CN101324576A

CN101324576A - 前列腺特异性抗原诊断试剂盒

Info

Publication number: CN101324576A
Application number: CNA2007100419142A
Authority: CN
Inventors: 孙兵; 袁建伟; 黄超峰; 胡宇; 蔡兴峰
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2007-06-13
Filing date: 2007-06-13
Publication date: 2008-12-17

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种前列腺特异性抗原PSA与G型免疫球蛋白功能区(IgG Fc)融合蛋白，本发明还公开了含有所述融合蛋白作为标准品的PSA检测试剂盒。本发明将IgG Fc与前列腺特异性抗原PSA相融合表达，不仅可大量地获得融合蛋白，而且该融合蛋白的纯化非常简单且生物活性与天然PSA接近。本发明克服了现有技术中难以重组表达以及纯化与天然PSA接近的重组PSA的技术缺陷，大大降低了PSA检测试剂盒的制造成本。

Description

前列腺特异性抗原诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种前列腺癌特异性检测试剂盒。

背景技术

前列腺癌是中老年男性的常见多发病。据统计，在男性癌症患者中，前列腺癌发病率最高，是除肺癌和大肠癌外的第三大死因。前列腺特异抗原PSA是分子量34KD的糖蛋白，具有高度的组织特异性，分布于正常的前列腺组织、前列腺增生组织、前列腺恶性组织和转移癌及前列腺分泌液、精浆中。PSA目前是前列腺癌诊断中最为重要、应用最为广泛的前列腺癌标志物，测量血清中的前列腺特异抗原PSA可以用于筛选和早期诊断前列腺癌。

前列腺特异抗原(PSA)有总前列腺特异抗原(t-PSA)、结合前列腺特异抗原(c-PSA)、游离前列腺特异抗原(f-PSA)之分，且t-PSA＝c-PSA+f-PSA。通常，以血清中f-PSA或t-PSA的含量来筛选和早期诊断前列腺癌。

目前用于血清PSA检测的试剂盒主要是酶联免疫试剂盒。本领域技术人员均了解，目前临床上在利用ELISA试剂盒检测前列腺特异性抗原PSA指标时，通常是以试剂盒中PSA标准品的浓度作为参照，来确定待测样品中是否含有PSA或含有PSA的浓度。由于PSA指标与确定受试者是否患病直接相关，因此对于试剂盒中标准品的要求很高，标准品蛋白的纯度及其与天然蛋白的接近程度对于检测的准确度和精确性至关重要。

尽管提取自体内的天然PSA蛋白是与待检测的样品中PSA蛋白最接近的，其可作为一种有效标准品。然而天然PSA蛋白不仅来源少，批次之间稳定性差(通常在批次间存在很大差异)，而且纯化难度非常大(通常需要经过离子交换层析，疏水层析，糖基化层析，高效液相色谱层析等多步纯化步骤)，难以得到单一形式的PSA蛋白，纯化的成本也非常高，大大限制了PSA检测试剂盒的生产、推广和应用。

因此，提供一种与天然PSA蛋白接近的重组PSA蛋白是非常有必要的。然而，本领域目前还难以利用基因工程技术大量表达出与天然PSA蛋白具有相同或相近活性的重组PSA蛋白，这可能是由于PSA是一种功能性蛋白，其本身的生物活性影响到重组细胞的生长状态及表达。此外，通常制备重组蛋白所采用的系统是原核表达系统，原核系统表达出的蛋白往往缺乏较好的空间构象和基本的糖基化修饰，与天然蛋白相差甚远。

因此，本领域迫切需要开发制备方便、成本低廉的制备PSA的方法，制备出与天然蛋白具有相同或相近活性的重组PSA，从而可作为PSA检测试剂盒中稳定性高的标准品，用于临床检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包含前列腺特异性抗原PSA和G型免疫球蛋白功能区的融合蛋白，该融合蛋白具有与天然PSA蛋白接近的活性，并且能够与抗PSA抗体良好地结合。

本发明的另一目的在于提供一种含有所述融合蛋白作为标准品的前列腺癌检测试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括：

(a)前列腺特异性抗原PSA元件；

(b)G型免疫球蛋白功能区(IgG Fc)元件；以及

(c)任选的位于PSA元件和G型免疫球蛋白功能区元件之间的连接肽。

在另一优选例中，所述的连接肽具有1-10个氨基酸。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基端还包括：苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒膜蛋白GP64信号肽。

在另一优选例中，所述的PSA元件位于氨基端，而所述的G型免疫球蛋白功能区元件位于羧基端。

在另一优选例中，所述的PSA元件位于羧基端，而所述的G型免疫球蛋白功能区元件位于氨基端。

在另一优选例中，所述的前列腺特异性抗原PSA具有SEQ ID NO：2中第41-277位氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的G型免疫球蛋白功能区元件是人的IgG Fc；更优选的，是人的IgG2 Fc。

在另一优选例中，所述的G型免疫球蛋白功能区具有SEQ ID NO：2中第280-497位氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的GP64信号肽具有SEQ ID NO：2中第1-38位氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子：

(i)编码所述融合蛋白；或

(ii)与(i)所述的核酸分子相互补。

在另一优选例中，所述的核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的核酸分子。

在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述的载体；或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的细胞是昆虫细胞。

在本发明的第五方面，提供一种制备所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括步骤：

在适合表达的情况下，培养所述的细胞，从而产生所述的融合蛋白；和

分离所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述融合蛋白的制备方法包括以下步骤：

(A)将所述的融合蛋白的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；

(B)将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞，使之表达所述的融合蛋白；和

(C)分离获得所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的杆粒为Bacmid杆粒。更优选的，所述的Bacmid来源于大肠杆菌DH10Bac。

在本发明的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制备检测前列腺特异性抗原PSA的试剂盒。

在本发明的第七方面，提供一种检测前列腺特异性抗原PSA的试剂盒，所述的试剂盒含有容器a，所述容器a中装有所述的融合蛋白，作为标准品。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：

容器b，所述容器b中装有特异性结合PSA的第一抗体；和/或

容器c，所述容器c中装有特异性结合PSA的第二抗体，且所述的第二抗体与第一抗体不同。

在另一优选例中，所述的第一抗体和第二抗体分别选自：保藏号为CCTCC-C200622，CCTCC-C200621或CCTCC-C200620的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。更优选的，所述的第一抗体选自保藏号为CCTCC-C200620，CCTCC-C200622的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；或所述的第二抗体是保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：标记物，底物，显色剂，洗涤液，质控品，或终止液。

