别是腹泻，更具体地是CDAD。
优选地，根据本发明的混合物通过包括下列步骤的方法制备：
将微生物培养在营养培养基中以在营养培养基中积累混合物；和
从营养培养基中分离所述混合物；
所述营养培养基包括吸附所述混合物的吸附剂。
所述营养培养基优选地包括0.5-15重量％的吸附剂。所述吸附剂优选地是吸附树脂。更优选地，所述吸附树脂选自由下列各项组成的组：离子交换树脂(Amberlite
Figure A20068004798600171
)XAD16，XAD16HP，XAD2，XAD7HP，XAD1180，XAD1600，IRC50，和Duolite
Figure A20068004798600172
XAD761。所述微生物优选地是桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)hamdenensis亚种。基于重量，营养培养基包括0.2％到10％的葡萄糖，0.02％到0.5％的K2HPO4，0.02％到0.5％的MgSO4·7H2O，0.01％到0.3％的KCl，0.1％到2％的CaCO3，0.05％到2％的酪蛋白氨基酸，0.05％到2％的酵母提取物，和0.5％到15％的XAD-16树脂。培养步骤优选地在约25到约35℃的温度和从约6.0到约8.0的pH进行。
优选地，根据本发明治疗的疾病与抗生素或癌症化学疗法或抗病毒疗法的使用相关。
根据一个优选的实施方案，所述混合物以约50mg到1000mg的量，更优选地100mg到400mg的量，特别地200mg的量每日1-3次，更优选地每日一次或两次，特别地每日两次，在3-15天，特别地约10天内进行施用。优选口服施用。
本发明的治疗可以容许有效治疗与艰难梭菌，金黄色葡萄球菌，和产气荚膜梭菌的产肠毒素菌株相关的腹泻疾病，而不会不利于系统抗生素并且不会增加消化道中的万古霉素抗性肠球菌(VRE)。本发明还减少消化道中VRE的存在。
从结合附图考虑的下面的详细描述中，本发明的其它目的和特征将变得显而易见。然而，要理解的是，所述附图只是出于举例说明的目的而设计并不是为了定义本发明的范围，对于本发明的范围应该参考后附的权利要求。还应该理解的是附图不必局限于一定范围，并且除非另外指出，它们仅仅倾向于概念性地举例说明本文所述的结构和方法。
附图简述
在附图中：
图1显示1B-MD阶段给药时间表。
图2显示在治疗后的类菌体数量。配对符号秩次检验(Pairssigned-ranks test)，双尾。对于计数＜3log 10，使用值2.9。
图3显示万古霉素对脆弱拟杆菌(B.fragilis)群的治疗方法的效果。
图4显示在用MCC治疗后，艰难梭菌营养体计数的定量减少。
图5是混合物的典型HPLC图谱，所述混合物可以用在本发明的方法中。
本发明的优选实施方案的详细描述
将用在本申请中的某些缩写或术语的定义提供如下：
AAD＝抗生素相关的腹泻
ATCC＝美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)
13C＝碳13
CO2＝二氧化碳
N2＝氮
H2＝氢
TAPS＝N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸
MOPS＝3-(N-吗啉代)丙磺酸
CDAD＝艰难梭菌相关的腹泻
CLSI＝临床和实验室标准研究所(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)，前NCCLS
ED50＝产生50％反应的有效剂量
HPLC＝高效液相色谱
IR＝红外光谱法
LLOQ＝定量的下限
MCC＝包含大环化合物的组合物
MIC＝最小抑制浓度
MIC50＝抑制50％的测试的细菌菌株的最小抑制浓度
MIC90＝抑制90％的测试的细菌菌株的最大抑制浓度
MRSA＝甲氧西林-抗性金黄色葡萄球菌
NCCLS＝国家临床实验室标准委员会，现在的CLSI
PMC＝假膜性结肠炎
VRE＝万古霉素-抗性肠球菌
VRSA＝万古霉素-抗性金黄色葡萄球菌
术语“抗生素相关的病症”指当抗生素治疗干扰消化道的微生物菌群的平衡，使病原生物如产生肠毒素的艰难梭菌，金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌菌株繁殖旺盛时而导致的病症。除了其它症状，这些生物可以引起腹泻，假膜性结肠炎，和结肠炎并且表现为腹泻，尿急，腹部绞痛，里急后重和发烧。腹泻，当严重时，导致脱水和与脱水相关的医学并发症。
术语“MCC”指对于全部抗生素物质，主要包含台勾霉素B(例如，通过HPLC分析，至少90％，优选地95％-98％)的制剂。MCC还包括小量(例如，至少1％，优选地2％-5％)的台勾霉素B相关化合物，即闰年霉素A4和至少一种在上面显示的式III-XIV的化合物。PCT申请PCT/US03/21977，其国际公开号为WO 2004/014295 A2，提供制备包含台勾霉素B的混合物的方法。将该PCT申请的全部内容结合于本文作为参考。然而，专门用于非人的MCC可以包含少于80％的台勾霉素B(针对整个抗生素物质，通过HPLC测定)。
术语“赋形剂”指被加入药物组合物以进一步有利于施用化合物的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于，碳酸钙，磷酸钙，各种糖和各种类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油和聚乙二醇。
术语“卤素”包括F，Cl，Br和I。
术语“大环化合物”指具有通常包含超过10个原子的大环结构的有机分子。
术语“18-元大环化合物”指具有包含18个原子的环结构的有机分子。
术语“元环”可以包括任何环结构，包括如上所述的碳环和杂环。术语“元”意指组成环的骨架原子的数量。因此，例如吡啶，吡喃和硫代吡喃是6元环，而吡咯，呋喃和噻吩是5元环。
术语“MIC”或“最小抑制浓度”指在体外抑制细菌分离物的生长所需要的抗生素的最低浓度。确定抗生素的MIC的常用方法是准备一些包含抗生素系列稀释物的管，接着将其用目的细菌分离物进行接种。在适当的大气压和温度下接种后，抗生素的MIC可以从显示没有浊度(无生长)的最低浓度的管进行确定。
术语“MIC50”指在给定的细菌物种中抑制50％的测试细菌菌株的生长所需要的抗生素的最低浓度。
术语“MIC90”指在给定的细菌物种中抑制90％的测试细菌菌株的生长所需要的抗生素的最低浓度。
术语″患者″指需要医学治疗的人或动物。出于本发明的目的，人患者典型地专门在一级医疗保健机构如医院或疗养院受到照料。然而，在从一级保健机构中出院后，治疗与使用抗生素或癌症化学治疗或抗病毒治疗相关的疾病可以在门诊病人的基础上进行，或可以由独立于一级医疗保健机构的家庭护理的医师开处方。需要医学治疗的动物典型地在兽医的护理下。
术语“药用载体”指药用的载体或稀释剂。
术语“药用盐”指来自药用无机碱和有机碱的那些。来自适合的碱的盐包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)，碱土金属盐(例如，镁盐)，铵盐和N(C1-C4烷基)4 +盐等。这些中的一些举例说明的实例包括氢氧化钠，氢氧化钾，胆碱氢氧化物，碳酸钠等。
术语″药物组合物″指本文所述的一种或多种台勾霉素，或其生理可接受的盐，与其它的化学成分如生理可接受的载体和/或赋形剂的混合物。药物组合物的目的是促进将化合物施用于生物体。
术语″生理可接受的载体″指没有导致对生物的明显刺激并且没有消除所施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
