兽用乳房炎膏及其制备、给药方法
(一)技术领域
本发明涉及兽用药品技术,具体涉及一种兽用乳房炎膏。
(二)背景技术
奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业最常见的疾病之一,是由多种因素导致乳腺组织的一种抵抗性炎症反应,其主要病理变化表现为乳腺组织的病变,并由此引起泌乳障碍。以病原微生物侵入乳腺引起的乳房炎占大部分,如细菌、病毒、支原体、真菌等侵入乳头,经乳腺管进入乳腺组织,从而引起发病。我国约有94%的奶牛乳房炎是由葡萄球菌和链球菌引起。奶牛乳房炎根据有无临床症状可将其分为临床型乳房炎和隐性乳房炎两种,一般认为临床型占30%,隐性占70%。临床型乳房炎可分急性、亚急性和慢性3种。隐性乳房炎乳房外观和乳汁常无明显变化,很难被发现,常常不被人们所重视。隐性乳房炎发病率较高,可转变为其他型乳房炎,其危害较大。
目前全世界约有2.3亿头奶牛,其中约1/3患有各种类型乳房炎,其中乳房炎的头数阳性率为48.2%~69.7%,乳区阳性率31%~51.2%。据北京、上海、广州、西安、兰州等城市的调查,乳腺炎的发病率达20%~70%,奶牛隐性乳房炎头数阳性率为40%~80%,个别牛群发病率甚至更高。据统计,在乳房炎引起的经济损失中,由于产奶量降低引起的损失占到70%,而由于患病使奶牛提前淘汰的占14%,废弃乳汁占治疗及兽医费用占80%。在世界范围内每年的牛奶生产损失达380万吨,全世界每年因乳房炎造成的损失约为350亿美元,仅美国的损失就达20亿美元。在加拿大,其经济损失为每头每年140~300美元[10]。Lund等报道,在丹麦由乳房炎引起的经济损失估计为每头每年225美元。它给我国造成的经济损失每年达1.35亿元,其中产奶量下降是主要原因,它占总损失的69%~80%。我国每天每头奶牛因隐性乳房炎产奶量减少3.7kg,每年由乳房炎引起的泌乳量降低所造成的损失,每头牛约1200~3600元以上。
近几十年来,该病的治疗主要以抗生素为主,但人们逐渐认识到抗生素不能从根本上解决问题,尤其是长期大剂量使用造成的细菌耐药性问题日益严重。而且由于病牛乳汁中含有大量病原微生物及其毒素或经治疗后大量抗生素残留,人食用后可引起发烧、呕吐、过敏等症状,危害人类健康。所以,随着人们对食品安全要求的不断提高和加入WTO后对我国奶产品质量要求的进一步严格,临床治疗常用的抗生素已逐渐被禁用或限用,因此研制开发特异性强、毒性小、低残留的药物防治、治疗奶牛乳房炎已成为当务之急。
中医中药是中华民族的瑰宝,经过几千年的发展,已经形成了非常科学、独特的治疗体系,同时也出现了很多优秀的成方、剂型。现在,中兽药以其治疗彻底、毒副作用小、残留低等特点在兽医临床上正发挥着越来越重要的作用,尤其在奶牛乳房炎治疗期间不影响牛奶的食用而成为该病的一个用药方向。针对奶牛乳房炎的发病规律、临床特点和生理、病理组织学的一些变化特点及奶牛生活习性,研制特异性强、操作方便、无残留、适合兽医临床应用的中药制剂是目前迫切需要解决的课题。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种采用涂抹方式给药,操作简单,且药物直接到达病所,疗效较高,具有显效快、作用强、治疗彻底、毒副作用小、无残留等特点的兽用乳房炎膏。
本发明的目的是这样实现的:它为一种直接患处涂抹式兽用药膏剂型,是由重量百分比为蒲公英50g~70g、紫花地丁50g~70g、关黄柏40g~60g、野菊花40g~60g、夏枯草40g~60g、白芨40g~60g、地龙30g~50g、桑枝30g~50g、血余炭30g~50g和花椒30g~50g制成。
本发明的另一目的在于提供兽用乳房炎膏的制备方法,制备时以上十味,除关黄柏粉碎成细粉外,蒲公英等九味酌予碎断,与食用植物油1040g同置锅内浸泡3日,中火炸枯,去渣,滤过,炼至滴水成珠。另取红丹200~250g加入油内,搅匀,收膏,将膏浸泡于水中。取膏用文火熔化,加入关黄柏细粉,搅拌均匀,制成1000g~1300g,分装得到药膏。
本发明制备成膏药制剂,主要是汲取传统黑膏药的黏贴性强、作用持久的特点,防止奶牛因食后趴窝而易将药物蹭掉,使之在较长时间内维持恒定及可控的有效浓度,减少给药次数。因制剂的基质主要成分为脂肪酸铅盐及植物油氧化聚合的增稠产物,脂肪酸铅盐有表面活性作用,故可增加皮肤的通透性及药物吸收,刺激神经末稍增强体循环,加速药物的传递和活血作用。为了更加适合于临床应用,对传统黑膏药制备工艺进行了一定改进,省去膏药摊涂于裱褙材料工序,可根据炎症部位及范围大小适量涂抹,使用更加方便。
本发明特点有:
1、将中药传统膏药经过大量的试验,应用到兽药,做为兽用药一种全新剂型的使用方法;
2、将中药传统膏药取消裱褙材料,减少收膏剂四氧化三铅等其它铅制剂的含量,降低膏药硬度,缩短使用时加温软化时间,对任意部位、任意受药面积,无裱褙直接添抹给药的给药方法。
工艺中根据各药味药性及化学性质将其分为二组:粗料、粉药。本发明制备工艺系将粗药料用油炸提取制作成药油,再将药油、丹按一定比例制成基质,将需保持生药药性的药物压成细粉,将细粉依法兑入加热熔化的基质中,搅匀去尽水气,减少了药材有效成份在高温熬炼时的分解损失,降低成本,制作方便。
本发明中十味药根据其药性及特点,采用蒲公英等九味先油浸,后油中炸枯,可将有效成分充分提取,药物浓度高,使膏药的载药量增大,保证临床疗效。黄柏粉成细粉后加药膏中,因为黄柏抗炎的主要成分小檗碱在高温油中分解,生成不溶性的小檗红碱,为保持其药性,故直接油浸粉末入药。以上制法,保持黑膏药传统工艺特色。