在另一优选例中，所述的第二抗体携带一标记物。

在本发明的第八方面，提供一种制备前列腺特异性抗原PSA蛋白的方法，所述的方法包括：对所述的融合蛋白进行切割，去除G型免疫球蛋白功能区元件，从而获得PSA蛋白。

另一方面，本发明还提供一种表达载体，所述的表达载体中含有一构建物，所述的构建物从5’至3’依次含有：

(I)苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒膜蛋白GP64信号肽的编码序列；和

(II)G型免疫球蛋白功能区的编码序列。

在另一优选例中，在(I)和(II)之间，还包括至少一个多克隆位点，便于插入待表达的目的基因。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了PSA基因转录本中转录本1，转录本3，转录本4，转录本5的核酸序列比较。

图2显示了PSA的RNA抽提后电泳图谱，其中，泳道1为marker；泳道2为CRL-1740的PSA RNA电泳结果。

图3显示了CRL-1740cDNA作为模板，以各对引物进行PCR扩增的结果。其中，泳道1为DNA marker，泳道2为外部引物正义引物1与外部引物反义引物的PCR扩增产物电泳结果；泳道3为外部引物正义引物2与外部引物反义引物的PCR扩增产物电泳结果；泳道4为外部引物正义引物1与转录本3反义引物的PCR扩增产物电泳结果；泳道5为外部引物正义引物2与转录本3反义引物的PCR扩增产物电泳结果。

图4显示了Nest PCR中，以第一次扩增引物为模板分别定义为A，B，C，D，进行第二次PCR扩增的电泳结果。其中，泳道1，4，7，10，13为marker；

泳道2为以模板A为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物1为引物的PCR扩增产物电泳结果；泳道3为以模板A为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物2为引物的PCR扩增产物电泳结果；

泳道5为以模板B为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物1为引物的PCR扩增产物电泳结果；泳道6为以模板B为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物2为引物的PCR扩增产物电泳结果。

泳道8为以模板C为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物1的PCR扩增产物电泳结果；泳道9为以模板C为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物2为引物的PCR扩增产物电泳结果；

泳道11为以模板D为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物1为引物的PCR扩增产物电泳结果；泳道12为以模板D为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物2为引物的PCR扩增产物电泳结果；

泳道14为以空白对照(蒸馏水)为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物1为引物的PCR扩增产物电泳结果；泳道15为空白对照(蒸馏水)为模板，以内部引物正义引物与内部引物反义引物2为引物的PCR扩增产物电泳结果。

图5显示了全长PSA基因的PCR产物用SAC I进行酶切后的电泳结果。其中，泳道1为marker；泳道2为酶切前的电泳结果；泳道3为maker；泳道4为酶切后的电泳结果。

图6显示了信号肽基因PCR扩增后的电泳结果。其中，泳道1为marker；泳道2为阴性对照；泳道3为GP64信号肽PCR产物。

图7显示了人IgG2 Fc的扩增产物的电泳结果。其中，泳道1为marker；泳道2为阴性对照；泳道3为人Fc PCR产物。

图8显示了PSA基因转入pFastBac-Fc-GP64质粒后的PCR电泳验证。其中，泳道1为marker；泳道2-5为克隆菌A，B，C，D；泳道6为阴性对照。

图9显示了PSA基因转入pFastBac-Fc-GP64质粒后的PCR电泳验证。其中，泳道1为marker；泳道2为克隆A质粒双酶切后电泳结果；泳道3为克隆A质粒双酶切前电泳结果；泳道4为克隆B质粒双酶切后电泳结果；泳道5为克隆B质粒双酶切前电泳结果；泳道6为克隆C质粒双酶切后电泳结果；泳道7为克隆C质粒双酶切前电泳结果；泳道8为克隆D质粒双酶切后电泳结果；泳道9为克隆D质粒双酶切前电泳结果；泳道10为阴性克隆菌双酶切后电泳结果；泳道11为阴性克隆菌双酶切前电泳结果。

图10显示了重组Bacmid杆粒的电泳结果。其中，泳道1为marker，泳道2为Bacmid-PSA杆粒的电泳结果。

图11显示了克隆所得基因测序结果与GenBank数据库中序列比对的结果。

图12显示了目的基因重组插入Bacmid载体的示意图。

图13显示了重组杆粒的PCR电泳验证结果。其中，泳道1为marker；泳道2为空白对照电泳结果；泳道3为阴性菌克隆对照电泳结果；泳道4-10为克隆A，B，C，D，E，F，G，H电泳结果。

图14显示了High Five昆虫细胞的生长曲线。

图15显示了High Five昆虫细胞感染前和感染后的状态。

图16显示了纯化后的蛋白的Wester Blot鉴定结果。其中，泳道1为marker；泳道2为未感染细胞；泳道3为感染空病毒细胞；泳道4为感染PSA-Fc杆状病毒HighFive细胞；泳道5为纯化PSA-Fc(信号肽在昆虫细胞表达融合蛋白后在胞内被自动切割)；泳道6为天然PSA。

图17显示了游离PSA检测试剂盒检测PSA-Fc的浓度梯度稀释曲线。

图18显示了游离PSA检测试剂盒检测PSA-Fc的剂量效应曲线。

图19显示了游离PSA检测试剂盒衡量国际标准品，PSA-Fc标准品的线性相关性。

图20显示了总PSA检测试剂盒检测PSA-Fc的浓度梯度稀释曲线。

图21显示了总PSA检测试剂盒检测PSA-Fc的剂量效应曲线。

图22显示了总PSA检测试剂盒衡量国际标准品，PSA-Fc标准品的线性相关性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，意外地发现，将G型免疫球蛋白功能区(IgG Fc)与前列腺特异性抗原PSA相连接并表达，可大量地表达出PSA-IgG Fc融合蛋白，该融合蛋白的纯化非常简单。并且，在将PSA与IgG Fc连接后，表达出来的重组融合蛋白的生物活性与天然PSA接近，也即IgG Fc不会影响到PSA的构象。抗体结合实验表明，所述融合蛋白能够良好地与抗PSA的抗体结合，结合特征与天然PSA接近，可见IgG Fc与PSA的连接并不影响到PSA与抗PSA抗体的结合。因而，所述的融合蛋白可用于作为标准品来制备检测前列腺癌的试剂盒。本发明克服了现有技术中难以重组表达以及纯化与天然PSA接近的重组PSA的技术缺陷，从而大大降低了PSA检测试剂盒的制造成本。

融合蛋白及其编码序列

本发明提供一种融合蛋白(简称PSA-Fc)，该蛋白包括前列腺特异性抗原PSA或其生物活性片段和IgG Fc或其生物活性片段。该融合蛋白具有与天然PSA蛋白相同或非常接近的蛋白活性，并且还便于被高水平地表达和纯化。

在本发明中，前列腺特异性抗原PSA可以具有一部分保守氨基酸被替代的序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。因此，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的PSA的氨基酸序列也包括在本发明中，所述的PSA也具有与天然PSA接近的特性，并且能够与抗PSA抗体特异性结合。