术语″假膜性结肠炎″或″肠炎″指由于小肠和大肠的粘膜的炎症导致形成假膜性物质(即，由血纤蛋白，粘液，坏死上皮细胞和白细胞组成的物质)。
用于本文时，术语“台勾霉素”指全部包括在下面的式I中显示的18元大环化合物的化合物家族：
式I
用于本文时，术语“台勾霉素B”指在下面的式II中显示的18-元大环化合物：
Figure A20068004798600212
式II(RT比率1.0)
用于本文时，术语闰年霉素A4指在下面的式XIV中显示的18元大环化合物：
Figure A20068004798600213
根据本发明的一个实施方案，在口服给药多剂量后，在血浆中检测到低MCC水平，其大多数在定量界限下。作为对照，在两项研究中的粪便水平非常高，超过针对艰难梭菌的MIC90(0.125μg/mL)的10,000倍。
根据本发明的一个实施方案，在患者中，与艰难梭菌相关的腹泻的复发可以通过以有效抑制艰难梭菌的复发但是对患者的正常消化道菌群没有影响的量和延续时间施用MCC而得到抑制。
根据一个实施方案，对于CDAD的MCC的每日口服剂量将在约50mg到约1.0g的活性剂/天范围内，优选地在从约100mg到约600mg/天范围内。一般而言，治疗将从约3到约15天之间的时间阶段持续。根据需要，可以使用更多或更少的量的药物和治疗间隔。例如，根据在下文报道的临床研究结果，在从约10天的过程中，每天给药约100-400毫克的MCC的剂量，证实在治疗CDAD中是有效的，具有最小的临床复发。
根据本发明的一个实施方案，所述混合物可以通过下列通用方法制备。
在从摇瓶到大“批量”发酵器的范围内，在容器中培养产生MCC的细菌。为了产生基本上大量的MCC，在罐中使用深层好氧发酵。然而，可以通过摇瓶培养获得小量。对于罐发酵，优选使用营养体接种物。通过用生物的孢子形式，菌丝体片段，或冻干的沉淀物接种小体积的培养基来制备营养体接种物，以获得新鲜，活跃生长的生物体培养物。接着，将营养体接种物转移到更大的罐中，其中在经过适合的培养时间后，以大量提高的产量产生MCC抗生素。如果发泡成为问题，那么将小量的消泡剂加入到大规模的发酵培养基中可能是必需的。
在对照培养基中用其它的添加剂/成分进行生产以提高产量。使用液体-浸没、搅拌培养方法进行MCC的生产。发酵在25℃到37℃的温度范围内进行。仔细监测碳源的消耗，并且如果需要加入额外量的碳源。发酵的pH优选地维持在约6.0到约8.0。在发酵液接种后，在3-15天之间，生产和积累MCC。
发现商购吸附树脂在发酵过程中增加MCC的产量和回收效率。吸附剂优选地以0.5-15重量％范围存在。MCC通过树脂吸收以非常好的产量(＞100mg/L培养液)从发酵培养液中回收，并且通过用各种极性的溶剂进行洗涤从树脂和菌丝体上洗脱。
首先，在发酵过程中使用吸附树脂如离子交换树脂(Amberlite)(XAD-16)将MCC从培养液中捕获出来。在完成发酵后，将固体块(包括吸附树脂)通过筛分从培养液中分离出来。将固体块用乙酸乙酯洗脱，接着在减压下浓缩。
在发酵结束后，将固体块(包括吸附树脂)通过筛分从培养液中分离出来。用有机溶剂如乙酸乙酯、甲醇、乙腈或两种或多种有机溶剂的混合物将MCC从树脂上洗脱下来。接着，在减压下将提取物进行浓缩。该残余物通过下列方式来进一步纯化，即，通过用低极性溶剂如己烷，庚烷，甲基环己烷进行研磨，或通过在两相溶剂系统如：乙酸乙酯/水；乙酸乙酯/氯化钠水溶液；甲醇/己烷；乙腈/己烷或其它以各种比率和组合存在的两种或多种溶剂的混合物中分配，或通过用适合的有机溶剂系统进行柱色谱法洗脱。目前MCC的纯化方法基于使用50∶50∶1的CH3CN/H2O/AcOH或70∶30∶1的MeOH/H2O/AcOH作为洗脱剂的中压反向(C-18)柱进行。用盐水洗涤包含需要的MCC的级分并且将其进行浓缩。将残余物溶解在乙酸乙酯中，用水洗涤并且将有机层蒸发到干燥以提供浅黄色泡沫，其又用异丙醇洗涤，并且在减压下干燥以产生白色粉末。合并纯度＞88％的级分。将级分浓缩到起始体积的一半。过滤沉淀物并用水洗涤滤饼。在高真空下将固体干燥过夜以得到白色粉末并且用HPLC分析。典型地，混合物包含90％-99％范围的台勾霉素B作为主要成分，闰年霉素A4(0.1％到5％)和至少一种或多种上述的式III-XIV的大环化合物。
实施例
通过描述本发明的具体实施方案而不倾向于以任何方式限制本发明的范围来提供下列实施例。
根据上述的制备方法制备在下面的实施例中使用的混合物。下表显示根据本发明制备的一些示例性混合物的组合物。
Figure A20068004798600241
根据下面的方法进行HPLC测定。
移动相A：将2.0mL的三氟乙酸加入到2L HPLC水中，过滤并脱气。
移动相B：将1.0mL的三氟乙酸加入到2L乙腈中，过滤并脱气。
柱：4.6X150mm柱，包含化学结合于直径3-10μm的多孔硅石或陶瓷微粒(例如，Zorbax Eclipse XDB-C8，3.5μm)的辛基硅烷。
检测器：230nm。
流速：约1.0mL/分钟。
注射体积：约10μL。
运行时间：约10μL。
稀释剂：100％乙腈。
梯度程序： 时间(分钟)   ％移动相A
移动相B
      0      60          40
      3.0    50          50
      14.0   39          61
      14.5   60          40
注意：混合物的保留时间必须在8-12分钟内。
标准制备物：精确称取约20mg的混合物到100mL容量瓶中，将其用稀释剂溶解并且稀释到一定体积。
样品制备物：精确称取约20mg的混合物到100mL的容量瓶中。加入约60mL稀释剂并涡旋以溶解。用稀释剂稀释到一定体积并混合。
系统的适合性：如下述方法所指导，对标准制备物进行色谱法并且记录最大反应。对于五次重复注射的台勾霉素B的峰面积的相对标准偏差是NMT 2.0％，台勾霉素B面积的拖尾因子是NMT 2.0。
方法：注射约10μL的稀释剂。分别注射等体积(约10μL)的标准和样品制备物，记录色谱并且对于主峰测量检测器反应。
相对停留时间：
相关物质                   RT比率
式II的化合物(台勾霉素B)    1.0
式III的化合物              0.71
式IV的化合物                 0.81
式V的化合物                  0.84
式VI的化合物(台勾霉素F)      0.92
式VII的化合物(台勾霉素C)     0.95
式VIII的化合物(台勾霉素A)    1.10
式IX的化合物                 1.13
式X的化合物                  1.19
式XI的化合物                 1.24
式XII的化合物                1.39
式XIII的化合物               1.48
式XIV的化合物(闰年霉素A4)    0.89
计算：使用下列公式计算测定值：
测定， % = R u R s × W std ( mg ) StdDil ( mL ) × P × SmpDil ( mL ) W smp ( mg ) × WF × 100
其中：Ru＝从测定制备物获得的台勾霉素B的峰面积
Rs＝从标准制备物获得的台勾霉素B的峰面积
P＝参考标准的纯度，包括水因数。
Wstd＝标准重量(mg)
StdDil＝标准稀释(mL).
