CN101319217A

CN101319217A - 白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法

Info

Publication number: CN101319217A
Application number: CNA2008100605738A
Authority: CN
Inventors: 黄鹂; 曹家树; 张爱红; 张豫超; 叶意群
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2008-12-10

Abstract

本发明公开了一种白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法。本发明还公开了含有BcPW1基因干涉片段的质粒及获得该质粒的方法、一种BcA9组织特异型启动子的含该质粒的植物表达载体，以及利用此表达载体转化植物细胞获得花粉发育异常、雄性育性降低的植物和对植物雄性育性进行改造的方法。BcPW1基因可能作用于细胞壁发育过程中绒毡层与花粉的信号传递过程。该基因的分离克隆及功能验证，有助于阐明花粉发育和植物雄性不育产生的分子机理，对生产上人为控制植物育性，利用基因工程手段培育优良品种具有重要的实践意义。

Description

白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法。

背景技术

植物雄性不育是指两性花植物的花粉花药异常导致花粉功能丧失的现象，在被子植物中普遍存在。利用植物雄性不育特性来选育雄性不育系是作物杂种优势利用中简化制种程序、降低制种成本的重要手段。植物雄性不育产生的机理极其复杂，至今仍不清楚。从发育分子生物学角度看，花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现。而花粉发育是一个多步骤复杂的过程，涉及众多基因的表达调控。随着实验方法的不断改进，近年来已经分离鉴定了众多花粉表达基因(Becker et al.，2003；Lee and Lee，2003；Honys and Twell，2003，2004；Pina et al，2005)。然而，在日渐累积的已鉴别的花粉表达基因中，大部分是功能未知的。例如在已经精确定位的模式植物拟南芥的30 000个基因中，有50％为功能未知，尽管其中任何一个都可能和与某个农艺学性状相关(Parkin et al，2005)，但功能未知即阻碍了其在生产中的应用。花粉中这些未知功能的基因可能编码新的在花粉和花药发育中起作用的蛋白质。因此，对这些新基因进行进一步研究，不仅将丰富对花粉发育相关基因的认识，有助于深入理解花粉发育及雄性不育产生的分子机理，同时也为农业生产中利用基因工程进行育种实践奠定了基础。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种白菜雄性育性相关基因BcPW1，它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

一种权利要求1所述的白菜雄性育性相关基因BcPW1的分离方法，包括以下步骤：

(1)Bc-A17T17片段的分离：用A17/T17引物对白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Bc-A7T17，用手术刀片割下聚丙烯酰胺凝胶上的差异片段，溶于100μL TE，并作为模板进行PCR扩增，条件与cDNA-AFLP中的预扩增相同；PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试剂盒纯化；回收产物连接到pGEM-T Easy Vector(Promega)并转化到E.coliDH 5α感受态细胞，经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该条带的核苷酸序列；

(2)Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端扩增：根据双链cDNA合成试剂盒中接头及引物特征设计3’RACE和5’RACE锚定引物P3和P5；根据差异片段Bc-A17T17设计正向特异引物S1和反向特异引物A1，正向特异引物S1与锚定引物P3扩增3’末端，反向特异引物A1与锚定引物P5扩增5’末端；锚定引物P5的序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；锚定引物P3的序列为：5’-GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3’；正向特异引物S1序列为5’-GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3’；反向特异引物A1序列为5’-TTACTAGTTTGCCAACTTGGTGAAG-3’；PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入pGEM-T Easy载体，转化DH 5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，得到Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端；

(3)BcPW1基因的全长克隆：根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异引物T1和T2，所述T1序列为5’-GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3’，和T2序列为5’-A TAGGATCCATAGGTCGGTCAATA-3’；常规PCR方法再次从花蕾cDNA中扩增Bc-A17T17片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA中扩增得到其DNA序列SEQ ID No.2。

本发明的有益效果是：本发明采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜核不育两用系的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行分析，同时配合RACE技术分离获得与花粉壁发育相关基因BcPW1，为进一步弄清不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物花粉发育和雄性不育发生的分子机制提供研究基础，进而为人工创建不育材料、培育优良品种提供物质条件。

