CN101337982A

CN101337982A - 对硝基苯-β-D-葡糖苷的合成及其应用

Info

Publication number: CN101337982A
Application number: CNA2007100578488A
Authority: CN
Inventors: 孙家莉; 王金良; 陈丽宇
Original assignee: TIANJIN INST OF MEDICAL AND MEDICINAL SCIENCES
Current assignee: TIANJIN INST OF MEDICAL AND MEDICINAL SCIENCES
Priority date: 2007-07-05
Filing date: 2007-07-05
Publication date: 2009-01-07

Abstract

对硝基苯－β－D葡糖苷的合成及其应用。以D－葡萄糖为原料，经醋酐进行乙酰化，将糖基部分溴代后与对硝基苯酚缩合，然后以甲醇钠水解制得β－D－葡萄糖苷酶底物对硝基苯－β－D葡糖苷。本发明成功合成了β－D－葡萄糖苷酶底物对硝基苯－β－D葡糖苷，并提供了利用该底物测定细菌β－D－葡萄糖苷酶，以便快速区分白色念珠菌和都柏林念珠菌及快速鉴定肠球菌的方法。将底物制成纸片，最佳底物浓度为4mg/mL底物颜色变化显著；最适的磷酸盐缓冲液pH的为pH5.5；0.1mol/L NaOH溶液为终止液，能在20分钟内鉴别白色念珠菌和都柏林菌念珠菌，并且能够在20分钟内鉴定肠球菌。为区分临床检验白色念珠菌和都柏林菌念珠菌、为快速省时检测肠球菌提供了新的方法。

Description

对硝基苯-β-D-葡糖苷的合成及其应用

技术领域：

本发明涉及到β-D-葡萄糖苷酶的底物对硝基苯-β-D-葡糖苷的合成方法，及用该底物测定细菌β-D-葡萄糖苷酶来鉴别白色念珠菌和都柏林菌念珠菌，并快速鉴定肠球菌的方法。

背景技术：

白色念珠菌和都柏林念珠菌都有较强的致病性。都柏林念珠菌是1995年才命名的新的致病性念珠菌。近年来，从HIV感染患者人体中分离出都柏林念珠菌，其毒力比白色念珠菌强，但在目前的临床细菌学检验中，白色念珠菌和都柏林念珠菌很相似他们的芽管生成实验及夺取膜孢子试验均为阳性，不能将这两种菌分开，则影响到后期用药的针对性。再者，肠球菌为院内感染的重要病原菌，不仅可引起尿路感染、皮肤软组织感染，还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心骨膜炎和脑膜炎，也会引起肺炎和呼吸系统等疾病。传统的方法检定肠球菌最快也需48-24小时，会导致病情的延误。本发明根据酶动力学原理设计的酶法检测，就是利用细菌内β-D-葡萄糖苷酶的检测能够快速地将白色念珠菌和都柏林菌区分开来，并且能够快速鉴定肠球菌。但是β-D-葡萄糖苷酶底物对硝基苯-β-D-葡糖苷的合成未见报道。我们根据多年合成各类型酶底物的经验，研究合成了该底物：对硝基苯-β-D-葡糖苷。

发明内容：

本发明提供了β-D-葡萄糖苷酶的底物对硝基苯-β-D-葡萄糖苷的合成方法。并提供了用该底物测定细菌β-D-葡萄糖苷酶，以便快速区分白色念珠菌和都柏林念珠菌及快速鉴定肠球菌的方法。

我们的合成方法是以D-葡萄糖为原料经醋酸酐使糖基部分乙酰化，再经溴代，然后与对硝基苯酚缩合，再用甲醇钠水解得到。

本发明所述的对硝基苯-β-D葡糖苷的合成，是经过以下步骤制得：

——β-五乙酰葡糖的制备：以葡萄糖为原料进行乙酰化反应，取干燥的D-葡萄糖200g，无水醋酸钠0.1-0.8倍(w/w)，醋酐5-8倍(w/v)，温热溶解，水浴上加热回流并搅拌2h，搅拌下倒入5-10倍于醋酐量的冰水中，搅拌1个小时，析出大量浅色结晶，过滤，水洗结晶，干燥，制得β-五乙酰葡糖粗品，用5-8倍量95％乙醇重结晶，得到β-五乙酰葡糖结晶220g，熔点mp130-132℃；此步反应醋酐的加入量最好为葡萄糖量的6倍(g/v)以上，维持体系有效回流，以防止葡萄糖的焦化或难溶。