Wsmp＝样品重量(mg).
WF＝样品水因数.
弃去得自稀释剂的峰，并且通过下式计算个体和总的相关物质的w/w百分比：
其中：Ri＝从样品制备物获得的相关物质的峰面积。
Ru＝从样品制备物获得的台勾霉素B的峰面积。
RFi＝相关物质反应因子(对于所有的相关物质RFi＝1.0)
此外，将根据本发明的混合物的典型HPLC图谱显示在图5中。在混合物中包含的化合物，例如式II-XIV的化合物可以依据它们的RT比率在HPLC图谱中找到。在图5中的Par-101表示RT比率为1.0的台勾霉素B。
接着，将上述混合物(50mg)与100mg Avicel PH 102，FMC(微晶纤维素)在1号大小的胶囊壳(size 1 capsule shell)中混合。
实施例1.接种物，pH，和阳离子对MCC针对艰难梭菌的体外活性的影响
已知对于许多抗生素测量的MIC值受到环境变量如pH，二价阳离子如钙和镁的浓度和细菌密度的影响。抗菌活性对这些因子的依赖性是重要的考虑因素，特别是对于在消化道中靶向细菌的抗生素，其中这些参数可随着饮食和疾病状态而变化较大。
当设计用于将来体外测试的方法时，MIC对这些环境变量的敏感性也可以是考虑的重要因素。临床和实验室标准研究所，CLSI(前NCCLS)推荐使用补充了维生素K1和氯高铁血红素的Brucella琼脂用于厌氧微生物的最小抑制浓度(MIC)测定。然而，在该培养基中的二价阳离子的水平没有被标准化。此外，在厌氧手套箱下使用的培养基的pH也可以在不同的气体混合物下变化。厌氧微生物典型地在氮气、氢气和二氧化碳的混合物中温育，并且CO2的存在将酸化培养基并且可以是变异性的重要来源。考虑到可用于厌氧微生物敏感性测试的气压条件的多样性(H2/CO2产生器，抽真空/替换方法或厌氧室)，接种多少也可能难以标准化。每个实验室可获得的厌氧条件将确定在工作台面(bench top)操作过程和厌氧平衡中生物体暴露于有氧气氛的持续时间，并因此影响培养物的存活力和实验结果。
在该研究中，我们检验了二价阳离子钙和镁的水平，pH(从5-8)，接种物密度(超过3个数量级)对MIC的影响以及Brucella培养液的不同批次的变异性。
材料和方法
细菌菌株：
实验室菌株艰难梭菌9689，700057，43255，17857和迟缓真杆菌(Eubacterium lentum)43055获自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection(ATCC))。所有的菌株被划线接种在brucella琼脂平板上，所述平板补充了氯高铁血红素和维生素K，其来自在使用前在10％甘油中保持在-78℃的冷冻贮液。
MIC测试：
将目前用于厌氧培养液和琼脂稀释的CLSI方法(4)用于进行MIC评估。培养液稀释对于梭菌的MIC测试不是一种有效的方法；然而，由于在厌氧室内平衡后测量固体琼脂的pH的潜在的不准确性，对于评估pH效果使用和比较了两种方法。
接种物密度对MIC值的影响：
使用琼脂稀释方法(4)，测定了接种物密度对艰难梭菌针对MCC和万古霉素的敏感性的影响。通过首先制备～108cfu/mL的混悬液来制备接种物，并接着将所述混悬液以10倍因子系列稀释，从而获得在105-108cfu/mL之间的培养物密度范围以得到102-105cfu/斑点的斑点密度。
pH对MIC值的影响：
使用琼脂稀释和微量培养液稀释方法，在6-8的pH范围内评价艰难梭菌对MCC的敏感性。
使用琼脂稀释方法，在两个单独的实验中，在6.2-8.0的pH范围内确定MCC针对艰难梭菌菌株的MIC。为了获得针对敏感性测试所需要的厌氧性pH，将缓冲液(100mM的NaH2PO4或TAPS[N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸])分别在pH 7和8加入培养基中。甚至用强缓冲作用，在厌氧气体中平衡后pH稍微变化，并且因此在一些情形中，将培养基在环境空气中滴定至需要的厌氧性pH。实际的pH一直在厌氧室内平衡后得到证实。仅在pH 7检测用作对照的万古霉素。
使用培养液微量稀释方法，在3个单独的系列中，在6-8的pH范围确定MCC和万古霉素针对艰难梭菌菌株的MIC值。在第一个系列中，在环境空气中滴定未缓冲的Brucella培养液以获得5-9的pH范围。然而，在手套箱环境(10％H2/5％CO2/85％N2)中，培养基的厌氧平衡降低了培养基的pH，导致在5-7.5范围内的厌氧pH范围(如使用具有平底pH探针的便携式pH计测试的，所述探针在手套箱外用缓冲液标准校准，接着被转移到内部)。对于随后的实验，将缓冲液加入培养基中以对抗由于厌氧平衡导致的pH改变。在第二个系列中，将10mM缓冲液[NaH2PO4·H2O pH7.0，MOPS pH 8.0，或TAPS pH 9.0，在环境空气中的pH值)加入pH值大于6的培养基中以在厌氧平衡后获得6-7.6的pH范围。在第三个系列中，对于超过6的pH处理，将缓冲液浓度增加到100mM，以获得6-8.1的厌氧pH范围。
二价阳离子浓度对MIC值的影响：
使用琼脂稀释方法确定钙和镁离子浓度对艰难梭菌菌株针对MCC的敏感性的影响。通过实验室专家公司(Laboratory Specialists，Inc)确定如生产商所要求的在Brucella培养液中的二价阳离子水平。加入额外量的二价阳离子(以氯化钙或氯化镁的形式)，从而得到2.1，3.0和5.7mg/dL的钙离子浓度和3.3，4.5，和7.5mg/dL的镁离子浓度。
MCC MIC值关于不同商业批次的培养基的再现性
使用CLSI琼脂稀释方法，还用来自BBL的三个不同的商业批次的Brucella琼脂(批号#30768960，211086，和3167036)检验艰难梭菌针对MCC的敏感性，所述Brucella琼脂补充了不同批次的维生素K(希格玛(Sigma)批号V-3501和0214010)和氯高铁血红素(希格玛批号072K1221和034K7656)。
结果
接种物密度对MIC值的影响
表1和2显示接种物密度对MCC和万古霉素针对艰难梭菌的两个菌株(ATCC 9689和ATCC 700057)的MIC的影响。两个艰难梭菌菌株对MCC的敏感性不受105-108cfu/ml(102-105CFU/斑点)的接种物浓度的影响，如通过对于所有测试的接种物浓度所获得的相同的MIC值所显示。然而，万古霉素的MIC随接种物浓度增加而递增，其中与最低接种物密度相比，最高的接种物密度表现出在MIC上四倍的增加。这些结果表明接种物密度不是影响艰难梭菌的MCC敏感性测试的结果的重要因素。
表1.MCC(μg/mL)对不同接种物密度的艰难梭菌ATCC 9689(102-105CFU/斑点)的体外活性