前列腺特异性抗原PSA的生物活性片段也可以被应用到本发明中。在这里，前列腺特异性抗原PSA的生物活性片段的含义是指作为一种多肽片段，其仍然能保持全长PSA的全部或大多数活性，并且能够与抗PSA抗体特异性结合。

在本发明的一种优选方式中，所述的前列腺特异性抗原PSA具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第41-277位氨基酸序列。

在本发明的融合蛋白中含有IgG Fc，IgG Fc与PSA的连接，在不影响PSA活性的情况下，还有利于融合蛋白的下游纯化。

IgG Fc可以是一部分保守氨基酸替代序列，只要所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性。因此，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的IgG Fc的氨基酸序列也包括在本发明中。

IgG Fc的生物活性片段也可以被应用到本发明中。在这里，IgG Fc的生物活性片段的含义是指作为一种多肽片段，其仍然能保持全长的IgG Fc的全部或大部分功能。

在本发明的一种优选方式中，所述的IgG Fc是人IgG Fc；更优选的，所述的人IgG Fc是人IgG2Fc，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第280-497位的氨基酸序列。

在所述PSA与IgG Fc之间，可包括或不包括连接肽序列。通常，所述的连接肽具有1-10个氨基酸，其不会影响到PSA的生物活性。

为了便于蛋白的表达，本发明人在所述融合蛋白的编码基因的5’端加上信号肽的编码序列，由于信号肽的作用，使得所述融合蛋白被分泌到宿主细胞外，从而便于蛋白的后续收集和纯化。作为本发明的优选方式，所述的信号肽是苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒膜蛋白GP64信号肽。更特别地，所述的GP64信号肽具有SEQ ID NO：2中第1-38位氨基酸序列。

另一方面，本发明还提供了编码所述的融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。作为一种优选方式，所述的核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

并且，本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。

本发明还提供了包含所述载体的宿主细胞。优选的，所述宿主细胞是昆虫细胞。任何适合于表达目的蛋白的昆虫细胞系统均可以用于本发明，优选的，所述的昆虫细胞是sf9昆虫细胞或HighFive昆虫细胞。如是sf9昆虫细胞或HighFive昆虫细胞。

作为本发明的优选方式，本发明还提供了一种利用昆虫系统来表达所述融合蛋白的方法，所述方法包括：将所述的融合蛋白的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；将重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞，使之表达所述的融合蛋白；和分离(如纯化)得所述的融合蛋白。优选地，所述的杆粒为Bacmid杆粒。更优选的，所述的Bacmid来源于大肠杆菌DH10Bac。

采用昆虫表达系统来表达PSA-Fc蛋白，表达量高且稳定，并且蛋白结构接近天然蛋白。经过实验证明，PSA-Fc在昆虫系统中得到了高水平的表达，在天然PSA标准品的替代实验中表现良好。

试剂盒

本发明提供一种检测PSA的试剂盒，所述的试剂盒是基于酶联免疫(ELISA)原理建立的。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的检测技术。本发明所述的试剂盒可用于前列腺癌和良性增生的鉴别诊断，特别是早期病人的筛查，也可用于前列腺癌术后化疗的监测及预后评估等。

本发明所述的试剂盒中，含有所述的PSA-Fc蛋白，作为标准品。

在试剂盒中，该PSA-Fc标准品可以是单一浓度的，在使用试剂盒时，由操作人员进行稀释，形成具有不同浓度PSA-Fc的溶液，用于作为待测样品的参照。或者，可直接在试剂盒中放置多种浓度的PSA-Fc溶液，从而省却了操作人员的稀释步骤。

通常，可利用所述的标准品来设置标准曲线，从而通过参照标准曲线来获得待测样品中PSA的浓度。作为一种优选方式，标准曲线可如下设置：用标准品的OD值检测结果为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制成PSA试剂盒的定量标准曲线；从而，根据待测样品检测获得的OD值，利用标准曲线可计算出待测样品中PSA的浓度。

如本文所用，所述的“样品”是指分离自人体的物质，包括但不限于：血清、血浆、尿液、或其它组织提取液。优选的，所述的“样品”是血清。

利用ELISA原理检测PSA可包括不同的检测方法，较常用的是夹心酶联免疫法。通常，在利用夹心酶联免疫法时，常规的做法是将第一抗体固定于载体，然后第一抗体与抗原反应，洗涤后再与带标记的第二抗体反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。

因此，所述的试剂盒中，还包括其它对于检测PSA必要的成分，包括：特异性结合PSA的第一抗体，和/或特异性结合PSA的第二抗体(该第二抗体与第一抗体不同)。

如本文所用，所述的“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一单克隆抗体”、“第一抗体”与“一抗”可互换使用，都是指一种可特异性结合PSA的抗体。

当利用ELISA方法检测PSA抗原时，通常将所述的第一抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与第一单克隆抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体是微量滴定板。

如本文所用，所述的“检测抗体”、“第二抗体”与“二抗”可互换使用，都是指一种可特异性结合PSA且对应于所述试剂盒中相应的第一抗体的抗体。对于抗原PSA而言，相应的第一抗体和第二抗体是不同的，并且可同时结合于所述的PSA的不同表位(抗原决定簇)。

为了便于鉴定，所述的试剂盒中还可包括标记物。所述的标记物是指用于确定待检测样品中PSA的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中PSA蛋白的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可直接被设置于第二抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗第二抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。抗体标记的方法在本领域是公知的，例如用简易过碘酸钠法或者戊二醛二步法进行HRP标记抗体。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示第二抗体与RBP4发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。

此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是ELISA方法中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、质控品、抗抗体或终止液。这些对于检测PSA有用的成分及其制备是本领域人员已知的。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

本发明还提供一种利用所述试剂盒体外检测PSA的方法，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一单克隆抗体的固相载体，从而使待测样品中的PSA与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“PSA-第一抗体”二元复合物的固相载体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-PSA-第一抗体”三元复合物的固相载体，且所述的第二单克隆抗体携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，从而确定待检测样品中PSA的存在与否以及存在的量。

重组载体

本发明还提供了一种重组载体，所述的重组载体中含有一构建物，所述的构建物从5’至3’依次含有：(I)苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒膜蛋白GP64信号肽的编码序列；和(II)IgG Fc的编码序列。

更优选的，在(I)和(II)之间，还包括至少一个多克隆位点，便于插入待表达的目的基因。

所述的重组载体是通过将GP64信号肽编码序列和IgG Fc的编码序列克隆入原始载体来构建的。优选的，所述的原始载体是一种适用于昆虫细胞表达的载体，例如，所述的原始载体选自(但不限于)：pFASTBAC载体、pFASTBAC DUAL。