1、药料的选择处理及提取
(1)油:按地区习惯采用大豆油。
(2)红丹:以含铅量多、质重者为佳。
(3)将粗料药蒲公英等九味进行挑选除杂,捣碎或切成小段,浸于油中,处方中加油量为加热后可将药料全部浸没油中的量,浸泡3日后与油共同加热,油温控制为200~220℃,提取有效成分,至药材表面焦黑,内部棕褐色为度。提取后,将药渣去除,药油备用。将处方中的关黄柏粉成细粉,过100目筛,备用。
2、炼油工艺
炼油为熬制膏药过程中的关键,是使油在高温条件下发生氧化、聚合、增稠,以适合制膏的要求。将上述备用的药油继续加热熬炼,炼油程度老嫩适宜,以“滴水成珠”为度。
炼油操作条件判断:
(1)油烟:开始为青色(浅),逐渐转黑而浓,进而为白色浓烟(撩时更明显),以看到白色浓烟为准。
(2)油花:沸腾开始时,油花多在锅壁附近,散后又聚集为准。炼油时应不断撩油,油将炼成时撩油速度要快;撩油时均应避免触及锅底,以防油着火,炼油时火不宜过猛。
(3)等到油快要熬好时,应该随时做滴水成珠试验,实验成功后即可离火下丹。
(4)炼油过程用中火,温度慢慢升高,熬炼药油约需要3个小时,温度升至320℃时,药油继续熬炼20分钟,然后离火,温度稍降后下丹即可。
3、下丹工艺
等油温达到310~320℃时加入红丹(注:不能低于310℃),下丹用量为食用植物油的1/4~1/5左右,反应生成脂肪酸铅盐,为膏药的基本组成部分,此外铅盐又可进一步促进油脂氧化、聚合、增稠而致成膏。
丹下完后,随时检验基质的老、嫩程度。下丹散布要匀,并不停的顺一个方向搅拌,以防沉聚锅底。下丹的速度太快而易溢锅,且基质的质地不匀;太慢时,又不易掌握基质老嫩。
下完丹后及时观察其颜色,当视其变成深灰色或黑色时应立即做老、嫩检验,如偏嫩再继续加热;偏老兑入适量较嫩的炼油。本发明制剂为能刮敷的药膏,是黑膏药剂型的改进品种,故需嫩些。
4、去“火毒”
油丹化合制成的膏药若直接应用,常对局部皮肤产生刺激性,轻则出现红斑,瘙痒,重则发泡溃疡,这种产生刺激的因素俗称为“火毒”。所以应将放冷的膏药放入清水中,浸泡数日。
药油下丹成膏后离火,用冷水喷洒锅中,即有黑烟冒出,反复多次,待稍冷时以细流倾入盛有较多冷水的水池中,并同时以木棍顺时针方向搅动,使其随水旋成带状。待冷却后,将其拧成适当小坨,浸于冷水内7天,每天换水1~2次,取出备用。
5、加料分装
取去火毒后的备用药膏,70℃加热熔化,加入关黄柏细粉,充分搅匀,分装,即得。
本发明的第三个目的在于提供一种兽用乳房炎膏的给药方法,给药时取消裱褙材料,加温软化膏药,加温温度范围为38-48℃,对患处任意受药面积,无裱褙直接涂抹患处给药。
本发明功能有:清热解毒、活血止痛、排脓通络、消肿生肌。主治乳痈初起、红肿热痛,无名肿痛。主治奶牛等家畜临床型、隐性型乳房炎、乳头炎等病症及化脓、蓄脓、乳房红肿热痛、机械性和吮吸性损伤引起的乳房皮温升高、乳汁不下等乳房疾病。
中兽医传统理论认为,乳房炎即乳痈,是痰、湿、气、血郁结不散化而为炎。因饲养管理不善,久卧湿热之地,湿热毒气上蒸,侵害乳房;或因胃热壅盛,肝郁气滞,乳络失畅以致乳房气血凝滞,疲结而生痈肿;或因牛犊吸奶,使乳汁停滞,乳房胀满等原因而导致本病。因此中药方剂的组方应以清热解毒、通经活血、消肿止痛、活络通乳为原则。一般以蒲公英、鱼腥草、金银花、连翘等清热解毒药为主药,配合活血化瘀、通经活络等药组成复方,在临床上收到了良好的疗效。
本发明中以蒲公英、紫花地丁为君药。蒲公英味甘性寒,善清热解毒,利尿散结。《唐本草》云:主妇人乳痈肿。《本草求真》谓其能入阳明胃,厥阴肝,凉血解热,故乳痈、乳岩为首重焉。又《本草正义》曰:其治一切疔疮痈疡,红肿热毒诸证,可服可敷,而治乳痈、乳疖,红肿坚块,尤为捷效;紫花地丁味苦寒,长于清热利湿,解毒消肿。《本草正义》曰:地丁专为痈肿疔毒通用之药。濒湖《纲目》称其治一切痈疽发背,疔肿瘰疬,无名肿毒,恶疮,然辛凉散肿,长于退热;野菊花、关黄柏、夏枯草为臣药。其中野菊花味苦辛凉,能疏风清热,消肿解毒。《本草汇言》谓其破血疏肝,解疔散毒,主妇人腹内宿血,解天行火毒、丹疔;黄柏味苦、寒,清热燥湿,泻火解毒。《用药心法》用其治疮痛不可忍者。《本草经疏》谓其治痈疽溃后发热。黄柏主五脏肠胃中结热,专治阴虚生内热诸证,非常药可比也;夏枯草味苦辛寒,清肝散结。《本草从新》称其治瘰疬、鼠瘘、瘿瘤、乳痈、乳岩。《本草》言夏枯草,大治瘰疬散结气,有补养厥阴血脉之功。以上三药与君药相伍,增其清热解毒,消肿散结之功;以白及、地龙、桑枝、血余炭和花椒为佐使。白及味苦、涩,性微寒,具收敛止血、消肿生肌之功效;地龙味咸寒,性寒故能解诸热疾,性寒而下行通经络也;桑枝味苦平,通筋活络,通达四肢;辅以血余炭味微苦温,善消淤血;花椒味辛温,温中散寒,除湿止痛,破癥结。以上诸药合用,则能清热解毒,活血化淤,通经活络,消肿止痛,诸症可解。
国内外研究现状:
1、抗生素治疗乳房炎
几十年来世界各地把抗生素列入治疗乳房炎的首选药物,但由于长期反复使用,使病原体对药物产生了抗药性,而降低了疗效,且使奶中抗生素的残留增加。
2、疫苗控制