  接种物密度(cfu/ml) CFU/斑点   ATCC 9689MCC   vanc
  1.92×1081.92×1071.92×1061.92×105   1.92×1051.92×1041.92×1031.92×102   0.063  20.063  10.063  10.063  0.5
表2.MCC(μg/mL)对不同接种物密度的艰难梭菌ATCC 700057(102-105CFU/斑点)的体外活性
  接种物密度(cfu/ml)   接种物密度(cfu/ml)   ATCC  700057MCC    vanc
  1.48×1081.48×1071.48×1061.48×105   1.48×1051.48×1041.48×1031.48×102   0.125  1，20.125  10.125  10.125  0.5
pH对MIC值的影响
表3描述了不同pH值对艰难梭菌针对MCC的敏感性的效果，其在两个单独的日子，通过琼脂稀释方法所测量。在第一次实验中，对于两个艰难梭菌菌株，与更低的pH处理(pH 6.2和pH 7.2)相比，最高的pH处理(pH 7.9)表现出MIC值的8倍的增加。当在最高的pH(pH 8.0)重复进行证实性实验时，MIC值对于两个菌株保持较高。对于任一菌株，在pH 6.2和pH 7之间，在MCC MIC中没有观察到增加。
MIC值随pH的增加不与增加的生长成一致的相关性，因此pH对MIC的影响似乎不仅仅是由于生物体在更高的pH的增加的存活力。与pH 6.2和pH 7.9处理相比，pH 7处理具有较不密集的生物体斑点生长。
表3.pH对琼脂稀释MIC值的影响(缓冲的培养基)
Figure A20068004798600321
表4，5和6显示在三个单独的日子，用5-8.1的pH范围进行的培养液微量稀释敏感性方法的MIC数据。在第一个系列中，其中培养基未被缓冲，对于两个艰难梭菌菌株，在pH 7.5的MCC的MIC比在pH 5.9的MIC大8倍(表4)。在pH 5的MIC不能被确定，因为生物不能在该pH上生长。对于艰难梭菌ATCC 9689和ATCC 700057，在MCC MIC上，缓冲的(10mM)pH 7.6处理分别比pH 6处理表现出8倍和16倍的增加(表5)。在该第三强缓冲(100mM)系列中，对于两种生物体观察到类似的结果，其中最高pH处理(pH 8.1)在MIC上比最低的pH处理(pH 6)表现出16倍增加(表6)。在所有的三个实验中，万古霉素显示出类似的趋势，其中与最低的pH处理相比，最高的pH处理产生4-8倍更大的MIC。
表4.使用未缓冲的培养基pH对MIC的影响
Figure A20068004798600322
Figure A20068004798600331
表5.使用弱缓冲的培养基(10mM)的pH对MIC的影响
Figure A20068004798600332
表6.使用强缓冲的培养基(100mM)的pH对MIC的影响
还在所有的pH处理上对测定平板的总的生长进行视觉检查。在第一个系列中，其使用未缓冲的培养液，总的培养浊度随pH增加而增加。除了对于pH 7.2和pH 7.6培养物浊度是相同的之外，在第二个系列中观察到相同的趋势，所述第二个系列使用10mM的缓冲培养液。在第三个系列中，在整个pH处理中，培养物浊度更相等，例外的是pH 7.5，其是最混浊的。
总而言之，对于敏感性测试的两种方法和各种浓度的缓冲盐，对于艰难梭菌的两个菌株，MCC和万古霉素的MIC值都随pH增加而增加。
二价阳离子浓度对MIC值的影响：
在商业Brucella培养液中的钙和镁水平的测量分别显示21和33mg/L的钙和镁离子浓度。加入各种额外量的二价阳离子，并且在三个不同的钙离子浓度(21，30和57mg/L)和三个不同的镁离子浓度(33，45和75mg/L)测试对于艰难梭菌菌株的MCC MIC值。在所有类型的培养基中，MIC值保持相同。在具有不同阳离子浓度的培养基中，艰难梭菌9689具有0.063μg/ml的MIC值，艰难梭菌700057具有0.125μg/ml的MIC值。测试作为对照的万古霉素，所述测试用补充的Brucella琼脂进行，在实验过程中，其没有添加任何额外的钙或镁作为对照，对于所有的实验证实预期的MIC值为1μg/ml(表7和8)。
表7.在补充不同二价阳离子浓度的Brucella琼脂中的MCC的体外活性
Figure A20068004798600351
表8.在补充不同二价阳离子浓度的Brucella琼脂中的MCC的体外活性
Figure A20068004798600352
关于不同商业批次的培养基的MCC MIC值：
在三个不同的日子使用三种不同批次的补充的Brucella琼脂培养基来比较MCC针对艰难梭菌菌株的活性。通过测试QC生物体，迟缓真杆菌对在CLSI(NCCLS)可接受范围，即0.06-0.25μg/mL内的克林霉素的活性来控制MIC测定。进行MIC测定的另一个对照步骤是包括甲硝唑并监测其对艰难梭菌菌株的活性，其在我们实验室中显示出具有范围在0.25-0.5μg/mL内的MIC值。如在表9中所显示，MCC对艰难梭菌的活性没有受到不同批次的补充的Brucella琼脂的影响。所有的对照证实在确定范围内的活性。
表9.使用三种不同批次的培养基测试的MCC的体外活性
Figure A20068004798600361
结论
与万古霉素相反，MCC针对艰难梭菌的活性不受在102-105cfu/斑点范围内的接种物浓度的影响。
艰难梭菌对MCC的敏感性不受阳离子浓度(在2.1-5.7mg/dL范围内的钙离子，浓度在3.3-7.5mg/dL范围内的镁离子)和不同商业批次的培养基的影响。
在6-8的pH范围内，对于MCC和万古霉素二者的MIC值随pH增加而增加。在碱性pH上的高MIC值可能是由于在高于它们的pKa时，这两种化合物的酚羟基的去质子形式，在这种情形中，它们形成带电的种类，预期其对细菌细胞具有更少的通透性。相反，在低于pKa时(对于MCC，7.22)，抗生素大部分被质子化，并且因此应该更有效地渗透细胞膜。
生物密度通常随增加的pH而增加；在存在缓冲剂时，生长密度，但不是MIC对pH的依赖性减少。尽管在缺乏缓冲液时，生物体密度与碱性成正相关，MIC趋势不可能只是pH对生物密度的影响的结果。这是因为在缓冲实验中观察到MIC和pH之间的相同的关系，其中在整个pH处理过程中，生物体密度更加相等，这可能是由于缓冲液类型对生物生长的不同的作用造成的。
实施例2.在健康受试者和患有艰难梭菌相关的腹泻(CDAD)的患者中的MCC的安全性、药物代谢动力学和后果
1B-MD阶段.