除了上述元件，所述的载体上还含有其它对于目的蛋白的表达有用的元件，如启动子，抗性选择标记，增强子或操作子等。

优选的，所述的载体被用于在昆虫细胞中表达所需的目的蛋白。采用所述的载体，可使得目的基因在昆虫细胞中被良好地表达，并被分泌到细胞外；同时，还有利于目的蛋白的纯化。

本发明对所述的目的蛋白没有特别的限制，只要其适合于被昆虫细胞系统表达。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示了一种前列腺特异性抗原PSA与IgG Fc的融合蛋白，该融合蛋白不仅便于被高水平地表达和纯化，并且还具有与天然PSA蛋白相同或非常接近的蛋白活性。

(2)提供了一种成本低廉，准确度高的PSA检测试剂盒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料

Bac to Bac细胞表达系统：pFASTBAC载体，购自Invitrogen公司；对照质粒(pFASTBAC-Gus或pFASTBACHT-CAT，购自Invitrogen公司)；DH10BAC细胞，购自Invitrogen公司；CELLFECTIN试剂，购自Invitrogen公司；昆虫细胞系Spodopterafrugiperda(Sf9)购自Invitrogen公司，Tricoplusia ni(High Five)购自Invitrogen公司。

PBS缓冲液(20×)：NaCl 170g，Na₂HPO₄11.3g，KH₂PO₄ 2.7g，加水定容至1L。

ELISA包被液：NaHCO₃ 0.738g，Na₂CO₃ 0.397g；调PH值为9.5左右，加水定容至250ml。

ELISA稀释液：牛血清100ml，PBS 899ml，Tween201ml。

ELISA洗涤液：1M Tris 20ml，1M HCl 16.8ml，Tween20 0.5ml，调PH值为7.0左右，加水定容至1L。

PB(0.1M，PH6.8)：Na₂HPO₄·12H₂O 1.76g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.8g，ddH₂O 100ml。

Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(1M，PH9.5)：1M Na₂CO₃ 30ml，1M NaHCO₃ 70ml。

10×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 30g，Glycine 144g，SDS 10g，H₂O 1L。

2×SDS凝胶加样缓冲液：Tris Cl 100mmol/L，二硫苏糖醇(DTT)200mmol/L，SDS 4％，溴酚蓝0.2％，甘油20％。

10×转移缓冲液：Tris 30g，Glycine 144g，H₂O 1L，临用前加200ml甲醇/L。

TBS缓冲液：HEPEs 20mM，NaCl 150mM，EDTA 5mM，P200.1％。

s.o.c培养基：双蒸水900ml，蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化钠0.5g，1mol/L氯化钾2.5ml，1mol/L氯化镁10ml，1mol/L葡萄糖2ml。

LB液体培养基：蛋白胨1g，酵母抽提物0.5g，NaCl 1g，双蒸水100ml。

LB固体培养基：蛋白胨1g，酵母抽提物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5g。

蛋白脱色液：冰醋酸100ml，甲醇100ml，双蒸水800ml。

10×TBS：Tris 24.4g，NaCl 80g，双蒸水1000ml，调pH至7.6。

考马斯亮蓝R-250染色液：甲醇135ml，水135ml，冰醋酸30ml，考马斯亮蓝R-250粉末0.75g。

Sf-900 II Serum-Free Medium(SFM)购自Invitrogen公司，胎牛血清(FCS)和新生小牛血清购自杭州四季青公司，Cellfection购自Invitrogen公司，青霉素链霉素购自西巴斯公司，二甲基亚砜(DMSO)购自Merck公司。Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium(DMEM)和RPMI-1640培养液购自Gibco公司。

10％SFM培养液：新生小牛血清100ml，SFM 900ml。

冻存液：DMSO 10ml，新生小牛血清20ml，SFM 70ml。

完全培养液：新生小牛血清100ml，DMEM 900ml。

冻存液：DMSO 10ml，新生小牛血清20ml，DMEM 70ml。

抗PSA单克隆抗体：分别是保藏号为CCTCC-C200622，CCTCC-C200621，CCTCC-C200620的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

Protein G纯化系统：

Hi-Trap Protein G柱：购自法玛西亚Biotech#17-0404-01。

20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)：NaH₂PO₄ 1.084g，Na₂HPO₄.7H₂O 3.273g，蒸馏水1000ml。

0.1M甘氨酸(pH 2.8)：甘氨酸3.75g，盐酸(concentrated)1.4ml，蒸馏水1000ml。

1M Tris：Tris base 141.1g，蒸馏水1000ml。

Pristine和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig抗体、HRP酶标记的羊抗小鼠Ig抗体购自Sigma公司，Protein G-sepharose 4B亲和层析柱购自AmershamBiosciences公司。工具酶切体系购自大连宝生物。质粒抽提试剂盒购自上海博采生物工程有限公司。T载体系统购自上海天根公司。

II.实施例

实施例1.PSA的基因克隆

1.CRL-1740前列腺癌细胞系的培养、RNA抽提与反转录

将CRL-1740前列腺癌细胞株(购自ATCC)从液氮中取出，放于37℃无菌水中，待冻存细胞溶化后加入10ml RPMI1640完全培养基中，吹打均匀后，1000rpm离心，重新洗涤细胞后将细胞以2×10⁶/ml培养于75cm²T FLASK，37℃培养2代。

细胞培养得到5×10⁶个细胞，通过常规方法进行RNA抽提，抽提时尽量保持低温和无RNAse。RNA抽提后电泳结果如图2所示，显示RNA被抽提出来。

反转录系统(40ul)如下：5×缓冲液8ul，0.1M DTT 4ul，dNTPs(10mM)8ul，RNAse抑制剂0.5ul，Superscriptase 1ul，Oligo(dT)12-16(0.5ug/ul)1ul，样品RNA(4ug)4ug，DEPC H₂O加至40ul。

将Oligo dT与RNA，DEPC水混匀后，70℃水浴10min(封口)，冰浴2-3min，加入其余上述混合液，37℃水浴1.5h，95℃水浴5min(封口)，冰浴，得到CRL-1740cDNA。

2.PSA的Nest PCR克隆

根据已有报导，PSA具有6个转录本，其中2号转录本和6号转录本均为全长PSA的短片段，其余的1、3-5号转录本如图1所示，可见PSA转录本情况复杂，不同转录本存在不同片段的缺失，特别是3号转录本其末端含有与其它转录本没有同源性的长片段。并且，对于CRL-1740中PSA的转录本情况并不清楚。因此扩增全长的PSA具有很大的难度。