——溴试剂的制备：3g红磷于20-30ml冰醋酸中，冰浴下逐渐滴入15-20g溴，完毕后放置半小时，过滤得溴试剂，密封保存于冰箱内备用。

——溴-α-D-四乙酰基葡糖的制备：50gβ-五乙酰葡糖，70-80ml溴试剂搅拌溶解，放置2小时，加入150ml氯仿混合，将混合物倒入5000ml冰水中，分出氯仿层以等体积的冰水洗两次，再用等体积的饱和的碳酸氢钠洗一次，取氯仿层加无水硫酸钠搅拌后静止过夜，次日在50-60℃水浴减压蒸去氯仿，得一糖浆。溶于等体积的乙醚中0℃放置过夜，得40g粗品，用2倍量乙醚重结晶得35g，mp84℃。

——对硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷的制备：取50g溴-α-D四乙酰基葡糖，33-41g的对硝基苯酚，于500ml丙酮中搅拌5-10分钟使之溶解，加1mol/LNaOH液250-300ml，搅拌2-3分钟，溶解，于冰箱放置过夜。收集长针状结晶，用水洗至白色。以20-30倍量无水乙醇重结晶，得长针状结晶23g，mp174-176℃。

——对硝基苯-β-D-葡糖苷的制备：取上步的对硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷进行水解反应，20g对硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷悬浮于200-500ml无水甲醇中，37℃保温5-15分钟，加入1mol/L甲醇钠无水甲醇液10-40ml，混匀，溶解，冰箱放置过夜，收集结晶，得12g粗品。

——精制时发现，以无水乙醇重结晶时，溶液变黄、非酶水解现象较为严重，且晶形成团簇，改为用无水甲醇重结晶后非酶水解现象减少，且晶形为细针状。12g粗品加20-30倍量的无水甲醇、活性炭脱色，重结晶后得白色细针状结晶10g，真空干燥。mp164-166℃。可以大大地减少非酶水解问题，干燥采用真空干燥以避免进一步水解。

本发明所述，用上述方法制得的对硝基苯-β-D-葡糖苷在细菌学β-葡糖苷酶的检测中的应用，是用来快速鉴别白色念珠菌和都柏林念珠菌，并鉴定肠球菌。

其步骤如下：

——材料

1.底物纸片的制作：6mm圆形滤纸片，再将滤纸片置于玻璃皿中，高温灭菌。精密称取4mg对硝基苯-β-D-葡糖苷溶于1ml生理盐水中，不停搅拌，以均匀分配滤纸片上的底物，置35℃干燥待用。

2.缓冲液：不同pH磷酸盐缓冲液(pH5.0～pH7.0)。

3.终止液：0.1mol/LNaOH溶液。

4.菌株：临床分离的白色念珠菌、链球菌、肠球菌、肠杆菌共82株。质控用标准菌株：大肠埃希氏ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853。

——根据酶学原理：将细菌涂布于含适当浓度的底物上，在适当pH条件下，细菌β-的葡萄糖苷酶将底物水解，使对硝基酚游离，在碱性条件下呈现黄色，细菌无β-葡萄糖苷酶则不呈色。进行细菌β-Glu酶检定。

——操作：

(1)在滤纸片上滴加pH5.5磷酸盐缓冲液，浸湿纸片。

(2)用接种环挑取细菌菌落浓涂于纸片上，温育于35℃ 20分钟。

(3)加一滴0.1mol/LNaOH溶液于纸片上观察涂菌落处有无黄色出现。

——结果：

最佳反应时间的选定20分钟为最适反应时间；最佳底物浓度的选定为4mg/mL底物颜色变化显著；加0.1mol/L NaOH溶液后的结果判定时间为10分钟；最适pH的选定为pH5.5。在念珠菌鉴定中的应用：临床菌株18株酵母样真菌，以芽管生成及厚膜孢子试验均阳性，初步鉴定为白色念珠菌。经β-Glu酶试验证明16株阳性，确定为白色念珠菌；2株阴性，为都柏林念珠菌。此2株在42℃均不生长，且木糖氧化为阴性，符合都柏林念珠菌。反应时间为20分钟。实验中还发现β-Glu酶对肠球菌的快速鉴定有特别的价值，反应时间也为20分钟。在链球菌属：化脓性链球菌、肺炎链球菌、绿色链球菌、链球菌属中唯有肠球菌为阳性，这为致病的肠球菌的快速鉴定又增加一新的手段。