简述.这是在佛罗里达州迈阿密的迈阿密大学临床药理学部进行的口服、多剂量、双盲、随机、安慰剂作为对照的、剂量逐步上升的研究。RichardPreston，M.D.作为该试验的主要研究者。MCC多口服剂量的耐受性和药物代谢动力学在总共24名健康的志愿受试者中进行评估。评估的MCC的口服剂量(在3个组中，每个组8名受试者，其中6名用活性剂处理，2名安慰剂处理)是150，300，和450mg(在包含50mg的研究药物的粉末填充的胶囊中)，其在早餐后每日施用，连续进行10天。给药受试者并且在组合的住院病人/门诊患者基础上监测。在10天的给药阶段中，让受试者在第0天和第9天进入研究单位，并且在每次入院后停留多达48小时。在完成计划表安排和程序后，在第2天和第11天让受试者出院。在门诊患者阶段，受试者每日向研究单位报告给药情况并且留下观察3小时。
在多次给药阶段过程中，在不同时间点/间隔收集系列血液，尿液和粪便样品。确定MCC的血浆，尿液和粪便浓度，进行药物代谢动力学分析。在受试者从研究中被排除之前，在每个研究阶段的第17天安排随访检查的计划表。在整个治疗阶段并且在随访研究中，紧密监测研究受试者的任何副作用的发生或异常实验室测试发现。见，图1，1B-MD阶段给药时间表。
2A阶段
简述.这是选择MCC的安全和有效剂量的剂量发现研究。向受试者随机给药100(50mg/12小时)，200(100mg/12小时)，或400(200mg/12小时)mg/天，持续10天，随后进行临床评估。受试者在每日日志卡片上记录了所有的症状。对粪便频率和稠度，血液在粪便中的存在和腹部不适给与特别的注意。在筛选进入和在治疗结束时(第10-12天)或退出时(无论哪一个更早)进行实验室评估。在治疗结束(第10-12天)进行临床观察和日志卡片评估。在第2天到第9天，第17天和第52天的治疗上进行患者会见。对于进入参与标准，进行艰难梭菌毒素的测定。对于未对MCC治疗做出反应的受试者和在临床复发的情形中，进行艰难梭菌毒素测定和培养。还在未对治疗做出反应的受试者退出时，进行临床、实验室和微生物学评估。在给药的第一天和最后一天，在给药前0.5小时和给药后2小时采取药物代谢动力学血浆样品。
关键参与标准.受试者是患有与艰难梭菌相关的腹泻的患者，其通过下列定义：1)腹泻(肠习惯的改变，其中在24小时内有3或更多次的未成型的粪便，或在36小时内有超过6次的松散或水样便)，和2)在粪便中存在艰难梭菌的毒素A或B。
关键排除标准受试者不能患有1)严重或威胁生命的CDAD，2)与CDAD不相关的威胁生命或严重的疾病，3)同时使用：万古霉素，甲硝唑，杆菌肽，或相关药物。(如果在知道粪便毒素的实验室结果前，研究者认为临床有必要开始治疗，那么用甲硝唑和/或万古霉素在多到24小时，但是不超过3次剂量的治疗是容许的)；用于治疗CDAD的任何药物；或其它抗生素，4)在过去的三个月里，溃疡性结肠炎或局限性回肠炎和CDAD的多次复发(定位为超过一次复发)的历史。(容许具有一次CDAD的复发的受试者参与)。
事件的时间计划表
表10.在2A阶段研究中的评估方法的时间计划表
Figure A20068004798600391
a在给药的第一天和最后一天，在施用前0.5小时和施用后2小时采取用于药物代谢动力学的血液样品
终点.在治疗结束时，研究者确定受试者是否已经被治愈或失败。此外，将腹泻消退的时间(定义为消退到每天＜3次的松散或水样便)和在治疗的第10天CDAD的症状的完全减轻(完全减轻是消退到每天≤3次总便数，不管是松散还是紧密；并且没有发烧、升高的白血细胞或腹痛)作为初始的终点，而在治疗后6周内的复发(腹泻的复发，定义为每天3次或更多次松散/水样便，具有阳性毒性测试)作为次级终点。
分析
安全群体：
安全群体包括已经接受研究药物的至少一次给药并且具有已获得安全信息的所有的随机受试者。
有效群体：
在按照方法治疗的患者中确定临床成功或失败。用于分析腹泻消退和症状完全减轻的时间的群体是改良意向治疗的群体(mITT)，其由所有的随机受试者组成，所述受试者接受至少一个剂量的研究药物，具有腹泻史，在24小时内具有3次或更多次的松散便和在基线的阳性艰难梭菌毒素。
腹泻消退的时间定义为从第一次给药研究药物到腹泻消退的时间(以天数表示)；在三个治疗组中比较腹泻消退的时间。将腹泻停止日定义为在24小时内发生＜3次的不成形便(水样或松散)的第一天，并且治疗的持续时间延续到第10天。使用本发明的日志记录数据来在第10和第12天评估腹泻的消退。
CDAD症状的完全减轻：
将CDAD的症状的完全减轻定义为到研究的第10天消退到每天≤3次的排便(如在患者日志中所记录的)，而没有其它的相关体征/症状如发烧(≥37.7℃)，腹痛(在日志中没有反应)和升高的WBC(WBC的正常实验范围)。如果有任何变量未提及，则认为该结果是未知的。
临床复发率：
将临床复发率定义为在治疗后6周内≥3次不成形便(松散或水样的)和艰难梭菌毒素A或B的阳性便。
结果
参与和人口统计
下面的部分总结研究群体在1B-MD阶段和2A试验中的参与和人工统计特征。总共24名健康受试者参与1B-MD研究阶段。交替的男性和女性受试者参与以提供在性别之间的对等。受试者年龄范围在38-62岁(平均51.6±7.5岁)，体重55.5-90kg(平均71.5±9.2kg)，高度147-183cm(平均164.8±10.8cm)。
在2B研究阶段，共49名受试者参与。在接受任何研究药物前，一名受试者不同意并且从研究中撤出，因此不能被评估安全性或功效。一名受试者(400mg给药组)在36小时内具有＞6次排便，但是在前24小时＜3次排便，并且不能评估腹泻消退的时间但是可以评估临床反应和安全分析。在给药1或2剂量后，三个患者由于不同意(1名受试者，100mg给药组)，需要另外的针对肺炎的抗生素(1名受试者，100mg给药组)或不能服研究药物(1名受试者，200mg给药组)而终止。将受试者的人工统计列于表11中。
表11.进行2A阶段研究的简要人工统计；显示在可评估安全性的群体中的48名受试者的人工统计。
Figure A20068004798600421
注意：值表示受试者的数字，除非另外指出
a其它的包括：东印度，印度
b将计算的身体质量指数定义为(体重，以kg为单位)/(高度，以米为单位)2。
功效
在治疗结束时临床评估治疗成功或失败时，研究者认为在低剂量给药组中有2名患者(2/14)，在中等剂量给药组中有2名患者(2/15)并且在最高剂量给药组中没有患者(0/16)是治疗失败的。在治疗成功的受试者中(n＝41)，在100mg/天剂量给药组中有一名受试者中复发CDAD(1/12)，在最高剂量给药组中有一名受试者复发CDAD(1/16)，总共复发率为2/41(5％)。这两例复发都是在治疗结束后约1个月发生。
Figure A20068004798600431
a在临床成功的患者中评估在治疗后6周内毒素阳性腹泻的复发