目前,使用疫苗控制奶牛乳房炎还未能产生满意的效果,只是生产出了某种细菌类型的疫苗,无法对所有细菌起作用。我国兰州兽医研究所研制出的奶牛乳房炎多联疫苗,即金黄色葡萄球菌-无乳链球菌-停乳链球菌疫苗,可使牛体产生金黄色葡萄球菌-无乳链球菌-停乳链球菌抗体。Gabriel Leitner等研制出奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌苗,攻毒试验表明该疫苗的保护率为70%,用224头牛进行田间试验,结果表明特异性抗体能够持续整个试验期(300~330天)。
3、生物制剂
生物制剂近年来日益受到人们的重视。郭宝福等报道,使用转移因子治疗奶牛隐性乳房炎具有明显的疗效,且安全、无毒副作用。用美国Biosystem公司生产的一种生物活性剂,其不含有任何激素及抗生素,可使患隐性乳房炎乳区阳性率由86.2%下降到50%。
4、中西兽医结合治疗奶牛乳房炎
有报道用中西药制剂薄硫膏乳房外敷法治疗急性奶牛乳房炎全部治愈。用青霉素、链霉素乳室注入结合内服公英散以及硫酸镁溶液热敷乳房患部,治疗牛乳房炎,取得了较好疗效。用左旋咪唑配合鱼腥草注射液肌肉注射及中药复方是治疗该病的最佳方法。采用内服荆防牛蒡汤、外敷草药、乳头管注射抗生素等方法。马井岩等发现中药内服、西药乳室注射和肌肉注射法对奶牛隐性乳房炎均有疗效,但乳室注射操作不方便,对乳头、乳管也有刺激,肌肉注射会产生应激反应。
5、中草药复方治疗乳房炎
用复方蒲公英煎剂液内服治疗临床型乳房炎126例,总有效率为94.44%,病原菌转阴率为40%。冯世玉等用乳疾宁、莫昌兰等用902乳炎康复方外用膏剂治疗隐性乳房炎都取得了较好结果。高纯一等用公英散加味治疗奶牛乳房炎286例,比抗生素的治愈率高。张光远用大瓜蒌散治疗乳房炎奶牛,治疗后产奶量比治疗前增加8.9%;而抗生素治疗后产奶量比治疗前产奶量减少8.1%。毛素珍等用白花蛇舌草、刺五加等中草药组成的冲剂治疗奶牛隐性乳房炎阳性牛,治疗后乳区转阴率为85.56%,乳区好转率为8.42%,总有效率为93.68%,较西药对照组的总有效率高。麻耀伦等发现用复方穿心莲溶液浸泡乳头防治奶牛隐性乳房炎具有良好的效果
6、中草药饲料添加剂防治奶牛乳房炎
赵恒寿等发现中草药饲料添加剂“通乳灵”对奶牛乳房炎有明显的治疗作用。谢慧胜等发现用增乳散添加饲喂奶牛,不但可以显著提高奶牛产奶量,而且隐性乳房炎检出率比对照组减少了24.23%。王晓丽等用纯中药制剂“消炎增乳散”超细散剂。主要由蒲公英、金银花、漏芦、党参、当归、神曲、路路通等中药组成。张淼涛等选用黄芪、白芍、当归、川芎、蒲公英、王不留行、益母草等,将药物粉碎混匀,随精料饲喂。
7、中草药提取物治疗乳房炎
张文玫等用绿草素、张彬等用消炎醌、周学辉[26]用六茜素治疗奶牛乳房炎均获得显著效果。顾小根等用桉乳注射液治疗临床型乳房炎,总有效率为88.4%,其中治疗急性乳房炎总有效率为84.8%。且试验组高于对照组。张余森等[28]发现不同剂量蒲公英注射液肝腧穴注射后,奶牛乳房炎的痊愈率为26.19%,总有效率为90.47%。甘志华等用复方丹参液治疗奶牛隐性乳房炎,其治愈率和总有效率分别达到87.55%和94.44%,疗效显著高于丹参注射液和抗生素。周方中用“桉精注射液”治疗临床型乳房炎,其疗效与青霉素、链霉素乳室注入相当,对少数病例的疗效优于抗生素。蒋次升等从清热解毒的中草药中筛选、制备的治疗急性乳房炎的中草药制剂CI注射液,具有与青霉素、链霉素相同的治疗效果。乳房炎消王是西北农业大学研制的治疗临床型乳房炎和隐性乳房炎的纯中药制剂,治愈率达93.2%,总有效率为98%。
总之,中草药不仅具有抗菌、抗病毒作用,还具有调节机体机能的作用,通过行气活血、散结消肿、通经下乳等功能,在治愈乳房炎的同时,还有增强奶牛乳汁分泌功能,所以治疗乳房炎时疗程短,见效快,经济实用。目前,已经有多种产品出现,一些中草药复方制剂和中草药提取物制剂已经在奶牛乳房炎的防治方面发挥了重要作用,有的治疗效果与青霉素等抗生素相当,有的效果还优于抗生素。因此,开展中草药防治奶牛乳房炎不但是可持续畜牧业发展的要求,也是人们对提高生活质量和绿色食品消费的要求。
临床上用于治疗奶牛乳房炎的中药制剂多为散剂、煎剂、注射剂。散剂和煎剂通过拌料或开水灌服,给药方便。但用量大,成本高,药物在瘤胃内有一定损失,且因肝脏的首过效应会影响疗效。中药注射剂作用迅速,但制备工艺繁琐且不易稳定,给药操作严格,乳池内灌注时易造成乳腺损伤。外用药膏提取药物有效成分,浓缩后制成膏剂,采用涂抹方式给药,操作简单,且药物直接到达病所,疗效较高。具有显效快、作用强、治疗彻底、毒副作用小、无残留等特点。在工艺制备方面,“英柏乳康膏”汲取传统黑膏药的粘贴性强、作用持久的特点,防止奶牛因食后趴窝而易将药物蹭掉,使之在较长时间内维持恒定及可控的有效浓度,减少给药次数。本制剂的基质主要成分为脂肪酸铅盐及植物油氧化聚合的增稠产物。脂肪酸铅盐有表面活性作用,可增加皮肤的通透性及药物吸收,刺激神经末稍增强体循环,加速药物的传递和活血作用。为了更加适合于临床应用,对传统黑膏药制备工艺进行了一定改进,省去膏药摊涂于裱褙材料工序,可根据炎症部位及范围大小适量涂抹,使用更加方便。
按中医功能主治查询,从方中药味组成看,目前还没有同本药类同方出现,另外从奶牛隐性乳腺炎、乳头炎发病率看,属于常见病,多发病,具顽固性,迁延性,复发率高的特点,目前治疗该病的特效中成药品种不多,因此对此类药物的研究必将带来一定的社会效益和经济效益。