发明的优点及效果：1、本发明是国内率先研究合成的β-葡糖苷酶底物对硝基苯-β-D-葡糖苷。经紫外、红外、核磁共振、元素分析、高效液相、旋光等确认和对照，所合成底物性能达到国外产品水平。2、建立了用自行合成的底物对硝基苯-β-D-葡糖苷测定细菌β-D-葡萄糖苷酶，以便快速(20分钟)区分白色念珠菌和都柏林念珠菌及快速鉴定肠球菌的方法。此方法简单、快速、实用，可以在各实验室推广应用。

具体实施方式：

实施例1、

底物：对硝基苯-β-D葡糖苷的合成

——β-五乙酰葡糖的制备：取干燥的D-葡萄糖200g，无水醋酸钠40g，醋酐1200g，温热溶解，水浴上搅拌回流2h，搅拌下倒入6000ml冰水中，搅拌1个小时，析出大量白色结晶，过滤，水洗结晶，干燥，制得β-五乙酰葡糖粗品，用7倍量95％乙醇重结晶，得到β-五乙酰葡糖结晶220g，熔点mp130-132℃；

——溴试剂的制备：3g红磷于30ml冰醋酸中，冰浴下逐渐滴入18g溴，完毕后放置半小时，过滤得溴试剂，密封保存于冰箱内备用。

——溴-α-D-四乙酰基葡糖的制备：50gβ-五乙酰葡糖，75ml溴试剂搅拌溶解，放置2小时，加入150ml氯仿混合，将混合物倒入5000ml冰水中，分出氯仿层以等体积的冰水洗两次，再用等体积的饱和的碳酸氢钠洗一次，取氯仿层加无水硫酸钠搅拌后静止过夜，次日在50-60℃水浴减压蒸去氯仿，得一糖浆。溶于等体积的乙醚中0℃放置过夜，得40g粗品，用2倍量乙醚重结晶得35g，mp84℃。

——对硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷的制备：取50g溴-α-D-四乙酰基葡糖38g的对硝基苯酚，于500ml丙酮中搅拌5-10分钟使之溶解，加1mol/LNaOH液280ml，搅拌2-3分钟，溶解，于冰箱放置过夜。收集长针状结晶，用水洗至白色。以30倍量无水乙醇重结晶，得长针状结晶23g，mp174-176℃。

——对硝基苯-β-D-葡糖苷的制备：20g对硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷悬浮于500ml无水甲醇中，37℃保温10分钟，加入1mol/L甲醇钠无水甲醇液20ml，混匀，溶解，冰箱放置过夜，收集结晶，得12g粗品。

——精制时发现，以无水乙醇重结晶时，溶液变黄、晶形成团簇，非酶水解现象较为严重，改为用无水甲醇重结晶后非酶水解现象减少，且晶形为细针状。12g粗品加20-30倍量的无水甲醇、活性炭脱色，重结晶后得白色细针状结晶10g，真空干燥。mp164-166℃。

——对硝基苯-β-D葡糖苷的结构确认：

元素分析(C₁₂H₁₅NO₈)

理化值：C 47.84％ H 5.02％ N 4.65％

测试值：C 47.71％ H 5.27％ N 4.58％

红外光谱(kBr)：3373(-OH)；2929(-C＝C)；1611，1495(ph)；

1352(-NO₂)；1254(-O-C)

核磁共振谱(溶剂：D₂O，内标：TMS，频率：300)：

8.22 7.20(m，4H，ph)

5.23(d，1H)

3.91(m 6H)