附图说明

图1白菜BcPW1 cDNA和DNA全长序列的扩增电泳图；

图2白菜BcPW1氨基酸序列结构域分析示意图；

图3白菜BcPW1表达的原位杂交分析观察图；

图4BcPW1 RNAi表达载体示意图；

图5通过农杆菌介导法获得转BcPW1干涉基因菜心植株观察图；

图6转BcPW1干涉基因菜心的X-Gluc组织化学染色检测图；

图7Northern杂交检测BcPW1在转基因菜心植株中的表达电泳图；

图8转BcPW1干涉基因菜心A9-bcpw1的花粉离体萌发观察图；

图9转BcPW1干涉基因菜心A9-bcpw1的花粉扫描电镜观察图。

具体实施方式

本发明通过基因表达差异分析从白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’的可育株系花蕾中分离得到一个可育花蕾特异表达的基因BcPW1，序列比对表明该基因为一个新的功能未知基因。原位杂交表明，BcPW1在小孢子及绒毡层细胞中表达。通过RNA干涉(RNAi)技术，将BcPW1的干涉基因片段导入正常可育的白菜细胞，验证了该基因的功能。在内源BcPW1的表达受阻断的转基因植株中，花粉的正常萌发受到严重影响，75％左右的花粉不能正常萌发，约15.6％的花粉能长出花粉管，但花粉管长到一定长度时顶端爆裂，正常萌发率只有10.5％。根据BcPW1预测蛋白质的结构特征及其在早期绒毡层细胞和小孢子中共表达的特点，认为其可能作用于细胞壁发育过程中绒毡层与花粉的信号传递过程。BcPW1的克隆和功能鉴定，有助于阐明花粉发育和植物雄性不育产生的分子机理，对生产上人为控制植物育性，利用基因工程手段培育优良品种具有重要的实践意义。实现本发明的具体技术步骤如下：

1.白菜BcPW1基因的分离和序列分析

利用cDNA-AFLP技术分析白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异，筛选到A17/T17引物扩增得到的在可育株系花蕾中特异表达的基因片段Bc-A17T17，长259bp，具体序列见SEQ ID No.1。通过RACE技术扩增得到该片段相关基因的cDNA的5’末端(图1A泳道1)和3’末端(图1A泳道2)，并经克隆酶切鉴定(图1B泳道1、2分别为3’RACE产物和单克隆酶切鉴定，泳道3、4分别为5’RACE产物和单克隆酶切鉴定)。根据两端拼接的cDNA全长序列设计引物，常规PCR方法扩增Bc-A17T17片段相关基因的cDNA序列(图1C泳道1)及其DNA序列(图1C泳道4)，经克隆和酶切鉴定(图1C泳道2、3为cDNA不同单克隆酶切鉴定结果，泳道5为DNA单克隆酶切鉴定结果)，测序结果表明cDNA全长1609bp，DNA序列全长2021bp，命名为BcPW1，具体序列见SEQ ID No.2。利用生物信息学软件分析BcPW1，发现该基因包含3个内含子和4个外显子，最大开放阅读框为1305bp，编码434个氨基酸。推导的氨基酸序列具有可能与细胞增殖、分化和程序性细胞死亡(PCD)相关的蛋白激酶C磷酸化位点(图2标注5)，参与调控信号转导相关的蛋白激酶的酪氨酸磷酸化位点(图2标注6)，及其它与细胞内信号转导、蛋白定位以及黏附等过程有关的位点(图2标注1~4分别为氨基化合物位点；N-糖基化位点；酪蛋白激酶II磷酸化位点；N-豆蔻酰化位点)。通过PredictProtein预测BcPW1编码蛋白质的二级结构，表明该蛋白含44.5％的α螺旋、11.1％的β折叠和44.5％的环状结构。并在N端具有一段信号肽，推测其为分泌蛋白。