本发明是临床上用于治疗奶牛乳房炎的纯中药制剂,具有消炎镇痛、活血化淤、消肿散痈之功效,适用于奶牛多种类型的急、慢性乳房炎。按照《兽药管理办法》有关新兽药研究技术指南要求,完成了该制剂的制备工艺、质量标准、稳定性药学研究,并在工艺稳定前提下,进行了一般药效学、临床药效学和一般毒理学试验等。现将试验结果总结如下:
一、药学研究
本发明汲取传统黑膏药的黏贴性强、作用持久的特点,防止奶牛因食后趴窝而易将药物蹭掉,使之在较长时间内维持恒定及可控的有效浓度,减少给药次数,使用更加方便。本制剂采用了传统黑膏药制备工艺,即油浸炸提取方法,将处方中除关黄柏粉碎成细粉外,蒲公英等九味酌予碎断,与食用植物油同置锅内浸泡后,中火炸枯,去渣,滤过,将药油炼至滴水成珠,取红丹加入油内,搅匀,收膏,去火毒。再取药膏用文火熔化,加入关黄柏细粉,搅拌均匀,制成本发明膏药制剂。
在质量标准制定上,采用薄层色谱法对乳康膏中盐酸小檗碱进行了定性鉴别,结果表明鉴别斑点清晰,分离良好,阴性对照液无干扰。以黄柏中盐酸小檗碱的含量作为指标,采用高效液相色谱法进行定量分析。色谱条件为:色谱柱为C18(200×4.6mm,5μm),流速为1.0mL/min,柱温30℃,检测波长为265nm,流动相为乙腈-水-冰醋酸-三乙胺(25∶73∶1∶1)。此条件下盐酸小檗碱与其他组分均能达到基线分离。盐酸小檗碱的浓度在7.5~75μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均加样回收率为98.10%,RSD=2.21%。表明所建立的方法可准确地进行定性、定量检测,能排除其他成分干扰,重复性好,适合于本发明产品中盐酸小檗碱含量的质量控制。
二、主要药效学试验
为对本发明的疗效做出科学客观的评价,对其进行了与功能主治有关的主要药效学及相关研究。
1.采用松节油致大鼠发热法评价英柏乳康膏的解热作用。结果表明,本发明产品和对照药阿司匹林对松节油致热有显著的解热作用,在各个时间点都有显著作用,说明本发明对松节油诱发的家兔发热有一定的解热作用。
2.通过小白鼠耳廓肿胀法和小鼠琼脂肉芽肿试验来本发明评价的抗炎消肿作用。结果表明,本发明高、中剂量组能够显著抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀,肿胀抑制率分别为59.6%、48.1%,与模型对照组比较差异极显著(p<0.01);本发明高剂量组能显著抑制琼脂所致小鼠慢性肉芽肿的生成,肿胀抑制率为31.73%,与模型组比较差异极显著(p<0.01)。
3.通过热板致痛法进行了本发明的解热作用试验。结果表明,本发明高、中、低剂量组均能明显的提高热板法致痛小鼠的基础痛阈,痛阈提高百分率分别为111.23%、92.47%、82.88%,与模型对照组比较差异极显著(p<0.01)。
4.采用“寒凝致瘀法”制成血瘀证模型,测定给予本发明前后血流变学指标、红细胞压积值等变化。结果显示,与模型组相比,本发明高、中剂量组全血黏度、血浆黏度、红细胞压积明显降低(p<0.01,p<0.05),红细胞电泳速度明显升高(p<0.01,p<0.05);本发明高剂量组红细胞聚集指数、红细胞形变指数显著降低(p<0.05)。且本发明高剂量组与阳性药物组相比差异不显著(p>0.05)。表明本发明可以对抗寒凝致瘀法造成的家兔血液流变学障碍,降低血液黏度,改善血液流变性。
5.应用RYJ-6A型药物透皮扩散仪和高效液相色谱仪,测定本发明对离体鼠皮的穿透量。结果表明,1~12h盐酸小檗碱的经皮透过量迅速增加,速率基本恒定,呈现近似零级动力学特征;12h后透过量仍稳定增长,但渗透速率稍微减慢。表明本发明具有一定的体外透皮效果,能保持一定的给药速率。48h累计透过量1.138μg,透过率为39.65%。
以上结果说明,本发明具有良好的抗炎、消肿、镇痛、活血化淤和透皮作用。
三、临床药效学试验
2007年4月初至2007年11月中旬,在黑龙江省双城市联兴乡兴团村、苏家村牛场、周家镇周家等9个奶牛场进行了本发明的临床药效学试验,整个实验期间共治疗轻度、重度、隐性、乳房炎硬性脓肿类后遗症等多种症状奶牛159头。
对临床型奶牛乳房炎,本发明治疗组给药3次后,阳性乳区数从治疗前的146个减少到14个,乳区治愈率达到90.41%;给药4次减少到11个,治愈率达到92.47%,停药后治愈率保持在93.84%~95.89%。用SPSS12.0统计学软件分析,给药4d后,治疗组与对照组治愈率差异显著(p<0.05);对隐性奶牛乳房炎,本发明治疗组给药4次后,阳性乳区数从治疗前的117个减少到11个,乳区治愈率达到90.60%;给药5次减少到8个,治愈率达到93.16%,停药后治愈率保持在94.87%~95.73%。用统计学软件分析,给药4d后,治疗组与对照组治愈率差异显著(p<0.05);对牛乳质量的影响,随着给药次数和天数的增加,本发明治疗组和对照组奶牛乳汁中乳脂、乳糖含量逐渐升高,乳蛋白含量逐渐降低;治疗组乳质提高较对照组快。用统计学软件分析,治疗组给药20d后与给药前相比差异显著(p<0.05),给药30d后与给药前相比差异极显著(p<0.01);对照组给药后30d与给药前相比差异显著(p<0.05);而基质组乳质变化始终不显著。
具体实验数据及过程在申请文件附件里有对乳房炎自然发病牛的疗效观察资料及药理毒理研究资料。
本发明治疗奶牛乳房炎的特点,主要体现在几个方面:
其一,受药代动力学影响,脂溶性药物比水溶性药物在乳房内分布较好(胡士明,1998),本试验采用植物油溶作剂进行提取,保证药物脂溶性成分提出比较充分,有效进入患处发挥作用,发挥直接抑菌和抗炎作用,清除致病因素,恢复机体的正常状态,大大提高治疗效果。