表1

外部引物正义引物1(Sp1)	CCTGTCCGTGACGTGG	SEQ ID NO：3
外部引物正义引物1(Sp1)	CCTGTCCGTGACGTGG	SEQ ID NO：3	外部引物正义引物2(Sp2)	CCAAGCTTACCACCTGCACC	SEQ ID NO：4
外部引物反义引物(As)	GGACAGAGTGGGTTATG	SEQ ID NO：5	外部引物正义引物2(Sp2)	CCAAGCTTACCACCTGCACC	SEQ ID NO：4
外部引物反义引物(As)	GGACAGAGTGGGTTATG	SEQ ID NO：5	内部引物正义引物(Sp3)	TGCACCCCTCATCCTG	SEQ ID NO：6
内部引物反义引物1(As1)	CTCTGGTCTACACCTGT	SEQ ID NO：7	内部引物正义引物(Sp3)	TGCACCCCTCATCCTG	SEQ ID NO：6
内部引物反义引物1(As1)	CTCTGGTCTACACCTGT	SEQ ID NO：7	内部引物反义引物2(As2)	CTTTTCCTAGCAACCC	SEQ ID NO：8
转录本3反义引物(As3)	GCAGGGAGAGAGTGAGATAG	SEQ ID NO：9	内部引物反义引物2(As2)	CTTTTCCTAGCAACCC	SEQ ID NO：8

本发明人设计了不同的外部引物(如表1)和转录本3特异引物，以前述从CRL-1740经RNA抽提和反转录获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，希望从CRL-1740中扩增出PSA全长片段。

外部引物PCR系统(30μl)：10×反应缓冲液(对应PFU酶)3μl，模板2ul，MgCl₂1.8μl，dNTP 1.5μl，引物As 1μl、Sp 1μl，cDNA 0.5μl，ddH₂O 21μl，PFU 0.2μl。PCR反应条件为94℃5min；94℃45s、50℃45s、72℃1min共进行30个循环，72℃7min，外部引物PCR退火温度50℃。

将外部引物扩增产物进行1/100稀释，以稀释后产物为模板进行内部引物PCR。系统(30μl)：10×反应缓冲液(对应PFU酶)3μl，模板2ul，MgCl₂ 1.8μl，dNTP 1.5μl，引物As 1μl、Sp 1μl，cDNA 0.5μl，ddH₂O 21μl，PFU 0.2μl。PCR反应条件：94℃5min；94℃45s、60℃45s、72℃1min共进行30循环，72℃7min。

采用外部引物的PCR扩增产物的电泳结果如图3所示，采用不同的外部引物进行扩增，均无法扩增到清晰并具有目的条带大小的核酸片段。

为了克服无法获得全长PSA的问题，本发明人经过反复实验，以第一次PCR扩增获得的各产物为模板分别定义为A(对应于Sp1和As的扩增产物)，B(对应于Sp2和As的扩增产物)，C(对应于Sp1和As3的扩增产物)，D(对应于Sp1和As3的扩增产物)。分别以设计的各内部引物(见表1)为引物，进行第二次PCR扩增，电泳结果见图4。

实验结果显示，模板A为引物可以在900bp左右位置扩增出条带，而此处大小正好与PSA全长模板大小接近。

在PSA基因的内部有一个工具酶酶切位点SAC I，将PCR产物用SAC I进行酶切。1％琼脂糖电泳验证。SAC I酶切验证结果显示，在PSA基因内部靠近5’端344bp有一个SAC I酶切位点，扩增条带大小为890bp，如果该片断是PSA核酸序列，必然在SAC I酶切处理后变为340bp和550bp左右的核酸片断。实验结果如图5，由实验结果可以得出，片段被SAC I酶切为大小分别为550bp和340bp的核酸片断，说明该核酸序列可能含有PSA核酸序列。

将获得预测为PSA全长的扩增产物进行测序，并与GENBANK数据库比对(见图11)，结果说明克隆片断为人源PSA全长序列基因，无突变。

实施例2.重组质粒的构建

本发明人克隆的是苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)膜蛋白GP64的信号肽，具体序列如下：atgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttcaataaggaacacacaagcaagatggtaagcgctattgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcg (SEQ IDNO：17)，引入BamHI酶切位点和CopI酶切位点。

表2

GP64模板-1	atgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttcaataaggaacacaca	SEQ ID NO：10
GP64模板-1	atgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttcaataaggaacacaca	SEQ ID NO：10	GP64模板-2	ataaaacaatagcgcttaccatcttgcttgtgtgttcct	SEQ ID NO：11
GP64模板-3	attgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcg	SEQ ID NO：12	GP64模板-2	ataaaacaatagcgcttaccatcttgcttgtgtgttcct	SEQ ID NO：11
GP64模板-3	attgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcg	SEQ ID NO：12	Gp64+正向引物(Sp)	ataagaatcggtccgaaaccatgctactagtaaatcag	SEQ ID NO：20
Gp64+反向引物(As)	gggatcccgcaaaggcagaatgcgc	SEQ ID NO：21	Gp64+正向引物(Sp)	ataagaatcggtccgaaaccatgctactagtaaatcag	SEQ ID NO：20

以表2中Gp64+S p、Gp64+As为引物，以GP64模板-1、2、3为模板，进行PCR，获得GP64的信号肽。信号肽基因PCR扩增后的电泳结果如图6。

以表3所示序列为引物，以质粒pWS3(自带IgG2Fc，购自中国军事医学科学研究院)为模板，进行PCR，获得人源IgG2 Fc(简称hFc)。并且，两端引入了HindIII和XhoI酶切位点。人IgG2 Fc的扩增产物的电泳结果如图7所示。

表3

IgG2Fc反向引物(As)	CCCAAGCTTTTTACCCGGAGACAGGGA	SEQ ID NO：13
IgG2Fc反向引物(As)	CCCAAGCTTTTTACCCGGAGACAGGGA	SEQ ID NO：13	IgG2Fc正向引物(Sp)	CCGCTCGAGACATGCCCACCGTGCCCA	SEQ ID NO：14

以BamHI、CopI酶切前述获得的GP64信号肽DNA序列，克隆入经同样酶切的pFASTBAC载体BamHI/CopI位点内，得到pFASTBAC-GP64质粒；以HindIII和XhoI酶切前述获得的IgG2 Fc的DNA序列，克隆入经同样酶切的pFASTBAC-GP64载体HindIII/XhoI位点内，从而获得pFastBac-GP64-Fc质粒。

以BamHI和XhoI酶切前述获得的PSA的DNA序列，克隆入经同样酶切的pFastBac-GP64-Fc质粒中，获得pFastBac-GP64-PSA-Fc质粒。PSA基因转入pFastBac-Fc-GP64质粒后的PCR电泳验证见图8(用BamHI酶切)和图9(用XhoI酶切)。说明GP64-PSA-Fc融合基因已经被克隆进入pFastBac-Fc-GP64，目的基因的测序结果如SEQ ID NO：1所示。蛋白翻译序列如SEQ ID NO：2所示。