2.BcPW1的时空表达特点分析

利用原位杂交技术分析了BcPW1在不同发育阶段的花蕾中的表达情况。结果显示在刚分化的花粉母细胞和绒毡层细胞中即出现BcPW1的表达信号(图3A)，随后在减数分裂时期的小孢子和绒毡层中表达量进一步提高，且发现在绒毡层中的表达比在小孢子中的表达稍强(图3B)，在四分体时期(图3C)、单核小孢子时期(图3D)的小孢子和绒毡层中继续存在，但表达量有所降低，在花粉成熟期已经检测不到BcPW1的表达信号(图3E)。在所有被检测的花蕾的萼片、花瓣、中柱及雌蕊中没有检测到BcPW1的表达。用正义探针进行杂交的对照中亦没有检测到表达信号(图3F)。这些结果说明BcPW1在花粉花药发育的早期就开始表达，在花粉成熟晚期表达逐渐减弱并消失。

3.利用RNAi技术验证BcPW1的功能

构建含白菜BcA9组织特异型启动子的BcPW1干涉基因表达载体(图4)，通过农杆菌介导法转入菜心(白菜的一个变种)植株，通过菜心无菌苗的培养(图5A)、菜心子叶-子叶柄外植体的预培养(图5B)、共培养(图5C)、分化培养(图5D)诱导Kan^R苗的产生及在无菌瓶中生长扩繁(图5E)、生根培养(图5F)、移栽前炼苗(图5G)、移栽诱导开花(图5H)等一系列过程，获得BcPW1基因的转基因植株T₀代，命名为A9-bcpw1。经X-Gluc组织化学染色发现转基因菜心植株A9-bcpw1的花药被染成蓝色(图6A、C、E)、而非转基因对照植株的花药并未有蓝色斑点显现(图6B、D、F)，同时，转基因植株的叶片(图6G)和非转基因植株的叶片(图6H)均未被染成蓝色，说明报告基因GUS在转基因植株的花药中特异表达，同时预示BcPW1干涉基因片段也随之在转基因植株的花药中得到表达。PCR、Southern杂交同时也表明BcPW1干涉基因已经整合到转基因植株的染色体。进一步的Northern杂交检测发现，BcPW1基因在转基因植株中的表达受到了明显抑制，如图7所示，与阳性对照植株可育株系‘Bcajh97-01B’(B line)和空载体转化植株(emp-tra)相比，在转基因植株A9-bcpw1的花(F)和花蕾(B)中；BcPW1基因的表达都受到了明显抑制，与阴性对照不育系‘Bcajh97-01A’(A line)不表达BcPW1基因的情况类似。由此，我们获得了9个转化芽系、63株转化植株。同时获得了空载体转化植株，作为后期相关检测的对照。

内源BcPW1的表达受阻断的转基因植株移栽后的生长状况和形态观察显示，转基因植株A9-bcpw1营养生长正常，并且能正常开花，与空载体转化植株和非转基因植株均没有明显差异，萼片、花瓣、雌蕊、雄蕊、蜜腺等花器官的发育也与空载体转化植株及非转基因植株没有明显区别。但离体萌发实验发现75％左右的花粉不能正常萌发，约15.6％的花粉能长出花粉管，但花粉管长到一定长度时顶端爆裂(图8B、D)，正常萌发率只有10.5％(图8E)。说明BcPW1表达受抑制影响了花粉的正常萌发。扫描电镜观察发现A9-bcpw1花粉近100％畸形。与正常的椭圆形、网纹清晰、三条萌发沟均匀分布的非转基因植株花粉(图9E、F)相比，A9-bcpw1的花粉不饱满、形状不规则，网纹浅、模糊，且萌发沟的数目及分布没有规律，呈现各种各样的畸形(图9A~D)，造成花粉不能完成正常的生物学功能。根据BcPW1预测蛋白质的结构特征及其在早期绒毡层细胞和小孢子中共表达的特点，认为其可能作用于细胞壁发育过程中绒毡层与花粉的信号传递过程，该基因的表达阻断将引起植物雄性育性的显著下降。