其二,中药可以通过改善乳房局部的血液循环,调节乳腺细胞的血液供应,进而修复受损害的乳腺细胞,达到彻底治愈乳房炎的目的。炎症初期,由于血管壁通透性升高,毛细血管网显著扩张,使大量血液成分析出,并导致血管内细胞聚集,血液黏度增加,进一步使血流速度减慢,加剧局部血液循环障碍,使药物不能有效扩散,影响药物发挥作用,现在临床上很多药物治疗乳房炎效果不好,与此有很大关系。本方桑枝通筋活络,通达四肢;辅以血余炭善消淤血;花椒除湿止痛,破癥结。改善微循环,降低局部组织内压力,使药物有效到达患处,加速坏死组织康复,提高治愈率。
此外,中药可以调节机体的免疫机能,具有提高自然杀伤细胞(NK细胞)活性以及促进白细胞介素II的产生,促进巨噬细胞吞噬功能,刺激并活化T、B淋巴细胞等多种功效,从整体上提高动物体质,发挥中药整体治疗优势。
乳房炎明显导致奶牛产奶量下降(Shook,1989),而且能够导致乳成分发生变化(Harmon,1994),主要是乳脂、乳糖成分降低,虽乳蛋白含量有所升高,但是对人体有用的缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等必需氨基酸显著降低(陈北亨等,2001)。本试验表明,乳康膏治疗奶牛后,随着阳性乳区康复,奶牛泌乳量上升,乳汁质量也大大改善。由于本试验所选奶牛大都是乳房炎比较严重的病例,试验初始,乳脂率2.29%,乳糖3.72%,干物质10.34%,都是比较低的水平。治疗后乳品质量改善十分明显,到第30d分别提高到3.42%、3.36%、11.78%,50d时乳脂率达到3.96%,是比较高的水平。乳蛋白也从初始的3.68%,50d时下降到3.19%。这也证明乳康膏治疗奶牛乳房炎的疗效是切实的,带来的经济效益是可观的。另外,乳康膏是纯中药制剂,奶中无抗生素残留,绿色、安全,使用乳康膏治疗乳房炎,除患病乳区在患病期间和刚愈后1~2d内的奶需要废弃外,患病期间的健康乳区和愈后全部乳区均无需弃奶,可减少因弃奶而造成的经济损失。
从整体看,本发明对临床型和隐性乳房炎都有很好的疗效(p<0.01)。本试验所治疗的奶牛很多都是病史较长难治愈病例,有的已形成很大的脓包,有的已形成硬性增生,已经很长时间不出奶或者稀水样奶,病症较严重,给治疗带来很大困难,在一定程度上影响了治愈率。同时发现本发明对这些顽固性病例有较好的疗效,对已形成脓包、乳房出现硬块者也有很好的疗效。
四、毒理学试验
1.用白色豚鼠进行本发明的皮肤过敏试验,结果表明应用0.1~0.2g剂量的本发明分别在第0、第7、和第14天于豚鼠左侧已去毛区涂抹一次,与皮肤接触6小时,末次给药后14天,豚鼠右侧已去毛的皮肤上涂布英柏乳康膏进行激发,与皮肤接触6小时,皮肤无任何刺激性;同法用赋形剂的豚鼠皮肤均无刺激性,而阳性对照组(用2,4-二硝基氯代苯激发和致敏)豚鼠均出现不同程度的红斑与水肿。本试验结果表明本发明无任何皮肤致敏性。
2.用本发明及其赋形剂进行家兔的完整皮肤和破损皮肤的刺激性试验。一次给药的皮肤刺激试验,用药量为1g,给药后1、24、48、72h完整皮肤及破损皮肤均未出现刺激反应,未见红斑、水肿、色素沉着、出血点等情况,刺激反应评分均小于0.4,与对照组比较无差别;破损皮肤组仅在第1h出现轻度刺激,但刺激反应评分均小于2。说明乳康膏一次给药对皮肤基本无刺激;多次给药的皮肤刺激试验,每次1g,连续用药一周,结果在去除药物后第1~7d,完整皮肤组家兔受试皮肤涂药部位未出现刺激反应,刺激反应评分均小于0.5,未见红斑、水肿、色素沉着、出血点等情况。动物活动、食欲、粪便均正常,眼、鼻等也无分泌物增加等表现。7日内每天除去药膏后,局部皮肤颜色正常,未见刺激性反应。破损皮肤组家兔受试皮肤涂药部位出现轻至中度刺激,但反应评分均小于2。结果提示多次给药各组均未出现较强刺激反应,只有破损皮肤有轻度刺激反应。
3.采用昆明种小白鼠进行本发明的急性毒性试验试验,在背部脱毛处一日内分别涂抹乳康膏1次、2次、3次,每次10g/kg。24h后除去药物,连续观察14d,结果其饮食、活动、大小便均正常,未发现有异常情况,也未发现有任何明显的中毒症状和死亡。在最大耐受量测定试验中,在背部脱毛处一日内分别涂抹本发明产品3次、4次、5次,每次10g/kg。观察7天内小白鼠的死亡情况或中毒反应。结果发现一日内4次用药组有鼠出现死亡,则以3次/d为最大耐受量,即每只小鼠约0.6g/d。以奶牛4个乳区同时用药为准,每只奶牛用量为40g/d,每只小鼠的最大耐受量倍数为562.5倍,说明本发明比较安全。
总之,本发明汲取了传统黑膏药的黏贴性强、作用持久之特点。并对其传统制备工艺进行了一定改进,省去膏药摊涂于裱褙材料工序,可根据炎症部位及范围大小适量涂抹,使用更加方便。药效学与毒理学试验表明其具有良好解热、镇痛、抗炎及活血化瘀作用,且透皮性好,经皮肤给药比较安全,经临床治疗试验验证效果良好,可用于防治奶牛等家畜临床型、隐性型乳房炎、乳头炎等病症及化脓、蓄脓、乳房红肿热痛、机械性和吮吸性损伤引起的乳房皮温升高、乳汁不下等乳房疾病。
(四)附图说明
图1为本发明制备流程图;
图2为盐酸小檗碱标准曲线图;
图3为透皮动力学曲线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明:
实施例1、对大鼠的解热作用一松节油所致发热法
1.1药品及试剂
本实施例的用量包括重量百分比为蒲公英60g、紫花地丁60g、关黄柏42g、野菊花42g、夏枯草42g、白芨42g、地龙32g、桑枝32g、血余炭32g和花椒32g,每1g软膏所含生药量约0.23g。用法与用量:取适量均匀涂在患处,隔日1次。
1.2实验动物
新西兰白兔若干只,体重2.1~2.5kg,雌雄各半,由哈尔滨市江北万方实验动物场提供。2.方法
家兔经一周常规饲养观察后,每日测定肛温1~2次,连续测定3d,使家兔适应测量体温操作。挑取体温38.6~39.5℃之间,波动在0.3℃以内的健康者40只。随机分为5组,即基质对照组、阿司匹林阳性对照组、乳康膏低、中、高剂量组,每组8只。实验前对每组动物每隔15min用体温计测肛温一次,共测3次,取其平均值作为基础体温。实验时阳性对照组按13mg/kg给予阿司匹林(将1.3g复方阿司匹林溶于100mL 0.9%生理盐水,配成浓度为1.3mg/mL溶液,按1mL/kg灌胃),其余各组腹部以8%硫化钠溶液脱毛,脱毛面积为3cm×3cm,脱毛后用0.9%氯化钠注射液洗净皮肤。基质对照组在脱毛部位均匀涂抹不含药物的基质0.5g/kg,每日2次;乳康膏高、中、低剂量组分别均匀涂布乳康膏每日3次、2次、1次,每次用量0.5g/kg,连续给药3d。每只家兔在末次给药前24h,在家兔背部皮下注射松节油0.4mL/kg。末次给药后每间隔1h测肛温一次,共测7次(第一次0.5h时测定),并记录致热后各时间点体温。
3.结果
注射松节油24h后,家兔体温升高。与基质组相比较,用药0.5h后,阿司匹林能显著抑制松节油致家兔体温升高(p<0.05);1h后,乳康膏高剂量组能显著抑制松节油致家兔体温升高(p<0.05),阿司匹林组与模型组相比差异极显著(p<0.01);用药2h后,乳康膏中剂量组能显著抑制松节油致家兔体温升高(p<0.05),乳康膏高剂量组与模型组相比差异极显著(p<0.01);用药3h后,乳康膏低剂量组能显著抑制松节油致家兔体温升高(p<0.05)。说明英柏乳康膏和阿司匹林对松节油诱发的家兔发热有一定的解热作用。结果见表1。
表1本实施例对松节油致热家兔的解热作用结果(x±s,n=8)
注:与基质组比较,*p<0.05,**p<0.01
实施例2、对大鼠的抗炎作用-小白鼠耳廓肿胀法
1.1药品与试剂
本实施例的用量包括重量百分比为蒲公英60g、紫花地丁60g、关黄柏42g、野菊花42g、夏枯草42g、白芨42g、地龙32g、桑枝32g、血余炭32g和花椒32g,每1g软膏所含生药量约0.3g。用法与用量:取适量均匀涂在患处,隔日1次。
1.2实验动物
昆明种小白鼠,体重25~30g,雌雄各半,由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物室提供。
1.3实验器材
打孔器,分析天平。
2.实验方法
取50只昆明种小白鼠,随机分为5组,即基质组、复方地塞米松软膏对照组和乳康膏高、中、低剂量组,每组10只。地塞米松组小鼠左耳内、外涂地塞米松软膏1g/kg,乳康膏高、中、低剂量组小鼠左耳内、外涂乳康膏2g/kg、1g/kg、0.5g/kg,1次/d,连续给药3d,基质组涂不含药物的赋形剂1g/kg,均以右耳作自身对照。并于末次给药1h后,以蒸馏水洗净药物,用干棉球擦干。于左耳内、外滴二甲苯0.02mL致炎。致炎1h后将小鼠颈椎脱臼致死,于耳廓基部剪下双耳,用直径0.6cm的打孔器分别在左、右耳对称处取下圆形耳片,称重,以左、右耳的重量差作为肿胀度。计算炎症肿胀抑制率。并进行统计(组间比较采用方差分析;各治疗组与对照组的比较采用t检验)。
炎症肿胀抑制率(%)=1-(药物组左右耳片重量差/基质组左右耳片重量差)×100%
3.实验结果
以二甲苯涂抹小鼠耳面后,可引起鼠耳明显肿胀。乳康膏高、中、低剂量组和复方地塞米松对二甲苯所致的小鼠急性耳廓肿胀均有一定的抑制作用,抑制率分别为59.6%、48.1%、40.3%和36.5%。
乳康膏高、中剂量组对小鼠耳肿胀的抑制作用与基质对照组相比较,差异极显著(p<0.01);乳康膏低剂量组和复方地塞米松软膏组与基质对照组相比较相比较,差异显著(p<0.05);且乳康膏高剂量组与地塞米松软膏相比较差异极显著(p<0.01)。表明英柏乳康膏具有一定的抗炎消肿作用。试验结果见表2。
表2本实施例对小鼠耳廓肿胀的抑制作用(x±s,n=10)
组别 动物数(只) 药物剂量(g/kg) 肿胀度(mg) 抑制率(%)
基质组 10 1 5.2±2.1 -
地塞米松组 10 1 3.3±1.0* 36.5
乳康膏低剂量组 10 0.5 3.1±1.4* 40.3
乳康膏中剂量组 10 1 2.7±1.3** 48.1
乳康膏高剂量组 10 2 2.1±0.8**# 59.6
注:与基质组比较:*p<0.05,**p<0.01;
与地塞米松组相比较:#P<0.01
实施例3、对小鼠的镇痛作用-热板法
1.1药品及试剂
本实施例的用量包括重量百分比为蒲公英60g、紫花地丁60g、关黄柏42g、野菊花42g、夏枯草42g、白芨42g、地龙32g、桑枝32g、血余炭32g和花椒32g,每1g软膏所含生药量约0.23g。用法与用量:取适量均匀涂在患处,隔日1次。
1.2实验动物
昆明种小白鼠,体重18~22g,雌性,由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物室提供。1.3器材