比对结果证明，pFastBac-GP64-PSA-Fc内含有正确读码框的GP64信号肽基因序列，PSA全长基因，人IgG2 Fc(1-38位为Gp64信号肽，41-277位为PSA编码区，280-497位为人IgG2 Fc)。理论分子量55道尔顿。

实施例3.杆状病毒的获得与蛋白表达和纯化

将前述制备的pFastBac-GP64-PSA-Fc质粒转化进入DH10Bac基因工程菌，通过蓝白斑筛选(选择白斑)得到阳性克隆。

从阳性杆粒菌中抽提获得重组的Bacmid杆粒(其中携带GP64-PSA-Fc编码基因)，以该Bacmid杆粒为模板，以表4所示序列为引物进行PCR扩增，获得扩增产物进行电泳验证。电泳结果如图10。

表4

M13正向	GTTTCCCAGTCACGAC	SEQ ID NO：15
M13正向	GTTTCCCAGTCACGAC	SEQ ID NO：15	M13反向	CAGGAAACAGCTATGAC	SEQ ID NO：16

将sf9细胞株从液氮中取出放于27℃无菌水中，待冻存细胞溶化后加入10ml SFM培养基中，吹打均匀后，1000rpm离心，重新洗涤细胞后将细胞以2×10⁶/ml培养于75cm²T FLASK，37℃培养2代。

病毒的制备方法如下：

①在六孔板中接种9×10⁵个sf9细胞/2ml/孔。其中培养基SFM中含有青霉素50U/ml，链霉素50ug/ml，10％FBS。27℃培养1h，使细胞贴壁。

②培养细胞的同时，制备重组Bacmid杆粒与Cellfectin试剂复合物：用100ul不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)稀释1ug重组的Bacmid杆粒(约5ul)；使用前将Cellfectin试剂倒置5-10次，使其充分混匀，取6ul Cellfectin试剂用100ul不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)稀释；将上述两种稀释液合并(总体积约210ul)，轻轻混匀，室温孵育15-45min。

③在制备重组的Bacmid杆粒与Cellfectin试剂复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2ml不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)洗涤一次，去掉培养基。

④在含有210ul的复合物的管内加入800ul的不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)，轻轻混匀，加到每个孔中。将六孔板内的细胞孵育5h，27℃。

⑤去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基(Grace’s medium，含双抗、10％FBS)。

⑥在27℃湿度培养箱中孵育72h或着直到细胞出现病毒感染迹象。

重组杆粒的PCR验证：目的基因重组插入Bacmid载体(原理如图12)后，利用载体两端的通用引物进行扩增，则阳性克隆的片断为载体大小加重组插入序列大小。所以目的基因扩增片断大小为1500+270+2000＝3770bp，电泳见图13。泳道4和5显示目的基因大小为接近4KB，提示目的基因已经插入载体，且杆粒状态良好，可以用来进行病毒的包装实验。

P1病毒原种的(P1)分离与贮存：

①当sf9细胞出现感染迹象时，将上层培养基(约2ml)转移到无菌带盖的EP管中，500g离心5min以去除细胞及大的碎片。可用蛋白结合率低的0.2um的滤膜过滤，滴度损失小于10％。

②将含病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中(一般，P1的滴度在10⁶左右)。

③将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱(短期)。若长期保存，进行1ml分装，避光储存于-70℃。冻融后，在使用前进行滴度检测。

病毒的扩增：

①原代病毒(P1)滴度较低，介于1×10⁶-1×10⁷，扩增后滴度为1×10⁷-1×10⁸。

②采用6孔板，2×10⁶sf9细胞/孔，细胞活力＞97％。

③在每个孔中加入适量的病毒。

扩增病毒时可用下列公式进行计算：MOI(Multiplicity Of Infection)在0.01至0.1之间。

接种量(ml)：MOI(phf/ml)×(细胞总数)病毒接种的滴度(pfu/ml)。

感染细胞48h收集的病毒扩增的将近100倍，超过48h收集的病毒质量较低。每种病毒的收集时间都有一定的差别，如在72h收集，但是随着细胞的裂解，病毒的增殖活力会受损。

收集病毒上清，500g离心5min。转移上清至灭菌管，得到P2病毒。保存如上所述。

按照上述方法进行病毒P3的扩增。

如病毒在-70℃储存过，在一定时间后，滴度会降低，在用于蛋白扩增前，需先进行病毒扩增。

实施例4.PSA蛋白的大量表达和纯化

High Five细胞的悬浮驯化培养：2×10⁶/ml细胞放于细胞培养瓶中，27℃50rpm培养。72小时后将细胞进行收集，静置10min。将上清1000rpm离心5min。用新鲜SFM稀释细胞至2×10⁶/ml，27℃50rpm培养。重复上述方法，直到细胞可以悬浮培养。

昆虫细胞的生长曲线见图14。采用悬浮驯化后的细胞进行悬浮培养，细胞密度可以达到1×10⁷/ml，细胞存活率99％。

High Five细胞表达重组PSA-Fc：将悬浮细胞1000rpm，离心2min，洗涤细胞。以最优化MOI感染昆虫细胞，以2×10⁶/m重悬昆虫细胞。27℃，96小时，2000rpm，4min。收集细胞上清。0.45um滤膜过滤。

昆虫细胞的感染状态见图15。可见感染后细胞发生明显的病变，包括细胞核变清晰，细胞变圆，细胞体积变大。病毒感染率100％。

PSA蛋白纯化：每个1.5ml离心管中加入100ul 1MTris碱。10mlPBS缓冲液清洗Protein G-sepharose 4B纯化柱。将培养基以1ml/min速度注入ProteinG-sepharose 4B纯化柱。10mlPBS缓冲液清洗Protein G-sepharose 4B纯化柱。0.1M甘氨酸0.5ml/min注入Protein G-sepharose 4B纯化柱。收集目的蛋白。

采用常规的方法，对纯化后的蛋白进行Wester Blot鉴定。结果见图16，从检测结果来看，目的蛋白PSA-Fc被表达并纯化，且纯化效果良好。

实施例5.PSA抗体的纯化和辣根过氧化物酶(HRP)标记

硫酸铵盐析法纯化抗体：饱和度为33％，4℃放置过夜，离心得沉淀；用33％饱和硫酸铵溶液洗涤沉淀一次；加入少量PBS，溶解沉淀；对PBS 4℃透析过夜后，离心得上清，即为纯化的抗体(Ig)，测蛋白浓度。