紫外最大吸收：303nm，

比旋光度：[α]²⁰ _D：-104°(C 0.500，H₂O)

实施例2、

用来快速鉴别白色念珠菌和都柏林念珠菌，并鉴定肠球菌。

其步骤如下：

——材料：

2.缓冲液：不同pH磷酸盐缓冲液(pH5.0～pH7.0)。

3.终止液：0.1mol/L NaOH溶液。

——操作：

(1)在滤纸片上滴加pH5.5磷酸盐缓冲液，浸湿纸片。

(3)加一滴0.1mol/L NaOH溶液于纸片上，观察涂菌落处有无黄色出现。

——白色念珠菌都柏林念珠菌鉴别：

临床菌株18株酵母样真菌，以芽管生成及厚膜孢子试验均阳性，初步鉴定为白色念珠菌。经β-Glu酶试验证明16株阳性，确定为白色念珠菌；2株阴性，为都柏林念珠菌。此2株在42℃均不生长，且木糖氧化为阴性，符合都柏林念珠菌。另有10株酵母样真菌均经芽管生成及厚膜孢子试验阴性，而排除白色念珠菌或都柏林念珠菌。

——肠杆菌鉴定：

肠杆菌属的β-Glu酶检测结果

链球菌属的β-Glu酶检测结果。

Claims

1、一种对硝基苯-β-D-葡糖苷的合成，其特征在于该对硝基苯-β-D-葡糖苷是以D-葡萄糖为原料，经醋酐进行乙酰化，以溴试剂溴化后与对硝基苯酚缩合，然后以甲醇钠水解制得。

2、根据权利要求1所述的对硝基苯-β-D-葡糖苷的合成，其特征是所述的对硝基苯-β-D-葡糖苷经过以下步骤制得：

——溴-α-D-四乙酰基葡糖的制备：50g β-五乙酰葡糖，70-80ml溴试剂搅拌溶解，放置2小时，加入150ml氯仿混合，将混合物倒入5000ml冰水中，分出氯仿层以等体积的冰水洗两次，再用等体积的饱和的碳酸氢钠洗一次，取氯仿层加无水硫酸钠搅拌后静止过夜，次日在50-60℃水浴减压蒸去氯仿，得一糖浆。溶于等体积的乙醚中0℃放置过夜，得40g粗品，用2倍量乙醚重结晶得35g，mp84℃。

——对硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷的制备：取50g溴-α-D-四乙酰基葡糖，33-41g的对硝基苯酚，于500ml丙酮中搅拌5-10分钟使之溶解，加1mol/LNaOH液250-300ml，搅拌2-3分钟，溶解，于冰箱放置过夜。收集长针状结晶，用水洗至白色。以20-30倍量无水乙醇重结晶，得长针状结晶23g，mp174-176℃。

——精制：12g对硝基苯-β-D葡糖苷粗品，加20-30倍量的无水甲醇、活性炭脱色，重结晶后得白色细针状结晶10g，真空下干燥。mp164-166℃。

3、一种权利要求1和2中制得的对硝基苯-β-D-葡糖苷在细菌学β-葡糖苷酶的检测中的应用，能在20分钟内鉴别白色念珠菌和都柏林念珠菌，并鉴定肠球菌。其步骤如下：

——材料

1).底物纸片的制作：6mm圆形滤纸片，再将滤纸片置于玻璃皿中，高温灭菌。精密称取4mg对硝基苯-β-D-葡糖苷溶于1ml生理盐水中，不停搅拌，以均匀分配滤纸片上的底物，置35℃干燥待用。

2).缓冲液：磷酸盐缓冲液pH5.5。

3).终止液：0.1mol/LNaOH溶液。

4).菌株：临床分离的白色念珠菌、链球菌、肠球菌、肠杆菌。质控用标准菌株：大肠埃希氏ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853。

——操作：

(1)在滤纸片上滴加pH5.5磷酸盐缓冲液，浸湿纸片。

(3)加一滴0.1mol/LNaOH溶液于纸片上，观察涂菌落处有无黄色出现。

——判定：

在念珠菌中鉴定，白色念珠菌为阳性、都柏林念珠菌为阴性。

在链球菌属，唯有肠球菌为阳性。