RCY-2型热板测痛仪:上海益联科教设备有限公司。
2.试验方法
取体重为18~22g的健康雌性小白鼠若干只,调节热板测痛仪,预热10min,使温度达到55±0.5℃。将小鼠置于热板上至出现舔后足反应的时间作为小鼠痛阈值。凡舔后足时间小于5s或大于30s或跳跃者弃之不用,即选取痛阈值5~30s的小鼠50只,随机分为5组,即空白基质对照组,阿司匹林(实验前取阿司匹林片,用蒸馏水配成浓度为20mg/mL的溶液)对照组,乳康膏高、中、低剂量组,每组10只。各小鼠测3次痛阈值,取均值作为基础痛阈值。阿司匹林组以1mL/kg体重灌胃,基质组两后足涂不含药物的赋形剂1g/kg,乳康膏高、中、低剂量组小鼠两后足分别涂抹乳康膏2、1、0.5g/kg,每日1次,共给药3d。末次给药后1h分别测定各组小鼠痛阈值,各组小鼠用给药前后痛阈差值作自身比较,同时对各给药组与基质组进行组间比较,并计算药物组痛阈值提高百分率,进行统计分析。
痛阈值提高百分率=(给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值)/给药前平均痛阈值×100%。
3.实验结果
将小鼠置于热板上后,小鼠出现舔后足反应。小鼠用药后,与基质对照组比较,乳康膏和地塞米松能明显延长小鼠舔后足反应的时间,并且这种镇痛作用随用药剂量的增大而加强。将小鼠置于热板上至出现舔后足反应的时间作为小鼠痛阈时间,试验各组用药前后痛阈值进行自身比较,乳康膏高、中、低剂量组和地塞米松均能提高小鼠的痛阈值,痛阈值提高百分率分别为111.23%、92.47%、82.88%和108.57%,而基质对照组变化不明显。与基质对照组相比较,乳康膏高、中、低剂量组和地塞米松软膏组给药后痛阈值较给药前显著提高(p<0.01)。结果见表3。
表3本实施例对小鼠的热板致痛的影响(x±s,n=10)
注:与基质对照组比较,**p<0.01
实施例4、对小鼠琼脂肉芽肿的影响
1.1药物
本实施例的用量包括重量百分比为蒲公英60g、紫花地丁60g、关黄柏42g、野菊花42g、夏枯草42g、白芨42g、地龙32g、桑枝32g、血余炭32g和花椒32g,每g软膏所含生药量约0.23g。用法与用量:取适量均匀涂在患处,隔日1次。
1.2实验动物
昆明种小白鼠,体重18~22g,雌雄各半。由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物室提供。
1.3实验器材
分析天平。
2实验方法
将实验动物昆明种小鼠在常规条件下饲养1周后,挑取健康者50只,随机分为5组,即空白基质对照组、复方地塞米松软膏对照组、乳康膏低剂量组、乳康膏中剂量组、乳康膏高剂量组,每组10只。各组动物实验前一日,于各鼠背部中间脱毛1cm×1cm。实验时,于各小鼠背部脱毛区皮下小心注射2%灭菌琼脂0.2mL,注射后呈圆形。1h后,在注射处皮肤给药,基质组涂抹不含药物的赋形剂1.0g/kg,地塞米松组涂复方地塞米松软膏1.0/kg,低剂量组给予小鼠涂乳康膏0.5g/kg,中剂量组涂乳康膏1.0g/kg,高剂量组涂乳康膏2.0g/kg,1次/1d,连续14d。末次给药24h后颈椎脱臼处死,剥离完整肉芽肿,称重,减去原琼脂重量,得肉芽净重,计算增生抑制率。并进行统计(组间比较采用方差分析;各治疗组与对照组的比较采用t检验)。
增生抑制率(%)=1-(药物组肉芽平均重量/基质组肉芽平均重量)×100%
3实验结果
乳康膏高、中、低剂量和地塞米松对琼脂所致的小鼠皮下慢性肉芽肿增生均有一定的抑制作用,抑制率分别为31.73%、24.84%、13.46%和23.00%。
乳康膏高剂量组对小鼠肉芽肿的抑制作用与基质对照组相比较,差异极显著(p<0.01);乳康膏中剂量组、地塞米松软膏组与基质对照组相比较,差异显著(p<0.05);乳康膏低剂量与基质对照组相比较差异不显著(p>0.05)。结果见表4。
表4本实施例对小鼠琼脂肉芽肿的影响(x±s,n=10)
与基质组比较:*p<0.05,**p<0.01
实施例5、活血化淤作用试验
1.1药物
本实施例的用量包括重量百分比为蒲公英60g、紫花地丁60g、关黄柏42g、野菊花42g、夏枯草42g、白芨42g、地龙32g、桑枝32g、血余炭32g和花椒32g,每1g软膏所含生药量约0.23g。用法与用量:取适量均匀涂在患处,隔日1次。
1.2仪器
MDK-3200双通道全自动血流变测试分析仪,由重庆麦迪克科技开发公司生产。
1.3实验动物
新西兰白兔,体重2.1~2.5kg,雌雄各半,由哈尔滨市江北实验动物养殖场提供。
2方法
将36只健康家兔随机分6组,即血瘀模型组、空白对照组、乳康膏高、中、低剂量组,每组6只。血瘀模型组不做任何处理,其余5组腹部以8%硫化钠脱毛,脱毛面积为3cm×3cm,脱毛后用生理盐水洗净皮肤。乳康膏高、中、低剂量组每日在脱毛部位均匀涂布乳康膏2次、1次、每2日1次,每次0.5g/kg;阳性对照组于脱毛部位均匀涂布英柏乳康膏0.5g/kg,每日1次;基质组在脱毛部位均匀涂抹空白基质,连续7d。第8d各组均采用“寒凝致瘀法”制成血瘀证模型,即对每只兔皮下注射盐酸肾上腺素28μg/kg后,将兔四肢放入冰水中10min(注意勿使其死亡),2h后再重复注射盐酸肾上腺素,处置后禁食不禁水。次晨每组兔子在清醒状态下,心脏穿刺取血,其中取1.5mL血迅速注入肝素抗凝管内,摇匀后用于测定血流变学指标;另取1.2mL血用毛细血管离心法测定红细胞压积值(HCT)。