抗体与HRP酶的交联(戊二醛两步法)：25％戊二醛(GA)原液用PB稀释到1.25％，取0.2ml；加入10mg HRP酶，混匀后22℃放置18小时；对0.85％-0.9％NaCl 4℃透析，5小时。透析完后用0.85-0.9％NaCl稀释到总体积1ml；加入1ml用0.85-0.9％NaCl稀释的5mg/ml上述纯化的抗体；加入0.1ml 1M PH9.5碳酸盐缓冲液反应，4℃，24小时；加入0.1ml 0.2M的赖氨酸终止反应，室温，2小时；对PBS 4℃透析过夜；再次硫酸铵盐析纯化抗体，即得到酶标记后的抗体。

实施例6.试剂盒的制备和使用

1.试剂盒的制备材料

PSA抗体：以保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤细胞株分泌的抗体为包被抗体；以保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤细胞株分泌的抗体为检测抗体来制备游离PSA(f-PSA)检测试剂盒。以保藏号为CCTCC-C200620的杂交瘤细胞株分泌的抗体为包被抗体；以保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤细胞株分泌的抗体为检测抗体来制备总PSA检测(t-PSA)试剂盒。

标准品：采用实施例4获得的PSA-Fc融合蛋白。

标记物：采用辣根过氧化物酶。

底物：采用TMB。

固相载体：采用96孔酶标板。

包被液：NaHCO₃0.738g，Na₂CO₃0.397g；调PH值为9.5左右，加水定容至250ml。

稀释液：牛血清100ml，PBS 899ml，Tween201ml。

洗涤液：1M Tris 20ml，1M HCl 16.8ml，Tween200.5ml，调PH值为7.0左右，加水定容至1L。

将各种试剂分别装入容器(如小瓶或离心管)中，将容器以及固相载体装入试剂盒中，得到游离PSA检测试剂盒，或总PSA检测试剂盒。

实施例7.夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)

(1)包被抗体：用包被液将包被抗体作适当稀释，浓度为5μg/ml，100μl/孔，4℃放置16～18小时。

(2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3分钟，反复3次，将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

(3)封闭：封闭液200μl/孔，37℃放置2小时。

(4)洗涤：同(2)。

(5)加样：加入待测的血清样本或标准品，100μl/孔，同时加入无关蛋白BSA作阴性对照，37℃反应2小时。

(6)洗涤：同(2)。

(7)二抗：加辣根过氧化物酶标记的检测抗体，100μl/孔，37℃反应2小时。

(8)洗涤：同(2)。

(9)显色：加底物TMB，100μl/孔，室温下避光反应10-15分钟。

(10)终止反应：加终止液2M浓H₂SO₄，100μl/孔。

(11)结果检测：用酶联免疫检测仪在波长450nm下进行检测。

(12)结果计算：

A)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐标，作出标准曲线。

B)计算待测样品PSA浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测样品的PSA浓度。

实施例8.天然PSA和本发明的PSA-Fc的比较

1.游离PSA检测试剂盒检测PSA国际标准品和PSA-Fc

(1)游离PSA检测试剂盒检测PSA-Fc的浓度梯度稀释曲线

初始浓度为112ng/ml的PSA-Fc分别稀释至1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，使用实施例6制备的游离PSA检测试剂盒进行检测，450nm读取底物吸光度。

结果见图17。结果表示，PSA-Fc能够与试剂盒中的包被抗体与检测抗体特异性结合，PSA-Fc在游离PSA检测试剂盒中的线性范围经过校正为0-25ng/ml。

(2)游离PSA检测试剂盒检测PSA-Fc的剂量效应曲线

取PSA-Fc浓度分别为：0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml。使用实施例6制备的游离PSA检测试剂盒进行检测，450nm读取底物吸光度。结果如图18。

结果表示，PSA-Fc在该检测试剂盒中线性度良好。

(3)游离PSA检测试剂盒衡量PSA国际标准品、PSA-Fc作为标准品的线性相关性

分别取PSA-Fc：0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，与PSA国际标准品0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml同时用实施例6制备的游离PSA检测试剂盒检测，比较PSA-Fc与国际标准品的相关性。该PSA国际标准品购自英国NIBSC批号为96/670，该国际标准品是分离自人体的PSA天然蛋白。

结果如表5和图19。结果表示，PSA-Fc与PSAA国际标准品(NIBSC-FPSA)用作标准品检测f-PSA，PSA国际标准品和PSA-Fc在0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml的范围内两者的线性相关度达到0.9995。说明天然标准品完全可以被PSA-Fc替代用于f-PSA试剂盒检测的标准品。

表5

PSA浓度(ng/ml)	NIBSC PSA OD450	PSA-Fc浓度(ng/ml)	OD 450
PSA浓度(ng/ml)	NIBSC PSA OD450	PSA-Fc浓度(ng/ml)	OD 450	0	0.074	0	0.068
0.5	0.14	0.5	0.134	0	0.074	0	0.068
0.5	0.14	0.5	0.134	1	0.204	1	0.214
2.5	0.364	2.5	0.375	1	0.204	1	0.214
2.5	0.364	2.5	0.375	5	0.651	5	0.701
10	1.197	10	1.229	5	0.651	5	0.701
10	1.197	10	1.229	25	2.193	25	2.35

2.总PSA检测试剂盒衡量PSA国际标准品，PSA-Fc作为标准品的线性相关性

(1)总PSA检测试剂盒检测PSA-Fc的浓度梯度稀释曲线

初始浓度为110ng/ml的PSA-Fc分别被稀释至1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，用实施例6制备的总PSA检测试剂盒检测，450nm读取底物吸光度。

结果见图20。结果表示，PSA-Fc在总PSA检测试剂盒中的线性范围经过校正为0-25ng/ml。

(2)总PSA试剂盒检测PSA-Fc剂量效应曲线

取PSA-Fc浓度分别为：0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml。使用实施例6制备的总PSA检测试剂盒进行检测，450nm读取底物吸光度。

结果如图21。结果表示，PSA-Fc在该检测试剂盒中线性度良好。

(3)总PSA检测试剂盒衡量PSA国际标准品，PSA-Fc作为标准品的线性相关性

分别取PSA-Fc：0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，与国际标准品0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml同时用试剂盒检测，使用实施例6制备的总PSA检测试剂盒比较PSA-Fc与PSA国际标准品的相关性。

结果如表6和图22。结果表示，PSA-Fc与PSA国际标准品(NIBSC-TPSA)用作标准品检测总PSA，PSA国际标准品和PSA-Fc在0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml的范围内两者的线性相关度达到0.9952。说明天然标准品完全可以被PSA-Fc替代用于t-PSA试剂盒检测的标准品。

