CN101319222A

CN101319222A - 重组融合表达串联抗菌肽基因的方法

Info

Publication number: CN101319222A
Application number: CN 200710110508
Authority: CN
Inventors: 王建华; 田子罡; 杨雅麟; 滕达
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2008-12-10

Abstract

本发明是一种重组融合表达串联抗菌肽基因的方法，通过与硫氧还蛋白TrxA融合来表达多拷贝的抗菌肽基因，既利用多拷贝来提高目标多肽在表达产物中的比例，又通过融合蛋白来提高串联抗菌肽基因的表达量和促进可溶性表达，克服了融合蛋白表达单拷贝抗菌肽基因法存在目标多肽在融合蛋白中所占比例低以及直接串联目标多肽基因法存在表达量和可溶性低的缺点。采用本发明能实现串联抗菌肽基因的高效表达，优化条件下，总的重组融合抗菌肽表达量超过2mg/mL(提取液)。

Description

重组融合表达串联抗菌肽基因的方法

技术领域

本发明技术涉及重组表达技术，特别是串联的抗菌肽基因的重组融合表达

背景技术

目前抗菌肽基因的重组表达，主要有以下两种方式：一通过与GST或TrxA融合来表达单拷贝的抗菌肽基因，其优点有利于提高抗菌肽基因的表达量和促进可溶性表达，缺点为通常目标多肽在融合蛋白中所占比例低；二、直接通过串联目标多肽基因来表达，该法虽然表达产物中目标多肽的比例较高，但缺少GST或TrxA融合蛋白提高抗菌肽基因的表达量和促进可溶性表达等优点。

发明内容

本发明是一种重组融合表达串联抗菌肽基因的方法，通过与TrxA融合来表达多拷贝的抗菌肽基因，既利用多拷贝来提高目标多肽在表达产物中的比例，又通过融合蛋白来提高串联抗菌肽基因的表达量和促进可溶性表达，克服了融合蛋白表达单拷贝抗菌肽基因法存在目标多肽在融合蛋白中所占比例低以及直接串联目标多肽基因法存在表达量和可溶性低的缺点。采用本发明能实现串联抗菌肽基因的高效表达，优化条件下，总的重组融合抗菌肽表达量超过2mg/mL(提取液)。

附图说明

图1阳性重组子PCR扩增产物

1，11：100bp Ladder(由上至下：1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100bp)；2：空质粒pET32a(+)扩增产物；3-9：含单拷贝到7拷贝编码基因的重组子扩增产物；10：含9拷贝编码基因的重组子扩增产物.

图2电泳分析融合蛋白诱导结果

1：蛋白质marker(由上至下：94.0，66.2，45.0，35.0，28.5，20.0，14.4kDa)2：诱导前对照；3-10：pET32-(LfcinB15-W4，10)_1-7，9IPTG诱导后结果

图3LfcinB15-W4，10四聚体融合蛋白纯化结果

1：蛋白质marker(由上至下：94.0，66.2，45.0，35.0，28.5，20.0，14.4kDa)；2：诱导后细胞总蛋白；3：诱导前细胞总蛋白对照；4：融合四聚体Ni²⁺螯合层析纯化结果.

图4目的融合蛋白凝血酶酶切电泳结果

1：蛋白质marker(由上至下：94.0，66.2，45.0，35.0，28.5，20.0，14.4kDa)；

2：目的融合蛋白酶切前；3：酶切24h结果；4：酶切48h结果。

图5SDS-PAGE电泳分析多肽四聚体电洗脱回收结果

2：融合蛋白经凝血酶酶切后混合物；3：四聚体电洗脱回收产物

图6重组LfcinB15-W4，10四聚体抑菌活性分析

(A)：对照50μl PBS；(B)：50μl合成LfcinB15-W4，10单体(200μg/ml)；

(C)：50μl重组LfcinB15-W4，10四聚体(300μg/ml)

具体实施方式

重组表达载体构建及转化子鉴定

根据大肠杆菌密码子的偏好性设计基因核苷酸序列，分别合成正义链和反义链，通过非镜像对称互补粘性末端形成多拷贝基因，与含BamH I酶切位点的前接头和含Hind III酶切位点的后接头连接。带有接头的多拷贝基因经HindIII和BamH I酶切后与线性化pET32a载体连接构建重组质粒表达载体pET32a-(LfcinB 15-W4，10)_n，转化大肠杆菌DH5α后，经菌落PCR鉴定、根据扩增产物的片段大小筛选得到含有不同拷贝数编码基因的阳性重组子。