3实验结果
由表5、表6可见,与空白组相比,模型组全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数、红细胞形变指数明显升高(p<0.01,p<0.05),红细胞电泳速度显著降低(p<0.05),表明造模后红细胞聚集、血液黏稠度增高,造模成功。
与模型组相比,阳性药物组、乳康膏高、中剂量组全血黏度、血浆黏度、红细胞压积明显降低(p<0.01,p<0.05),红细胞电泳速度明显升高(p<0.01,p<0.05);阳性药物组、乳康膏高剂量组红细胞聚集指数、红细胞形变指数显著降低(p<0.05)。且乳康膏高剂量组与阳性药物组相比差异不显著(p>0.05)。表明乳康膏可以对抗寒凝致瘀法造成的家兔血液流变学障碍,降低血液黏度,改善血液流变性。
表5本实施例对家兔血液流变学的影响(x±s,n=6)
注:与空白组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
表6本实施例对家兔血液流变学的影响(x±s,n=6)
注:与空白组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
实施例6、透皮试验
1实验方法
1.1离体鼠皮制备
取20g左右的小白鼠腹部毛剪短,均匀涂抹8%硫化钠脱毛,15min后用棉球轻轻擦去毛,观察脱毛情况及充血程度,24h后选取皮肤脱毛彻底、充血少、无损伤的小白鼠,脱颈椎处死,剥离腹部皮肤,分离皮下组织及脂肪,用生理盐水洗净。置生理盐水中,放入4℃冰箱冷藏保存,1周内使用,试验前鼠皮不得有任何损伤。
1.2透皮贴制备
取5g黄柏细粉,置具塞锥形瓶中,加10mL甲醇超声提取2次,定容至20mL,过滤,取1mL滤液,浓缩至干。按括重量百分比为蒲公英60g、紫花地丁60g、关黄柏42g、野菊花42g、夏枯草42g、白芨42g、地龙32g、桑枝32g、血余炭32g和花椒32g制成黄柏透皮贴100g。
1.3透皮实验
RYJ-6A型药物透皮扩散仪,接受池为6.5mL,内径1.8cm,试验温度为39±0.5℃,电磁搅拌速度为330rpm/min。扩散池一端用离体鼠皮覆盖,用缝线扎紧,使皮肤角质层朝向管内,在扩散池内加入0.7g透皮贴供试品,接受池内加入6.5mL接受液(流动相),使鼠皮与接受液面充分接触,在39±0.5℃条件下连续搅拌,分别于加样后1,2,4,6,8,10,12,18,24,36,48h取样,每次取样1.5mL,并及时补充1.5mL空白接受液。取样的接受液过0.45μm微孔滤膜,取续滤液,用高效液相色谱法测定。
1.4色谱条件
色谱柱为C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸-三乙胺(50∶50∶0.75);检测波长为265nm;流速为1mL/min;柱温30℃。
1.5标准曲线制备
取盐酸小檗碱标准品,加甲醇配制成每1mL含6.4μg盐酸小檗碱的溶液,超声混匀,临用前用流动相依次稀释成0.4,0.8,1.6,2.4,3.2μg/mL各种浓度的标准品溶液,每次进样20μL,按“英柏乳康膏质量标准草案”下色谱条件测定。以盐酸小檗碱进样浓度为横坐标,样品峰面积为纵坐标,得回归方程与工作曲线。
1.6精密度试验
精确吸取盐酸小檗碱1.6μg/mL对照品溶液20μL,连续进样6次,求RSD。1.7稳定性试验
取1h时的样品溶液0.5mL,室温放置,每次间隔0,2,4,12,36,48h进样,进样量为20μL,求RSD。
1.8盐酸小檗碱含量测定
测定黄柏透皮贴中盐酸小檗碱的含量;并测定每个取样点样品中盐酸小檗碱的浓度,每组重复测定3次,计算平均值,并计算各时间点盐酸小檗碱的累积渗透量。不同取样点的累积渗透量(M)按下式计算:
式中Cn为第n个样品中盐酸小檗碱的实测浓度,V为接收池体积,Ci为每次取样点取样液中盐酸小檗碱的实测浓度,Vi为每次取样体积。
2试验结果
2.1标准曲线制备
以盐酸小檗碱进样浓度为横坐标,样品峰面积为纵坐标,进行线性回归,得标准曲线(标准曲线见图2)及得回归方程Y=121582X-2201.3,r=0.9995,表明盐酸小檗碱进样浓度在0.4~3.2μg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。结果见表7。
表7盐酸小檗碱标准溶液的测定结果(n=3)
2.2精密度试验
精密量取盐酸小檗碱1.6μg/mL对照品溶液20μL,连续进样6次,测得峰面积,求得RSD为0.67%,表明进样的准确性及仪器精密度良好。结果见表8。
表8精密度试验结果
2.3稳定性试验
取同一供试品溶液,分别在0,2,4,12,36,48h进样测定,进样20μL,求得RSD值为1.42%,表明供试品在48h内比较稳定。结果见表9。
表9稳定性试验结果
2.4盐酸小檗碱含量测定
1~12h盐酸小檗碱的经皮透过量迅速增加,速率基本恒定,呈现近似零级动力学特征(见图3);12h后,透过量仍稳定增长,但渗透速率稍微减慢。表明乳康膏具有一定的体外透皮效果,能保持一定的给药速率。48h累计透过量1.138μg,透过率为39.65%(测得每个扩散池中盐酸小檗碱含量约2.87μg)。结果见表10。
表10不同取样点盐酸小檗碱的累积透皮量(μg)