表6

PSA浓度(ng/ml)	NIBSC t-PSAOD450	PSA-Fc浓度(ng/ml)	OD 450
PSA浓度(ng/ml)	NIBSC t-PSAOD450	PSA-Fc浓度(ng/ml)	OD 450	0	0.096	0	0.096
0.5	0.138	0.5	0.132	0	0.096	0	0.096
0.5	0.138	0.5	0.132	1	0.227	1	0.169
2.5	0.268	2.5	0.281	1	0.227	1	0.169
2.5	0.268	2.5	0.281	5	0.374	5	0.39
10	0.705	10	0.737	5	0.374	5	0.39
10	0.705	10	0.737	25	1.458	20	1.248
		25	1.405	25	1.458	20	1.248

实施例9.重组PSA(不含IgG Fc元件)的制备

基本的制备方法同制备PSA-Fc，不同点在于：在构建重组质粒pFastBac-GP64-PSA-Fc时，在PSA与Fc段之间加上烟草病毒蛋白酶(rTEV)的酶切位点的编码序列(GAAAACCTGTATTTTCAGGGC(SEQ ID NO：18)，其对应的蛋白序列为ENLYFQG(SEQ ID NO：19))。表达和纯化同前，获得重组的PSA-rTEV-Fc融合蛋白。

在获得重组的PSA-rTEV-Fc后，利用rTEV蛋白酶进行酶切，分离获得切除了IgGFc的重组PSA。

菌种保藏

本发明涉及的单抗杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏号分别为：CCTCC C200620(杂交瘤细胞系S-115-8)、CCTCCC200621(杂交瘤细胞系S-191-5)、CCTCC C200622(杂交瘤细胞系S-44-10)，保藏日均为2006年4月29日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>前列腺特异性抗原诊断试剂盒

<130>073068

<160>21

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1491

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>1

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcgggatcc 120

attgtgggag gctgggagtg cgagaagcat tcccaaccct ggcaggtgct tgtggcctct 180

cgtggcaggg cagtctgcgg cggtgttctg gtgcaccccc agtgggtcct cacagctgcc 240

cactgcatca ggaacaaaag cgtgatcttg ctgggtcggc acagcctgtt tcatcctgaa 300

gacacaggcc aggtatttca ggtcagccac agcttcccac acccgctcta cgatatgagc 360

ctcctgaaga atcgattcct caggccaggt gatgactcca gccacgacct catgctgctc 420

cgcctgtcag agcctgccga gctcacggat gctgtgaagg tcatggacct gcccacccag 480

gagccagcac tggggaccac ctgctacgcc tcaggctggg gcagcattga accagaggag 540

ttcttgaccc caaagaaact tcagtgtgtg gacctccatg ttatttccaa tgacgtgtgt 600

gcgcaagttc accctcagaa ggtgaccaag ttcatgctgt gtgctggacg ctggacaggg 660

ggcaaaagca cctgctcggg tgattctggg ggcccacttg tctgtaatgg tgtgcttcaa 720

ggtatcacgt catggggcag tgaaccatgt gccctgcccg aaaggccttc cctgtacacc 780

aaggtggtgc attaccggaa gtggatcaag gacaccatcg tggccaaccc cctcgagaca 840

tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 900

aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 960

gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1020

aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1080

ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1140

aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1200

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1260

acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1320

cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ccccttcttc 1380

ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1440

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc c 1491

<210>2

<211>497

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>融合蛋白

<400>2

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe AsnLys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Gly Ser Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu

35 40 45

Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala

50 55 60

Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala

65 70 75 80

His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu

85 90 95

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe

100 105 110

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg

115 120 125

Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu

130 135 140

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln

145 150 155 160

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile

165 170 175

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu

180 185 190

His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val

195 200 205

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr

210 215 220

Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln

225 230 235 240

Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro

245 250 255

Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr

260 265 270

Ile Val Ala Asn Pro Leu Glu Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

275 280 285

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

290 295 300

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

305 310 315 320

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

325 330 335

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

340 345 350

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

355 360 365

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

370 375 380

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

385 390 395 400

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

405 410 415

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

420 425 430

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

435 440 445

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

450 455 460

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

465 470 475 480

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

485 490 495

Ser

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>3

cctgtccgtg acgtgg 16

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>4

ccaagcttac cacctgcacc 20

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>5

ggacagagtg ggttatg 17

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>6

tgcacccctc atcctg 16

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctctggtcta cacctgt 17

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cttttcctag caaccc 16

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>9

gcagggagag agtgagatag 20

<210>10

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>模板

<400>10

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacaca 48

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mi sc feature

<223>模板

<400>11

ataaaacaat agcgcttacc atcttgcttg tgtgttcct 39

<210>12

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>模板

<400>12

attgttttat atgtgctttt ggcggcggcg gcgcattctg cctttgcg 48

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mi sc feature

<223>引物

<400>13

cccaagcttt ttacccggag acaggga 27

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>14

ccgctcgaga catgcccacc gtgccca 27

<210>15

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mi sc feature

<223>引物

<400>15

gtttcccagt cacgac 16

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>16

caggaaacag ctatgac 17

<210>17

<211>114

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>AcNPV病毒膜蛋白GP64的信号肽编码序列

<400>17

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcg 114

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mi sc feature

<223>蛋白酶切位点基因序列

<400>18

gaaaacctgt attttcaggg c 21

<210>19

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<400>19

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210>20

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mi sc feature

<223>引物

<400>20

ataagaatcg gtccgaaacc atgctactag taaatcag 38

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mi sc feature

<223>引物

<400>21

gggatcccgc aaaggcagaa tgcgc 25

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括：

(a)前列腺特异性抗原PSA元件；

(b)G型免疫球蛋白功能区元件；以及

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基端还包括：苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒膜蛋白GP64信号肽。

3.一种核酸分子，其特征在于，

(i)所述的核酸分子编码权利要求1或2所述融合蛋白；或

(ii)所述的核酸分子与(i)所述的核酸分子相互补。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的核酸分子。

5.一种基因工程化的细胞，其特征在于，

所述的细胞含有权利要求4所述的载体；或

所述的细胞基因组中整合有权利要求3所述的核酸分子。

6.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

在适合表达的情况下，培养权利要求5所述的细胞，从而产生权利要求1所述的融合蛋白；和

分离权利要求1所述的融合蛋白。

7.权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备检测前列腺特异性抗原PSA的试剂盒。

8.一种检测前列腺特异性抗原PSA的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：

容器a，所述容器a中装有权利要求1所述的融合蛋白，作为标准品。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

容器b，所述容器b中装有特异性结合PSA的第一抗体；和/或

10.一种制备前列腺特异性抗原PSA蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：对权利要求1所述的融合蛋白进行切割，去除G型免疫球蛋白功能区元件，从而获得PSA蛋白。