图1显示了PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。经DNA测序鉴定后得到阅读框架和核苷酸序列均正确无误的含有8个不同拷贝数编码基因的重组子。

融合蛋白的诱导表达

含有不同拷贝数编码基因的转化子的过夜培养物，转接新鲜LB培养基，37℃，振荡培养至OD600约0.4，加入IPTG至终浓度1mM，转移至30℃，250rpm振荡培养4h。每个样品取诱导后菌液1ml，离心弃培养基；PBS洗涤沉淀，1×SDS上样缓冲液重悬沉淀；沸水煮8～10min，12000rpm离心5min，取上清SDS-PAGE分析。图2显示了12％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。单体至七聚体融合蛋白理论分子量分别为22.33，24.31，26.29，28.27，30.25，32.23，34.21kDa九聚体融合蛋白理论分子量为38.17kDa。经凝胶分析软件BandScan扫描分析确定，含有单拷贝至6拷贝的转化子诱导产生的特异性蛋白条带在诱导后细胞总蛋白中的比例分别为10.4％、14.3％、18.2％、45.0％、13.2％、14.5％，7拷贝和9拷贝无明显特异性诱导条带。其中四聚体融合蛋白表达水平最高达到诱导后总蛋白的45.0％。优化条件下，总的重组融合抗菌肽表达量超过2mg/mL(提取液)。

目的融合蛋白的纯化

根据在LB培养基中的表达结果分析，换用2YT培养基。不同拷贝数的表达情况分析，4拷贝的重组子表达量最为显著。选定4拷贝作为后续蛋白纯化的样品。并对诱导起始浓度、IPTG浓度和诱导时间进行优化。诱导后收集菌体，用BugBuster试剂裂解细胞后，离心，上清可溶部分和沉淀不溶部分分别上样电泳。结果显示多肽四聚体融合蛋白绝大部分以包涵体形式存在于不溶部分中。故选择在变性条件下纯化融合蛋白，变性剂选用8M尿素。根据目的融合蛋白的浓度，与适当体积的50％Ni-NTAHis-Bind树脂悬液混匀，加入到空色谱柱中，静置1h，使目的融合蛋白和树脂充分结合；拔去色谱柱下端的塞子，收集穿过峰，以备于SDS-PAGE分析；分别依次以4倍柱床体积的含有20mM、50mM、100mM、150mM、250mM、500mM咪唑的漂洗缓冲液洗脱，分别收集流出液，以备于SDS-PAGE分析。纯化结果显示在50mM咪唑浓度洗脱条件下，可以有效的去除杂蛋白干扰，在250mM咪唑浓度洗脱条件下可以将目的融合蛋白洗脱出来。并且纯化后目的融合蛋白纯度达86.3％(图3)。

凝血酶酶切及四聚体电洗脱回收

重组融合蛋白经Ni²⁺亲和层析后，用超滤管和透析方法更换缓冲体系为凝血酶裂解缓冲液，按每毫克融合蛋白加入5个单位比例加入凝血酶，混匀后，在25℃水浴进行保温。酶切24h和48h分别取样，电泳分析酶切结果(图4)。经凝胶扫描分析软件分析，融合蛋白90％以上被凝血酶裂解，融合标签与重组融合蛋白四聚体分开。

用GeBA透析管电洗脱回收重组LfcinB15-W4，10四聚体，电泳分析回收结果(图5)。凝胶分析软件分析回收四聚体纯度达到99％。PBS中透析后，用超滤管浓缩，Bradford方法测定其蛋白质浓度约300μg/ml。

LfcinB15-W4，10四聚体抑菌实验及MIC测定

平板抑菌结果(图6)显示重组多肽四聚体样品在金黄色葡萄球菌平板上形成明显透明抑菌圈，展示出同合成多肽单体相似的抑菌活性。利用Hancock实验室改进的抗菌肽最小抑菌浓度测定方法即微量肉汤稀释法，测定重组LfcinB15-W4，10四聚体对金黄色葡萄球菌的MIC约为16μg/ml。

Claims

1.重组融合表达串联抗菌肽基因的方法，其特征在于：通过与硫氧还蛋白TrxA融合来表达多拷贝的抗菌肽基因，既利用多拷贝来提高目标多肽在表达产物中的比例。

2.如权利要求1所述的重组融合表达串联抗菌肽基因的方法，其特征在于：通过融合蛋白来提高串联抗菌肽基因的表达量和促进可溶性表达。

3.如权利要求1所述的重组融合表达串联抗菌肽基因的方法，其特征在于：优化条件下，总的重组融合抗菌肽表达量超过2mg/mL(提取液)。