结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1BcPW1基因的分离和克隆

(1)Bc-A17T17片段的分离用A17/T17引物对白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Bc-A7T17，用手术刀片割下聚丙烯酰胺凝胶上的差异片段，溶于100μL TE(10mmol·L^-1Tris，pH 7.5，1mmol·L^-1EDTA，pH 8.0)，并作为模板进行PCR扩增，条件与cDNA-AFLP中的预扩增相同。PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试剂盒纯化。回收产物连接到pGEM-T Easy Vector(Promega)并转化到E.coli DH 5α感受态细胞，经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该条带的核苷酸序列。

(2)Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端扩增根据双链cDNA合成试剂盒(SMART^TMPCR cDNA Synthesis Kit)中接头及引物的特征设计了3’RACE和5’RACE锚定引物P3和P5；根据差异片段Bc-A17T17设计正向特异引物S1，与锚定引物P3扩增3’末端，反向引物A1与锚定引物P5扩增5’末端。锚定引物P5的序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’：锚定引物P3的序列为：5’-GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3’；正向特异引物S1序列为5’-GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3’；反向特异引物A1序列为5’-TTACTAGTTTGCCAACTTGGTGAAG-3’。PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入pGEM-T Easy载体，转化DH 5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，得到Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端。

(3)BcPW1基因的全长克隆根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异引物T1(序列为：5’-GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3’)和T2(序列为：5’-ATAGGATCCATAGGTCGGTCAATA-3’)。常规PCR方法再次从花蕾cDNA中扩增Bc-A17T17片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA中扩增得到其DNA序列。

实施例2利用RNAi技术验证BcPW1的功能

(1)正义及反义片段的分离根据BcPW1 DNA全长序列及植物双元载体pBI121的多克隆酶切位点，在BcPW1序列内部第1个碱基至第583个碱基之间设计引物，扩增583bp序列作为正义基因片段(包含一段外显子序列和一段内含子序列)。PCR引物分别含有Xba I和BamH I限制性内切酶位点(下划线部分)及三个保护碱基，BcPW1-iX5：5’-GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3’，BcPW1-iB3I：5’-ATAGGATCC GCCCAGTCAGGAGTATAA-3’。在BcPW1序列内部第1个碱基至第426个碱基之间设计引物，扩增426bp序列作为反义基因片段，PCR引物分别含有Sma I和BamH I限制性内切酶位点(下划线部分)及三个保护碱基，BcPW1-iS5：5’-ATACCCGGGGAGGTCATTCAATTCAT-3’，BcPW1-iB3E：5’-CTAGGATCCCCTTCCAATAGCAAA AGA-3’。阳性克隆质粒分别命名为pTBcPW1iS和pTBcPW1iA。

(2)干涉表达载体的构建将阳性克隆质粒pTBcPW1iS和pTBcPW1iA分别进行Xba I和BamH I、BamH I和Sma I双酶切，PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳分离后，回收目的片段。取上述制备好的的BcPW1正义和反义基因片段、BcA9启动子和经Hind III和BamH I双酶切的pBI121以摩尔比1∶1∶1∶1混合，用T₄DNA连接酶连接。连接产物转化DH 5α感受态细胞。经转化的细菌涂于含Kan 50mg·L^-1的固体LB培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，在5mL含Kan 50mg·L^-1的液体LB培养基中振荡培养过夜，碱裂解法抽提其质粒DNA，采用PCR和限制性内切酶酶切等方法鉴定阳性克隆。阳性克隆质粒命名为pBIBcA9-BcPW1i。

(3)干涉表达载体对菜心的遗传转化将上述构建好的植物表达载体pBIBcA9-BcPW1i质粒通过冻融法转入农杆菌LBA4404，菜心的遗传转化通过组织培养途径实现。本实验以子叶-子叶柄为外植体，把子叶柄插入预培养培养基中2~3mm深，培养3d，农杆菌侵染后平放入共培养培养基上，培养2d。将共培养2d后的菜心子叶-子叶柄外植体转入分化培养基上，大约20d左右，待分化出的抗性芽长到一定大小，小心从基部将其切下转入到新的分化培养基上继续生长。得到的抗性芽在分化培养基上继代并筛选，每20d左右转瓶一次，去除其中的假阳性植株。待抗性植株长到2~3cm时，将其从愈伤组织切下，转到生根培养基上。待抗性植株在生根培养基上长出大量白色的须状根时，打开瓶口炼苗2~3d，小心去除根上的培养基，移入含水量为60％的培养土中，保湿培养5~7天后，再转到室外培养。