将腹泻消退的时间定义为根据患者的日志卡，患者消退到每天少于3次不成形便的时间。在mITT群体中，减轻的中值时间对于MCC 100mg/天，200mg/天和400mg/天治疗组分别是5.5天，3.5天，和3.0天。腹泻消退的平均天数时间在100mg/天治疗的受试者中是6.3±3.66天，在200mg/天治疗的受试者中是4.8±3.56天，在400mg/天治疗的受试者中是3.6±2.03天。在100mg/天和200mg/天治疗组之间和在200mg/天和400mg/天治疗组之间，腹泻消退的时间不存在统计学上显著的差异；然而，在100mg/天和400mg/天治疗组之间的差异具有统计学显著性(p＝0.0506 KaplanMeier估计和p＝0.0503 Kruskal-Wallis检验)。
表13.腹泻消退的时间(mITT群体)，定义为到每天消退到＜3次不成形便的时间(根据患者的日志卡片)
Figure A20068004798600441
a到第10天，其腹泻没有消退到每天＜3次松散便的受试者
bKaplan-Meier估计
c获自广义Wilcoxon检验的P值
在表14中显示到治疗结束时CDAD的症状的完全减轻，其被定义为到研究的第10天，每天≤3次总的排便数(不管成形还是不成形，如在患者的日志卡片中所记载)，并且没有发烧、升高的WBC计数或腹痛(根据患者日志卡片的反应)。37.5％的100mg/天治疗组，50.0％的400mg/天治疗组和86.7％的400mg/天治疗组获得完全的减轻。值得注意的是，到第10天没有完全减轻的大多数患者仍然是治疗成功的，其到第17天症状消退并且不需要进一步的治疗。从研究中退出的三名患者(一名不同意，一名需要专门的抗生素，一名不能口服药物)也被列在没有完全减轻之列。
表14.在mITT群体中，到治疗结束时，CDAD症状的完全减轻，其被定义为到研究的第10天，每天≤3次的总排便数(成形或不成形，如在患者的日志卡片上所记载)，没有其它的相关体征/症状如发烧、腹痛和升高的WBC
Figure A20068004798600451
只有2个受试者(在100mg/天治疗组中的1名受试者，在400mg/天治疗组中的1名受试者)经历了临床复发。
安全性
在1B-MD阶段研究中，MCC在所有的剂量上被所有的受试者良好耐受。报道了14例不良事件，7例在150mg组中，2例在450mg组中，5例在安慰剂组中。将不良事件总结如下：头痛(2)，眩晕(1)，虚弱(1)，疲劳(1)，鼻充血(1)，吞咽困难(1)，咽炎(1)，结膜炎(1)，上呼吸道感染(2)，皮疹(1)和瘙痒(1)。接受MCC的患者中没有患者具有药物相关的副作用。
在2A阶段研究中，如在表15中所显示，在100mg/天治疗组中有4/16(25.0％)的受试者，在200mg/天治疗组中有4/16(25.0％)受试者，在400mg/天治疗组中有1/16(6.3％)受试者在研究中被报道具有至少一个AE。在100mg/天治疗组的感染和侵染体系统中报道了AEs的最高频率(3/16；18.8％受试者)。在100mg/天治疗组中有2/16(12.5％)受试者报道患有血管疾病，在200mg/天治疗组中有2/16(12.5％)受试者报道患有胃肠疾病。
表15.在2A研究的安全群体中的副作用的发生率，通过系统器官分类和优选的术语总结
Figure A20068004798600461
Figure A20068004798600471
注意：百分比是受试者在该类中的比例
5名受试者据报道在研究中具有SAEs(表16)。在100mg/天治疗组中，一名受试者患有中等严重性的腹泻，另一名受试者患有严重恶化的充血性心力衰竭(CHF)。在200mg/天治疗组中，一名受试者具有严重的葡萄球菌败血症和严重的脑出血，另一名受试者具有中等严重的胃肠出血，第三名受试者具有中等严重的胸痛。在MCC 400mg治疗组中没有受试者具有SAE。认为所有的SAEs与研究药物不相关。
表16.在2A研究的安全性群体中的严重副作用的发生率
Figure A20068004798600481
a最后一次给药研究药物的日期减去第一次给药研究药物的日期加1。
b如下计算研究天数：开始的日期减去研究药物的第一次给药的日期加1。
c基于研究者的评估。
d受试者死亡。
药物代谢动力学
血浆浓度数据
在1B-MD阶段研究中，在给与多剂量口服施用后，MCC的血浆浓度通常低于剂量范围的定量的界限。
仅在来自6名受试者的12个样品中发现可检测的血浆浓度。
在所述12个可检测的浓度中，仅发现2个明显高于LLOQ，而其它的很少超过5ng/mL的LLOQ。
分别在第1天，第1小时和仅在第10天的第10次剂量前在受试者021中观察到两种浓度(11.1和48.0ng/mL)。
应该注意的是，150mg剂量没有产生可检测的浓度。
由于在浓度范围内的低MCC血浆水平，对于药物代谢动力学分析，没有超过LLOQ的充分的血浆数据点。
在2A阶段研究中，在多剂量口服施用后，MCC的血浆浓度大部分低于量化界限，但是在许多样品和许多受试者中具有剂量依赖性的增加，具有可测量的血浆浓度。
在MCC 100mg/天治疗组中的2/15(13.3％)受试者中，在MCC200mg/天治疗组中的9/16(56.3％)受试者中，在MCC 400mg/天治疗组的13/17(76.5％)受试者中发现可检测的血浆浓度。
可观察的MCC浓度在MCC 100mg/天治疗组中范围是9.45到12.3ng/mL，在MCC 200mg/天治疗组5.12到93.7ng/mL，并且在MCC400mg/天治疗组中5.32到84.9ng/mL。
在所有的治疗组的可检测的MCC浓度中，大部分(35/41；85.4％)在21ng/mL以下。
仅在2名受试者中观察到超过50ng/mL的MCC浓度，在200mg/天给药组中和在400mg/天给药组中各有一名。
MCC的泌尿排泄数据
在1B-MD阶段研究中尿的MCC水平都低于量化界限(LLOQ＝5ng/mL)。
MCC的粪浓度数据
表17显示来自1B-MD研究的粪浓度，其被标准化到150mg剂量；粪MCC平均为916.0μg/g(138.4-1768.9μg/g)。
表17在1B-MD阶段研究中的MCC粪浓度，其被标准化为150mg剂量
Figure A20068004798600501
对于2A阶段研究，在MCC 100mg/天治疗组(n＝11个样品，充足的)，在治疗结束时，粪MCC平均为255.6μg/g(范围：81.9-558.3μg/g)。在MCC200mg/天治疗组(n＝9个样品，充足的)中，粪MCC平均为441.7μg/g(范围：11.7-786.7μg/g)。在MCC 400mg/天治疗组(n＝13个样品，充足的)中，粪MCC平均为1433.3μg/g(范围：389.0-3974.8μg/g)。
表18.在2A阶段研究中治疗结束时，MCC的粪浓度
Figure A20068004798600502
结论
总而言之，本研究显示在多到450mg的多次口服剂量后MCC被良好耐受，在作用位点获得高水平，并且在治疗艰难梭菌相关的腹泻中表现出有前景的结果。
本研究还发现1)在任一研究中没有治疗-出现的副作用可能是药物相关的，2)在多剂量口服施用后，在血浆中检测到低MCC水平，其大部分低于量化界限。由于低血浆浓度，在1B-MD研究收集的尿中没有检测到完整的MCC。3)相反，在两个研究中的粪水平非常高，超过针对艰难梭菌的MIC90(0.125μg/mL)的10,000倍，4)在进行完整疗程治疗的45名受试者中，在治疗前或在治疗10天结束时，只有4名受试者被认为是失败，在50-mg q12hr剂量组中有2名受试者，在100-mg q12hr剂量组中有2名受试者被认为是失败的。在200-mg q12hr剂量中没有失败的记录(0/16)，5)在成功治疗后，只有2名受试者观察到复发。约在治疗结束后一个月有两名复发，6)尽管不是统计学显著的，腹泻停止的中值时间显示一种趋势，其表明更高的剂量可能更加有效。腹泻停止的时间对于50-mg q 12 hr剂量组确定是5.5天，对于100-mg q 12 hr剂量组是3.5天，和对于200-mg q 12hr剂量组是3.0天。
实施例3.MCC在体内选择性地针对艰难梭菌有效，并且没有影响厌氧粪菌群的主要成员：这对于更低的复发率是关键的。
为了测试MCC在体内针对艰难梭菌具有选择性的活性，并且对于正常厌氧粪菌群可以是相对不足(sparing)的假说，在系列粪样品上进行定量粪培养，所述粪样品获自进入MCC的2A阶段剂量范围临床实验(现在称为MCC)的患者。艰难梭菌腹泻的优化抗生素治疗应该消除病原体的营养体形式，但是保留(spare)可能负责集群抗性的正常菌群的主要成分。
方法
患者(n＝32)随机接受一天两次的50，100或200mg的MCC，持续接受10天。24名患者以前没有接受治疗；8名患者接受1或2个剂量的标准治疗。作为生态对照，对7个另外的患者用万古霉素125mg一日四次治疗10天。培养10-2，4，6，8的新鲜粪样品，以获得艰难梭菌营养体和孢子形式；通过细胞测定测试粪滤液的细胞毒素B。在研究开始时和第10天，检查稀释10-3，5，7，9的需氧和厌氧粪菌群培养物的主要的菌群变化。由于类菌体群生物普遍存在并且是可培养的，将该属选择作为微生物菌群完整性的指示物。
详细方法显示如下：
1)在Calgary健康区聚集区(Calgary Health Region catchment area)中的单中心研究，群体～1百万
2)随机开放标记，在2A阶段研究范围内给药，每12小时比较口服用于CDAD治疗的50mg，100mg或200mg，持续10天。
3)实验募集结束后，用万古霉素125mg一日四次治疗单独的生态对照组的患者，治疗10天，作为治疗/生态对照，所述患者对于该实验是合格的。
4)轻度到中度CDAD：在研究开始时，＞3但是＜12个腹泻样品/24小时，阳性艰难梭菌毒素测试，发烧＜39℃，WBC＜30,000/mm3，无呕吐，没有严重的腹部不适
5)初始CDAD或仅第一次复发发作。
6)如果可能，以前没有进行过治疗。该方案容许多到3个在前标准治疗剂量，但是对于该评估，容许最多2个剂量的标准治疗。在该研究群体中，24个患者以前没有进行过治疗。
7)没有同时进行对于任何病症的肠胃外抗生素治疗。
8)系列粪样品：除了开始的诊断样品，在研究开始时，在研究开始后第4天，第7天，第10天，第14天，第21天，第28天和第42天获得＞5克(通常是10-30克)的粪的重复收集样品
9)对于该报道，比较第0天和第10天粪的艰难梭菌计数和主要的正常定居菌群属的数量结果的变化。
10)用新鲜传代的样品通过HeLa细胞测定确定艰难梭菌定量计数和艰难梭菌细胞毒素B的粪滤液浓度，因为冷冻对于确定艰难梭菌的定量计数是不利的。
11)因为认为类菌体群生物在受试者中普遍存在并且是高计数的，而且可能是赋予“定居抗性”的正常菌群的主要成分之一，将该群用作抑制厌氧粪菌群的指数。对于在10天不能显示类菌群群物种的恢复的患者，处理随后的样品以记录该群恢复的时间。如果样品没有被立即处理，将等分试样在-80℃冷冻在15％甘油/脑心输注培养液(Brain Heart Infusion Broth)中，用于进行进一步处理。
12)厌氧菌群培养的培养基和方法基于Wadsworth-KTL厌氧手册，第6版，2002。通过在CCFA琼脂上将样品稀释至10-2，4，6，8/克粪湿重，来确定艰难梭菌计数。通过用等体积的100％乙醇处理粪的等分试样1小时，离心，洗涤2次并且重悬浮以定量计数来确定孢子数量。
13)使用MacConkey，BAP，m-肠球菌琼脂，Lab M厌氧血琼脂，BAP，BBE，KVLB，PEA琼脂以10-3，5，7，9进行稀释，进行初始检查之前温育48小时，并且再温育7天来量化正常的菌群培养物。
14)对于万古霉素生态对照，使用产气荚膜梭菌作为指示生物，通过生物测定一式三份地确定万古霉素粪滤液浓度。
15)使用wilcoxon匹配，在log10转化后确定微生物计数中的差异。
结果
在研究开始时，艰难梭菌的平均log10CFU±SD营养体计数(所有的MCC患者)是6.8±3.6，范围2-10.95；在第10天，除了接受50mg的一名患者，所有其他的患者的艰难梭菌定量计数减少＜2log10/gm粪。万古霉素类似地有效。在研究开始时，在1/3的每组患者中，类菌体群计数是＜3，3-8，和8.5-10log10 CFU/gm，其中正常计数是＞11。在类菌体群中的变化显示在表19中。
表19.类菌体群计数/克粪湿重的log10 CFU的平均值±SD
  MCC，50mg(n＝10)   MCC，100mg(n＝8)   MCC，200mg(n＝11)   万古霉素(n＝7)
  第0天   6.64±2.82   6.64±2.82   7.04±2.87   7.39±2.67
  第10天   8.23±2.60   6.30±2.53   7.34±3.06   3.62**±1.90
  p*   0.11   0.44   0.56   0.03
*威氏配对符号秩次检验(wilcoxon matched pairs signed-ranks test)，双尾；
**计数＜3log10＝2.90
下面的附图还举例说明来自本研究的结果。
结论
基于定量的类菌体群计数，患有艰难梭菌腹泻的患者在研究开始时，具有可变地受损的正常菌群，其中约1/3在3log10 CFU/gm范围，1/3在4-7log10 CFU计数中，并且剩余的具有更高的计数(没有在正常的11-12log10 CFU范围内的)。所有的MCC的剂量似乎减少艰难梭菌的数量，如万古霉素一样。没有观察到随MCC的剂量增加，类菌体计数的剂量依赖性减少。万古霉素在治疗过程中严重地减少类菌体计数，并且尽管大多数患者恢复它们的计数，极少数仍然在延长的时间内缺乏。
基于显示高响应率和低复发率的这些数据和临床结果，似乎MCC的200mg剂量是进行进一步的临床研究的适合的剂量。
本发明不限于上述的实施方案，所述实施方案仅作为举例的目的而存在，但是其可以在保护范围内以各种方式进行修改，所述保护范围由后附的专利权利要求限定。

Claims (46)

1.一种治疗由细菌的存在导致的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要的患者施用有效量的混合物，其中所述混合物包括有效量的台勾霉素B和选自由下列各项组成的组的另外的大环化合物：
Figure A2006800479860002C1
III(OP-1416)，
Figure A2006800479860002C2
IV(OP-1415)，
V(OP-1417)，
Figure A2006800479860003C1
IX(OP-1435)，
Figure A2006800479860003C2