转基因植株经PCR检测、Southern及Northern印迹杂交检测，筛选获得BcPW1基因表达沉默和受抑制的转基因植株A9-bcpw1。

(4)转基因植株的形态和细胞学观察体外检测花粉萌发情况，用于花粉离体萌发的半固体培养基组成为：15％蔗糖+0.4mmol·L-1硼酸+0.4mmol·L-1CaNO3+0.1％琼脂。采集花朵的时间均为上午9:00左右，每株采5朵花药刚裂开的花，采后先将花粉抖落到硫酸纸上，充分混匀，将其点涂在载玻片上的培养基中，不加盖玻片，将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿中，置于黑暗、20~25℃恒温条件下培养，4~6h后在显微镜下观察萌发率。扫描电镜观察花粉形态，采刚开放的花朵，用镊子夹持花药将花粉轻轻地涂在贴有双面胶的金属载物台上，喷金后在Philips XL-40型扫描电镜下观察花粉形状、饱满程度及表面网纹，拍照。

最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>259

<212>DNA

<213>Brassica rapa

<400>1

actacttcta gttctacttc tacatcagac tccaggggaa cagcgcaggc aaattgaact 60

gaagctaagg tgtaacttca ccaagttggc aaactagtaa ccaatagcta ataatttaga 120

gatttttatt tttgattgca aataaaacaa atatcggtgt aggctagcaa tatatctatt 180

gaccgaccta tgcaaaataa taactatgta taagtacata tagattgtaa gcattctata 240

tgctaacatc caaaagtga 259

<210>2

<211>2021

<212>DNA

<213>Brassica rapa

<400>2

gaggtcattc aattcattcc ctacaaacaa aaaaatataa ttttcttttt aaaaaaacaa 60

aaagataaaa gaataatggc aagagttcat ctattgttat gcttcaccct tctatttgca 120

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gatgccatgc aatttattcg ttcaagaatt ggaaacaaat cagcagaagt aagttacaaa 1440

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ggaacaagtc acaacccagt tcgttgaggt tgctattaag agtgaaactt cgacaactac 1740

ttctagttct acttctacat cagactccag gggaacagcg caggcaaatt gaactgaagc 1800

taaggtgtaa cttcaccaag ttggcaaact agtaaccaat agctaataat ttagagattt 1860

ttatttttga ttgcaaataa aacaaatatc ggtgtaggct agcaatatat ctattgaccg 1920

acctatgcaa aataataact atgtataagt acatatagat tgtaagcatt ctatatgcta 1980

acatccagaa gtgatgatta atgaaagaaa tttttgtggt g 2021

Claims

1、一种白菜雄性育性相关基因BcPW1，其特征在于：它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的白菜雄性育性相关基因BcPW1，其特征在于：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

3、一种权利要求1所述的白菜雄性育性相关基因BcPW1的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)Bc-A17T17片段的分离：用A17/T17引物对白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Bc-A7T17，用手术刀片割下聚丙烯酰胺凝胶上的差异片段，溶于100μL TE，并作为模板进行PCR扩增，条件与cDNA-AFLP中的预扩增相同；PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试剂盒纯化；回收产物连接到pGEM-T Easy Vector(Promega)并转化到E.coliDH 5α感受态细胞，经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该条带的核苷酸序列。

(2)Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端扩增：根据双链cDNA合成试剂盒中接头及引物特征设计3’RACE和5’RACE锚定引物P3和P5；根据差异片段Bc-A17T17设计正向特异引物S1和反向特异引物A1，正向特异引物S1与锚定引物P3扩增3’末端，反向特异引物A1与锚定引物P5扩增5’末端；锚定引物P5的序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；锚定引物P3的序列为：5’-GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3’；正向特异引物S1序列为5’-GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3’；反向特异引物A1序列为5’-TTACTAGTTTGCCAACTTGGTGAAG-3’；PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入pGEM-T Easy载体，转化DH 5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，得到Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端。