X(OP-1437)，
Figure A2006800479860003C3
XI(OP-1402)，
Figure A2006800479860003C4
XII(OP-1433)，
Figure A2006800479860004C1
XIII(OP-1438)，
XIV(闰年霉素A4)，和
它们的组合，其中当式XIV的化合物存在时，所述混合物包括约0.1重量％到约5重量％的式XIV的化合物。
2.权利要求1的方法，其中所述混合物包括至少90重量％的台勾霉素B。
3.权利要求1的方法，其中所述混合物包括至少95重量％的台勾霉素B。
4.权利要求1的方法，其中所述混合物包括至少98重量％的台勾霉素B。
5.权利要求1的方法，其中所述混合物总共包括至少1重量％的另外的大环化合物。
6.权利要求1的方法，其中所述混合物总共包括约2重量％到约5重量％的另外的大环化合物。
7.权利要求1的方法，其中所述混合物显示基本上在图5所显示的HPLC图谱。
8.权利要求1的方法，其中所述混合物包括约0.3到约5重量％的式XIV的化合物。
9.权利要求1的方法，其中所述混合物包括约0.3到约3重量％的式XIV的化合物。
10.权利要求1的方法，其中所述混合物包括约0.3到约1.5重量％的式XIV的化合物。
11.权利要求1的方法，其中所述混合物包括约1重量％的式XIV的化合物。
12.权利要求1的方法，其中所述混合物还包括下列化合物的至少一种：
Figure A2006800479860005C1
VI(OP-1431，台勾霉素F)，
Figure A2006800479860005C2
VII(Op-1432，台勾霉素C)，和
Figure A2006800479860005C3
VIII(OP-1434，台勾霉素A)。
13.权利要求1的方法，其中所述细菌选自由下列各项组成的组：梭菌属(Clostridium)物种，葡萄球菌属(Staphylococcus)物种，肠球菌属(Enterococcus)物种及其组合。
14.权利要求1的方法，其中所述细菌选自艰难梭菌(C.dofficile)，产气荚膜梭菌(C.perfringens)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，及其组合。
15.权利要求1的方法，其中所述细菌是艰难梭菌。
16.权利要求1的方法，其中所述混合物基本上不影响在患者中的厌氧胃肠菌群的主要成员。
17.权利要求1的方法，其中疾病或病症的复发率显著减少。
18.权利要求1的方法，其中所述疾病是腹泻和结肠炎的至少一种。
19.权利要求1的方法，其中所述疾病是感染性腹泻。
20.权利要求18的方法，其中所述疾病是艰难梭菌相关的腹泻。
21.权利要求1的方法，其中所述混合物通过包括下列步骤的方法制备：
在营养培养基中培养微生物以在所述营养培养基中积累所述混合物；和
从营养培养基中分离所述混合物；
其中所述营养培养基包括吸附所述混合物的吸附剂。
22.权利要求21的方法，其中所述营养培养基包括约0.5到约15重量％的吸附剂。
23.权利要求21的方法，其中所述吸附剂是吸附树脂。
24.权利要求23的方法，其中所述吸附树脂选自由下列各项组成的组：离子交换树脂
Figure A2006800479860006C1
(Amberlite
Figure A2006800479860006C2
)XAD16，XAD16HP，XAD2，XAD7HP，XAD1180，XAD1600，IRC50，和Duolite
Figure A2006800479860006C3
XAD761。
25.权利要求21的方法，其中所述微生物是桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)hamdenensis亚种。
26.权利要求1的方法，其中所述疾病与抗生素的使用或癌症化学治疗或抗病毒治疗相关。
27.权利要求1的方法，其中葡萄球菌属物种是甲氧西林-抗性葡萄球菌物种。
28.权利要求1的方法，其中所述葡萄球菌属物种是甲氧西林-抗性金黄色葡萄球菌。
29.权利要求1的方法，其中所述肠球菌属物种是万古霉素-抗性肠球菌。
30.权利要求1的方法，其中所述混合物在3-15天内，以约50mg到约1000mg的量，每日1-3次地施用。
31.权利要求1的方法，其中所述混合物以约100mg到约400mg的量每日1或2次地施用。
32.权利要求1的方法，其中所述混合物以约200mg的量，每日一次地施用。
33.权利要求1的方法，其中所述混合物以约200mg的量，每日两次地施用。
34.权利要求1的方法，其中所述混合物以这样的方式施用从而使在患者中，混合物的血浆浓度低于5ng/mL。
35.权利要求1的方法，其中所述混合物以这样的方式施用从而使在患者的尿中，混合物的浓度低于5ng/mL。
36.一种药物混合物，其包括台勾霉素B和选自由下列各项组成的组的另外的大环化合物：
Figure A2006800479860007C1
III(OP-1416)，
Figure A2006800479860007C2
IV(OP-1415)，
Figure A2006800479860008C1
V(OP-1417)，
Figure A2006800479860008C2
IX(OP-1435)，
X(OP-1437)，
Figure A2006800479860008C4
XI(OP-1402)，
Figure A2006800479860009C1
XII(OP-1433)，
Figure A2006800479860009C2
XIII(OP-1438)，
Figure A2006800479860009C3
XIV(闰年霉素A4)，和
它们的组合，其中当式XIV的化合物存在时，所述混合物包括约0.1到约5％的式XIV的化合物。
37.权利要求36的混合物，其包括至少90重量％的台勾霉素B。
38.权利要求36的混合物，其包括至少95重量％的台勾霉素B。
39权利要求36的混合物，其总共包括至少1重量％的另外的大环化合物。
40.权利要求36的混合物，其总共包括约2重量％到约5重量％的另外的大环化合物。
41.权利要求36的混合物，其中所述混合物显示基本在图5中所显示的HPLC图谱。
42.权利要求36的混合物，其中所述混合物包括约0.3％到约5重量％的式XIV的化合物。
43.权利要求36的混合物，其中所述混合物包括约0.3％到约3重量％的式XIV的化合物。
44.权利要求36的混合物，其中所述混合物包括约0.3重量％到约1.5重量％的式XIV的化合物。
45.权利要求36的混合物，其中所述混合物包括约1重量％的式XIV的化合物。
46.权利要求36的混合物，其另外包括下列化合物的至少一种：
Figure A2006800479860010C1
VI(OP-1431，台勾霉素F)，
Figure A2006800479860010C2
VII(OP-1432，台勾霉素C)，和
Figure A2006800479860010C3
VIII(OP-1434，台勾霉素A)。
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